pontificia universidad catolica de...
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO
FACULTAD DE AGRONOMIA
AREA DE HORTALIZAS Y FLORES
TALLER DE LICENCIATURA
PROPAGACIÓN in vitro DE ALGUNAS ESPECIES DE Leucocoryne
CLAUDIA FUENTEVILLA SAA
QUILLOTA CHILE 2004
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN 2
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4
2.1. Antecedentes generales del género Leucocoryne 4
2.1.1. Ubicación taxonómica y distribución geográfica 4
2.1.2. Descripción botánica del género Leucocoryne 5
2.2. Antecedentes sobre propagación de Leucocoryne 6
2.2.1. Propagación sexual 6
2.2.2. Propagación asexual 7
2.3. Antecedentes sobre propagación in vitro 8
2.3.1. Definición 8
2.3.2. Ventajas y desventajas de la micropropagación 10
2.3.3. Factores que inciden en la micropropagación 11
2.3.3.1. Instalaciones 11
2.3.3.2. Selección del explante 11
2.3.3.3. Desinfección 12
2.3.3.4. Medios de cultivo 12
2.3.3.5. Condiciones ambientales de incubación 14
2.3.4. Etapas de la micropropagación 15
2.3.4.1. Establecimiento 15
2.3.4.2. Multiplicación 15
2.3.4.3. Enraizamiento 16
2.3.4.4. Aclimatación 16
2.4. Antecedentes sobre propagación asexual por técnicas in vitro en Leucocoryne 17
3. MATERIALES Y MÉTODOS 21
3.1. Ensayo 1. Efecto de tres medios de cultivo y uso de mitad de bulbo obtenido
por corte longitudinal como explante, sobre el comportamiento y formación de 22
bulbillos en las etapas de establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo
in vitro.
3.1.1. Preparación de medios 23
3.1.2. Preparación material vegetal 23
3.1.3. Protocolo desinfección 24
3.1.4. Protocolo de siembra 25
3.2. Ensayo 2. Efecto de dos tipos de cortes en bulbos y dos cultivares, sobre el
comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de establecimiento del
cultivo in vitro.
3.2.1. Preparación de medios 28
3.2.2. Preparación material vegetal 28
3.2.3. Protocolo desinfección 28
3.2.4. Protocolo de siembra 29
3.3. Ensayo 3. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la
hoja, sobre el comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de
establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo in vitro.
3.3.1. Preparación de medios 31
3.3.2. Preparación material vegetal 31
3.3.3. Protocolo desinfección 31
3.3.4. Protocolo de siembra 31
3.4. Ensayo 4. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la
hoja, utilizando material ex vitro, sobre el nivel de contaminación en el
establecimiento de los explantes.
3.4.1. Preparación de medios 34
3.4.2. Preparación material vegetal 34
3.4.3. Protocolo desinfección 34
3.4.4. Protocolo de siembra 36
3.5. Ensayo 5. Germinación in vitro: Caracterización de la curva de germinación y
bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea.
3.5.1. Preparación de medios 37
3.5.2. Preparación material vegetal 37
27
30
32
36
3.5.3. Protocolo desinfección 37
3.5.4. Protocolo de siembra 37
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39
4.1. Ensayo 1. Efecto de tres medios de cultivo y uso de mitad de bulbo obtenido
por corte longitudinal como explante, sobre el comportamiento y formación de
bulbillos en las etapas de establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo
in vitro.
4.1.1. Análisis de la variable contaminación 39
4.1.2. Análisis de la variable rendimiento y diámetro de bulbillos obtenidos 40
4.2. Ensayo 2. Efecto de dos tipos de cortes en bulbos y dos cultivares, sobre el
comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de establecimiento,
multiplicación y engorde del cultivo in vitro.
4.2.1. Análisis de la variable contaminación 44
4.3. Ensayo 3. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la
hoja, sobre el comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de
establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo in vitro.
4.3.1. Análisis de la variable contaminación 47
4.3.2. Análisis de la variable rendimiento y diámetro de bulbillos obtenidos 49
4.4. Ensayo 4. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la
hoja, utilizando material ex vitro, sobre el nivel de contaminación en el
establecimiento de los explantes.
4.4.1. Análisis de la variable contaminación 51
4.5. Ensayo 5. Germinación in vitro: Caracterización de la curva de germinación y
bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea.
5. CONCLUSIONES 59
6. RESUMEN 60
7. ABSTRACT 61
39
53
44
47
51
8. LITERATURA CITADA 62
ANEXOS
1. INTRODUCCIÓN
La diversidad climática y la aislación geográfica de Chile da lugar a una aislación botánica
maravillosa con una enorme diversidad genética (BRIDGEN, OLATE y SCHIAPPACASSE,
2002).
Dicha característica climática, da como resultado un gran endemismo en importante parte de
las familias de geófitas de nuestro país, y sus respectivos géneros. En el caso del “Huilli”, el
género en cuestión no es la excepción y según un estudio realizado por CONAF en el año
1989, la mayoría de los géneros descritos ya se encontraban en estado vulnerable. Con el
paso del tiempo y la acción antrópica, muchas de estas especies podrían ya encontrarse en
estado de peligro, debido a la alta tasa de extracción de bulbos y corte de flores para llegar a
mercados floristas informales.
La incansable búsqueda de nuevos productos que ofrecer en el mercado de la floricultura, en
paralelo a la necesidad de proteger las especies nativas de nuestro país, que dicho sea de
paso, cada vez se encuentran más cerca de desaparecer, ha sido el fundamento para la
realización de un proyecto de mejora genética y protección, que se ha iniciado con
Leucocoryne y es en este contexto que se enmarca esta investigación.
El Proyecto FONDO SAG 6 - 5 - 400: “Defensa del patrimonio genético de Leucocoryne a
través del mejoramiento genético y su introducción como cultivo para flor de corte.”, como
programa de mejora genética, se sostiene en tres pilares: diversidad (natural o generada por
cruzamientos), desarrollo de ejemplares con características deseables para un fin específico
(que en este caso puede ser flor de corte, o bien para maceta) y la capacidad de multiplicar
dichos ejemplares de tal modo de llegar a constituir un cultivar.
Persiguiendo este último fin, la técnica de cultivo in vitro, se convierte en una herramienta
eficaz para llevar a cabo la posibilidad de introducir especies del género Leucocoryne en el
mercado, ya que se trata de una planta de fácil manejo, desde el punto de vista agronómico, y
podría competir con otras bulbosas, considerando que Chile presenta condiciones
fitosanitarias óptimas para trabajar con este tipo de especies.
La hipótesis sobre la cual se basa esta investigación es que utilizando técnicas de propagación
in vitro, específicamente la micropropagación, es posible obtener un alto número de bulbos
florales, es decir, con capacidad de florecer el mismo año de plantación, de una variedad o
tipo específica, en un corto período de tiempo.
Así mismo, los objetivos que persigue esta investigación son los siguientes:
Objetivo general:
Determinar un protocolo para la propagación in vitro de Leucocoryne spp.
Objetivos específicos:
Evaluar respuesta de crecimiento de Leucocoryne en distintos medios de cultivo.
Evaluar el efecto del tipo de explante sobre el comportamiento y formación de bulbos in
vitro.
2. REVISION BIBLIOGRÁFICA
2.1. Antecedentes generales del género Leucocoryne:
2.1.1. Ubicación taxonómica y distribución geográfica
Gloria del sol o “Huilli”, en lengua nativa, es el nombre común con que se conocen las
plantas geófitas del género Leucocoryne. El primero en ubicarlo en una familia fue
J.G.Baker, quien lo hizo en la familia Liliaceae (ZOELLNER, 1972), pero la taxonomía
actual lo ubica en la familia Alliaceae (MANSUR et al. , 2002).
MANSUR et al. (2002), señala que el género Leucocoryne es endémico de Chile. Su
distribución más septentrional son los cordones montañosos que acompañan a la costa, a una
altura de 400-800 m, zona que se extiende desde Iquique hasta el valle de Copiapó. Desde la
desembocadura del río Copiapó, se observa un ensanchamiento del área ocupada por
Leucocoryne. Desde el río Elqui hasta el río Maipo prospera en la cordillera de la costa, en el
valle central y en la cordillera de Los Andes en donde aparecen numerosas especies. Desde el
río Maipo hacia el sur se nota una disminución de Leucocoryne existiendo solamente una
especie en el río Bío-Bío (HOFFMAN, 1998; ZOELLNER, 1972).
En la distribución de Leucocoryne, existen factores climáticos comunes: son zonas donde las
lluvias caen esporádicamente y sólo en los meses de invierno. Aparece una vegetación
efímera en la que predominan los geófitos y terófitos, pequeñas plantas que cubren los
campos con sus flores en los meses primaverales, para desaparecer rápidamente cuando se
acercan los meses estivales y los campos se convierten en semidesiertos (ZOELLNER,
1972).
2.1.2. Descripción botánica del gÉnero Leucocoryne
Según SCHIAPPACASSE, YAÑES Y PEÑAILILLO (1999), las especies geófitas son
plantas de estructuras vegetativas subterráneas especializadas en el almacenamiento de
carbohidratos, agua y minerales. Estas estructuras les permiten sobrevivir en estado de receso
cuando las condiciones son desfavorables, tales como sequía y temperaturas extremas.
Cuando las condiciones son favorables, rápidamente reanudan el crecimiento y completan su
ciclo. Estas plantas se pueden clasificar en cinco categorías: bulbos, cormos, tubérculos,
rizomas y raíces tuberosas. Las cuatro primeras categorías involucran, tanto modificaciones
del tallo como de las hojas y el último es principalmente una metamorfosis de la raíz
(HARTMANN, 1990).
El órgano geófito de Leucocoryne es un bulbo esférico o algo ovalado, de 1.5 a 2.5 cm de
diámetro, el que está cubierto exteriormente por membranas secas de color castaño y en su
interior se encuentran hasta veinte túnicas carnosas. En la base del bulbo existe un disco del
cual nacen muchas raíces fasciculadas. En su ápice se yergue el cuello, una estructura
cilíndrica, formada por la base de las hojas que generalmente está rodeada de hojas secas,
remanentes de años anteriores. De dicho ápice nace un escapo floral único que puede tener
una altura de 30 – 80 cm, es hueco y glabro, y en su ápice existen dos espatas. La
inflorescencia es una umbela pausiflora o multiflora. Las flores poseen pedicelos filiformes
glabros (MANSUR et al., 2002).
El perigonio consta de un tubo basal de 8 – 12 mm de color verdoso. Este tubo termina en 6
tépalos estrellados de 1.4 – 2.0 cm de largo, su coloración varía del blanco al celeste. En el
ápice del tubo floral surgen tres estructuras carnosas cilíndricas que alcanzan hasta 6 mm de
largo, que corresponden a los estaminodios. El androceo consta de 3 estambres, sin
filamentos y cuyas anteras están adheridas al tubo floral, constan de 2 tecas y poseen
dehiscencia longitudinal. El polen es monadal, heteropolar, bilateral, monocolpado. El
gineceo posee un ovario súpero hipogineo cilíndrico, con un estigma corto, capitado, ubicado
por debajo de los estambres. El fruto es una cápsula tricarpelar dehiscente. Cada carpelo
posee muchas semillas lenticulares insertadas en el eje (MANSUR et al., 2002).
2.2. Antecedentes sobre propagación de Leucocoryne:
2.2.1. Propagación sexual
Como indica MANSUR et al (2002), la polinización del estigma se efectúa con facilidad. El
polen acumulado sobre el estigma cae y fecunda la flor, por lo que cualquier insecto que la
visite, puede actuar de vector de manera sencilla. Rara vez puede tener autopolinización ya
que es autoincompatible y preferentemente su polinización es cruzada, lo que da pie a una
alta diversidad de especies en el genero en estudio. Pero este tipo de reproducción presentaría
un problema, en condiciones naturales, es que los frutos maduran en octubre – noviembre y
las semillas caen a un suelo endurecido, expuestas a ser comidas o destruidas.
