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PCR - “Polymerase Chain Reaction”
(Reação em cadeia da polimerase)
• Fator limitante para biologia molecular pequena quantidadede material disponível (DNA)
• Replicação in vitro de DNA – amplifica regiões específicas deDNA (exponencialmente), gerando milhares de cópias domolde de interesse
• Termocicladores: ciclos de altas e baixas temperaturas
APLICAÇÕES:
•Isolamento de DNA genômico
•Diagnósticos de doenças
•Amplificações de regiões de
interesse
•PCR (reação em cadeia da polimerase)
•PCR: amplificação enzimática de um fragmento de DNAlocalizado entre 2 iniciadores (primers ou oligonucleotídeos)
•Ciclos repetidos de desnaturação pelo calor, hibridização deiniciadores e síntese de DNA amplificação exponencial do DNAalvo
•Capaz de gerar quantidades suficientes de DNAs específicos apartir de pouca amostra para a análise de mutações, por ex.
•Amplificação a partir de poucas células bucais, embrião com 3dias, esperma de vagina de uma vítima de estupro, gota desangue seco
Antigamente: banho-maria
com diversas temperaturas
Atualmente:
termocicladores
Componentes e reagentes:
• DNA molde: contém a região a ser amplificada
• Primers: complementares às regiões 5´ e 3´ da molécula alvo
• dNTPs: nucleotídeos livre a serem incorporados às novas fitas
• Tampão: fornece meio ótimo para atividade e estabilidade da Taq
• Mg+2: cofator da enzima
• Enzima: Taq DNA polimerase
•Enzima isolada da bactéria Thermus aquaticus,
presente em regiões vulcânicas do Yellowstone
National Park, EUA (águas quentes 70C)
•Bactéria termófila – organismos que vivem e se
reproduzem em altas temperaturas
•Taq DNA polimerase termoestável – suporta
altas temperaturas
Taq DNA polimerase
Yellowstone National Park, EUA BactériaThermus aquaticus
Estrutura tridimensional da
enzima Taq DNA polimerase
Taq polimerase
Primers
Tampão
Água
94ºC
DENATURAÇÃO
72ºC
EXTENSÃO
57ºC
ANELAMENTO
ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas
(Termociclador)
25-40 (35) CICLOS
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP(nucleotídeos)
1. Detecção de deleções / inserções produtos amplificados que
apresentam alterações em seu tamanho.
2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de bases)
geram polimorfismos genéticos que podem ser determinadas pela
ação das enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.
3. Diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional para doenças herdadas
4. medicina forense (DNA fingerprint).
5. Diagnóstico de doenças infecciosas por agentes patogênicos diversos.
Aplicações do PCR