POREMEĆAJ KONCENTRACIJE PROTEINA KRVNE PLAZME

Prof. Dr Dragan Gvozdid

2020-21.

Vežba 6.

Sažetak:

1) Osnovna podela proteina plazme prema elektroforetskoj pokretljivosti je: albumini, a, b i g globulini i fibrinogen

2) U kliničkoj praksi se rutinski određuje koncentracija ukupnih proteina i albumina

3) Pad ili porast koncentracije albumina, globulina i fibrinogena može da ukaže na pojedina patološka stanja

4) Elektroforeza proteina se u kliničkoj praksi radi u sklopu dijagnostike poliklonskih i monoklonskih gamapatija i za dijagnostiku inflamacije kod goveda

Proteini krvne plazme:

• Normalna koncentracija proteina u krvnoj plazmi (serumu) domadih životinja i ljudi iznosi u proseku od 60 - 80 g/L (euproteinemija)

• U kliničkoj praksi se svakodnevno određuju ukupni proteini seruma i albumini, dok se koncentracija globulina dobija računski - oduzimanjem koncentracije albumina od koncentracije ukupnih proteina

• Ponekada se pojavi potreba za analizom različitih proteinskih frakcija koje se mogu dobiti primenom elektroforeze

Promene koncentracije proteina krvne plazme/seruma su:

• Hiperproteinemija (povišenje)

• Hipoproteinemija (sniženje)

• Disproteinemija (poremedaj odnosa albumina i globulina)

• Paraproteinemija (pojava stranih proteina u krvi)

Hiperproteinemija:

• Povedanje sinteze albumina preko fizioloških granica do sada nije zabeleženo – ne postoji apsolutna hiperproteinemija usled hiperalbuminemije

• Relativna hiperproteinemija nastaje kod dehidracije, jer životinja gubi tečnost

• Vrlo često životinje koje povradaju, imaju dijareju i ne uzimaju vodu, imaju proteine seruma/plazme na gornjoj ili iznad gornje fiziološke granice

• Odnos albumina i globulina tada nije promenjen, odnosno paralelno raste koncentracija albumina i globulina

Hipoproteinemija

• Kao pojam znači smanjenje koncentracije proteina u krvnoj plazmi

• Može nastati kao posledica podjednakog pada koncentracije albumina i globulina

• Tada nema promene odnosa albumina i globulina

• Do podjednakog gubitka albumina i globulina dolazi u slučaju hemoragije i hronične inflamacije creva sa gubitkom proteina („protein losing enteropathy“, eng. )

Disproteinemija - hipergamaglobulinemija

• Poremedaj kvantitativnog odnosa proteina krvne plazme

• Povedan obim sinteze globulina dovodi do apsolutne hiperglobulinemije

• Hiperglobulinemija nastaje kod akutne i hronične inflamacije i kod postojanja pojedinih vrsta tumora

Akutna i hronična inflamacija

• Kod akutnih inflamacija raste koncentracija proteina akutne faze koji spadaju u a i b globulinsku frakciju

• Kod hroničnih inflamacija raste koncentracija i proteina akutne faze i g globulina, odnosno antitela

• Hipergamaglobulinemija se javlja kod hroničnih zapaljenja kao što su tuberkuloza, lajšmanioza, infektivni peritonitis mačaka, erlihioza i bakterijski endokarditis

Hipoalbuminemija nastaje usled:

• Smanjenog unošenja proteina hranom -gladovanja

• Poremedaja varenja i resorpcije • Smanjene sinteze u jetri • Gubitka proteina putem eksudacije u toku

akutnih zapaljenja (oštedenja kože vedeg stepena, glomerulonefitisa, pleuralnih i peritonealnih efuzija)

• Ubrzanog katabolizma kod infekcija i malignih procesa

Oštedenja jetre i imunodeficijencije!