Por otra parte, SCHIAPPACASSE, YAÑES Y PEÑAILILLO (1999), señalan la existencia
de diversas ventajas y desventajas de la propagación por semillas. Entre ellas (aunque no
aplicables a todas) se encuentran:
- Permite realizar mejoramiento genético.
- Existen menos posibilidades de transmisión de enfermedades a través de semillas que a
través de estructuras vegetativas.
- Las semillas se comercializan fácilmente: su tamaño es pequeño, pueden pasar barreras
aduaneras mejor y sufren menos los cambios de hemisferio que las estructuras
vegetativas.
- En algunos casos, las plantas resultantes de semillas pueden no tener la deseada similitud
con los progenitores.
- El periodo de juvenilidad puede durar mucho tiempo; en el caso del tulipán suelen
transcurrir cuatro a cinco temporadas desde una siembra hasta que las plantas produzcan
flores.
- En algunos casos, el periodo de viabilidad de las semillas es corto.
- Algunas semillas tienen complejos mecanismos que impiden su germinación por
prolongados periodos de tiempo y germinan sólo si se les proporcionan condiciones
muy especiales.
Los mismos autores indican que los mecanismos que aseguran la germinación de las semillas
en condiciones favorables para el desarrollo de las plántulas, e impiden su germinación bajo
condiciones “normales” son diversos. Tales semillas están en letargo o “dormancia”. La
dormancia puede deberse a diferentes causas, según las cuales se denomina ecodormancia,
paradormancia o endodormancia.
2.2.2. Propagación asexual
La reproducción vegetativa se produce por la formación de nuevos bulbillos que se originan
en el disco basal del bulbo madre, como pequeñas estructuras, que en su ciclo vital, poco a
poco se transformaran en nuevos bulbos (MANSUR et al., 2002).
Según MANSUR et al. (2002), el ciclo de vida natural de todas las especies de este género,
toma al menos tres años desde semilla a bulbo floral, pudiendo variar levemente según la
especie. Este ciclo comienza cuando las semillas germinan superficialmente con temperaturas
entre 10 – 15°C. Al cabo de aproximadamente 45 días, empieza a formar un bulbillo que
crece y se desarrolla, y que al cabo de 90 días postgerminación, llega a tener un diámetro
aproximado de 4 a 6 mm y 60 mg de peso. Luego, en noviembre, entra en receso. En la
segunda temporada de crecimiento el bulbo brota sin necesidad de agua, desarrolla un par de
hojas y engorda. Al cabo de 100 – 120 días, la planta senesce, sin alcanzar aún un tamaño
floral. En la tercera temporada de crecimiento, aproximadamente 90 – 100 días después de
emergencia, y con un bulbo de 0.3 gramos de peso, la planta produce uno o dos escapos
florales, teniendo cada uno de cinco a ocho flores y 25 a 40 semillas por flor. Esto coincide
con investigaciones realizadas por OHKAWA (1999), donde los bulbos con un peso superior
a 0.3 gramos florecen en un 100 %, y todas las varas florales tienen calidad para que puedan
utilizarse como flor de corte. Este autor indica que no todos los bulbos con un peso entre 0.1
y 0.2 gramos florecen y para que alcancen un tamaño comercial deben cultivarse por un año,
al cabo del cual alcanzarán un peso mayor a un gramo.
Además, durante el desarrollo del proyecto “Defensa del patrimonio genético de Leucocoryne
a través del mejoramiento genético y su introducción como cultivo para flor de corte.”, que se
lleva a cabo en la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de
Valparaíso, se ha observado que algunos individuos de Leucocoryne, poseen la capacidad de
generar bulbillos en la porción aérea de la planta, es decir, se originan en la parte superior del
escapo floral, en la base de la zona de inserción de los pedúnculos florales (Figura 1).
Así mismo, SCHIAPPACASSE, YAÑES Y PEÑAILILLO (1999) se refieren a distintas
técnicas artificiales, que aceleran la propagación vegetativa propia en especies geófitas. Entre
ellas se encuentran el corte en cruz o “scoring”, vaciado o “scooping” y “coring”. Los tres
métodos se aplican a bulbos tunicados, de preferencia en receso.
El primero consiste en hacer cortes profundos a lo largo del diámetro de la cara basal del
bulbo, en el plato basal. Los cortes tienen que ser lo suficientemente profundos para dañar el
punto de crecimiento. El segundo, “scooping”, consiste en remover completamente el plato
basal y la base de las escamas. Se puede realizar con un cuchillo o con una cuchara de borde
cortante. Finalmente, la técnica conocida como “coring”, consiste en la remoción de un
cilindro de tejido que incluye el punto de crecimiento, introduciendo un sacabocado o
utensilio desde la zona del plato basal verticalmente hacia el interior del bulbo.
2.3. Antecedentes sobre propagación in vitro:
2.3.1. Definición
El término de cultivo in vitro se aplica a todo cultivo bajo vidrio (tubo, bocal, etc.) en medio
aséptico, e incluye diversas técnicas cuyos métodos y fines son muy diferentes
(BOUTHERIN y BRON, 1994). Por otra parte, PIERIK (1990), señala que el cultivo sobre
un medio nutritivo en condiciones estériles, optimizando las condiciones ambientales y
nutricionales de células, protoplastos, embriones, semillas, explantes (trozos de tejidos u
órganos extraídos de la planta madre) o plantas, es lo que se conoce como cultivo in vitro.
La micropropagación consiste en producir plantas a partir de porciones muy pequeñas de
ellas. La capacidad de ciertos tejidos vegetales, como el callo y las suspensiones de células,
FIGURA 1. Bulbillos aéreos (bulbilos) generados en individuos de Leucocoryne sp. Quillota
octubre del 2002.
así como aquella de varios órganos de plantas tales como tallos, flores, raíces y embriones, de
crecer de manera más o menos indefinida, se ha utilizado durante muchas décadas en los
laboratorios científicos como un instrumento de investigación por genetistas, botánicos y
fitopatólogos (HARTMANN y KESTER, 1995).
Es importante destacar que el cultivo in vitro es posible gracias a una propiedad de las células
vegetales llamada totipotencia celular. Con esto se quiere decir que una célula no embrionaria
tiene el potencial de diferenciarse en una célula embrionaria y después desarrollarse en una
planta nueva completa si el ambiente es favorable, ya que todos los genes para la producción
de la planta completa existen en esas células diferenciadas (SALISBURY y ROSS, 1994).
2.3.2. Ventajas y desventajas de la micropropagación
Según KITTO (1997) y MROGINSKI (1991), entre las ventajas más importantes de este
método de propagación cuando se compara con los convencionales están:
Altos coeficientes de multiplicación que permiten manipular volúmenes elevados de
plantas en cortos períodos de tiempo.
Rápida introducción de nuevas variedades o clones.
Reducción del tiempo de multiplicación.
Producción independiente de las condiciones ambientales.
Incremento en los rendimientos debido al rejuvenecimiento y saneamiento.
Uniformidad en las plantaciones producidas.
Mejor facilidad para la comercialización.
Además, dentro de las ventajas de este método, señaladas por BOUTHERIN y BRON (1994),
se encuentran:
Salvamento de especies en vía de desaparición.
Permite la programación de cultivos a lo largo del año.
Creación de bancos de germoplasma, que podrán conservar especies o cultivares que
ofrezcan un interés agronómico, hortícola, industrial, ecológico, etc.
Garantía de homogeneidad.
Buena calidad sanitaria.
Dentro de las desventajas de este proceso HARTMANN Y KESTER (1995), indican que:
Las instalaciones necesarias son costosas y en muchas especies de plantas las
consideraciones económicas es posible que no justifiquen su empleo comercial.
Para efectuar las operaciones se necesita adiestramiento específico.
Los errores de identidad, introducción de organismos patógenos desconocidos o la
aparición de mutantes desapercibidos, pueden multiplicarse a escala considerable, en un
tiempo muy corto.
Con respecto a las modificaciones genéticas, la técnica mas generalizada y la más segura para
evitar la variabilidad y lograr la reconstitución de clones homogéneos, es el cultivo de
meristemas o ápices de tallo de forma directa. Cuando se generan plantas a partir de callo, se
facilita la aparición de variantes, sobre todo si se utilizan mezclas complejas de reguladores
de crecimiento (MARGARA, 1988). El callo corresponde a una masa de células no
especializadas, típicamente poliploides, dispuestas laxamente (SALISBURY y ROSS, 1994).
2.3.3. Factores que inciden en la micropropagación
2.3.3.1. Instalaciones
Se debe disponer de instalaciones especiales de tipo laboratorio para preparar los cultivos,
producir y mantener condiciones estériles y proporcionar las condiciones de crecimiento
adecuadas (HARTMANN y KESTER, 1995)
2.3.3.2. Selección del explante
Prácticamente se puede utilizar cualquier porción o parte de la planta. Para iniciar los trabajos
de cultivo in vitro, en primera instancia, dicha selección está dada por el objetivo perseguido
y la especie vegetal que se trate. Generalmente, se emplean plantas sanas y vigorosas, y
dentro de éstas, las zonas que se encuentran en activa división, como los meristemos. Las
plantas jóvenes son las que aportan los explantes más reactivos, ya que la totipotencialidad
disminuye con la edad. El tamaño del explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta,
pues la dificultad para iniciar un cultivo aumenta con su disminución (MROGINSKI, 1991).
Esto coincide con lo planteado por PIERIK (1990) quien indica que en términos generales,
explantes jóvenes no leñosos, en estado vegetativo y de mayor tamaño, tienen mayor
capacidad de regeneración y adaptación in vitro.
El tamaño de un explante puede variar desde 1 a 5 mm de la punta meristemática misma, a un
trozo de tallo de varios centímetros de largo. También se pueden utilizar para obtener
explantes trozos de hojas que tengan nervaduras, escamas de bulbos, escapos florales y
cotiledones (HARTMANN y KESTER, 1995).
2.3.3.3. Desinfección
Diversos compuestos químicos se utilizan para desinfectar superficialmente los explantes. Se
emplean con mayor frecuencia el etanol (70% v/v) y el hipoclorito de sodio (1-3%) y con
menor frecuencia se utiliza el hipoclorito de calcio (6-12 %) y el bicloruro de mercurio (0.1 –
1.25 %), aunque con este compuesto por lo general se obtienen mejores resultados, es
altamente tóxico y no se remueve con facilidad del explante. Conjuntamente con los
desinfectantes se pueden añadir gotas de Tween 20, para reducir la tensión superficial y
eliminar las burbujas que se forman en la superficie y cavidades del explante (JIMENEZ,
1998 y MARGARA, 1988). No obstante, las concentraciones del agente esterilizante y la
duración se deben escoger en función de minimizar los daños para los explantes. Se debe
tener en cuenta la especie vegetal y tipo de explante, ya que no existe un procedimiento único
(ROCA, 1991; MROGINSKI, 1991 y MARGARA, 1988). Luego se escurre la solución y el
material se enjuaga 2 o 3 veces con agua destilada estéril (HARTMANN y KESTER, 1995).
2.3.3.4. Medios de cultivo
Los explantes cultivados in vitro no se comportan completamente autotróficos, entonces el
medio de cultivo debe aportar el agua, los macro y micro nutrientes, azúcares y,
eventualmente, vitaminas y reguladores de crecimiento. La constitución del medio de cultivo
depende de la planta (genotipo), de las interacciones de éste con el ambiente (factores
físicos), del tamaño del explante y del objetivo o etapa de la micropropagación (PIERIK,
1990).
La efectividad del medio depende tanto de los ingredientes básicos, como del pH del medio y
del agente solidificante (MARGARA, 1988).
Para el cultivo in vitro, no existe un medio universal, sin embargo el medio MS basal
propuesto por Murashige y Skoog (1962), con algunas modificaciones en sus ingredientes ha
sido el más frecuentemente utilizado en la mayoría de las especies propagadas in vitro.
