portada 65€¦ · vitoria-gasteiz, 2010 tesis doctorales n.º 65 universidad de zaragoza...

65

Miren Josune García

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS ESPECIESDE PIROPLASMAS EN LAS POBLACIONES DE IXÓDIDOS

DE LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO

Vitoria-Gasteiz, 2010

TESIS DOCTORALESN.º 65

Universidad de ZaragoZa

IdentIfIcacIón molecular de las especIes de pIroplasmas en las poblacIones de IxódIdos

de la comunIdad autónoma del país Vasco

dIstrIbucIón y preValencIa de babesIa y theIlerIa en los ungulados doméstIcos y sIlVestres

Miren Josune García

Edición: 1.ª Enero 2010

Tirada: 50 ejemplares

© Administración de la Comunidad Autónoma del País Vasco Departamento de Medio Ambiente, Planificación Territorial, Agricultura y Pesca

Internet: www.euskadi.net

Edita: Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco Donostia-San Sebastián, 1 - 01010 Vitoria-Gasteiz

Impresión: Eusko Printing Service, S.L. www.eps-grupo.com

ISBN: 978-84-457-3039-3

D. L.: VI 30-2010

Un registro bibliográfico de esta obra puede consultarse en el catálogo de la BibliotecaGeneral del Gobierno Vasco: <http://www.euskadi.net/ejgvbiblioteka>.

A José Luís, a Edurne y a mis padres,

por su confianza y apoyo incondicionales

La Dra. Ana Hurtado Esgueva y la Dra. Ana L. García Pérez, investigadoras del

Departamento de Producción y Sanidad Animal de NEIKER - Instituto Vasco de

Investigación y Desarrollo Agrario

CERTIFICAN:

Que Dña. Miren Josune García Sanmartín ha realizado bajo nuestra dirección los

trabajos correspondientes a su Tesis Doctoral titulada "Identificación molecular de las

especies de piroplasmas en las poblaciones de Ixódidos de la Comunidad Autónoma del

País Vasco. Distribución y prevalencia de Babesia y Theileria en los ungulados domésticos

y silvestres". Dicha Tesis se ajusta al proyecto de Tesis inicialmente presentado y cumple

las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza, por

lo que autorizan su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal

correspondiente.

En Derio a 8 de junio de 2007

DIRECTORAS DE LA TESIS

Fdo. Ana Hurtado Esgueva Fdo. Ana L. García Pérez

PRESENTACIÓN DE LA TESIS

El presente trabajo se ha desarrollado en el Departamento de Producción y Sanidad

Animal de NEIKER- Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario. La realización

de este estudio ha sido posible gracias a la financiación del Instituto Nacional de

Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) (RTA02-001) y del

Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación del Gobierno Vasco. Asimismo, la

autora de esta memoria ha disfrutado de una beca predoctoral del INIA (2003-2007).

Los estudios que integran esta tesis han dado lugar a las cinco publicaciones sobre

piroplasmas en las poblaciones de Ixódidos de la Comunidad Autónoma del País Vasco y

en los ungulados domésticos y silvestres del Norte de España que se citan a continuación:

1. Nagore D., García-Sanmartín J., García-Pérez A. L., Juste R. A., Hurtado A.

Detection and identification of equine Theileria and Babesia species by reverse line

blotting: epidemiological survey and phylogenetic analysis. Veterinary Parasitology

2004; 123: 41-54.

2. Nagore D., García-Sanmartín J., García-Pérez A. L., Juste R. A., Hurtado A.

Identification, genetic diversity and prevalence of Theileria and Babesia species in a

sheep population from Northern Spain. International Journal for Parasitology 2004;

34: 1059-1067.

3. García-Sanmartín J., Nagore D., García-Pérez A. L., Juste R. A., Hurtado A.

Molecular diagnosis of Theileria and Babesia species infecting cattle in Northern

Spain using reverse line blot macroarrays. BMC Veterinary Research 2006; 2: 16.

4. García-Sanmartín J., Aurtenetxe O., Barral M., Marco I., Lavín S., García-Pérez A.

L., Hurtado A. Molecular detection and characterization of piroplasms infecting

cervids and chamois in Northern Spain. Parasitology 2007; 134: 391-398.

5. García-Sanmartín J., Barandika J. F., Juste R. A., García-Pérez A. L., Hurtado A.

Distribution and molecular detection of Theileria and Babesia in questing ticks from

Northern Spain. Medical and Veterinary Entomology 2008; 22: 318-325.

AGRADECIMIENTOS

Mucho más allá del trabajo de investigación y laboratorio que se ordena y analiza en esta Tesis Doctoral, están las personas que me han acompañado, enseñado, escuchado, animado y hasta digamos “aguantado” a lo largo de todos estos años de paso por NEIKER. Este apartado va dedicado a todas esas personas sin cuya ayuda no habría sido posible la realización de este trabajo.

En primer lugar, quiero agradecer a la directora de este trabajo, la Dra. Ana Hurtado, por la confianza que depositó en mí en la realización de este trabajo y por la magnífica labor de dirección realizada. Agradecer también la labor de la co-directora, la Dra. Ana L. García Pérez, por saber discutir, criticar y orientar el trabajo realizado. Sobre todo querría agradecerles su disposición en todo momento y, sobre todo, por vuestra calidad humana.

Al Dr. Ramón Juste, jefe del Departamento de Producción y Sanidad Animal de NEIKER y a la Dra. Marta Barral, por sus numerosas aportaciones a lo largo del desarrollo de esta tesis. Igualmente, querría agradecer al Dr. Dani Nagore, por introducirme en el mundo de la biología molecular y ayudarme a entender sus entresijos.

A NEIKER, por darme la oportunidad de introducirme en el mundo de la investigación y por ser el marco principal donde se ha desarrollado este trabajo. También querría agradecer a todos los ganaderos y veterinarios que nos han suministrado muestras e información, por su importantísima colaboración.

A la Dra. Silvia García Belenguer, por hacer de puente entre Neiker y la Universidad de Zaragoza y a la secretaria del Dpto. de Sanidad animal de la Facultad de Veterinaria, por conseguir las respuestas a todas mis preguntas.

A Charo y su equipo, del Servicio de Documentación y Biblioteca del INIA, por ser tan eficientes en su trabajo.

Les doy las gracias a Jesse, Nieves y a la Dra. Esmeralda Minguijón por estar siempre dispuestos a resolver mis dudas, por todos sus consejos y por su ayuda durante toda la tesis. También quiero agradecer de forma especial a Bea y a los ya doctores Vega, Mara, Sorkunde y David, por haber estado siempre dispuestos a ayudarme, animarme y aconsejarme tanto en mi paso por NEIKER como sobre el futuro. Asimismo, me gustaría agradecerles su amistad y los buenos momentos que hemos pasado. De nuevo quiero dar las gracias a Sorkunde, por ayudarme a traducir el resumen de la tesis al euskera.

También me gustaría expresar mi agradecimiento a todos mis compañeros (investigadores, becarios, técnicos, analistas de laboratorio y personal de administración, mantenimiento, limpieza e informática) de NEIKER por su apoyo incondicional y por conseguir que todo funcione. En especial quiero agradecer a los que han sido mis compañeros de laboratorio durante todos estos años: Olaia, Iratxe, Itziar, Xeider, Jon, Dr. Iker Agirregomoskorta, Elena, Zuriñe, Ainara, Galder, Amaia, Idoia, Sonia, Ana D., Itzi K., Laura, Marivi, Lucia e Inés por esos momentos tan divertidos y por preocuparse siempre como iban las cosas.

A mis amigos/as de Donosti, de Logroño, de Zaragoza, de Valencia, de Asturias-León y como no a “los pelotis”, porque la vida es más que trabajo. Por los momentos gratos que hemos compartido, vitales para afrontar los lunes con fuerza e ilusión.

Al reciente Dr. Julio Benavides, por sus ánimos desde León y por esa ayuda incondicional con la búsqueda de la bibliografía.

A Paloma y Xabi, por esas sobremesas.

A la Familia Fernández Villar, por abrirme un lugar en su corazón y en su casa.

A mis padres, José y Emma, y a mi hermana Edurne, que a pesar de la distancia, han estado siempre a mi lado, apoyándome y ayudándome a alcanzar todas las metas que me he propuesto.

Y por último, pero sin lugar a duda en el puesto más importante, a José Luís, por haber compartido conmigo todo el largo camino que me ha llevado hasta aquí, por su paciencia, cariño, apoyo, ayuda y comprensión y por ser esa fuente continúa de energía para seguir avanzando.

