pore-forming toxinsforming toxins - bio.ijs.sibio.ijs.si/~krizaj/group/predavanja 2010/toksini, ki...

TOKSINI, KI TVORIJO POREPORE FORMING TOXINSPORE-FORMING TOXINS

VSEBINAKAJ so toksini, ki tvorijo pore

VSEBINA

KAKO tvorijo poreNekateri predstavnikiKAKO študiramo tvorbo pore

V č k t l l k j

KAKO študiramo tvorbo pore(površinska plazmonska

resonanca)Več kot le luknje....

Prof dr Gregor AnderluhProf. dr. Gregor AnderluhOddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani

[email protected]

CITOLITIČNI PROTEINI

1. TOKSINI, KI TVORIJO PORE- v membrani tvorijo pore prepustne z različne ione ali majhne molekule- premer pore 1-15 nm, sestavljena iz 1-40 monomerovbakterijski (kolicini) antibakterijski peptidi toksini ožigalkarjevbakterijski (kolicini), antibakterijski peptidi, toksini ožigalkarjev,peptidi žuželk

2. CITOLITIČNI ENCIMIEncimi, ki direktno poškodujejo membrane tako, da razgradijo lipidnemolekulefosfolipaze A2 (PLA2)- tudi drugi učinki!, -toksin (sfingomielinaza C) iz Staphylococcus aureus -toksin (lecitinaza fosfolipaza C) iz ClostridiumStaphylococcus aureus, -toksin (lecitinaza, fosfolipaza C) iz Clostridiumperfringens...

3. TOKSINI Z MEHANIZMOM DELOVANJA PODOBNIM DETERGENTSKEMUAmfifilne molekule, ki se kopičijo v membrani na meji s polarno vodnofazo. Saponini

4. TOKSINI Z NEZNANIM MEHANIZMOM DELOVANJAKardiotoksini (ki so nevrotoksini), a tudi hemolitični!

http://tcdb.ucsd.edu/tcdb/

Saier Jr, MH (2000) A Functional-phylogenetic Classification System for Transmembrane Solute TransportersTransmembrane Solute Transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: pp. 354

Protein

Vir Velikost n r Funkcija Receptor Podobni toksini

VIRUSNI hemaglutinin

virus influence 3 fuzija z membranami

BAKTERIJSKI gramicidin

Bacillus brevis 2 kDa 2 0.3 nm antibiotik

-toxin Staphylococcus 3 kDa 6 2 nm patogeneza streptolizin S toxin Staphylococcus aureus

3 kDa 6 2 nm patogeneza streptolizin S

kolicin Ia Escherichia coli 69 kDa 1 0.9 nm antibiotik proteini bakt. zunanje mem.

družina kolicinov npr. Ia, Ib, A, E

aerolizin Aeromonas hydrophila

52 kDa 7 4 nm patogeneza glikoprotein

-toxin

Staphylococcus aureus

33.4 kDa 7 1-2 nm patogeneza -hemolizin, leukocidin

perfringolizin O Clostridium perfringens

53 kDa do 50 do 30 nm patogeneza holesterol tiolno aktivirajoči toksinip f g

hemolizin A Escherichia coli

110 kDa 1 1-1.5 nm patogeneza RTX toksini

-endotoksin Bacillus thuringiensis

29 kDa 4-6 0.5-1 nm patogeneza, insekticiden

glikoprotein cyt, cry družine endotoksinov

diphtheria toksin Corynebacterium diphtheriae

59 kDa 1 1.8 nm prenos proteinov preko membran

heparin vezavni rec.

protektivni antigen Bacillus anthracis 63 kDa 7 1.2 nm prenos proteinov preko membran

spec. receptor jota toksin (C.perfringens)

GLIVNI K1 kill t i S h 12 kD + tibi tik l k lič d ži killK1 killer toxin

Saccharomyces cerevisiae

12 kDa+10 kDa

antibiotik glukan celične stene kvasovk

družina killer toksinov kvasovk

flamutoksin

Flammulina velutipes

31 kDa 6 4-5 nm

RASTLINSKI zeamatin

Zea mays 22 kDa obramba PR-5 proteini

enterolobin

Enterolobium contortisiliquum

54 kDa obramba

ŽIVALSKIŽIVALSKI amebaporin Entamoeba

histolytica 8 kDa 2 nm obramba,

patogeneza NK lizini

TC-TOX

Trypanosoma cruzi

75 kDa patogeneza C9 komplementa, perforin

Tethya hemolizin Tethya lyncurium (spužva)

21 kDa 2-3 nm

ekvinatoksin II Actinia equina 20 kDa 3-4 2 nm obramba, plenjenje

sfingomielin citolizini morskih vetrnic

karibdotoksin Carybdea 107 kDa 0.8-1 nm obrambakaribdotoksin Carybdea marsupialis