También se han empleado, pero con menor frecuencia, los medios Wh propuesto por White
(1943), B5 propuesto por Gamborg et al. (1968), BDS propuesto por Dunstan y Short (1977)
(IZQUIERDO y QUIONES, 2001).
Por otro lado, los reguladores de crecimiento son compuestos orgánicos que se sintetizan en
alguna parte de la planta y se traslocan a otra parte, en donde concentraciones muy bajas
causan una respuesta fisiológica (SALISBURY y ROSS, 1994). Un balance apropiado entre
auxinas y citoquininas es necesario para la formación de plantas a partir de meristemos,
ápices o yemas. Este balance está determinado por las concentraciones endógenas de auxinas
y citoquininas presentes en el explante, las cuales dependen de la especie y del tipo de
explante. Se considera que si la relación auxina/citoquinina en el medio de cultivo es
favorable a la segunda se incentiva la formación de brotes y lo contrario promueve el
enraizamiento y la callogénesis (JIMENEZ, 1998 y DIXON, 1994).
Las auxinas sintéticas comprenden al ácido naftalenacético (ANA), usado de 0.1 a 10 mg*l-1;
al ácido indolbutírico (IBA), usado a razón de 0.1 a 10 mg*l-1; a los ácidos 4-
clorofenoxiacético (CPA) y 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), usados ambos en proporción de
0.05 a 0.5 mg*l-1 y el ácido indolacético (AIA), empleado en cantidades de 1 a 50 mg*l-1. Las
citoquininas incluyen a la N6-benciladenina (BA), la kinetina, la N6-isopentenil-adenina (2iP)
y la zeatina, y se utiliza en un rango de 0.01 a 10 mg*l-1 (HARTMANN y KESTER, 1995).
Sobre la base de experiencias recientes, aparecen los jasmonatos, especialmente al ácido
jasmónico (AJ) y el jasmonato de metilo (MeJA), como promotor de defensa de las plantas a
ataques de insectos y resistencia de enfermedades. Los jasmonatos han sido encontrados a
través de plantas, con las concentraciones más altas posibles en tejidos jóvenes en activo
crecimiento. El jasmonato de metilo es el principal componente del aceite esencial de
Jasminium y otras especies. Altas concentraciones de ácido jasmónico han sido aisladas
desde líquidos filtrados de cultivos de hongos.
Los jasmonatos fueron inicialmente reconocidos por su habilidad como promotores de la
senescencia de segmentos de hojas de cebada, pero un papel en la resistencia a enfermedades
fue sugerido cuando la biosíntesis de fitoalexinas en cultivo de células, fue ligado al
contenido de ácido jasmónico. Ahora es sabido que el ácido jasmónico se acumula en plantas
heridas, y que además activa algunos genes codificadores de proteínas con propiedades
fungicidas.
Por su efecto en la expresión genética, los jasmonatos moderan un número importante de
otros procesos fisiológicos, entre los que se incluyen la germinación de semillas y polen,
almacenamiento de proteínas de reserva y desarrollo radicular. En la mayoría de esos efectos
los jasmonatos aparecen en un trabajo conjunto con el etileno. Este amplio espectro de acción
de los jasmonatos ha conducido a algunos investigadores a sugerir que los jasmonatos pueden
ser elevados al nivel de fitohormonas (HOPKINS, 1999).
2.3.3.5. Condiciones ambientales de incubación
Este requisito se debe cumplir rigurosamente para el éxito en el establecimiento de los
cultivos in vitro. Para ello es conveniente que los explantes se incuben en ambientes
controlados de luz (1000 – 5000 lux) y temperatura (20 – 28 °C), así como de humedad
relativa (70 – 80 %) acordes con los objetivos del trabajo. Estos efectos influyen
prácticamente en todos los procesos: absorción de agua, evaporación, fotosíntesis,
respiración, crecimiento, floración, cuajado del fruto, entre otros (ROCA, 1991 y PIERIK,
1990). No obstante se debe tener en cuenta que cada cultivo tiene sus propias especificidades
(IZQUIERDO y QUIONES, 2001).
2.3.4. Etapas de la micropropagación
Muchos autores coinciden en la existencia de 4 fases o etapas en la micropropagación. Sin
embargo, IZQUIERDO y QUIONES (2001), hacen referencia a una etapa previa a estas
cuatro etapas. La llaman Fase 0 o Preparativa, y sería indispensable en el desarrollo de un
esquema de micropropagación, ya que es la fase en que se selecciona la planta donadora de
los explantes y se determinan todas las condiciones para el posterior establecimiento de los
mismos.
2.3.4.1. Establecimiento
La función de esta etapa es establecer al explante en el medio de cultivo e inducir el
desarrollo de brotes múltiples para multiplicación posterior, lo cual puede implicar: (a)
estimular la formación de brotes axilares, (b) la iniciación de brotes adventicios en brotes,
hojas, escamas de bulbos, escapos florales, cotiledones y material similar, o (c) la iniciación
de formación de callo en superficies cortadas (HARTMANN y KESTER, 1995).
2.3.4.2. Multiplicación
En esta etapa, cada explante se desarrolla y forma un grupo de brotes que salen de una masa
basal común expandida de tejido tipo callo. Luego, esta estructura se divide en propágulos
separados, que se transplantan a un medio de cultivo fresco. El tipo de medio que se use
depende de la especie, cultivar y tipo de cultivo. De ordinario es esencialmente el mismo que
se usó en la etapa de establecimiento, pero a menudo se aumenta la concentración de
citoquinina (HARTMANN y KESTER, 1995).
2.3.4.3. Enraizamiento
Los propágulos de algunas variedades necesitan una etapa de cultivo adicional, pues aún
cuando la sobrevivencia no sea un problema, es necesaria esta etapa para el enraizamiento
individual de los brotes, el incremento de su resistencia al estrés de humedad y enfermedades,
para el establecimiento de las reservas de alimentos necesarios en el período de transición y
para el desarrollo de la capacidad autotrófica, debido a que la apariencia verde de las plantas
no es suficiente para poder realizar la fotosíntesis, ya que aunque los pigmentos
fotosintetizadores estén presentes, las enzimas están en ocasiones ausentes o inactivas
(IZQUIERDO y QUIONES, 2001).
2.3.4.4. Aclimatación
Las plantas enraizadas, o sin enraizar, se sacan del recipiente de cultivo, se lava por completo
el agar, para remover una fuente potencial de contaminación y se transplantan a una mezcla
de suelo estándar, pasteurizada, en macetas pequeñas en una forma más o menos
convencional. Inicialmente se debe proteger las plantas colocándolas bajo sombreadero, con
alta humedad relativa o bajo niebla. Pueden necesitarse varios días para que se formen nuevas
raíces (HARTMANN y KESTER, 1995).
BOUTHERIN y BRON (1994) señalan que las raíces nacidas in vitro son extremadamente
frágiles y colocadas en contacto con un sustrato, mueren. Es necesario esperar la formación y
el crecimiento de nuevas raíces para que la planta se nutra. Durante esta fase, las jóvenes
plántulas se van a comportar como estaquillas. Será necesario entonces, asegurar los mismos
cuidados: higrometría elevada, temperatura cercana a los 20°C, sombreado eventual,
vigilancia muy cuidadosa de las enfermedades.
Sin embargo, las raíces formadas in vitro probaron ser plenamente capaces de expandirse y
crecer durante la aclimatación. Esta conclusión se opone a la hipótesis de que las raíces in
vitro no son capaces de sobrevivir bajo condiciones ex vitro (PIERIK, 1990).
SAFFIE (2002) se refiere a un experimento realizado con jazmín asiático, donde las raíces
formadas in vitro son viables y totalmente capaces de continuar el crecimiento después de ser
transferidas desde un medio in vitro a un invernadero convencional, a pesar de la reducida
absorción de fósforo.
2.4. Antecedentes sobre propagación asexual por técnicas in vitro en Leucocoryne:
En el caso de Leucocoryne, existen escasos antecedentes de experiencias previas a esta
investigación en cuanto a la micropropagación u otra técnica in vitro. No obstante, en otras
especies pertenecientes a la familia Alliaceae, como es el ajo (Allium sativum) y cebolla
(Allium cepa), o bien en tulipán (Tulipa spp.), también poseedor de bulbo tunicado, hay
antecedentes de este tipo de propagación.
BHOJWANI (1980), evaluó el comportamiento in vitro del clon de ajo francés “ Rose de
Kakylis” previamente saneado a virus. Desinfecta los dientes, aísla los ápices caulinares y los
inocula en el medio basal B5 suplementado con 0.5 mg*l-1 de 2-iP y 1 mg*l-1 de ANA,
obteniendo 5.8 brotes por explante como promedio en un mes, mientras que con 0.5 mg*l-1 de
6-BAP sólo obtuvo 2 a 4 brotes, y en medio basal MS con las mismas concentraciones de
ANA y 2-iP obtuvo solamente 2.6 brotes / explante. Al transferir las plántulas al medio B5
con 0.2 mg*l-1 de ANA como suplemento hormonal logró el 100 % de enraizamiento.
Posteriormente WALKEY et al. (1987) obtiene plantas de Allium sativum libres de virus por
cultivo de meristemos. Los explantes entre 0.5 – 0.8 mm crecieron mejor en el medio B5 que
en el MS cuando el mismo se enriqueció con AIA (2.5 mg*l-1) y 6-BAP (4-8 mg*l-1) o KIN
(4-8 mg*l-1), siendo superior la combinación AIA y KIN, que formó entre 4 – 5 brotes por
explante.
Uno de los primeros informes relacionados con la microbulbificación sincronizada in vitro en
ajos de sanidad controlada fue realizado por RACCA (1989) citado por IZQUIERDO y
QUIONES (2001). Este autor utiliza como medio basal MS a la mitad suplementado con 0.3
ppm de ANA y 3 ppm de 2-ip, pero las pérdidas fueron superiores al 70 % cuando se
transfirieron las plántulas propagadas in vitro directamente a macetas. Este inconveniente lo
solucionó transfiriendo las vitroplantas después de la fase de multiplicación a un medio MS
diluido a la mitad sin suplemento de auxinas ni citoquininas, un volumen de medio de cultivo
de 25 cm3/explante, días largos (16 horas luz) y cálidos (22°C). A los 90 días obtuvo un 62 %
de bulbificación con 60 g*l-1 de sacarosa. Estos microbulbillos alcanzan una sobrevivencia
superior al 85 % en campo, siempre y cuando su tamaño sea superior a 3 mm de diámetro.
SUN YOO, PIKE y COBB (1990), trabajan con escamas sacadas de bulbos dormantes. En
este ensayo se compara el uso de distintos reguladores de crecimiento: ácido indolacético,
ácido giberélico, ácido abscísico y kinetina, sobre el crecimiento de brotes y hojas en los
explantes. Se indica que la mejor respuesta se observó con el uso de kinetina, incorporado al
medio, que correspondía al medio basal propuesto por MURASHIGE y SKOOG (1962), 7
g*l-1 de agar y 10 uM de kinetina.
CAPOTE (1993), establece una metodología para la micropropagación in vitro de genotipos
cubanos de cebolla en la que utiliza yemas. Estas yemas, luego de ser desinfectadas, fueron
inoculadas en un medio MS reducido a la mitad, que se suplementó con 0.5 mg*l-1 de ANA y
4 mg*l-1 de 6-BAP. La inducción de brotes fue de 12.8 brotes por explante. Los brotes
enraizaron en el medio basal antes expuesto, enriquecido con 0.5 mg*l-1 de ANA.
Además, es importante señalar, el estudio acerca de la influencia del ácido jasmónico (AJ), en
la formación de brotes y bulbos en cultivo in vitro de Allium sativum, donde el medio fue
suplementado con éste como regulador de crecimiento, junto a N6-isopentenil-adenina (2iP)
y se obtuvo 18 brotes/explante y un 55.8 % de bulbificación in vitro (RAVNIKAR et al,
1993).