Termino agradeciendo al colectivo naranja por reivindicar el fin de la precariedad en la carrera de los jóvenes investigadores lo que me ha llevado a conseguir mi primer contrato, en prácticas claro.

Índice y AbreviAturAs

13

ÍNDICE DE CONTENIDO

ABREVIATURAS .................................................................................................. 15

1. INTRODUCCIÓN GENERAL....................................................................... 17

Introducción y objetivos........................................................................................... 19

Revisión bibliográfica.............................................................................................. 25

1.1 Las garrapatas ................................................................................................ 27

1.1.1 Argasidae ................................................................................................ 28

1.1.2 Ixodidae................................................................................................... 28

1.2 Los piroplasmas ............................................................................................. 31

1.2.1 Ciclo biológico ........................................................................................ 31

1.2.1.1 Fase en el hospedador........................................................................... 32

1.2.1.2 Fases en el vector ................................................................................. 33

1.2.2 El género babesia .................................................................................... 35

1.2.2.1 Las babesias bovinas ............................................................................ 36

1.2.2.2 Las babesias de los pequeños rumiantes................................................ 38

1.2.2.3 Las babesias equinas............................................................................. 38

1.2.2.4 Las babesias de los rumiantes silvestres................................................ 39

1.2.2.5 Las babesias caninas............................................................................. 40

1.2.2.6 Las babesias en la especie humana........................................................ 40

1.2.2.7 Otras babesias....................................................................................... 41

1.2.2.8 Babesiosis: sintomatología y lesiones ................................................... 42

1.2.3 El género Theileria .................................................................................. 43

1.2.3.1 Las theilerias bovinas ........................................................................... 44

1.2.3.2 Las theilerias de los pequeños rumiantes............................................... 45

1.2.3.3 Las theilerias equinas............................................................................ 46

1.2.3.4 Las theilerias de los rumiantes silvestres............................................... 46

1.2.3.5 Las theilerias caninas............................................................................ 47

1.2.3.6 Theileriosis: sintomatología y lesiones.................................................. 47

1.3 Epidemiología de las piroplasmosis................................................................ 50

1.4 Clasificación y sistemática de los piroplasmas................................................ 54

1.5 Diagnóstico de las piroplasmosis.................................................................... 59

1.5.1 Diagnóstico clínico .................................................................................. 59

1.5.2 Diagnóstico laboratorial........................................................................... 60

1.5.2.1 Estudio microscópico ........................................................................... 60

1.5.2.2 Infección experimental ......................................................................... 60

1.5.2.3 Cultivo in vitro ..................................................................................... 61

identificAción moleculAr de lAs especies de piroplAsmAs en lAs poblAciones de ixódidos de lA comunidAd AutónomA del pAÍs vAsco

14

1.5.2.4 Diagnóstico serológico ......................................................................... 61

1.5.2.5 Métodos moleculares............................................................................ 62

1.6 Control de las piroplasmosis........................................................................... 68

2. ESTUDIOS ...................................................................................................... 71

Estudio I .................................................................................................................. 73

Estudio II................................................................................................................. 89

Estudio III.............................................................................................................. 101

Estudio IV ............................................................................................................. 111

Estudio V............................................................................................................... 121

3. DISCUSIÓN GENERAL .............................................................................. 137

4. CONCLUSIONES GENERALES ................................................................ 147

5. ANEXOS........................................................................................................ 151

6. RESUMEN, SUMMARY, LABURPENA .................................................... 167

RESUMEN............................................................................................................ 169

SUMMARY .......................................................................................................... 171

LABURPENA ....................................................................................................... 173

7. BIBLIOGRAFÍA........................................................................................... 175

Índice y AbreviAturAs

15

Índice y Abreviaturas

13

ABREVIATURAS

BC Basque Country

bp Base pairs

CFT Complement Fixation Test

C.I. Confidence interval

CAPV Comunidad Autónoma del País Vasco

C Concentration DNA Deoxyribonucleic acid Ácido desoxiribonucleico

dNTP deoxynucleotide triphosphate

ECF East Coast fever

EDTA Ethylenediaminetetra-acetic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

ETG Enfermedades transmitidas por garrapatas

EE.UU. Estados Unidos de América

EUSTAT Instituto Vasco de Estadística

FC Fijación de complemento

IFAT Immunofluorescent antibody test

IFI Inmunofluorescencia Indirecta

ITS Internal transcribed spacer

NCBI National Center for Biotechnology Information

P Probabilidad pb Pares de bases PCR Polymerase chain reaction Reacción en cadena de la polimerasa

PCV Packed cell volume OIE Office International of Epizooties Oficina Internacional de Epizootias Organización Mundial de Sanidad Animal

OR Odds ratio

PAC Política Agraria Común RFLP Restriction fragment length polymorphism Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción RLB Reverse line blot Hibridación reversa en línea

RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid Ácido ribonucleico ribosómico

SDS Dodecil sulfato sódico sp. species (singular) especie spp. species (plural) especies

SSPE Sodium Chloride, Sodium Hydrogen Phosphate, EDTA

TE Tris EDTA

Tm Melting temperature

1. INTRODUCCIÓN GENERAL

Introducción y objetivos

introducción generAl

21

Introducción general

19

Introducción y objetivos

Las piroplasmosis son enfermedades de difusión mundial que afectan tanto a los animales

domésticos y silvestres como al hombre. Los agentes etiológicos principales de estas enfermedades

son los hemoparásitos de los géneros Theileria y Babesia, agentes causantes de la theileriosis y

babesiosis respectivamente. Entre las enfermedades transmitidas por garrapatas, las piroplasmosis

se consideran los procesos más relevantes en el campo de la veterinaria, por las consecuencias

económicas producidas por la muerte de los animales afectados o por el descenso de las

producciones. No obstante, su importancia va más allá del terreno de la veterinaria ya que algunas

de las enfermedades que afectan al ganado son zoonosis que pueden causar graves trastornos para

la salud humana.

Tras la picadura de la garrapata estos agentes pasan al torrente sanguíneo invadiendo las

células hemáticas donde se multiplican. La enfermedad se puede presentar de forma aguda en los

animales no inmunizados, cursando con sintomatología grave y diversa consistente en un síndrome

febril y hemolítico. Si el animal supera este período, pueden presentarse etapas de mejoría

alternadas con períodos de recurrencia. En los casos en que el animal supera la fase aguda de la

enfermedad, éste suele permanecer como portador crónico asintomático. Este estado se presenta

como consecuencia de un estado de equilibrio entre el parásito y el animal. Sin embargo, este

equilibrio se puede romper por diferentes causas como estrés, enfermedades concurrentes, etc.

Además, los portadores asintomáticos son fuente de infección para las garrapatas vectoras,

favoreciéndose con ello el mantenimiento de la infección en la población animal.

Muchas de las enfermedades que afectan a los animales de producción, como la babesiosis y

theileriosis bovinas y equinas, están inscritas como enfermedades notificables en la lista de la

Organización Mundial de Sanidad Animal, antiguamente conocida como Oficina Internacional de

Epizootias (OIE). Debido a su importancia en el comercio de animales y sus productos, las

autoridades veterinarias de los países importadores y exportadores deben acreditar la ausencia de

sintomatología, el resultado negativo a las pruebas diagnósticas y la ausencia de garrapatas en el

ganado equino y vacuno para su comercio internacional. La metodología tradicionalmente utilizada

para identificar estos agentes ha sido la microscopía y las técnicas serológicas. Sin embargo, estas

técnicas poseen ciertas limitaciones, como la dificultad de detectar las infecciones mixtas, las fases

iniciales o crónicas de la enfermedad y la limitada sensibilidad y especificidad que ofrecen. No

obstante, en los últimos tiempos, las técnicas moleculares van tomando mayor protagonismo ya que

ofrecen mayor sensibilidad y especificidad, así como una información más objetiva.


22


20

Las piroplasmosis, al igual que todas las enfermedades transmitidas por garrapatas, tienen un

notable impacto en la ganadería extensiva. En los últimos años se ha observado un incremento de

las poblaciones de garrapatas en la Comunidad Autónoma de País Vasco (CAPV) que ha podido

deberse al aumento de la carga ganadera ocurrido en los últimos años. Además en el caso del

vacuno, este aumento se ha visto acelerado por la crisis del sector lácteo español provocada por las

decisiones de la Política Agraria Común (PAC) del año 2000, originando una reconversión del

sector hacia la producción cárnica que en la CAPV ha dado lugar a un descenso de la proporción de

vacuno lechero desde el 39% en 1989 al 19% en el 2004 (EUSTAT, Instituto Vasco de Estadística),

y al aumento del ganado de carne explotado en régimen extensivo en pastos de monte. Asimismo,

se ha observado un incremento en los censos de ganado equino y ovino en la última década.