107 kDa 0.8 1 nm obramba

eisenaporin Eisenia fetida (deževnik)

42 kDa 6 3 nm obramba sfingomielin

ektatomin Ectatomma tuberculatum

7.9 kDa 2 obramba, napad

mellitin Apis melifera (čebela)

3 kDa 10-15 2.5-3 nm obramba magainin, cekropin

stonustoksin Synanceja horrida (“stone-fish”)

148 kDa 3 nm obramba ( )

perforin Homo sapiens

70 kDa > 20 20 nm obramba C9 komplementa, TC-TOX

Bcl-2 Homo sapiens

30 kDa 2 anti-apoptozni protein

anti-apoptozni proteini

NK-lizin Homo sapiens

10 kDa 1 obramba amebaporin, saposini

defenzini

Homo sapiens 4 kDa 6 2 nm obramba antibakterijski

Protein

-toxin

12 kDa+10 kDa

flamutoksin

31 kDa 6 4-5 nm

RASTLINSKI zeamatin

enterolobin

54 kDa obramba

TC-TOX

Trypanosoma cruzi

21 kDa 2-3 nm

Bcl-2 Homo sapiens

defenzini

Protein

-toxin

12 kDa+10 kDa

flamutoksin

31 kDa 6 4-5 nm

RASTLINSKI zeamatin

enterolobin

54 kDa obramba

TC-TOX

Trypanosoma cruzi

21 kDa 2-3 nm

Bcl-2 Homo sapiens

defenzini

Protein

-toxin

12 kDa+10 kDa

flamutoksin

31 kDa 6 4-5 nm

RASTLINSKI zeamatin

enterolobin

54 kDa obramba

TC-TOX

Trypanosoma cruzi

21 kDa 2-3 nm

Bcl-2 Homo sapiens

defenzini

Protein

-toxin

12 kDa+10 kDa

flamutoksin

31 kDa 6 4-5 nm

RASTLINSKI zeamatin

enterolobin

54 kDa obramba

TC-TOX

Trypanosoma cruzi

21 kDa 2-3 nm

Bcl-2 Homo sapiens

defenzini

Protein

-toxin

12 kDa+10 kDa

flamutoksin

31 kDa 6 4-5 nm

RASTLINSKI zeamatin

enterolobin

54 kDa obramba

TC-TOX

Trypanosoma cruzi

21 kDa 2-3 nm

Bcl-2 Homo sapiens

defenzini

Protein

-toxin

12 kDa+10 kDa

flamutoksin

31 kDa 6 4-5 nm

RASTLINSKI zeamatin

enterolobin

54 kDa obramba

TC-TOX

Trypanosoma cruzi

21 kDa 2-3 nm

Bcl-2 Homo sapiens

defenzini

TOKSIČNI EFEKTI Toksični efekti so posledica prehajanjasnovi skozi pore:snovi skozi pore:IoniManjše snovi (sladkorji, nukleotidi, ATP)Proteini

KoncVdor Ca2+ sekundarni prenašalec

Konc. agregacija trombocitovsproščanje citokinov(interlevkin 2, TNF) iz limfocitov septični šok

Porušitev transmembranskegapotenciala

potencialakolicini

Liza celic zaradi koloidno-osmotskega šoka

hemoliza (=liza eritrocitov)

Gouaux, E (1997) Channel-forming toxins: tales of transformation. Curr Opin Struct Biol. 7(4): pp. 566. Review.

Dober model za študij:Dober model za študij:

Interakcij protein-membranaj pInterakcij protein-proteinOligomerizacijeVgradnje v membraneZvitja proteinov

-barrel toxins -helical toxins

Cholesterol DependantCytolysins from G+ bacteriaP f i l i OPerfringolysin O

Colicins from Escherichia coliColicin N Equinatoxin

Actinoporins

Insecticidal endotoxinsFrom BacillusLeukocidins family From Bacillus thuringiensis

Leukocidins familyfrom S. aureus-toxin

Anderluh G, Lakey JH (2008) Disparate proteins use similar architectures to damage membranes. Trends Biochem Sci. 10: 482-490.

Toksini v vodni raztopini

V bVezava na membrano (receptor)

OligomerizacijaOligomerizacija

Insercija v membrano

T orba poreTvorba pore

-toxin iz S. aureusLeukocidini iz S. aureus

(HlgB, LukF-PV)

Ohranjenost domen, ki omogočajo vezavo na membrane in tvorbo pore

Anderluh G, Lakey JH (2008) Disparate proteins use similar architectures to damage membranes. Trends Biochem Sci. 10: 482-490.