Finalmente en ajo, IZQUIERDO (2000), estudió algunos clones en cada fase para la
micropropagación del cultivo y obtuvo como resultado que los explantes se establecen mejor
y en menor tiempo en un medio MS basal suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 0.1 mg*l-1
de KIN: se obtienen entre 4.9 y 7.3 brotes por explante. El mayor porcentaje de bulbificación
in vitro se induce en el medio basal antes citado cuando se le adicionan 75 g*l-1 de sacarosa.
Por otra parte, en tulipán, se realizó una experiencia de cultivo in vitro, donde el material
utilizado como explante, correspondió al tallo floral, que fue cortado en rebanadas, y puestas
tanto en medio sólido como en medio líquido. El problema que aquí se presenta, es que
muchos de los brotes originados no tienen un punto de crecimiento. El porcentaje de brotes
sin punto de crecimiento puede llegar a ser de mas de un 95 %. Sin embargo, por medio del
uso de ácido jasmónico (AJ), el número de brotes con un punto de crecimiento puede ser
incrementado considerablemente, desde un 5 a 10 % hasta más de un 40 % e incluso
pudiendo alcanzar un 90 % (LANGENS, 2001).
En otras especies como orquídeas, específicamente en Diuris longifolia R. Br., se ha
investigado la micropropagación a partir de inflorescencias. En este caso se utilizan las
yemas de varas florecidas, y las plántulas resultantes tienen las mismas características
genéticas que su progenitor. Los explantes son desinfectados durante 5 a 10 minutos en
hipoclorito de sodio al 1 % con adición de 0.05 % de Tween 80, y lavados tres veces por 5 a
10 minutos en agua destilada esteril. Luego son puestos en el medio Vacin y Went (1949)
modificado, con adición de N6-benciladenina (BA). Los protocormos se forman a los 49 días
después de haber ubicado los explantes en dicho medio (COLLINS y DIXON, 1992).
CUADRO 1. Resumen experiencias de micropropagación en ajo, cebolla, tulipán y orquídea.
AUTOR ESPECIE MEDIO
ESTABLECIMIENTO
OBSERVACIONES
SUN YOO,
PIKE and
COBB (1990)
Cebolla MS + 30 g*l-1sucrosa + 7
g*l-1 agar + 10 um*l-1
Kinetina
Respuesta superior en relación con
otros reguladores de crecimiento
utilizados (IAA, GA, ABA).
CAPOTE
(1993)
Cebolla MS/2 + 0.5 mg*l-1 ANA
+ 4 mg*l-1 6 BAP
Medio enraizamiento: MS + 0.5
mg*l-1 ANA.
B5 + 0.5 mg*l-1 2-iP + 1
mg*l-1 ANA
5.8 brotes / explante (1 mes)
B5 + 0.5 mg*l-1 6 BAP 2 – 4 brotes / explante (1 mes)
BHOJWANI
(1980)
Ajo
MS + 0.5 mg*l-1 2-iP + 1
mg*l-1 ANA
2.6 brotes / explante (1 mes)
WALKEY et
al. (1987)
Ajo B5 + 2.5 mg*l-1 AIA + 4
– 8 mg*l-1 Kinetina
4 – 5 brotes / explante
RACCA*
(1989)
Ajo MS/2 + 0.3 ppm ANA +
3 ppm 2-iP
Con medio de engorde MS/2 + 60
g*l-1 sacarosa se obtiene 62% de
bulbificación en 90 días.
RAVNICAR
et al. (1993)
Ajo MS + AJ + 2-ip 18 brotes / explante y 55.8 % de
bulbificación in vitro.
LANGENS
(2001)
Tulipán Medio enriquecido con
AJ.
Se observó un aumento de hasta un
90 % en la obtención de brotes con
punto de crecimiento.
COLLINS y
DIXON
(1992)
Orquídea Medio Vacin y Went
(1949) modificado + BA
Se obtienen protocormos a los 49
días del establecimiento.
IZQUIERDO
(2000)
Ajo MS + 0.1 mg*l-1 ANA +
0.1 mg*l-1 Kin
4.9 – 7.3 brotes / explante
* : Citado por IZQUIERDO y QUIONES, 2003.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación correspondiente a la propagación in vitro de Leucocoryne sp., se llevó a
cabo en el Laboratorio de Propagación “Profesor Gregorio Rosenberg” de la Facultad de
Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en la calle San
Francisco s/n, La Palma, Quillota, durante el periodo comprendido entre marzo del 2003 y
marzo del 2004.
La investigación constó de cinco ensayos. Como material vegetal se utilizó bulbos de
Leucocoryne spp. cv. Caravelle y Sirius, la porción basal, media y apical de hojas y semillas.
Los medios fueron elegidos respecto de la literatura estudiada, eligiendo como medio basal el
MS, y variando las concentraciones de reguladores de crecimiento, entre las mínimas y las
máximas utilizadas por diversos autores.
Para la preparación de medios se adoptó algunas técnicas descritas por PIERIK (1990) y se
realizó siempre con al menos 4 días de anticipación al momento de ser utilizados.
Se preparó el medio MS (Anexo 1), extrayendo cada componente de una solución madre y
complementando con distintos reguladores de crecimiento. Los elementos líquidos se
traspasaron de la solución madre con la ayuda de pipetas a un frasco. Los elementos sólidos
fueron pesados en una balanza electrónica. La solución de dicho frasco, se depositó en una
probeta, y se aforó con agua bidestilada hasta obtener el volumen deseado, traspasándose
luego a una olla o vaso precipitado, el cuál fue puesto en el agitador (Heidolph MR 3001 K),
con el fin de homogenizar la solución, donde se le adicionó el azúcar y se reguló el pH en 5.7
con alícuotas de KOH (1 N) y HCl (1 N).
A continuación, la solución de medio, se calentó en un anafre eléctrico. Al alcanzar los 60°C,
se le adicionó agar de algas marinas y se revolvió hasta disolver, retirando el recipiente de la
fuente de calor al alcanzar los 92 °C (Temperatura de ebullición). Inmediatamente, el medio
fue distribuido en tubos o en frascos, tapándolos, con papel metálico en el caso de los tubos,
o bien, con tapas en el segundo caso. Finalmente los tubos, o frascos, fueron introducidos al
autoclave, donde se mantuvieron por 15 minutos a partir del momento en que se alcanzó 121
°C y 1.5 bar.
La preparación de la cámara de flujo laminar, previo a siembras o repiques, se realizó con una
limpieza del mesón con etanol al 96 %. Los instrumentos como pinzas, portabisturí, papel
absorbente, algodón y papel de aluminio, fueron esterilizados en una estufa de calor seco.
Una vez puestos todos estos instrumentos en el mesón, junto al mechero (metanol) y el
alcohol, se mantuvo la sala con luz ultravioleta (UV) por al menos 15 minutos.
3.1. Ensayo 1. Efecto de tres medios de cultivo y uso de mitad de bulbo obtenido por corte
longitudinal como explante, sobre el comportamiento y formación de bulbillos en las
etapas de establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo in vitro:
Este ensayo se inició el 24 de junio del 2003.
Los tratamientos (T) correspondieron a los tres medios de cultivo a utilizar y se evaluó la
contaminación traducida en sobrevivencia, el número de bulbillos generados por explante y el
diámetro final de éstos. La formación o no de tejido calloso se evaluó sólo de manera
descriptiva.
CUADRO 2. Definición de los tratamientos en ensayo 1.
N° DE
TRATAMIENTO
TRATAMIENTO
T 1 Medio 1 (M1)
T 2 Medio 2 (M2)
T 3 Medio 3 (M3)
El experimento se condujo por un Diseño Completamente al Azar (DCA) con un 5 % de
significancia, donde los resultados de contaminación traducidos en sobrevivencia, medida en
porcentaje en cada tratamiento, se analizó mediante test de comparación de medias Student
Newman Keuls, ya que dicho test, permite la comparación entre distintos tratamientos.
En este caso, inicialmente la unidad experimental fue un grupo de diez tubos, y se realizaron
cuatro repeticiones por tratamiento. Esto, en el caso de la variable contaminación, ya que
posteriormente, se determinó que cada explante fuese una unidad experimental, debido a los
altos niveles de contaminación obtenidos.
3.1.1. Preparación de medios
La preparación de los tres medios se realizó cuatro días antes de la siembra, como se
describió anteriormente. En este ensayo se mantuvo constante la concentración de ANA y se
adicionó en distintas concentraciones KIN, como se muestra en el Cuadro 3. Los tres medios
se prepararon con 30 g*l-1de sacarosa y 7 g*l-1 agar.
CUADRO 3. Composición de medios de cultivo de establecimiento ensayo1.
MEDIO
NUTRITIVO
CONSTITUCIÓN
Medio 1 (M1) MS (Anexo 1) + 0.1 mg/L de ANA + 4 mg/L de KIN
Medio 2 (M2) MS (Anexo 1) + 0.1 mg/L de ANA + 2 mg/L de KIN
Medio 3 (M3) MS (Anexo 1) + 0.1 mg/L de ANA + 0.1 mg/L de KIN
3.1.2. Preparación material vegetal
El material utilizado, correspondió a bulbos de Leucocoryne cv. Caravelle, traídos desde
Holanda en enero del año 2002, iniciándose su almacenaje en cámara a 20°C en octubre del
mismo año, vale decir, estos bulbos, se mantuvieron en cámara por ocho meses para luego ser
utilizados en este ensayo.
Al momento de la siembra in vitro, se podían observar lesiones de color café claro hendidas
en la catáfila carnosa más externa, lo que en ajo es evidencia de ataque fungoso,
característico de Penicillium spp.según lo descrito por APABLAZA (2000).
3.1.3. Protocolo desinfección
Como la búsqueda de un protocolo de desinfección no era el objetivo de esta investigación,
ésta se basó en trabajos exitosos realizados en ajo (Allium sativum), por el investigador,
RACCA (1989), modificándolo en algunos aspectos según la respuesta obtenida en un pre-
ensayo.
1. Los bulbos fueron limpiados, sacándoles la catáfila externa seca y lavados en agua
corriente. En este proceso, para asegurar una limpieza óptima, los bulbos fueron
cepillados y se les adicionó algunas gotas de Tween 20.
2. Una vez lavados, se les extrajo las catáfilas carnosas más externas, teniendo el cuidado de
no desprender el disco basal.
3. Posteriormente, los bulbos enteros, fueron depositados en un matraz de 250 ml y
sumergidos durante 15 minutos en una solución de Captan: Benomilo de 1.8 g*l-1 de cada
uno de estos fungicidas, adicionadas dos gotas de Tween 20, surfactante que ayudó a un
mejor contacto entre el fungicida y el explante.
4. Luego, fueron sumergidos durante 30 segundos en etanol al 70 %.
5. Por último fueron sumergidos por 15 minutos en cloruro de sodio al 1 %, preparado con
agua destilada, para finalmente, lavarlos tres veces con agua destilada estéril, al interior
de la cámara de flujo laminar.
3.1.4. Protocolo de siembra
Los bulbos extraídos desde el matraz, fueron cortados longitudinalmente, con bisturí
(Número 11) sobre una placa y luego puestos sobre papel absorbente, para retirar
cualquier exceso de agua.
Luego cada explante (mitad de bulbo), fue introducido en un tubo que contenía 7 cc de
medio, con una pinza, depositándolo sobre el agar con la zona de corte hacia abajo, y
presionando levemente. Durante este paso, se tuvo la precaución de que la boca del tubo
mirara siempre hacia el fondo de la cámara, de manera que recibiera solo aire purificado,
con el fin de aminorar la posibilidad de contaminación.
Posteriormente, cada tubo fue identificado con el medio que contenía, y el número de
repetición correspondiente, para luego ser llevados a cámara de crecimiento, con una
temperatura promedio de 23 °C y un periodo de luz de 16 horas, con una intensidad
lumínica de 2000 lux.