Actualmente, el sector ganadero de la CAPV se compone de 175.714 cabezas de vacuno (repartidas

en 7.525 explotaciones), 295.939 cabezas de ovino (4.720 explotaciones), y 17.457 cabezas de

equino (3.893 explotaciones) (EUSTAT, 2005). Si se suma el notable crecimiento en la última

década de especies cinegéticas como el jabalí y el corzo, a las características bioclimáticas de esta

región, se crea una situación muy favorable para la supervivencia y multiplicación de las fases

libres de garrapatas en la vegetación. Este hecho representa un problema relevante tanto en la

ganadería, como en la salud pública.

NEIKER lleva muchos años trabajando en el estudio de varios patógenos transmitidos por

garrapatas como Borrelia burgdorferi, Anaplasma phagocytophilum, Coxiella burnetii y el virus de

la encefalitis ovina (Barral y cols. 2002; García-Pérez y cols. 2000; Gil y cols. 2005; González y

cols. 1987; Oporto y cols. 2003, 2006). Además, se conoce la distribución y prevalencia de las

distintas especies de garrapatas (Barandika y cols. 2006). Sin embargo, la única evidencia de la

presencia de Babesia y Theileria en la zona es a partir de las muestras que se reciben en el Servicio

de Diagnóstico de NEIKER y a los resultados obtenidos en un estudio realizado en la década

pasada sobre la distribución y prevalencia de Babesia spp. en las garrapatas de la CAPV mediante

el estudio de la hemolinfa (Moreno 1995). Como consecuencia, hasta el inicio de este trabajo

muchos factores relacionados con la biología, epidemiología y transmisión de estos agentes en esta

zona eran limitados o desconocidos. Por tanto, en este trabajo se ha planteado el objetivo general de

mejorar el diagnóstico laboratorial de las piroplasmosis, a través del desarrollo de una técnica

molecular que permita detectar e identificar simultáneamente las distintas especies de piroplasmas,

y aplicarla al estudio de la epidemiología de las piroplasmosis, sus vectores y sus reservorios. Para

ello, se han llevado a cabo cinco estudios cuyos objetivos específicos se concretan a continuación:


23


21

Objetivo 1

Desarrollar y poner a punto la técnica de diagnóstico molecular hibridación reversa en línea o

“Reverse Line Blot” (RLB) con objeto de detectar e identificar de manera rápida y específica las

especies de protozoos de los géneros Theileria y Babesia que afectan al ganado de la CAPV

Objetivo 2

Determinar la diversidad y heterogeneidad genética de diferentes especies de piroplasmas

presentes en animales domésticos, rumiantes silvestres y garrapatas de la CAPV

Objetivo 3

Estudiar la prevalencia de las especies Theileria y Babesia presentes entre las poblaciones de

ganado ovino, vacuno, equino, y rumiantes silvestres en la CAPV para investigar el papel de las

especies domesticas y silvestres en el ciclo natural de los diferentes agentes

Objetivo 4

Conocer las especies de garrapatas que pueden actuar como vectores de los diferentes

piroplasmas con objeto de mejorar el conocimiento de la epidemiología de estas infecciones, y

poder predecir riesgos de exposición a estos agentes

Revisión bibliográfica


27


25

1.1 LAS GARRAPATAS

Las garrapatas son artrópodos hematófagos de distribución mundial pertenecientes al orden

Acarina (phylum Arthropoda, clase Arachnida, orden Acarina, suborden Ixodoidea) (Soulsby 1982)

que se caracterizan por su régimen de vida parásito, por alimentarse de diferentes tipos de

mamíferos, aves y reptiles, y por realizar tres mudas a lo largo de su vida. La importancia de estos

artrópodos radica tanto en su capacidad parasitaria (ectoparásito) como en su papel como vector-

transmisor y reservorio de diferentes enfermedades infecciosas o parasitarias. De esta forma, un

vector o transmisor biológico es aquel que asegura la transmisión de un patógeno (con

multiplicación y/o evolución del agente en su interior) (Martínez-Fernández y Cordero del

Campillo 1999). De esta definición se desprenden los siguientes términos, la competencia vectora o

habilidad de un vector para adquirir y transmitir la infección, y la capacidad vectora, que es la

expresión matemática que mide la eficiencia vectora, índice calculado a través de términos

matemáticos. La capacidad de un artrópodo para actuar como vector, según Rodhain (1985),

depende de que éste se infecte, desarrolle posteriormente el agente en su interior, mantenga el

patógeno en al menos un estadio y sea capaz de transmitirlo a un nuevo hospedador. Asimismo,

otras variables que determinan la epidemiología de las enfermedades transmitidas por garrapatas

(ETG) son la densidad de los hospedadores, el grado de infección en las garrapatas y en el

hospedador reservorio. De esta forma, para que un hospedador vertebrado sea considerado como un

reservorio eficaz, el animal debe ser susceptible al agente y mantener el ciclo del parásito,

desarrollando una bacteriemia o parasitemia de larga duración.

La distribución mundial de las garrapatas, así como algunas características estructurales,

fisiológicas, biológicas y de comportamiento, hacen que sean consideradas como vectores

potenciales de multitud de patógenos. En Europa Ixodes ricinus, es vector de B. burgdorferi sensu

lato, de A. phagocytophilum y del virus de la encefalitis (TBE), si bien puede también llegar a

transmitir Babesia divergens y Babesia microti, agente causal de la babesiosis en el hombre, entre

otras (Sonenshine 1991; Soulsby 1982). Además, se ha detectado que una garrapata puede estar

infectada hasta con tres organismos diferentes (Alekseev y cols. 2004). Como consecuencia, tanto

los animales como el hombre, al ser picados por una garrapata, podrían ser infectados por varios

organismos.

Las garrapatas han desarrollado magníficos sistemas para su supervivencia como la diapausa,

que implica el cese de las funciones fisiológicas en los periodos de clima desfavorable (son

relativamente sensibles a la desecación) o en ausencia de hospedadores apropiados. Además, son

capaces de absorber agua a partir del aire circundante, lo que facilita el mantenimiento de una

población. En algunas especies la detección de los hospedadores se realiza mediante un complejo


28


26

sistema sensorial (órgano de Haller) por el que reconocen olores, vibraciones o cambios de

temperatura (Sonenshine 1991).

Se conocen casi 900 especies de garrapatas agrupadas en tres familias: Ixodidae o garrapatas

duras (agrupan al 80% de las garrapatas del mundo), Nuttalliellidae (representada por una única

especie) y Argasidae o garrapatas blandas (el resto de especies) (Barker y Murrell 2004).

1.1.1 ARGASIDAE

Las garrapatas blandas se caracterizan por carecer de escudo y por alimentarse en breves y

repetidos periodos de tiempo (como máximo unas pocas horas), permaneciendo en el hospedador

sólo el tiempo necesario. Además, muchas especies poseen múltiples estadios de ninfa, y las

hembras pueden ovoposicionar varias veces durante su alimentación. La mayoría de las especies

son parásitos nidícolas, de aves y reptiles (Sonenshine 1991).

Los Argásidos con importancia médica y veterinaria pertenecen a los géneros Argas,

Ornithodoros y Otobius (Jongejan y Uilenberg 2004). Esta familia de garrapatas tiene predilección

por los hábitats secos, con especies distribuidas ampliamente por el mundo. El género Argas

parasita principalmente a las aves y está relacionado con la transmisión de Borrelia anserina

(borreliosis aviar) (Diab y Soliman 1977). En lo referente al género Ornithodoros, su mayor

importancia económica veterinaria está relacionada con la transmisión de la peste porcina africana

(Kleiboeker y Scoles 2001), y en medicina humana, con la fiebre recurrente (Anda y cols. 1996).

En la Península Ibérica se ha citado la presencia de estos dos géneros tanto en la zona centro como

sur de la misma (Cordero del Campillo y cols. 1994). Los animales de abasto son los animales que

con mayor frecuencia parasitan las garrapatas del género Otobius, si bien no se les ha relacionado

con la transmisión de agentes infecciosos (Encinas-Grandes y cols. 1999).