• Smanjen obim sinteze a i b globulina se može nadi kod teškog oštedenja jetre

• Smanjen obim sinteze g globulina, odnosno antitela, kod urođenih imunodeficijencija kod kojih postoji poremedaj u sazrevanju i aktivaciji B limfocita

Paraproteinemija:

• Kod tumora koji zahvataju B limfocitnu lozu (limfoidna leukemija, limfom, plazmocitom) delije tumora predstavljaju umnožen jedan klon limfocita

• One mogu da proizvode u višku teške ili lake lance imunoglobulina (k i l) ili njihove fragmente koji su svi istovetne građe te se na elektroforezogramu prepoznaju kao vrh sa uzanom bazom na x osi (slika 6.2.C)

Elektroforezogram mačke sa IgG monoklonskom gamopatijom nastalom zbog multiplog mijeloma. Vrh sa

uzanom osnovom je prisutan u γ-regionu (sterlica).

Paraproteini!

• Ovi slobodni laki lanci se nazivaju Bence – Jones-ovi proteini ili paraproteini

• Male su molekulske mase tako da lako prolaze kroz glomerularnu membranu i izlučuju se mokradom (paraproteinuirija) u kojoj se takođe mogu detektovati

METODE ODREĐIVANJA KONCENTRACIJE UKUPNIH PROTEINA

BIURETSKA PROBA – "Gold standard“

Kvantitativna spektrofotometrijska metoda Kolorimetrijska reakcija

Princip reakcije – vezivanje Cu++ jona i amino azota iz peptidne veze proteina

REFRAKTROMETAR

BIURETSKA PROBA

8 ml biuretskog reagensa (vodeni rastvor Na,K-tartarata; CuS04; NaOH)

+ 1.9 ml 0.9% Na Cl (Fiziološki rastvor)

+ 0.1 ml Serum / Plazma

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE FIBRINOGENA

METODA PRECIPITACIJE TOPLOTOM - HEATH PRECIPITATION

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE FIBRINOGENA METODOM PRECIPITACIJE TOPLOTOM

HEATH PRECIPITATION

Robin W Allison. Veterinary Hematology and Clinical Chemistry, Second edition. Mary Anna Thrall, Glade Weiser, Robin W Allison and Terry W Campbell

1. Napuniti dve mikrohematokritske cevčice krvlju uzetoj u epruveti sa EDTA antikoagulansom

2. Centrifugirati u mikrohematokritskoj centrifugi

3. Iz jedne cevčice odliti plazmu i odrediti koncentraciju ukupnih proteina refraktrometrom

4. Drugu mikrohematokritsku cevčicu staviti u zagrejano vodeno kupatilo na 56-580C 3-5 minuta

5. Centrifugirati cevčicu da bi istaložili precipitirani fibrinogen

6. Odrediti koncentraciju proteina u plazmi refraktrometrom

7. Razlika u koncentraciji ukupnih protein između zagrejane i nezagrejane mikrohematokritske cevčice prestavlje koncentraciju fibrinogena

KLINIČKA KORELACIJA

• Opšti podaci o pacijentu: Krava, 4 godine stara. • Anamneza: Ved dve do tri nedelje gubi na težini.

Druge životinje u stadu ne pokazuju znake bolesti. • Klinički pregled: Normalna hidratacija, mršava, T

= 39,3°C, puls = 90/min, respiracija = 35/min. Rektalnom palpacijom utvrđeno da je levi bubreg uvedan, a ultrazvučnim aparatom su uočene ciste ispunjene tečnošdu. Rektalnim pregledom je takođe utvrđeno da je krava steona (oko 70 dana). Urin je bio crven. Escherichia coli je izolovana iz urina.

Laboratorijski nalaz:

Rezultati analize Referentne vrednosti

Hematološki nalaz

Broj eritrocita (x1012/L) 6,4 5-10

Hematokrit (%) 28 24-46

Hemoglobin (g/L) 100 80-150

MCV (fL) 44 40-60

MCHC (g/L) 353 300-360

Proteini plazme (g/L)* 102 65-85

Fibrinogen (g/L) 12 3-7

Protein: fibrinogen odnos 8,5

Leukociti (x109/L) 5,9 4-12

Segmentirani neutrofili 2,5 0,6-4

Mladi neutrofili 0 0-1,2

Limfociti 3,1 2,5-7,5

Monociti 0,17 0,025-0,8

Eozinofili 0 0-2,4

Procena broja trombocita† Adekvatan broj

Biohemijski nalaz‡

Urea (mmol/L) 17 1,4-8,2

Kreatinin (mmol/L) 381 46-122

Elektroforeza proteina seruma

Albumin (g/L) 18 30-42

a-globulin (g/L) 15 7,9-9,3

b-globulin (g/L) 37 8,4-11,6

g-globulini (g/L) 25 18,4-23,5

A: G odnos 0,23 0,8-0,9

Analiza urina

Specifična težina 1,018 1,006-1,35

pH 8,0

Eritrociti +++

Proteini ++++ (>2g/L) * Proteini plazme određeni refraktometrom

† Procena broja trombocita sa krvnog razmaza

‡ Heparinisana plazma

Interpretacija slučaja:

• Koncentracija fibrinogena je povedana. To se dešava ukoliko postoji inflamacija i/ili dehidratacija

• Odnos proteini: fibrinogen je bio 8,5. Kod krava, odnos ukupni proteini: fibrinogen manji od 10 ukazuje na značajno povedanje fibrinogena zbog inflamacije

• Leukogram je bio u okviru referentnih vrednosti. Kod preživara je uobičajeno da iako postoji inflamacija, broj leukocita ostaje u fiziološkim granicama, a osnovna promena je povedanje koncentracije fibrinogena

• Povedanje koncentracije fibrinogena je uobičajeno kod goveda sa bolestima bubrega

Urin!

• Krava je imala azotemiju (povedanje koncentracije uree i kreatinina)

• Mogude je da je azotemija nastala zbog dehidratacije ili zbog poremedaja funkcije bubrega

• Kako je specifična težina urina ukazivala na izostenuriju, i kako je postojala proteinurija i hematurija, a levi bubreg je bio promenjen, može se konstatovati da kod ove životinje postoji poremedaj funkcije bubrega - nefritis

Proteini!

• Hipoalbuminemija može da bude posledica – a) gubitka albumina mokradom i – b) smanjenog stvaranja u hepatocitima zbog konkurentne

hiperglobulinemije.

• Tačan obim proteinurije nije mogao biti ustanovljen zbog istovremenog prisustva hematurije

• Hiperglobulinemiija je nastala zbog povedanja a, b i g proteinske frakcije.

• Povedanje a i b frakcije nastaje zbog pojačane sinteze proteina akutne faze (u hepatocitima), a povedanje g frakcije zbog povedane sinteze imunoglobulina u toku hronične antigene stimulacije koja je kod ove krave nastala zbog stalnog prelaska antigena E. coli u cirkulaciju

ZADATAK 1.

• Nacrtati standardnu krivu na osnovu ekstinkcija dobijenih merenjem apsorpcije talasa koji prolaze kroz rastvore sa poznatim koncentracijama proteina i urađenom biuretskom probom

• Proba se izvodi na kolorimetru ili spektorfotometru

• Odrediti koncentraciju proteina u nepoznatom serumu biuretskom metodom

Podaci za izradu baždarne krive:

fiziološki rastvor (mL)

Zapremina BSA (mL)

koncentracija BSA (g/L) Ekstinkcija

1,9 0,1 10 0,175

1,8 0,2 20 0,200

1,7 0,3 30 0,240

1,6 0,4 40 0,290

1,5 0,5 50 0,330

1,4 0,6 60 0,380

1,3 0,7 70 0,420

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ekst

inkc

ija

koncentracija proteina (g/L)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ekst

inkc

ija

koncentracija proteina (g/L)

Zadatak 2. Opisati promene na elektroforezogramima prikazanim u tabeli 1.

Zdrave životinje Obolele životinje Promena

Hronični inflamatorni

proces koji se odigrava u

jetri se karakteriše

sniženjem koncentracije

albumina usled snižene

sinteze i povišenom

koncentracijom gama-

globulina usled

stimulacije različitim

antigenima

Zdravo goveče (A/G = 0,7)

Goveče: Hronični apces jetre (A/G = 0,17)

Zadatak 3.

• Odrediti koncentraciju fibrinogena precipitacijom toplotom