Luego, y con una periodicidad entre 25 y 30 días, se realizó un subcultivo a medio fresco. En
el caso en que el tamaño del bulbillo era menor a 2 mm de diámetro se repicó al mismo
medio en el que el explante se había establecido. Al contrario, si el bulbillo era mayor a 2
mm de diámetro se repicó a medio de engorde.
El medio de engorde utilizado corresponde al de bulbificación de Lilium, siendo el medio
basal el MS, adicionado con 60 g*l-1 de sacarosa (Anexo 2) y 6.5 g*l-1 de agar, distribuido en
frascos de 6 cm de diámetro por 10 cm de alto (30 cc/frasco).
Con los datos obtenidos en cada frasco, se elaboró una planilla donde se evaluó en primera
instancia, contaminación. Posteriormente, se evaluó el número de bulbos obtenidos por
explante y el diámetro de éstos. Para ello, se utilizó una lupa y un pie de metro digital. La
formación de callo sólo se abordó de manera descriptiva.
FIGURA 2. Explante de Leucocoryne sp. cv. Caravelle sembrado en ensayo 1, Quillota 2003.
3.2. Ensayo 2. Efecto de dos tipos de cortes en bulbos y dos cultivares, sobre el
comportamiento en la etapa de establecimiento de cultivo in vitro:
Este ensayo se inició el 31 de octubre del 2003.
Los factores a evaluar fueron el tipo de corte (rebanada v/s scoring) y dos cultivares
(Caravelle y Sirius), obteniéndose 4 tratamientos (Cuadro 4). Debido al alto porcentaje de
contaminación obtenido en este ensayo, sólo se evaluó la contaminación traducida en
sobrevivencia.
CUADRO 4. Definición tratamientos ensayo 2.
N° DE
TRATAMIENTO
TRATAMIENTO
T 1 Leucocoryne spp. cv. Caravelle y corte rebanada. (Car.+Reb.)
T 2 Leucocoryne spp. cv. Caravelle y “scoring”. (Car.+Scor.)
T 3 Leucocoryne spp. cv. Sirius y corte rebanada. (Sir.+Reb.)
T 4 Leucocoryne spp. cv. Sirius y “scoring”. (Sir.+Scor.)
El medio utilizado fue un medio basal MS enriquecido con Acido Jasmónico y Kinetina, y
fue llamado Medio 4.
El experimento se condujo por un Diseño Completamente al Azar (DCA) con un 5 % de
significancia, con arreglo factorial de 2 x 2, donde los resultados de contaminación traducidos
en sobrevivencia, medida en porcentaje en cada tratamiento, se analizó mediante test de
comparación de medias Student Newman Keuls, ya que dicho test, permite la comparación
entre distintos tratamientos.
En este caso, un grupo de cinco explantes fue una unidad experimental.
3.2.1. Preparación de medios
La preparación de medios se realizó de igual forma que en el ensayo 1, variando la
composición de los reguladores de crecimiento, que en este caso fue Kinetina y Acido
Jasmónico (AJ), y la concentración de agar que fue de 6.5 g*l-1.
CUADRO 5. Composición de medios de cultivo de establecimiento ensayo2.
MEDIO
NUTRITIVO
CONSTITUCIÓN
Medio 4 (M4) MS (Anexo 1) + 0.01 mg*l-1 de AJ + 4 mg*l-1 de KIN
El medio fue distribuido en frascos medianos de 5 cm de diámetro por 9 cm de alto,
depositando 30 cc en cada uno.
3.2.2. Preparación material vegetal
El material utilizado, correspondió al mismo del ensayo 1, además de Leucocoryne cv. Sirius,
cuyos bulbos se mantuvieron bajo las mismas condiciones de almacenaje que los del
mencionado ensayo.
Al momento de la siembra in vitro, se podían observar abundantes lesiones de color café en
la catáfila carnosa más externa, lo que en ajo es evidencia de ataque fungoso, característico
de Penicillium spp.según lo descrito por APABLAZA (2000), además de un severo ataque de
chanchito blanco (Pseudococcus sp.).
3.2.3. Protocolo desinfección
En este ensayo se utilizó el mismo protocolo de desinfección utilizado en los bulbos del
ensayo 1, teniendo como precaución mantener separados los dos cultivares, durante todo el
proceso. Para ello se les puso en matraces de 250 ml, identificados con el nombre del cultivar
y el lavado en cámara de flujo, se realizó con agua adicionada con antioxidantes (Ácido
ascórbico y Ácido cítrico, en concentración de 200 g*l-1 cada uno).
3.2.4. Protocolo de siembra
1. De cada matraz se tomó cinco bulbos, los que fueron cortados en rebanadas desde el
disco basal hacia arriba, obteniéndose 25 explantes. Los veinte restantes, del mismo
cultivar, se sembraron enteros previa realización de un corte en cruz (“scoring”) en el
disco basal (20 explantes). Estos cortes fueron realizados con bisturí (Número 11) sobre
una placa y luego puestos sobre papel absorbente, para retirar cualquier exceso de agua.
2. Luego cada explante, fue introducido en un frasco que contenía 30 cc de medio, con una
pinza, depositándolo sobre el agar y presionando levemente. Durante este paso, se tuvo la
precaución de que la boca del tubo mirara siempre hacia el fondo de la cámara, de
manera que recibiera solo aire purificado, con el fin de aminorar la posibilidad de
contaminación.
3. Posteriormente, cada tubo fue identificado con el cultivar, el tipo de corte que contenía, y
el número de repetición correspondiente, para luego ser llevados a cámara de
crecimiento, con una temperatura promedio de 23 °C y un periodo de luz de 16 horas,
con una intensidad lumínica de 2000 lux.
Con una periodicidad entre 25 y 30 días, se realizó un transplante a medio fresco.
Con los datos obtenidos en cada frasco, se elaboró una planilla donde se evaluó
contaminación.
3.3. Ensayo 3. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la hoja, sobre
el comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de establecimiento,
multiplicación y engorde del cultivo in vitro:
Este ensayo se inició el 1 de septiembre del 2003.
Los factores analizados correspondieron a los tres medios de cultivo utilizados en el ensayo 1
(M1, M2 y M3) y las tres zonas de la hoja de donde se extrajo explantes, las que fueron: zona
apical, zona media y zona basal, obteniéndose 9 tratamientos. Se evaluó la contaminación
traducida en sobrevivencia, el número de bulbillos generados por explante y el diámetro final
de éstos. La formación o no de tejido calloso, al igual que en los ensayos 1 y 2, se evaluó de
manera descriptiva.
CUADRO 6. Definición tratamientos ensayo 3.
N° DE
TRATAMIENTO
TRATAMIENTO
T1 M1 a
T2 M1 m
T3 M1 b
T4 M2 a
T5 M2 m
T6 M2 b
T7 M3 a
T8 M3 m
T9 M3 b
Donde : a : Explante tomado de la zona apical de la hoja.
m : Explante tomado de la zona media de la hoja.
b : Explante tomado de la zona basal de la hoja.
El experimento se condujo por un Diseño Completamente al Azar (DCA) con un 5 % de
significancia, con arreglo factorial de 3 x 3, donde la contaminación traducida en
sobrevivencia, medida en porcentaje en cada tratamiento, se analizó mediante test de
comparación de medias Student Newman Keuls, ya que dicho test, permite la comparación
entre distintos tratamientos. La unidad experimental fue un explante
3.3.1. Preparación de medios
Se realizó de la forma descrita en el ensayo 1, utilizándose en este caso tubos, con 7 cc de
medio, y una concentración de agar de 6.8 g*l-1.
3.3.2. Preparación material vegetal
El material utilizado, correspondió a 3 hojas de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Los explantes
fueron tomados de los brotes generados por individuos del ensayo 1, al momento del primer
repique. Las hojas, de 8 cm de longitud aproximadamente, fueron cortadas y sembradas de
inmediato, para evitar su deshidratación.
3.3.3. Protocolo de desinfección
En este ensayo no se realizó desinfección del material, ya que provenía de material sano que
se manipuló al interior de la cámara de flujo laminar.
3.3.4. Protocolo de siembra
1. Cada hoja fue extraída desde el explante a repicar del ensayo 1 y fueron cortados tres
trozos de la porción apical, tres de la porción media y tres de la porción basal, con bisturí
(Número 11).
2. Luego cada explante (trozo de hoja), de longitud de 2 mm aproximadamente, fue
introducido en un tubo que contenía 7 cc de medio, con una pinza, depositándolo sobre el
agar de manera horizontal y presionando levemente. Durante este paso, se tuvo la
precaución de que la boca del tubo mirara siempre hacia el fondo de la cámara, de
manera que recibiera solo aire purificado, con el fin de aminorar la posibilidad de
contaminación.
3. Posteriormente, cada tubo fue identificado con el medio que contenía, y el número de
repetición correspondiente, para luego ser llevados a cámara de crecimiento, con una
temperatura promedio de 23 °C y un periodo de luz de 16 horas, con una intensidad
lumínica de 2000 lux.
Finalmente, y con una periodicidad entre 25 y 30 días, se realizó un repique. En el caso en
que el tamaño del bulbillo era menor a 2 mm de diámetro se repicó al mismo medio en el que
el explante se había establecido. Al contrario, si el bulbillo era mayor a 2 mm de diámetro se
repicó a medio de engorde.
Con los datos obtenidos en cada frasco, se elaboró una planilla donde se evaluó en primera
instancia, contaminación. Posteriormente, se evaluó, la formación de bulbillos (número de
bulbillos obtenidos por explante) y el diámetro de éstos. Para esto, se utilizó una lupa y un pie
de metro digital. La formación de callo, al igual que en los ensayos anteriores, sólo se
describió.
3.4. Ensayo 4. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la hoja,
utilizando material ex vitro, sobre el nivel de contaminación en el establecimiento de los
explantes:
Este ensayo se inició el 12 de diciembre del 2003.
Los factores correspondieron a los cuatro medios de cultivo a utilizar y las tres zonas de la
hoja de donde se extrajo explantes, las que fueron: zona apical, zona media y zona basal,
obteniéndose 12 tratamientos. Se evaluó la contaminación traducida en sobrevivencia, la
formación o no de tejido calloso, el número de bulbillos generados por explante y el peso
final de éstos.
CUADRO 7. Definición tratamientos ensayo 3.
N° DE
TRATAMIENTO
TRATAMIENTO
T1 M1 A
T2 M1 M
T3 M1 B
T4 M2 A
T5 M2 M
T6 M2 B
T7 M3 A
T8 M3 M
T9 M3 B
T10 M4 A
T11 M4 M
T12 M4 B
Donde : A : Explante tomado de la zona apical de la hoja.
M : Explante tomado de la zona media de la hoja.
B : Explante tomado de la zona basal de la hoja.
Los medios fueron los tres utilizados en el ensayo 1 (medio 1, 2 y 3) y el utilizado en el
ensayo 2 (Medio 4).
El experimento se condujo por un Diseño Completamente al Azar (DCA) con un 5 % de
significancia, con arreglo factorial de 3 x 4, donde los resultados de contaminación traducidos
en sobrevivencia, medida en porcentaje en cada tratamiento, se analizó mediante test de
comparación de medias Student Newman Keuls, ya que dicho test, permite la comparación
entre distintos tratamientos. La unidad experimental fue un explante
3.4.1. Preparación de medios
Se realizó de la forma descrita en los ensayos 1 y 2, utilizándose en este caso tubos, con 7 cc
de medio, y una concentración de agar de 6.8 g*l-1.
3.4.2. Preparación material vegetal
El material utilizado, correspondió a 5 hojas de Leucocoryne purpúrea, de aproximadamente
dos meses de edad, cuyas semillas fueron sembradas el 22 de septiembre del 2003, en
sustrato esterilizado y mantenidos bajo sombreadero en la Facultad de Agronomía, localidad
de La Palma.