1.1.2 IXODIDAE

Las garrapatas duras se caracterizan por poseer un escudo quitinoso. Las especies de esta

familia se alimentan de forma única y prolongada en cada estadio (larvas, ninfas y adultos),

oscilando desde horas hasta días o semanas en función del estadio y especie de garrapata, con la

única excepción de los machos adultos que realizan ingestas breves y repetidas. De los

aproximadamente tres años a lo largo de los cuales se desarrolla la vida de las garrapatas de la

especie I. ricinus, solamente pasa unas semanas sobre los hospedadores, empleando el resto de su

vida en su desarrollo, diapausa y búsqueda de hospedadores (Milne 1950). Las variaciones de la

actividad de los Ixódidos en esta fase, la fase libre, están estrechamente relacionadas con el

microclima (Hubalek y cols. 2003). A diferencia de la familia Argasidae, los Ixodidae mudan una

única vez por estadio y en cada una de las fases la garrapata necesita alimentarse sobre un

hospedador para poder continuar con su desarrollo. De esta forma, en función del número de


29


27

especies diferentes de vertebrados que parasite la garrapata en su ciclo de vida, ésta puede ser de

uno, dos o tres hospedadores (Figura 1). La naturaleza estacional de esta actividad de búsqueda de

los hospedadores determina la estacionalidad de las infecciones que transmiten tanto a los animales

como al hombre.

Figura 1. Ciclo trifásico de I. ricinus (A) y bifásico de Rhipicephalus bursa (B). Fuente: Lori y cols. 2005.

La adaptación al medio externo ha originado que los Ixódidos hayan adquirido diferentes

hábitos de vida. Un gran número de las especies comprendidas en la familia Ixodidae son exófilas

en todas o en alguna de sus fases. Éstas se desarrollan en la vegetación y esperan en las partes altas

de la misma el paso del hospedador, atendiendo a ciertos estímulos como el dióxido de carbono, el

calor o el movimiento (Sonenshine 1991). En cambio, otras especies son endófilas y desarrollan

todas sus fases en las madrigueras y nidos de micromamíferos, reptiles o aves de los que se

alimentan, discurriendo el ciclo completo en los hábitats de los hospedadores. Las especies endo-

exófilas desarrollan las primeras fases de su vida como las especies endófilas, pero al llegar al

estado de adulto salen a la superficie y se comportan como exófilas. Además, en función del

estadio y especie de garrapata tienen apetencia por diferentes hospedadores (e incluso por el

hombre). De esta forma, una especie se define como monotropa si el ciclo vital lo completa en la

misma especie de hospedador y ditropa cuando los estadios inmaduros parasitan especies diferentes

a los adultos. Rhipicephalus sanguineus, especie vectora de la fiebre exantemática mediterránea,

entre otras enfermedades, es un ejemplo de especie mono-ditropa, que parasita exclusivamente al

hombre cuando no está a su disposición su hospedador principal, el perro (Parola y Raoult 2001).

En cambio, en las especies politropas, como I. ricinus, los adultos parasitan principalmente grandes

animales (como los ungulados), las ninfas tienen preferencia por micromamíferos o grandes

animales, y las larvas se alimentan fundamentalmente en aves o micromamíferos. Esta baja

A B


27




como al hombre.




















A B


27




como al hombre.




















A B


30


28

especificidad trae consigo grandes implicaciones en la epidemiología de las enfermedades que

transmiten como el caso de las piroplasmosis, objeto de este trabajo.

La epidemiología de las ETG está influenciada por otros factores fisiológicos y ecológicos

como el grado de contacto entre garrapata y hospedador, la actividad estacional de la garrapata, los

movimientos del hospedador, la susceptibilidad del hospedador y las condiciones ambientales.

Además la proporción de garrapatas que adquieren la infección, como en el caso de B. burgdorferi,

puede verse incrementada con la duración del acoplamiento durante la alimentación en el

hospedador (Piesman y cols. 1991).

Cada especie está adaptada a un tipo de hábitat o vegetación característicos, lo que determina

la distribución geográfica de las diferentes especies de garrapatas. En la CAPV las garrapatas más

comunes tanto en los animales como en la vegetación se engloban dentro de los géneros Ixodes,

Dermacentor, Haemaphysalis y Rhipicephalus, siendo I. ricinus la más abundante de todas ellas

(Barandika y cols. 2006; Barral y cols. 1993; Moreno 1995; M. Barral, comunicación personal)

(Tabla 1). Ésta se encuentra ampliamente distribuida en la zona norte de la Península Ibérica, ya

que tiene una elevada exigencia higrométrica, apenas detectándose en la zona sur. En cambio, las

garrapatas del género Hyalomma frecuentes en zonas más secas, como el centro y sur de España,

no parecen estar presentes en la CAPV (Barandika y cols. 2006; Cordero del Campillo y cols.

1994; Encinas-Grandes 1986; Estrada-Peña y cols. 2004). Otras especies de gran importancia en la

transmisión de los piroplasmas son Amblyomma y Boophilus, pero sólo esta última está presente en

el sur de España (Cordero del Campillo y cols. 1994; Estrada-Peña y cols. 2004). Recientemente el

género Boophilus se ha reclasificado dentro del género Rhipicephalus (Horak y cols. 2002) debido

a su cercana relación filogenética. Sin embargo, dada la importancia de este género como vector de

diversos agentes infecciosos, el término Boophilus se mantiene de uso común.

Tabla 1. Especies de garrapatas identificadas hasta la fecha en la CAPV y características del ciclo biológico.

Especies de garrapatas Hallazgos en la CAPV Ambiente Tipo de hospedador Nº de hospedadores Ixodes ricinus V, D, S exófila di-politropa Tres Haemaphysalis punctata V, D exófila ditropa tres Haemaphysalis inermis V, D exófila ditropa tres Haemaphysalis sulcata D exófila ditropa tres Haemaphysalis concinna V, D exófila ditropa tres Ripicephalus bursa V,D,S exófila mono- ditropa dos Rhipicephalus sanguineus V, S endo-exofila monotropa o mono-ditropa tres Dermacentor reticulatus V, D, S endo- exófila ditropa tres Dermacentor marginatus V, D, S endo-exófila ditropa tres Ixodes hexagonus S endófila mono-ditropa tres Haemaphysalis hispanica V*, S endófila monotropa tres Rhipicephalus pusillus V* endófila monotropa tres Ixodes acuminatus S endófila monotropa o mono-ditropa tres Ixodes canisuga S endófila monotropa tres Ixodes trianguliceps S endófila monotropa tres

V, vegetación; D, animales domésticos; S, animales silvestres; *, hallazgos esporádicos en vegetación. Fuente: Barandika y cols. 2006; Barral y cols. 1993; Estrada-Peña y cols. 2004; Lori y cols. 2005; Moreno 1995; M. Barral, comunicación personal.


31


29

1.2 LOS PIROPLASMAS

El término piroplasmosis engloba un grupo de enfermedades transmitidas por garrapatas de

distribución mundial causadas por parásitos protozoarios intraeritrocíticos agrupados

principalmente dentro de los géneros Babesia y Theileria. El nombre de piroplasma, bajo el que se

suele englobar a estas especies, hace referencia a la forma piriforme que posee el estadio

intraeritrocitario de los mismos (Levine 1971). Estas enfermedades afectan a un amplio número de

especies animales domésticas y silvestres en las regiones templadas y tropicales del planeta, y

ocasionalmente, algunas especies del género Babesia producen zoonosis.

Los géneros Babesia y Theileria se engloban dentro del phylum Apicomplexa, un grupo de

parásitos protozoarios caracterizados por la presencia de un complejo apical en la fase previa al

estadio invasivo (Levine 1988). El orden Piroplasmida (Wenyon, 1926), comprende dos familias de

protozoos intraeritrocitarios Babesiidae y Theileriidae que agrupan a los géneros Babesia, y

Theileria y Cytauxzoon, respectivamente (Ashford y cols. 2001) (Tabla 2). Sin embargo, a lo largo

de la historia estos géneros han adquirido nombres tan dispares como Piroplasma, Pyrosoma,

Apiosoma, Nuttallia, Nicollia, Babesiosoma, Smithia y Rossiella (Levine 1985).

Tabla 2. Clasificación del Phylum Apicomplexa

Reino Protozooa Phylum Apicomplexa

Clase Hematozoea Subclase Piroplasmia

Orden Piroplasmida Familia Babesiidae

Género Babesia Familia Theileriidae

Género Theileria Género Cytauxzoon

En la actualidad, gracias a las técnicas moleculares, se han reclasificado especies como

Theileria equi, previamente descrita como Babesia equi (Mehlhorn y Schein 1998; Zapf y Schein

1994). También han servido para identificar y caracterizar nuevas especies como Theileria annae

(Zahler y cols. 2000a), Babesia conradae (Kjemtrup y cols. 2006; Kjemtrup y Conrad 2006) y

Babesia duncani (Conrad y cols. 2006) (ver apartado 1.4).