NEKATERI PREDSTAVNIKI

•kolicini•melitin, ekvinatoksin

•od holesterola odvisni citolizini•-toksin

ALFA TOKSIN iz Staphylococcus aureus

-toxin iz S. aureusLeukocidini iz S. aureus

(HlgB, LukF-PV)

Song L, et al. (1996) Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science. 274(5294):pp. 1859-66.

(HlgB, LukF PV)

Branton D et al. (2008) Approaches to nanopore sequencing. Nature Biotechnology 26, 1146 – 1153.

Sanderson K (2008) Personal genomes: Standard and pores. Nature 456, 23-25.

Wikipedia Single‐molecule studiesRac‐GFP trafficking along filopodium of Xenopus cell

PtK1 kangaroo kidneyPtK1 kangaroo kidney epithelial cells expressing GFP‐vinculin

widefield TIRF Nikon microscopy

5 mM 1,2‐diphytanoylsn‐glycero‐3‐phosphocholine in hexadecane

A.J. Heron, J.R. Thompson, A.E. Mason, M.I. Wallace, J. Am. Chem. Soc (2007) 129, 16042

50 nl aqueous droplet (size)Alpha Hemolysin S aureus ( 10 pAlpha Hemolysin S. aureus ( 10 p

Advantages1. Hydrogel bilayers are stable and easy to form (HAHAHA...)2. No event is missed3. Agarose provide flat support ideal for imaging4. TIRF gives great contrast

Cyclodextrins heptakis(2,3,6‐tri‐O‐methyl)—cyclodextrin (TRIMEB)

k 105 M 1 1kon 105 M‐1 s‐1

extent of block (95%)

ACTINOPORINS equinatoxin sphingomyelin specific

Melittin GIGAILKVLSTGLPALISWIKRKRQE: . ...:.: : :: . .:::

EqtII GASLSFDILKTVLEALGN-VKRKIAVEqtII GASLSFDILKTVLEALGN VKRKIAV

Anderluh G, Maček P (2002) Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon 40(2): pp. 111.

MELITIN

•Peptid iz čebeljega strupa (tudi magainini,cekropin...). Navadno antibakterijski.

•26 aminokislin

•Amfifilen (amfipatičen)

THE CHOLESTEROL DEPENDANT CYTOLYSINS

Gram+ bacteria

Potent cytolysins forvarious types of cellsyp

471-571 amino acids,40-70% identity

Conserved

TMH1Conservedundecapeptide motif:ECTGLAWEWWR

D4Hotze EM et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 8261-8268

METODE ZA ŠTUDIJ TOKSINOV, KI TVORIJO PORE

Molekularno biološkeProdukcija heterolognih proteinov in mutantProdukcija heterolognih proteinov in mutant

BiofizikalneModelni lipidni sistemi (liposomi)Merjenje prevodnosti planarnih lipidnih membranMerjenje uvedene fluorescenceMerjenje uvedene fluorescence Merjenje vezave na membrane s pomočjo površinskeplazmonske resonance (SPR, BIACORE)

StrukturneDoločevanje 3D strukture kompleksov lipid-protein sDoločevanje 3D strukture kompleksov lipid protein spomočjo NMR in X-ray kristalografije

POVRŠINSKA PLAZMONSKA RESONANCASPR- surface plasmon resonanceSPR- surface plasmon resonance

Kako specifična je interakcijaKako hitra je interakcijaj jKako močna je interakcijaKoliko reaktantov je prisotnihFarmacevtska industrijaFarmacevtska industrijaRaziskaveAnalize

PREDNOSTI PRED OSTALIMI BIOFIZIKALNIMI PRISTOPI•Merjenje molekularnih interakcij brezMerjenje molekularnih interakcij brez označevalcev•Merjenje interakcije v realnem času (“Real-time measurements”))•Neinvazivna tehnika•Majhne količine materiala•Hitrost

SENZORSKI ČIPI

DekstranHidrofilenSkupine za vezavo ligandov

Povezovalni slojZlato 50 nmZa SPR

Steklena ploščicaPodpora, stabilnost

TECHNOLOGY BIACORESPR detection systemS hiSensor chipMicrofluidic system

Ravnotežje R

Regeneracija

ZačetekRegeneracija

SENSORGRAM R

.U.) Ravnotežje

Začetek

R ijČas

Regeneracija

PROTEIN MEMBRANE INTERACTIONS

hybridbilayermembranes

tetheredbilayermembranes

antibodycapture

avidin-biotincapturecapture

lipophilich

DNA captureanchors

2:3 isopropanol:50 mM NaOH (v:v) or0.5 % SDS (m:v) or40 mM octylglucopyranoside

Running buffer140 mM NaOH20 mM Tris-HCl, pH 8.51 mM EDTA1 mM EDTA@ 30 l/min

100 mM NaOH wash BSA (0.1 mg/ml)

equinatoxin

Lipids (0.5-4 mM LUV 10 min @ 1 l/min) up to 11 000 RU

Honing S (2005) Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Regulates Sorting Signal Recognition by the Clathrin-Associated Adaptor Complex AP2.Molecular Cell 18, 519–531.