Las hojas, de 8 cm de longitud aproximadamente, fueron colectadas el mismo día de la
siembra in vitro, pasando no más de cuatro horas desde su recolección hasta su siembra.
3.4.3. Protocolo desinfección
1. Las hojas fueron lavadas, en abundante agua corriente.
2. Una vez lavadas, se les puso en un matraz de 250 ml y fueron sumergidas durante 5
minutos en cloruro de sodio al 1 % adicionado con dos gotas de Tween 20 y con
constante agitación.
3. Finalmente, las hojas fueron lavadas tres veces con agua estéril más antioxidantes, al
interior de la cámara de flujo laminar.
FIGURA 3. Hojas de Leucocoryne purpurea utilizadas como material vegetal en ensayo 4, Quillota 2003.
3.4.4. Protocolo de siembra
1. Cada hoja fue extraída desde el matraz, y puesta en placa Petri que contenía una lámina
de 1 a 2 mm aproximadamente de agua bidestilada estéril con antioxidantes. Una vez
sumergida la hoja en dicha lámina de agua, fueron cortados cuatro trozos de la porción
apical, cuatro de la porción media y cuatro de la porción basal, con bisturí (Número 11).
Cada explante tenía una longitud de 2 mm, para posteriormente ser puestos sobre papel
absorbente, para retirar el exceso de agua.
2. Luego cada explante (trozo de hoja), fue introducido en un tubo que contenía 7 cc de
medio, con una pinza, depositándolo sobre el agar de manera horizontal, y presionando
levemente. Durante este paso, se tuvo la precaución de que la boca del tubo mirara
siempre hacia el fondo de la cámara, de manera que recibiera solo aire purificado, con el
fin de aminorar la posibilidad de contaminación.
3. Posteriormente, cada tubo fue identificado con el medio que contenía, y el número de
repetición correspondiente, para luego ser llevados a cámara, con una temperatura
promedio de 23 °C y un periodo de luz de 16 horas, con una intensidad lumínica de 2000
lux.
Posteriormente, y con una periodicidad entre 25 y 30 días, se realizó un repique a medio
fresco.
Con los datos obtenidos en cada frasco, se elaboró una planilla donde se evaluó
contaminación.
3.5. Ensayo 5. Germinación in vitro: Caracterización de la curva de germinación y
bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea:
Este ensayo se inició el día 12 de diciembre del 2003.
3.5.1. Preparación de medios
El medio nutritivo usado para la germinación de las semillas, fue el medio basal MS diluido a
la mitad, sin adición de vitaminas, ni de sacarosa. Además se utilizó el medio de
bulbificación utilizado en los ensayos anteriores.
3.5.2. Preparación material vegetal
El material utilizado en este ensayo, correspondió a 130 semillas de Leucocoryne purpurea,
cosechadas en noviembre del año 2002, y almacenadas a temperatura ambiente, hasta la
ejecución de este ensayo, de las cuales 115 fueron sembradas en un medio llamado de
germinación y las 15 restantes fueron sembradas directamente en medio enriquecido con
sacarosa (bulbificación).
3.5.3. Protocolo desinfección
Las semillas fueron introducidas a un matraz, donde se les adicionó unas gotas de Tween 20,
y se les sumergió durante 10 minutos en hipoclorito de sodio al 1 %, para luego, ser lavadas
tres veces con agua destilada estéril, al interior de la cámara de flujo laminar.
3.5.4. Protocolo de siembra
Cada semilla fue introducida en un tubo de 2.5 cm de diámetro por 6 cm de altura, que
contenía aproximadamente 7 cc de medio, con todas las medidas que aseguraran una mínima
posibilidad de contaminación.
Posteriormente, y una vez sellados los tubos, fueron llevados a cámara en condiciones de
oscuridad, con temperatura de 10° C. Una vez emitida la radícula, y teniendo esta una
longitud de aproximadamente 2 a 3 mm, fueron trasladados a una cámara de crecimiento, con
una temperatura de 23 °C y con 16 horas de luz, con una intensidad de 2000 lux.
Una vez alcanzado un porcentaje de germinación cercano al 90 %, las plántulas, con un
crecimiento aproximado de 5 cm fueron repicadas a un medio de bulbificación (medio de
engorde utilizado en los ensayos 1, 2 y 3).
El porcentaje de germinación, se midió diariamente y el de bulbificación cada una semana.
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Ensayo 1. Efecto de tres medios de cultivo y uso de mitad de bulbo obtenido por corte
longitudinal como explante, sobre el comportamiento y formación de bulbillos en las
etapas de establecimiento, multiplicación y engorde del cultivo in vitro:
4.1.1 Análisis de la variable contaminación
La gran limitante en el establecimiento in vitro de los explantes en este ensayo, resultó ser la
contaminación fungosa. Esta, fue de fácil determinación, ya que el signo que se presentó,
concordó con lo expuesto por APABLAZA (2000), para el genero Penicillium descrito para
ajo (Allium sativum), ya que en primer lugar se observó micelio de color blanco, que
posteriormente esporuló, mostrando un moho de color verde azulado.
Del análisis de varianza de los porcentajes de contaminación con hongos, se desprende que
no existe efecto de los tratamientos sobre dicha variable. A continuación, en el Cuadro 8 se
presentan los resultados de este análisis.
CUADRO 8. Porcentaje de explantes de Leucocoryne sp. cv. Caravelle, contaminados con
hongo, por tratamiento. Quillota 2003.
Porcentaje de explantes con contaminación fungosa
Tratamiento
Número de
Explantes
sembrados
Día 15
Día 30
Día 45
Día 60
M1 40 55 62.5 62.5 62.5
M2 40 55 60 60 62.5
M3 40 35 37.5 40 42.5
Se realizó cuatro evaluaciones en el tiempo, debido a que se observó que la contaminación
seguía expresándose durante un periodo prolongado. El hecho de que al día 60 siguieran
apareciendo explantes contaminados, podría indicar que el inóculo tuvo su origen en el
explante y no en un error de manipulación.
Cabe señalar, que gran parte del material utilizado, tal como se describió en el capítulo
anterior, presentaba lesiones color café hendidas en la catáfila carnosa más externa, que en
ajo evidencia ataque de Penicillium sp. (APABLAZA, 2000) y en un número importante de
explantes, el crecimiento del micelio tenía en dichas lesiones su punto de partida. En otros
casos, la contaminación partía del disco basal o bien en el agar, alrededor del explante. Esto
contrasta con lo presentado por BRIONES (2003), quien en un trabajo con Leucocoryne
coquimbensis y L. purpurea obtuvo entre un 13 y un 20 % de contaminación por bacterias,
siendo en su caso el ataque fungoso despreciable.
En este ensayo, no se detectó visualmente otro tipo de hongo que contaminara los explantes,
y el ataque bacteriano fue bajo y se presentó con posterioridad a la sexta semana (datos no
presentados).
4.1.1 Análisis de la variable rendimiento y diámetro de bulbillos obtenidos
Esta variable fue medida al final del ensayo.
Para ello, se utilizó los explantes que permanecieron sanos, y considerando que el nivel de
contaminación fue alto, se decidió que cada explante representara una repetición.
En el cuadro siguiente se muestra el rendimiento promedio obtenido en cada uno de los
tratamientos.
CUADRO 9. Efecto de tres medios de cultivo sobre el rendimiento y el diámetro de los
bulbos obtenidos de Leucocoryne sp. cv. Caravelle, Quillota 2003.
Tratamiento
Número de
Explantes
Rendimiento
(N° de bulbillos /
explante)
Diámetro bulbillos
(mm)
M1 8 8.38 6.15
M2 8 17 7.94
M3 8 7 7.89
El análisis de varianza de la variable número de bulbillos obtenidos por explante, arrojó que
no habría efecto de los tratamientos, es decir, los explantes respondieron favorablemente en
los tres medios de cultivo utilizados. Esto es importante de destacar, ya que cabe recordar que
la elección de los medios se realizó sobre la base de trabajos realizados en ajo (Allium
sativum). De lo que se podría inferir, que los medios de cultivo utilizados para dicha especie,
son convenientes para el establecimiento y propagación de Leucocoryne sp.
Así mismo, el análisis estadístico de la variable diámetro de los bulbillos obtenidos, tampoco
arroja diferencias entre los distintos medios, fluctuando entre 6 y 7 mm de diámetro, lo que al
ser relacionado con el peso, los sitúa en un rango apto para florecer en la temporada siguiente
según MANSUR et al. (2002) y OHKAWA (1999), quienes indican que un bulbo con peso
superior a 0.3 gr puede ser catalogado como bulbo floral.
Respecto de la formación de bulbillos, como se puede apreciar en la Figura 4, ésta se
desarrolló de manera muy diversa en los distintos explantes, no mostrando un patrón
uniforme de brotación. En algunos casos los bulbillos se generaron en el disco basal, en otros
en la parte apical del bulbo partido longitudinalmente (explante) así como en otras porciones
del explante. O bien, el bulbillo se formó a partir del engrosamiento de una catáfila interna.
FIGURA 4. Las fotos a, b, c, d, e y f muestran las distintas formas de generación de bulbillos
de Leucocoryne sp. cv. Caravelle, en la etapa de multiplicación del medio 1 (b),
medio 2 (d) y medio 3(a, c, d, f), en el ensayo 1. Quillota 2003.
a b c d e
a b
c d
e f
FIGURA 5. Aspecto de bulbillos, provenientes de explantes de Leucocoryne sp. cv. Caravelle
sembrados en el medio 2, engordando en medio MS suplementado con 60 g*l-1
de sacarosa, en el ensayo 1. Quillota 2003.
FIGURA 6. Aspecto de tejido calloso generado en explantes de Leucocoryne sp. cv.
Caravelle establecidos en medio 3, en el ensayo 1. En la foto c, puede apreciarse
los pelos radiculares que se generaron a partir del callo. Quillota 2003.
a
b
c
En cuanto a la formación de tejido calloso, variable que solo fue abordada de manera
descriptiva, se observó su formación en distintas proporciones dependiendo del medio de
cultivo en el cual se desarrolló el explante. En el medio en que menos se observó fue en el
medio 1 y por el contrario, la mayor cantidad de tejido de callo se observó en el medio 3
(Figura 6). Esto concuerda con lo señalado con DIXON (1994) y JIMENEZ (1998), que ven
favorecida la callogénesis con una relación auxina/citoquinina mas favorable a la primera, ya
que el medio 3 constó de medio MS, suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 0.1 mg*l-1 de
KIN, en contraste con el medio 1 que fue suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 4 mg*l-1 de
KIN, inclinando notablemente la relación a favor de la citoquinina.
4.2. Ensayo 2. Efecto de dos tipos de cortes en bulbos y dos cultivares, sobre el
comportamiento en la etapa de establecimiento de cultivo in vitro:
4.2.1. Análisis de la variable contaminación
De igual forma que en el ensayo 1, el principal problema en el establecimiento de los
explantes, fue la contaminación por hongos. A continuación en el Cuadro 10, se detallan los
resultados obtenidos.
CUADRO 10. Porcentaje de explantes de Leucocoryne sp. cv. Caravelle contaminados con
hongo, por tratamiento. Quillota 2003.
Porcentaje de explantes con contaminación fungosa
Tratamiento
Número de
Explantes
sembrados
Día 20
Día 40
Día 60
Caravelle+ Reb. 25 48 76 96
Caravelle + Scor. 25 48 76 96
Sirius + Reb. 25 40 72 92
Sirius + Scor. 25 48 76 100
FIGURA 7. Signo de la contaminación fungosa provocada por Penicillium sp. en explantes a
partir de bulbos de Leucocoryne sp. cv. Sirius(corte en rebanada), en ensayo 2.
Quillota 2003.
El análisis de varianza de los porcentajes de contaminación, indicó que no existe efecto de los
tratamientos sobre la variable en estudio. El signo, fácilmente visible, al igual que el ensayo
anterior, correspondió a un moho verde azulado, previo crecimiento de micelio blanquecino
(Figura 7).