1.2.1 CICLO BIOLÓGICO

El ciclo biológico de los piroplasmas es un ciclo indirecto en el que las garrapatas actúan como

vector transmisor del parásito. Los géneros Theileria y Babesia, como todos los Apicomplexa,

alternan a lo largo de su ciclo la reproducción asexual y sexual, transcurriendo por tres fases:

esquizogonia, gametogonia y esporogonia (Figura 2). La esquizogonia tiene lugar en el animal,

mientras que las dos fases restantes acontecen en la garrapata. A pesar de que se han estudiado


32


30

muchos detalles de este ciclo, en muchas especies todavía es incompleto. Este apartado resume en

grandes líneas el ciclo de las theilerias y de las babesias.

Figura 2. Ciclo biológico de B. canis (A) y Theileria spp. (B). Fuente: Mehlhorn 2004.

A: 1 Esporozoito en glándula salivar. 2–5 Producción de merozoitos. Cuando la garrapata ingiere los merozoitos (5.1) se digieren en el intestino (5.2) o se transforman en gamontes (6). 7, 8 Cuerpos radiados en las células intestinales (8). 9 Fusión de gametos. 10 Formación del cigoto 11–14 Formación del quineto a partir del cigoto en el interior de una vacuola en la célula intestinal. 15–18 El quineto abandona la luz intestinal, e invade las células de varios órganos y los huevos de la garrapata hembra adulta. Formación de nuevos quinetos (esporoquinetos). 19–21 Los quinetos penetran en las glándulas salivares, donde se forma el esporonte dando lugar a miles de esporozoitos.

B: 1 Esporozoito en glándula salivar 2 Esquizonte o cuerpo de Koch dentro del linfocito. 3 Merozoito libre invadiendo eritrocitos. 4 Fisión binaria en el eritrocito. 5 Merozoitos libres invadiendo nuevos eritrocitos. 6 Formación de un estadio esférico u ovoide (gamontes). 7, 8 Gamontes o merozoitos libre en el intestino de la garrapata. 8.1–8.4 Formación de microgamontes (8.2) que por fisión dan lugar a microgametos (8.3–8.4). 9 Fusión con el macrogameto. 10 Cigoto. 11–13 Formación del quineto en la célula intestinal. 14, 15 Tras la muda o el acoplamiento a un hospedador, los quinetos penetran en las células de las glándulas salivares, donde se forma el esporonte dando lugar a los esporozoitos.

AV, célula alveolar de la glándula salivar; BI, fisión binaria; DK, quineto en desarrollo; E, eritrocito, HC/NH, núcleo de la célula hospedador; IV, vacuola interna; KB, cuerpo de Koch (esquizonte); N, núcleo; SPO /JS /ES, esporonte; SP, esporozoito.

1.2.1.1 Fase en el hospedador

El ciclo comienza con la esquizogonia o fase de reproducción asexual. Esta etapa tiene lugar

en el animal, diferenciándose a su vez dos fases en el género Theileria y en una fase en el género

Babesia. Se inicia días después de que la garrapata infectada (la fase de ninfa o de adulto en el

género Theileria, y cualquier estadio en Babesia) comience su alimentación sobre un hospedador

competente. En los Ixódidos el estímulo de la función trófica es decisivo para que se lleve a cabo la

A B


33


31

diferenciación celular del esporoblasto en esporozoito o forma infectante, que será evacuado a la

luz alveolar y transportado a través de la saliva hasta la sangre del hospedador (Mehlhorn y Schein

1984).

La fase intralinfocitaria o exoeritrocitaria acontece en el género Theileria. Tras la inoculación,

los esporozoitos invaden las células linfoides. El desarrollo del parásito propicia una serie de

transformaciones del linfocito infectado, mediante la división sincrónica de las formas parasitarias

y de las células hospedadoras, dando lugar a dos células hijas, de tal forma que cada una mantiene

una forma parasitaria o esquizonte en el interior. La continua repetición de este proceso produce un

gran número de linfocitos parasitados. Asimismo, en el esquizonte se suceden una serie de

divisiones nucleares, dando lugar a esquizontes multinucleados o "cuerpos" o "esferas de Koch".

Posteriormente, a los 8-14 días de la infección, los esquizontes comienzan a producir merozoitos.

Los merozoitos quedan libres una vez que el linfocito degenera (Mehlhorn y Schein 1984).

Las formas infectantes (los merozoitos en el género Theileria o los esporozoitos en el caso de

Babesia) invaden los hematíes por endocitosis una vez invaginada la membrana eritrocitaria (Fase

intraeritrocitaria). Inicialmente, el parásito queda en el interior de una vacuola parasitaria que

pierde posteriormente su membrana, permaneciendo el parásito listo para dividirse asexualmente

por fisión binaria, adquiriendo una morfología pleomórfica: formas redondeadas, ovoides, de anillo

alargadas, en forma de coma o varilla, formas anaplasmoides o formando la "cruz de Malta"

(células hijas formando tétradas). Estas estructuras pleomórficas se conocen vulgarmente con el

nombre de piroplasmas. Tras la división, que se produce en pocas horas, los merozoitos lisan el

eritrocito infectando más eritrocitos (Mehlhorn y Schein 1984).

En el género Theileria, tras la ruptura de los eritrocitos, los merozoitos invaden otros

eritrocitos, dando lugar a unas formaciones esféricas u ovoides que se multiplican asexualmente y

adquieren una apariencia semejante a las formaciones anulares de malaria, conocidas como

gamontes (Mehlhorn y Schein 1984, 1998). También se han descrito estas estructuras en algunas

especies de Babesia como B. divergens (Mackenstedt y cols. 1990), B. bigemina, B. canis

(Mackenstedt y cols. 1995) y B. microti (Rudzinska y cols. 1983).

1.2.1.2 Fases en el vector

La fase de gametogonia tiene lugar en el intestino la garrapata y la de esporogonia en las

glándulas salivares de la garrapata y, en el caso de Babesia también en otros órganos de la misma.

La fase de gametogonia es la fase de reproducción sexual con la que el parásito inicia su ciclo

en el vector. Una vez que la garrapata ha ingerido la sangre de un hospedador infectado, se produce

la destrucción de los eritrocitos, liberando los estadios intraeritrocitarios en la luz intestinal. Sólo


34


32

una pequeña proporción sobrevive a la digestión intestinal. Posteriormente invaden las células

intestinales, dando lugar, por un lado a microgametos filiformes, uninucleados y de pequeño

tamaño, y por otro a los macrogametos, con forma ovoide. Ambas formas celulares pasan por un

estadio intermedio que presenta abundantes prolongaciones citoplasmáticas de donde deriva la

denominación de cuerpos radiados ("ray bodies") descritos por Koch (Koch 1906). Posteriormente,

los gametos se fusionan (Gauer y cols. 1995; Mackenstedt y cols. 1994, 1995) y forman un cigoto

móvil (ooquineto) mediante la proyección en una vacuola, capaz de atravesar la pared del intestino

y comenzar a reproducirse asexualmente en diferentes tejidos del vector (Mehlhorn y Schein 1984).

En el género Theileria, este cigoto continúa aumentando y tras un proceso de reproducción

asexual (fase de esporogonia) origina los esporoquinetos. Estos esporoquinetos, con movilidad

propia, atraviesan la pared del tubo digestivo y se localizan en la hemolinfa en el momento de la

muda de la garrapata. Sin embargo, puede suceder previamente a la muda, como sucede en

Theileria annulata, T. equi o Theileria velifera (Mehlhorn y Schein 1984).

En el género Babesia, el cigoto es conducido a través de la hemolinfa a diferentes

localizaciones tisulares del vector como los hemocitos, células de los túbulos de Malpighi, fibras

musculares, donde se multiplican asexualmente para producir esporoquinetos. En la hembra adulta

la infección se transmite a la siguiente generación (transmisión transovárica); el cigoto invade las

células ováricas y ovocitos donde se producen los esporoquinetos. Estos ciclos de división

continuarán en la hembra durante la preovoposición y la ovoposición. Tras la ovoposición, los

parásitos permanecen inactivos o latentes en los tejidos de las larvas en desarrollo. Cuando las

larvas infectadas por Babesia inician la alimentación tiene lugar un proceso de esporogonia similar

al que acontece en los adultos en la infección primaria. El parásito invade inicialmente el epitelio

intestinal de las larvas y finalmente las glándulas salivares (Mehlhorn y Schein 1984).

Por último, a través de la hemolinfa, los esporoquinetos son conducidos a las glándulas

salivares, donde penetran en las células alveolares situándose en su citoplasma. En estas células los

esporoquinetos se transforman en esporoblastos. El protozoo permanece en este estado en las

células alveolares de la garrapata hasta la alimentación sobre un nuevo hospedador. Parece

establecido que el desarrollo del esporozoito comienza una vez que la garrapata se ha acoplado al

hospedador (Mehlhorn y Schein 1984).