2440 m

3600 3800 4000 4200Ti ( )

Cooper MA et al. (2000) A Vesicle Capture Sensor Chip for Kinetic Analysis of Interactions ith Membrane

2440 m

Time (s) Interactions with Membrane-Bound Receptors. Analytical Biochemistry 277, 196–205.540 m

100 mM NaOH

0 1 / l BSA buffer LLO 100 mM NaOH

0.1 mg/ml BSA buffer

RULLO 100 mM NaOH

LLO-buffer

LLO on L1 chip

40 mM octylglucopyranoside40 mM octylglucopyranoside

-50 0 50 100 150 200 250 300

-10000 2000 4000 6000 8000 10000 12000

Time s

Leukocidins

1500 A+B

100 mM NaOH 10 mM glycine, pH 2

Res 100 mM NaOH 10 mM glycine, pH 2

A+Bpredicted

2 M NaCl

-100-50 150 350 550 750 950 1150 1350 1550

RU >10000 RU lipids0% CHO

>10000 RU lipids20% CHO

-100-50 0 50 100 150 200 250

>10000 RU lipids35% CHO5-60 nM Listeriolysin

-50 0 50 100 150 200 250

Time s

RU pH8.5 pH7.55-60 nM LLO20% cholesterol30 l/min

p p 30 l/min11000 RU lipids

-50 0 50 100 150 200 250

RUpH6.5 pH5.5

pH6.5 pH5.5

-50 0 50 100 150 200 250

RUcholesterol 7-dehydrocholesterol

-100-50 0 50 100 150 200 250

-sitosterol ergosterol lanosterol

-50 0 50 100 150 200 250

cholesteryl acetate cholestenon

-50 0 50 100 150 200 250

Wild-type (Trp-112)

0 50 100 150 200Time (s)

DOPC/SM 1/1DOPC

54 87 105 107 113 133 137 138EqtII S V S P Y Y Y YStII S V S P Y Y Y Y

0 50 100 150 200

Time (s)

Sagartia S V S P Y Y Y YMagnifical S V S P Y Y Y YPsTX-20A S V S P Y Y Y N

The role of amino acid sideThe role of amino acid side chains in membrane association and dissociation.

Stahelin RV and Cho W (2001) Differential Roles of Ionic, Ali h ti d A ti R id i M b P t iAliphatic, and Aromatic Residues in Membrane-ProteinInteractions: A Surface Plasmon Resonance Study on Phospholipases A2. Biochemistry 40, 4672-4678.

PCSMnormal C

untreate d

sfingom.

normal

normal+G27C-NBD

MCD+G27C-NBD

BSA (0.1 mg/ml)

SMaze+G27C-NBD

100 mM NaOH wash

Ghosts

SMaze G27C NBD

0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200

Time s

0 01 0 1 1

1E-4 1E-3 0.01 0.1 1Concentration (g/ml)

0.01 0.1 1Concentration (g/ml)

Normal-SM

0 100 200 300

Time (s)

pon -SM

0 50 100 150 200 250 300

Time (s)

0 50 100 150 200 250 300

Time (s)

TOKSINI, KI TVORIJO PORE SO:

•Proteini, ki ubijajo celice tako, da tvorijo transmembranske pore

N j i bij j l j j i b bi•Namenjeni ubijanju, plenjenju in obrambi

•Raznolike molekule ki jih druži isti večstopenjskiRaznolike molekule, ki jih druži isti večstopenjski mehanizem delovanja

•Strukturno sestavljeni iz -heliksov ali -ploskev

P t i l b l k l bi t h l iji•Potencialno uporabne molekule v biotehnologiji

UNIVERSITY OF LJUBLJANADepartment of Biology

GBF-Gesellschaft für BiotechnologischeForschungBraunschweig, GermanyNelson Gekara p gy

Ljubljana, Slovenia

Gregor AnderluhKatarina KristanI G i

Sigfried Weiss

Ion GutierrezZdravko PodlesekPeter Maček

INSTITUTE JOŽEF STEFANDepartment of Biochemistryand Molecular BiologyLjubljana, SloveniaAlekos AthanasiadisDušan Turk

C O C Gabriella VieroCENTRO CNRFisica Stati AggregatiPovo (Trento), Italy

Gabriella VieroMauro Dalla SerraGianfranco Menestrina

UNIVERSITY OF NEWCASTLE UPON TYNEMedical School, Department of Biochemistryand GeneticsNewcastle upon Tyne, UK

Qi HongJeremy H. Lakey

pore-forming toxinsforming toxins - bio.ijs.sibio.ijs.si/~krizaj/group/predavanja 2010/toksini, ki...

Documents