Es importante destacar, que el estado sanitario de los bulbos utilizados en este ensayo, se
encontraba lejano al óptimo, ya que se observó deshidratación en los bulbos, lesiones café
hendidas en las catáfilas más externas (síntoma de Penicillium sp. en ajo) y ataque severo de
chanchito blanco, al momento de la siembra de explantes, debido a que correspondían a
descarte de bulbos plantados en dicha temporada (2003).
Aún cuando el ataque fungoso fue severo, pasado un periodo prolongado de tiempo (60 días),
siguieron apareciendo explantes contaminados, lo que podría indicar que el inóculo es
endógeno al explante, y la contaminación, en gran parte, no se debería a una manipulación
inadecuada.
Esto, evidenciaría la importancia de lo señalado por MROGINSKI (1991), PIERIK (1990) y
HARTMANN y KESTER (1995), respecto de la sanidad del material a propagar, de manera
de asegurar un buen establecimiento de los explantes.
4.3. Ensayo 3. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la hoja, sobre
el comportamiento y formación de bulbillos en las etapas de establecimiento,
multiplicación y engorde del cultivo in vitro:
4.3.1 Análisis de la variable contaminación
En este ensayo, se pudo observar un bajo porcentaje de contaminación. A continuación, en el
Cuadro 11, se presentan los datos relacionados con esta variable.
CUADRO 11. Porcentaje de contaminación fungosa en explantes provenientes de hoja de
individuos de Leucocoryne sp. cv. Caravelle en etapa de multiplicación in
vitro. Quillota 2003.
Porcentaje de explantes con contaminación fungosa
Tratamiento
Número de
Explantes
sembrados
Día 30
Día 60
Día 90
Día 120
M1 a 3 0 0 0 33.33
M1 m 3 0 0 0 0
M1 b 3 0 0 0 0
M2 a 3 0 0 0 0
M2 m 3 0 33.33 33.33 66.67
M2 b 3 0 0 0 0
M3 a 3 0 0 0 0
M3 m 3 0 0 33.33 33.33
M3 b 3 0 0 33.33 33.33
El análisis de varianza estadístico, indicó que no existiría diferencia significativa entre los
tratamientos, respecto de la variable contaminación.
En este ensayo, a diferencia de los anteriores, los niveles de contaminación son bastante más
bajos y se presentan con posterioridad, a los cincuenta días después de la siembra de los
explantes. Esto puede deberse principalmente a dos aspectos. El primero de ellos es que el
material utilizado provenía de individuos que se mantuvieron sanos durante su etapa de
establecimiento in vitro, en el ensayo 1, y la manipulación de los explantes se realizó siempre
al interior de la cámara de flujo laminar, por lo que la posibilidad de contaminación externa
se minimizó de manera importante. El segundo aspecto, es que como indica ALISTER
(1998), en el caso del cultivo in vitro de Lilium, la mejor respuesta respecto de la
contaminación se obtiene con explantes provenientes de la zona aérea de la planta, ya que
cuando estos provienen de órganos subterráneos, dicho porcentaje aumenta notablemente,
debido al contacto de estos con el suelo y los microorganismos allí existentes.
4.3.1. Análisis de la variable rendimiento y diámetro de bulbillos obtenidos
A partir del análisis de varianza de estas variables, se determinó que existieron diferencias
significativas entre los tratamientos para éstas, como se muestra en el Cuadro 12.
CUADRO 12. Efecto de tres medios de cultivo y distinta zona de origen del explante dentro
de la hoja de Leucocoryne sp. cv. Caravelle, sobre el rendimiento y el
diámetro de los bulbos obtenidos in vitro. Quillota 2003.
Tratamiento
Número de
Explantes
Rendimiento
(N° de bulbillos /
explante)
Diámetro bulbillos
(mm)
M1 a 3 0 b 0 b
M1 m 3 0 b 0 b
M1 b 3 2 a 2.9 a
M2 a 3 0 b 0 b
M2 m 3 0 b 0 b
M2 b 3 0 b 0 b
M3 a 3 0 b 0 b
M3 m 3 0 b 0 b
M3 b 3 0 b 0 b
Letras iguales en las columnas indican que no existe diferencia estadística significativa entre
los tratamientos según el test de Student Newman Keuls, con un 5 % de significancia.
La formación de los bulbillos se observó aproximadamente un mes después de la siembra de
los explantes, por lo que se podría decir que, en general, y bajo las condiciones en las que se
desarrolló este ensayo, ese sería el tiempo suficiente para que ocurra la organogénesis (Figura
8).
FIGURA 8. Aspecto de formación y engorde de bulbillos a partir de explante de hoja de
Leucocoryne sp. cv. Caravelle en ensayo 3, Quillota 2003.
a) Explante con formación de bulbillos, 44 días después de la siembra. b)
Ampliación de a. c) Explante a los 30 días posteriores a la siembra. d) Explante
en etapa de multiplicación. e) Aspecto de un bulbo en medio MS suplementado
con 60 mg*l-1 de sacarosa.
a b
c d
c d
e
Al analizar las variables, se puede advertir que sólo en uno de los tratamientos efectuados, se
obtuvo respuesta, correspondiendo a la utilización del medio 1 y uso de la porción basal de la
hoja. Un aspecto destacable de esta situación, es que con este medio no se observó una
presencia notable de tejido calloso. Se pudo observar la generación de los bulbillos
directamente del trozo de hoja y no de este tipo de tejidos, lo que según MARGARA (1998),
sería una ventaja, ya que cuando se generan plantas a partir de callo, se facilita la aparición de
variantes, sobre todo si se utilizan mezclas complejas de reguladores de crecimiento.
Por otra parte, el diámetro promedio obtenido es de 2.9 mm, esto en 6 meses de cultivo in
vitro.
Respecto a la formación de tejido calloso, ésta fue baja y se pudo observar sólo en explantes
provenientes de la zona basal de la hoja. Esta respuesta, en conjunto con el análisis anterior
hacen pensar en una posible diferencia histológica dentro de la misma hoja, que promueve
distintas respuestas dependiendo de la zona de donde se extrae el explante.
3.6. Ensayo 4. Efecto de tres medios de cultivo y la ubicación del explante en la hoja,
utilizando material ex vitro, sobre el nivel de contaminación en el establecimiento de los
explantes:
4.4.1. Análisis de la variable contaminación
En este ensayo, el análisis de varianza no arrojó diferencias entre los tratamientos, en el caso
de contaminación provocada por hongos. No así en el caso de contaminación provocada por
bacterias, donde sí se mostraron diferencias significativas.
CUADRO 13. Efecto de cuatro medios de cultivo y distinta zona de origen del explante
dentro de la hoja de Leucocoryne purpurea, sobre la contaminación con
hongos. Quillota 2003.
Porcentaje de explantes con contaminación
Provocada por hongos Provocada por bacterias
Tratamiento
Número de
Explantes
sembrados Día 20 Día 40 Día 60 Día 20 Día 40 Día 60
M1 A 4 25 25 25 0 b 25 b 25 b
M1 M 4 0 0 0 0 b 0 c 0 c
M1 B 4 25 25 25 0 b 25 b 25 b
M2 A 4 0 0 0 0 b 25 b 25 b
M2 M 4 25 25 50 0 b 0 c 0 c
M2 B 4 25 25 25 0 b 25 b 25 b
M3 A 4 25 25 50 0 b 25 b 25 b
M3 M 4 0 0 0 0 b 0 c 0 c
M3 B 4 50 50 50 0 b 0 c 0 c
M4 A 4 25 25 25 0 b 25 b 25 b
M4 M 4 25 25 25 0 b 0 c 0 c
M4 B 4 25 25 25 25 a 50 a 75 a
Letras iguales en las columnas indican que no existe diferencia estadística significativa entre
los tratamientos según el test de Student Newman Keuls, con un 5 % de significancia.
En este caso, la contaminación fungosa se presentó desde las primeras semanas después de la
siembra de explantes, manteniéndose relativamente constante, por lo que se podría atribuir a
que el protocolo de desinfección no fue él mas adecuado. Sin embargo, estos niveles de
contaminación son menores a los detectados en el caso de uso de explante proveniente de
bulbo, lo que sin duda corrobora lo concluido por ALISTER (1998) respecto al efecto del
origen del explante sobre la variable contaminación.
En cuanto a la contaminación producida por bacterias, del análisis se desprende que el mayor
porcentaje de contaminación bacteriana, se produce en el tratamiento 12. Esto podría
explicarse por el origen del explante, ya que al ser de la zona basal de la planta, estuvo en
contacto directo con el suelo y sus microorganismos. Esta situación se repite, con menor
incidencia, en los tratamientos donde el explante provenía de la misma zona. En el caso de
los tratamientos donde los explantes provenían de la zona media de la hoja, no hubo
contaminación bacteriana, lo que en concordancia con lo anterior, se debería a que esta
porción se encuentra más distante del suelo, sin tener un contacto directo con él durante el
cultivo ex vitro. Sin embargo, los resultados de los tratamientos 1, 4, 7 y 10 se contradicen
con lo anterior, ya que dichos explantes fueron tomados de la zona apical de la hoja, es decir,
la zona más distante del suelo, y se mantuvo una contaminación bacteriana de un 25 %,
donde bajo lo anteriormente expuesto, no se esperaría detectar contaminación.
3.7. Ensayo 5. Germinación in vitro: Caracterización de la curva de germinación y
bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea:
El porcentaje de germinación fue medido diariamente. Al observar la Figura 9 es posible
apreciar la tendencia en la germinación de Leucocoryne purpurea en el tiempo, en
condiciones de oscuridad y a una temperatura de 10 °C, sembradas en medio de germinación.
En el caso de las semillas sembradas en medio de germinación y mantenidas a una
temperatura de 23 °C, no hubo germinación.
Así mismo, en las semillas sembradas directamente en medio de bulbificación (MS
suplementado con 60 g*l-1 de sacarosa), tampoco se produjo germinación, pero si hubo
imbibición, con un aumento en las dimensiones de las semillas considerable respecto de las
sembradas en medio de geminación. Al realizar un corte transversal a la semilla bajo la lupa,
se pudo notar que el proceso germinativo se encontraba gatillado, ya que se observaba
fácilmente la radícula bien formada (Figura 10 foto f). Esto podría deberse a que la alta
concentración de azúcar actúo de manera tal que lo que se efectuó fue un acondicionamiento
FIGURA 9. Curva de germinación in vitro de Leucocoryne purpurea a 10 °C de temperatura
y condición de oscuridad. Quillota 2003.
0 0 2
6
20
42
50
66
74 76 76 76
82 82
86
90 91
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Día
Porc
enta
je
FIGURA 10. Apectos Leucocoryne purpurea en ensayo 5. Quillota 2003.
a) Material vegetal utilizado en el ensayo. b) Plántula, 6 días post-germinación.
c) Estado de plántula al momento de repique a medio de engorde. d) Plántula
con dos semanas en medio de engorde. e) Comparación entre semilla sembrada
en medio de bulbificación(flecha roja) y semilla sembrada en medio de
germinación (flecha azul). f) Semilla sembrada en medio de bulbificación no
germinada, vista a la lupa.
a
a
a
b
c
d
e f
osmótico, técnica utilizada en la producción de semillas con el fin de gatillar el proceso
germinativo, de manera de uniformar la germinación en condiciones de campo.
Plántulas normales, según BESNIER (1989), son aquellas que tienen un sistema radicular
bien desarrollado, un eje caulinar con hipocotilo o epicotilo bien desarrollado y una yema
terminal, además de dos cotiledones (en el caso de las dicotiledóneas). Por el contrario, el
mismo autor se refiere a plántulas anormales como aquellas que no parecen dar origen a
plantas normales por falta de estructuras esenciales o porque están dañadas, plántulas
deformes o desequilibradas, o con desarrollo débil. En este ensayo el 100 % de las semillas
germinadas dieron origen a plántulas normales.