Desde el punto de vista epidemiológico las poblaciones de garrapatas infectadas representan la

principal fuente de parásitos para el hospedador. Las garrapatas adquieren la infección cuando se

alimentan sobre un hospedador reservorio; por ejemplo en el estadio de larva, transmitiéndola al

próximo estadio (transmisión transestadial), en este caso a la ninfa, que será la responsable de

transmitir el agente etiológico a un nuevo hospedador susceptible. Además, en las hembras adultas


35


33

se produce la ya mencionada transmisión transovárica, en la que el parásito invade el ovario e

infecta el huevo. Esta vía es exclusiva del género Babesia, pero no está descrita en B. microti. Por

tanto el estadio larvario no supone ningún riesgo para la transmisión de la infección por theilerias o

B. microti (Gray y cols. 2002a). El papel de las garrapatas macho adultas como vectores no está

muy estudiado, si bien se ha demostrado experimentalmente la transmisión de determinados

piroplasmas por garrapatas adultas macho de Rhipicephalus (Boophilus) spp. y Dermacentor spp.

(Dalgliesh y cols. 1978; Guimaraes y cols. 1998; Stiller y cols. 2002).

Otras vías de transmisión a tener en cuenta están relacionadas con el hospedador vertebrado.

Los estudios realizados sobre la transmisión transplacentaria o perinatal sugieren la transmisión al

feto de T. equi, Babesia bovis, B. divergens y Theileria sergenti (Baek y cols. 2003; Egeli 1996;

Friedhoff 1988; Guimaraes y cols. 1998; Phipps y Otter 2004; Yeruham y cols. 2003). Igualmente,

se ha demostrado la infección iatrogénica en caballos, por el uso de jeringuillas contaminadas con

T. equi (Friedhoff 1988). Además, se han descrito infecciones por Babesia spp. en el hombre

durante las transfusiones de sangre en los Estados Unidos de América (EE.UU.) (Herwaldt y cols.

2002; Kjemtrup y cols. 2002). Por consiguiente, es necesario controlar la infección por Babesia en

los donantes de sangre, ya que según el estudio realizado por Eberhard y cols. (1995) B. microti

puede permanecer infectiva bajo las condiciones normales de un banco de sangre.

1.2.2 EL GÉNERO BABESIA

Babes (1888) realizó la primera descripción de los piroplasmas al identificar en la sangre de un

bovino enfermo un organismo que causaba fiebre y hemoglobinuria al que denominó

Haematococcus bovis. Posteriormente, Starcovici (1893) lo renombró como Babesia bovis. Al

mismo tiempo, las investigaciones de Smith y Kilborne (1893) identificaron el agente causal de

”Texas Fever” al que denominaron Pyrosoma bigeminum (B. bigemina), demostrando por vez

primera la transmisión de un agente patógeno mediante un artrópodo (Rhipicephalus (Boophilus)

annulatus) a un hospedador mamífero. Desde 1888 se han realizado multitud de descripciones de

babesias (Levine 1988), aunque solamente se ha identificado el vector, estudiado ampliamente la

epidemiología y realizado la caracterización molecular de un número limitado de especies (Tabla

3). Se ha relacionado a los Ixódidos como únicos vectores de Babesia, si bien en un estudio

realizado con garrapatas blandas (Argásidos) se identificó a la especie Ornithodoros erraticus

como reservorio de Babesia meri (Gunders 1977).


36


34

Tabla 3. Principales especies de babesias y características de tamaño, hopedador, vector y distribución.

Tamaño

Especie ( m) Hospedador Vector Distribución Año

descripción

B. bigemina 4.5 x 2 vacuno, búfalo, rumiantes silvestres Boophilus spp., Rhipicephalus spp. Mundial 1893

B. bovis 2.0 x 1.5 vacuno Boophilus spp., Rhipicephalus spp., Ixodes spp. Mundial 1888

B. caballi 3.0 x 2.0 équidos Dermacentor spp., Hyalomma spp., Rhipicephalus spp. Mundial 1910

B. canis canis 5.0 x 3.0 perro D. reticulatus Mundial 1895 B. canis rossi 5.0 x 3.0 perro H. leachi África 1910 B. canis vogeli 5.0 x 3.0 perro R. sanguineus Mundial 1937 B. capreoli corzo I. ricinus Europa 1962 B. conradae perro ? EE.UU. 2006 B. crassa ovino ? Irán, Turquía 1981

B. divergens 2.0 x 0.4 vacuno, rumiantes silvestres, hombre I. ricinus Europa, África

Norte 1911

B. duncani hombre ? EE.UU. 2006 B. felis 0.9 x 0.7 gato, félidos silvestres ? África, Asia 1929 B. major 3.7 x 1.5 vacuno, bisonte H. punctata Europa, China 1926 B. microti pleomórfico micromamíferos, hombre I. scapularis EE.UU., Europa 1910

B. motasi 4.0 x 2.0 ovino, caprino R. bursa, H. punctata Europa, Asia, África 1926

B. occultans 2.9 x 1.2 vacuno Hyalomma spp. Sudáfrica 1981 B. odocoilei cérvidos I. scapularis EE.UU. 1968 B. orientalis búfalo R. haemaphysaloides China 1997 B. ovata 3.2 x 1.7 vacuno H. longicornis Japón 1980

B. ovis 2.0 x 0.5 ovino, caprino, muflón, cabra pirenaica R. bursa Mundial 1893

B. perroncitoi 2.6 x 1.9 porcino R. sanguineus, D. reticulatus Europa, África 1939

B. trautmanni 4.0 x 2.0 porcino Rhipicephalus spp., Boophilus spp., Dermacentor spp. Europa, África 1918

B.gibsoni 1.9 x 2.0 perro R. sanguineus, Dermacentor spp. África, Asia 1910 Babesia sp. vacuno ? China 2002 Babesia sp. (China) ovino, caprino H. longicornis China 2003 Babesia sp. CA1 hombre ? EE.UU. 1998

Babesia sp. EU1 Hombre, cérvidos ? Europa (Eslovenia) 2003

Babesia sp. KO1 hombre ? Corea 2007 Babesia sp. MO1 hombre ? EE.UU. 1998 Babesia sp. U vacuno Hy. anatolicum anatolicum? China 2002 Babesia sp. WA1 hombre ? EE.UU. 1998

?: vector desconocido o no demostrado. Fuente: Conrad y cols. 2006; Duh y cols. 2005b; Herwaldt y cols. 2003; Kim y

cols. 2007; Kjemtrup y cols. 2006; Sonenshine 1991; Soulsby 1982; Uilenberg y cols. 1989, 1995, 2006.

1.2.2.1 Las babesias bovinas

Las dos especies mundialmente más importantes por su distribución, tanto en las regiones

tropicales y subtropicales, como por su patogenicidad son B. bigemina y B. bovis. Se ha descrito su

presencia en Australia (Mahoney 1974; Waldron y Jorgensen 1999), en el África subsahariana

(Smeenk y cols. 2000), en América Central y Sudamérica (Barros y cols. 2005; Guglielmone 1995;

Oliveira-Sequeira y cols. 2005) y en países asiáticos como China (Yin y cols. 1997). En los países

europeos los casos documentados de estas especies se localizan en la zona sur de España (Almería

y cols. 2001a, 2001b, 2002; Cordero del Campillo y cols. 1994; Gubbels y cols. 1999), Portugal


37


35

(Caeiro 1999), Grecia (Papadopoulos y cols. 1996a), e Italia (Cringoli y cols. 2002; Georges y cols.

2001). Más recientemente se ha detectado también un caso en Suiza (Hilpertshauser y cols. 2007).

Estas especies ampliamente descritas en el vacuno, se han detectado en el búfalo de agua y en

rumiantes silvestres (Callow y cols. 1976; Penzhorn 2006). En la transmisión de B. bigemina se

encuentran implicadas varias especies de garrapatas de los géneros Boophilus (B. microplus, B.

decoloratus, B. annulatus), y Rhipicephalus (R. evertsi y R. bursa) (Buscher 1988; Friedhoff 1988;

Habela y cols. 1995), mientras que B. bovis es trasmitida por los géneros Ixodes, Rhipicephalus y

Boophilus (Soulsby 1982).

B. divergens es el tercer agente en importancia mundial en las babesiosis bovinas y el primero

en Europa. La mayoría de los estudios epidemiológicos realizados hasta la fecha se limitan a este

continente (Cordero del Campillo y cols. 1994; Papadopoulos y cols. 1996a; Zintl y cols. 2003),

donde su vector (I. ricinus) (Donnelly y Peirce 1975) está ampliamente distribuido; si bien se ha

detectado también su presencia en África del Norte (Bouattour y Darghouth 1996). La principal

especie afectada por B. divergens es el ganado vacuno (Zintl y cols. 2003), aunque se han detectado

casos en rumiantes silvestres (Penzhorn 2006) (ver apartado babesiosis en rumiantes silvestres). Se

han recogido garrapatas I. ricinus positivas a B. divergens en ovino, rebecos y ciervos de Suiza

(Hilpertshauser y cols. 2006).

La especie de Babesia con menor distribución y prevalencia en los bóvidos, B. major, ha sido

descrita en China (Yin y cols. 1997) y en Europa. Los casos europeos registrados hasta la fecha se

distribuyen por Francia, Gran Bretaña, Grecia y España (Brocklesby y cols. 1973; Cordero del

Campillo y cols. 1994; L'Hostis y cols. 1995; Papadopoulos y cols. 1996a), donde el único vector

conocido es H. punctata (Brocklesby y Barnett 1970; Morzaria y cols. 1977; Yin y cols. 1996). El

hospedador principal de esta especie es el ganado vacuno aunque se ha descrito al menos un caso

en bisonte (Findlay y Begg 1977). De forma puntual, se ha detectado la presencia de B. major en

garrapatas I. ricinus recogidas de cérvidos de Suiza (Hilpertshauser y cols. 2006).

Recientemente se ha descrito la presencia de otras babesias en bóvidos como es el caso de B.

occultans descrita en Sudáfrica y transmitida por Hyalomma spp. y de B. ovata transmitida por

Haemaphysalis longicornis en Japón (Arai y cols. 1998; Gray y de Vos 1981; Ohta y cols. 1996).

Asimismo se han descrito al menos dos nuevas babesias en China, B. orientalis en búfalos,

transmitida por Rhipicephalus haemaphysaloides (Liu y cols. 2005, 2007) y Babesia U sp. en

vacas, cuya transmisión posiblemente está relacionada con Hy. anatolicum anatolicum (Luo y cols.

2002, 2003, 2005).


38


36

1.2.2.2 Las babesias de los pequeños rumiantes

La especie de Babesia más importante en el ganado ovino por su amplia distribución y

patogenicidad es B. ovis. Está descrita en África, Asia, centro y sur de América y Europa, asociada

a la distribución de R. bursa, su único vector conocido (Friedhoff 1997). En Europa se han descrito

tanto en el este de Europa como en el área mediterránea incluyendo España (Aktas y cols. 2007;

Ferrer y cols. 1998a; Friedhoff 1997; Habela y cols. 1990b; Papadopoulos y cols. 1996b; Savini y

cols. 1999; Simón-Vicente y cols. 1987).

La taxonomía de las babesias ovinas es confusa y existen ciertas controversias sobre la

identidad de B. motasi, ya que bajo esta denominación se engloba lo que podrían ser al menos tres

babesias distintas. En la bibliografía se halla la descripción de una babesia ovina denominada B.

motasi, transmitida por R. bursa (Friedhoff 1988) y H. punctata (Alani y Herbert 1988b). Se han

descrito casos de B. motasi en Europa, en países como Alemania, Gran Bretaña, Holanda y España

(Friedhoff 1988; Simón-Vicente y cols. 1987). Las investigaciones llevadas a cabo por Alani y

Herbert (1988b), Lewis y cols. (1981) y Uilenberg y cols. (1980) concluyeron que las descripciones

realizadas en la especie B. motasi comprendían al menos dos subespecies, B. motasi (Países

Bajos/Gales) y B. motasi (Turquía), difiriendo entre ellas en su patogenicidad para ovejas y cabras,

su respuesta inmune, infectividad e incluso morfología.

En el ganado ovino también se han realizado descripciones de otras babesias como la especie

B. crassa descrita en Irán (Hashemi-Fesharki y Uilenberg 1981) de vector desconocido y

representada también por dos variantes geográficas: Babesia sp. (Turquía) y B. crassa (Iran)

(Schnittger y cols. 2003). Además, se ha descrito una Babesia sp. (China) en China que ha sido

relacionada con B. motasi (Bai y cols. 2002). Sin embargo, ambas babesias difieren en

patogenicidad y en la especie vectora implicada (Schnittger y cols. 2003). A diferencia de B.

motasi, Babesia sp. (China) es muy patógena tanto para ovejas y cabras, y es transmitida por

Haemaphysalis longicornis.

1.2.2.3 Las babesias equinas

La babesiosis equina, también conocida como piroplasmosis equina, engloba a un grupo de

enfermedades de amplia distribución mundial causadas por B. caballi (Nuttall y Strickland 1910) y

la recientemente reclasificada Theileria (Babesia) equi (Mehlhorn y Schein 1998). Está presente en

todos los continentes y se ha descrito en la mayoría de los équidos domésticos e incluso en los

silvestres como la cebra (Equus cebra) (Camacho y cols. 2005a; Coleto 1999; Mehlhorn y Schein

1998; Penzhorn 2006; Uilenberg 1995; Zweygarth y cols. 2002). Las garrapatas vectoras

implicadas en su transmisión comprenden los géneros Dermacentor, Hyalomma y Rhipicephalus

(Battsetseg y cols. 2001; Friedhoff 1988; Mehlhorn y Schein 1998; Uilenberg 1995). Asimismo,


39


37

Stiller y cols. (2002) demostraron experimentalmente la competencia vectora de las garrapatas

adultas macho de Dermacentor variabilis y Dermacentor nitens en la transmisión respectiva de B.

caballi y T. equi. En el caballo se ha detectado por técnicas moleculares la presencia de otras

babesias propias de otros hospedadores como B. bigemina, B. bovis y B. canis (Buling y cols. 2007;

Criado-Fornelio y cols. 2003b, 2006).

1.2.2.4 Las babesias de los rumiantes silvestres

La fauna silvestre es importante en el mantenimiento y multiplicación de las poblaciones de

garrapatas (Gilot y cols. 1994; Pichon y cols. 1999), y por ello se considera una población de

interés en el estudio de la epidemiología de ciertas piroplasmosis. La primera referencia de

babesiosis en los rumiantes silvestres data de 1962, cuando Enigk y Friedhoff (1962) aislaron y

describieron un protozoo en un corzo (Capreolus capreolus) procedente de Alemania, al que

denominaron B. capreoli. Posteriormente, se han realizado otras descripciones en el continente

europeo de esta especie y de B. divergens en reno (Rangifer tarandus tarandus), corzo y ciervo

(Cervus elaphus y Cervus nippon) (Duh y cols. 2005b; Gray y cols. 1991; Langton y cols. 2003).

En Europa también se ha identificado una nueva Babesia de vector desconocido, Babesia sp. EU1,

en cérvidos de Eslovenia (Duh y cols. 2005b) y en I. ricinus en Eslovenia y Suiza (Duh y cols.

2001, 2005a; Hilpertshauser y cols. 2006). Recientemente se ha detectado también en la especie de

garrapata H. punctata (Hilpertshauser y cols. 2006).

La presencia de babesias en los rumiantes silvestres de EE.UU. se encuentra ampliamente

documentada. Por ejemplo, la especie B. odocoilei, ha sido descrita como el agente responsable de

babesiosis en cérvidos de EE.UU., como el ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus), reno

(Rangifer tarandus tarandus), caribú (Rangifer tarandus caribou) y alce (Cervus elaphus

canadensis) (Gallatin y cols. 2003; Holman y cols. 2000, 2003). Esta especie de babesia no es

específica de los cérvidos, ya que se han descrito casos en bóvidos silvestres: buey almizclado

(Ovibos moschatus) (Schoelkopf y cols. 2005) y muflón canadiense del desierto (Ovis canadensis

nelsoni) (Schoelkopf y cols. 2005; Thomford y cols. 1993). La especie de garrapata responsable de

transmitir este agente en EE.UU. es I. scapularis (Steiner y cols. 2006; Waldrup y cols. 1990).

Además, se han detectado otras babesias todavía sin clasificar en el reno (Holman y cols. 2002),

ciervo mulo (Odocoileus hemionus) y muflón canadiense del desierto (Goff y cols. 1993; Thomford

y cols. 1993; Yabsley y cols. 2005a).

La información disponible en los rumiantes silvestres de España se limita a estudios de

seroprevalencia o casos clínicos sobre la presencia de B. ovis en el muflón (Ovis musimon) (Ferrer

y cols. 1998b) y en la cabra pirenaica (Capra pyrenaica) (Ferrer y cols. 1998c; Marco y cols.