En el caso de la bulbificación, el cambio a un medio MS suplementado con sacarosa tuvo un
efecto positivo, ya que desde la primera semana se detectó un ensanchamiento en la base del
cuello de las plántulas, en un 34.1 % de los individuos, aumentando de manera gradual hasta
obtener, en cinco semanas, un 62.6 % de las plantas germinadas bulbificadas, tendencia que
puede observarse en la Figura 11.
Finalmente, el diámetro ecuatorial del bulbo, promedio, alcanzado en esas cinco semanas fue
de 2.73 mm (Figura 12). Esto concuerda con los resultados obtenidos por BRIONES (2003),
quien obtuvo un diámetro ecuatorial del bulbo de 2.4 mm en seis semanas, pero con una
mayor concentración de sacarosa (90 – 120 g*l-1 sacarosa). De este último resultado se
desprende que, si bien es cierto el tamaño obtenido no corresponde a un bulbo floral, sí es
posible disminuir de manera importante el tiempo transcurrido desde germinación hasta
bulbificación y posterior receso, durante el primer ciclo de vida de esta especie, ya que
MANSUR et al. (2002) señala que en condiciones naturales este primer ciclo tiene una
duración de alrededor de 100 días.
FIGURA 11. Curva de bulbificación in vitro, Leucocoryne purpurea. Quillota 2003.
34.1
47.3
58.2 61
.5
62.6
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5
Semana
Porc
enta
je
FIGURA 12. Curva de crecimiento promedio de bulbos engordados a partir de semilla de
Leucocoryne purpurea, en condiciones in vitro. Quillota 2003.
1.25
1.73 1.
9
2.2
2.73
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
1 2 3 4 5
Semana
Diá
met
ro e
cuat
oria
l (m
m)
5. CONCLUSIONES
Es posible la obtención de una metodología de propagación in vitro para Leucocoryne spp.
utilizando la técnica de micropropagación, en las etapas de establecimiento, proliferación y
engorde.
Los tres medios de cultivo utilizados (M1, M2 y M3 constituidos por medio MS
suplementado con distintas concentraciones de ANA y KIN) resultaron favorables para el
establecimiento y multiplicación de los explantes, cuando estos fueron trozos de bulbos
(mitad de bulbo). Por el contrario, cuando los explantes provenían de las distintas porciones
de la hoja (apical, media y basal), sólo se observó una respuesta favorable con el medio 1(MS
suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 4 mg*l-1 de KIN).
El origen del explante, determinó fuertemente el nivel de contaminación en la etapa de
establecimiento, siendo éste mayor en explantes provenientes de bulbo. En explantes
provenientes de la parte aérea de la planta (hoja), el nivel de contaminación fue menor.
Respecto del rendimiento obtenido (número de bulbillos por explante) la tasa fue mayor en
explantes provenientes de bulbo. Así también, explantes provenientes de la zona basal de la
hoja, tendrían un mayor potencial para generar bulbillos, en relación con explantes
provenientes de otras porciones de hoja.
La germinación y posterior bulbificación, in vitro, logran acortar de manera importante el
primer ciclo de la planta de Leucocoryne sp., respecto del ciclo natural de individuos de este
género.
6. RESUMEN El género Leucocoryne, endémico de Chile, posee características muy particulares que le aportan un potencial y una proyección importante en el mercado, como flor de corte y / o aplicaciones en paisajismo, y el cultivo in vitro representa una alternativa para la propagación masiva del material vegetal. Es por eso que en el Laboratorio de Propagación de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso se realizó una investigación con el fin de determinar un protocolo de propagación in vitro de Leucocoryne spp. Se logró establecer un protocolo de propagación in vitro, donde se utilizó como material vegetal bulbos de Leucocoryne sp. cultivar Caravelle y Sirius, y hojas de Leucocoryne purpurea, desde donde se extrajo los explantes. En el caso de bulbo, el explante correspondió a la mitad de éste, obtenido mediante un corte longitudinal. Por otro lado, de hoja se extrajo tres tipos de explantes, los que se determinaron, según su ubicación en la hoja, en zona apical, zona media y zona basal. En cuanto a la contaminación esta resultó ser menor en explantes provenientes de hoja, ya que en el uso de trozo de bulbo, la contaminación fungosa fue una limitante importante en el establecimiento de los explantes. Respecto del rendimiento obtenido (Bulbos obtenidos por explante), fue mayor en el caso de trozo de bulbo como explante. Cabe destacar, que cuando se utilizó trozo de hoja como explante, en los únicos que se obtuvo respuesta fue en aquellos provenientes de la zona basal de ésta. Se probó el efecto de distintos medios de cultivo, constituidos por medio MS suplementado con ANA y KIN en distintas concentraciones, y en el caso de explantes provenientes de bulbo, los tres medios utilizados fueron favorables para el establecimiento y proliferación in vitro. En el caso de explantes provenientes de hoja, el único medio donde se observó respuesta fue en el medio 1 (MS suplementado con 0.1 mg*l-1 de ANA y 4 mg*l-1 de KIN). Para la tercera etapa in vitro, llamada de engorde (o bulbificación) se utilizó un medio MS adicionado con 60 g*l-1 de sacarosa. Los calibres obtenidos en el caso de los bulbos provenientes de explantes extraídos de bulbos, los sitúa en calibres de bulbo de tamaño floral. No así los obtenidos de explantes aéreos. Finalmente, se caracterizó la germinación y bulbificación in vitro, de Leucocoryne purpurea, donde se obtuvo un 91 % de germinación, un 100 % de plántulas normales, un 62.6 % de bulbificación y un diámetro ecuatorial del bulbo final de 2.79 mm, promedio. Los dos últimos parámetros, obtenidos en cinco semanas de cultivo en medio de engorde (medio MS adicionado con 60 gr / l de sacarosa), lo que indica que puede acortarse de manera importante el primer ciclo de vida de esta especie, respecto con el ciclo natural desarrollado bajo las condiciones climáticas normales que afectan el territorio donde este género puede encontrarse.
7. ABSTRACT The Chilean endemic genus Leucocoryne has distinctive features that make it interesting for use as a cut flower and as a garden plant, with a great market potential. In vitro techniques could allow mass propagation of select genotypes. In order to develop a protocol for in vitro propagation of this genus, a series of experiments were carried out in the Plant Propagation Laboratory at the Faculty of Agricultural Sciences of the Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. A laboratory protocol for in vitro propagation was developed, obtaining explants from bulb tissue of the Leucocoryne sp. ‘Caravelle’ and ‘Sirius’, as well as leaf tissue from Leucocoryne purpurea. Bulb explants were prepared by lengthwise sectioning of the structure, obtaining two halves. Leaf explants were prepared from the apical, intermediate and basal regions of the leaf. Explant establishment was curtailed by contamination. Fewer losses were oserved when using leaf explants, while bulb explants were severely infected by fungi. With regards to propagation efficiency, defined as the number of bulb obtained from each explant, it was greater when using bulb tissue. Only basal leaf explants were succesful. Several culture media were tested, using an MS salt solution supplemented with NAA and kinetin in several concentrations. Bulb explants showed good results in all of the three culture media tested, used for both for the establishment and in vitro proliferation stages. Leaf explants showed a positive response only when using Medium 1 (MS supplemented with 0.1 mg*l-1 NAA and 4 mg*l-1 kinetin). The third in vitro stege, named enlarging (or bulbing) was done with MS medium suppemented with 60 g*l-1 sucrose. When using bulb explants, the bulbs obtained a size adequate for flowering, while the bulbs derived from leaf explants were smoller. In another experiment, in vitro seed germination was studied in Leucocoryne purpurea. Up to 91% germination was observed, with 100% of normal plants. After five weeks of culture in a bulb-inducing medium (60 g*l-1 sucrose), 62.6% bulbing was observed, with an average bulb equatorial diameter of 2.79 mm. These results suggest that the first growing cycle in this species could be substantially shortened, as compared to its normal cycle in the natural enviroment in which this genus is found.
8. LITERATURA CITADA
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83.
ANEXOS
ANEXO 1. Composición medio nutritivo MURASHIGE y SKOOG, 1962 Código solución
madre Constitución Concentración
solución madre (g/l)
Volumen para preparación de
1 l de medio (ml/l)
Concentración final del medio
(mg/l)
Macroelementos
I NH4NO3 330 5 1650 II KNO3 190 10 1900 III KH2PO4 34 5 170 IV MgSO47H2O 74 5 370 V CaCl22H2O 88 5 440
Microelementos VI KI 0.166 5 0.83
H3PO3 1.24 5 6.2 ZnSO44H2O 2.12 8.6 MnSO44H2O 3.38 22.3
VII CuSO45H2O 0.01 2.5 0.025 VIII Na2MoO42H2O 0.05 5 0.25 IX CoCl26H2O 0.01 2.5 0.025
X Na2EDTA 7.46 5 37.3 FeSO47H2O 5.56 27.8
Vitaminas XI Tiamina HCl 0.02 0.5 0.1 XII Piridoxina 0.1 2.5 0.5 XIII Ác. Nicotínico 0.1 2.5 0.5
Sacarosa: 30 g*l-1 de medio
ANEXO 2. Composición medio nutritivo MURASHIGE y SKOOG (1962), modificado para
bulbificación.
Código solución
madre Constitución Concentración
solución madre (g/l)
Volumen para preparación de
1 l de medio (ml/l)
Concentración final del medio
(mg/l)
Macroelementos
I NH4NO3 330 5 1650 II KNO3 190 10 1900 III KH2PO4 34 5 170 IV MgSO47H2O 74 5 370 V CaCl22H2O 88 5 440
Microelementos VI KI 0.166 5 0.83
H3PO3 1.24 5 6.2 ZnSO44H2O 2.12 8.6 MnSO44H2O 3.38 22.3
VII CuSO45H2O 0.01 2.5 0.025 VIII Na2MoO42H2O 0.05 5 0.25 IX CoCl26H2O 0.01 2.5 0.025
X Na2EDTA 7.46 5 37.3 FeSO47H2O 5.56 27.8
Vitaminas XI Tiamina HCl 0.02 0.5 0.1 XII Piridoxina 0.1 0.5 XIII Ác. Nicotínico 0.1 0.5
Sacarosa: 60 g*l-1 de medio
ANEXO 3. Rendimiento obtenido en ensayo 1, a partir de explantes de bulbos de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Quillota 2003.
Repetición Número de bulbillos / explante
Medio 1 Medio 2 Medio 3 1 16 27 21 2 2 60 13 3 5 12 1 4 7 7 12 5 15 9 3 6 18 18 1 7 3 2 2 8 1 1 3
ANEXO 4. Diámetro ecuatorial de bulbos obtenidos en ensayo 1, a partir de explantes de bulbos de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Quillota 2003.
Repetición Diámetro ecuatorial de bulbo (mm)
Medio 1 Medio 2 Medio 3 1 5.33 6.45 5.07 2 7.86 5.99 5.83 3 4.60 5.12 14.38 4 5.94 7.33 6.08 5 6.18 6.71 6.27 6 5.95 5.56 14.27 7 3.10 10.18 5.32 8 10.21 16.19 5.93
ANEXO 5. Rendimiento ensayo 3, a partir de explantes de hojas de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Quillota 2003.
Tratamiento Número de bulbillos / explante
Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 1 0 0 0 2 0 0 0 3 4 2 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 7 0 0 0 8 0 0 0 9 0 0 0
ANEXO 6. Diámetro ecuatorial de bulbos obtenidos en ensayo 3, a partir de explantes de hoja de Leucocoryne sp. cv. Caravelle. Quillota 2003.
Tratamiento Diámetro ecuatorial de bulbo (mm)
Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 1 0 0 0 2 0 0 0 3 5.16 3.55 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 7 0 0 0 8 0 0 0 9 0 0 0