2000).


40


38

1.2.2.5 Las babesias caninas

A escala mundial, la especie que más frecuentemente parasita a los perros es B. canis. En la

pasada década se reconocieron tres subtipos o subespecies de B. canis con características

morfológicas semejantes, pero con diferencias patogénicas, antigénicas, genéticas, así como

diferencias en la especie de garrapata vectora. Como consecuencia, algunos autores han debatido si

considerarlas como subespecies o como especies distintas (Carret y cols. 1999; Uilenberg y cols.

1989; Zahler y cols. 1998). Además, su distribución es sustancialmente diferente. B. canis rossi ha

sido descrita en África, ligada a la distribución de su vector Haemaphysalis leachi (Lewis y cols.

1996; Matjila y cols. 2004; Oyamada y cols. 2005; Uilenberg y cols. 1989). Por otro lado, B. canis

canis y B. canis vogeli tienen una distribución semejante y más cosmopolita que B. canis rossi. Se

ha descrito su presencia en Europa, norte de América, Australia y África (Birkenheuer y cols. 2005;

Caccio y cols. 2002; Criado-Fornelio y cols. 2003b; Duh y cols. 2004; Foldvari y cols. 2005;

Jefferies y cols. 2003; Matjila y cols. 2004, 2005). Estas dos babesias difieren en su vector, ya que

B. canis canis es transmitida por D. reticulatus y B. canis vogeli por R. sanguineus (Rar y cols.

2005b; Uilenberg y cols. 1989). Otra babesia que afecta a los perros es B. gibsoni, una pequeña

babesia con similar distribución a B. canis canis y B. canis vogeli, y transmitida por

Haemaphyhsalis spp. y Rhipicephalus spp. (Birkenheuer y cols. 2003; Casapulla y cols. 1998;

Jefferies y cols. 2003; Uilenberg 2001; Yamane y cols. 1993; Zahler y cols. 2000b). Recientemente

se han realizado nuevas descripciones de babesias en perros de EE.UU. como Babesia sp. (Coco)

North Carolina (Birkenheuer y cols. 2004) y B. conradae (Kjemtrup y cols. 2006). En España se ha

descrito la presencia de B. canis canis, B. canis vogeli y B. gibsoni (Criado-Fornelio y cols. 2003a,

2003b, 2007; Suárez y cols. 2001).

1.2.2.6 Las babesias en la especie humana

El hombre también puede ser infectado por Babesia spp. Se han descrito varias especies de

Babesia asociadas a babesiosis humana, como B. microti, B. divergens y varios genotipos de

Babesia: WA1, CA1, MO1, EU1 y KO1 (Gorenflot y cols. 1998; Herwaldt y cols. 2003; Kim y

cols. 2007). De forma anecdótica se han descrito casos, diagnosticados por microscopia, y

relacionados con B. canis (Marsaudon y cols. 1995) y B. bovis (Calvo de Mora y cols. 1985).

El agente etiológico principal de la babesiosis humana en Estados Unidos es B. microti donde

el ratón de patas blancas (Peromyscus leucopus) actúa de reservorio (Telford, III y Spielman 1993)

y es transmitida por I. scapularis (Holman y cols. 2004; Piesman y Spielman 1980). La babesiosis

por B. microti es considerada en EE.UU. como una enfermedad emergente (Foppa y cols. 2002;

Homer y cols. 2000; Kjemtrup y Conrad 2000). A pesar de que B. microti es responsable de la

mayoría de los casos clínicos (Homer y cols. 2000), en los últimos años se han descrito otras

babesias patógenas como Babesia sp. WA1 (Washington), Babesia sp. CA1 (California) y Babesia


41


39

sp. MO1 (Missouri) en personas esplectomizadas (Gorenflot y cols. 1998; Kjemtrup y Conrad

2000). Recientemente, gracias a la caracterización de dos aislados del tipo WA1 y CA5 (Kjemtrup

y cols. 2002; Quick y cols. 1993), se ha descrito una nueva especie que afecta al hombre a la que se

ha denominado B. duncani (Conrad y cols. 2006).

El primer caso de babesiosis humana documentado en Europa data de 1957 y fue atribuido a B.

bovis, causando la muerte en un granjero yugoslavo esplectomizado (Skrabalo y Deanovic 1957).

Dado que la mayoría de las descripciones posteriores realizadas en Europa se relacionaron con B.

divergens y puesto que en ocasiones el diagnóstico microscópico de las especies de babesia es

difícil, lo más probable es que el agente causal de aquel primer caso fuera también B. divergens. A

partir de esa fecha, se han identificado una treintena de casos por B. divergens, al menos 26 de ellos

en pacientes esplectomizados, en Francia, Reino Unido, España, Portugal, Suecia, ex-Yugoslavia y

la ex-Unión Soviética (Centeno-Lima y cols. 2003; Gorenflot y cols. 1998). En Europa, los

micromamíferos constituyen el principal reservorio de B. microti y las garrapatas vectoras son las

especies I. trianguliceps e I. ricinus (Karbowiak 2004; Randolph 1995), aunque hasta la fecha no se

ha encontrado que I. trianguliceps parasite al hombre. Ciertos estudios demuestran su presencia en

la garrapata I. ricinus tanto de forma experimental (Gray y cols. 2002b) como en estudios de campo

realizados en Polonia, en Eslovenia y en Suiza (Duh y cols. 2001; Foppa y cols. 2002; Sinski y

cols. 2006; Skotarczak y Cichocka 2001). Estudios realizados en el hombre, demuestran la

respuesta serológica frente a B. microti en Alemania y Suiza, asociada a pacientes expuestos a

picadura de garrapatas (Foppa y cols. 2002; Hunfeld y cols. 2002). En 2004 se diagnosticó en un

paciente suizo una coinfección de Babesia sp. con la enfermedad de Lyme (Meer-Scherrer y cols.

2004). Recientemente se han caracterizado los primeros casos de babesiosis en el hombre por

Babesia sp. EU1 (nombre provisional “Babesia venatorum”), presente también en los cérvidos

(Haselbarth y cols. 2007; Herwaldt y cols. 2003).

En España se han diagnosticado varios casos de babesiosis producida por B. divergens (Calvo

de Mora y cols. 1985; Moreno Giménez y cols. 2006; Olmeda y cols. 1997), entre los que cabe

destacar un caso en las Islas Canarias, diagnosticado molecularmente (Olmeda y cols. 1997). Sin

embargo, las descripciones de la presencia en España de B. microti se limitan a un estudio realizado

en larvas de I. ricinus en la Rioja (Estrada-Peña y cols. 2005).

1.2.2.7 Otras babesias

Se ha descrito la presencia de babesias en otras especies de animales domésticos como B.

perroncitoi y B. trautmanni en el ganado porcino y B. felis en los félidos (Uilenberg 1995), de

distribución limitada (Tabla 3).


42


40

1.2.2.8 Babesiosis: sintomatología y lesiones

Los animales afectados por babesiosis, tras un periodo de incubación de una a tres semanas,

desarrollan una serie de síntomas inespecíficos como hipertermia, decaimiento general, anorexia,

deshidratación, alteraciones digestivas, taquicardia, taquipnea y una bajada drástica de la

producción lechera en los animales en producción. La mayoría de los síntomas descritos en esta

enfermedad, así como la muerte de los animales afectados, son consecuencia de la anoxia tisular,

originada a su vez por la anemia, trombosis y edemas, procesos no presentes siempre ya que

dependen del curso de la enfermedad (que puede cursar desde una forma asintomática hasta una

forma severa), de la especie y cepa de babesia y de factores relacionados con el hospedador como

la edad, el estado sanitario y nutricional, el estatus inmunitario, la susceptibilidad y otros factores

como la coinfección con otros agentes (Kakoma y Mehlhorn 1994). La fiebre puede ocasionar

abortos en el ganado vacuno en gestación (Radostis y cols. 2000).

Las babesias con mayor importancia veterinaria en el ganado vacuno son B. bigemina y B.

bovis, en las regiones tropicales y subtropicales del planeta y B. divergens en Europa. La

patogénesis de la infección por B. bigemina y B. divergens está relacionada con la severidad de la

hemólisis intravascular que desencadenan, a su vez determinada por el grado de parasitemia y el

número de eritrocitos destruidos o alterados estructuralmente. Los principales efectos se deben a

una anemia hemolítica aguda, seguida de una congestión severa y una sobrecarga de los órganos

responsables de la limpieza de la hemoglobina y de los restos celulares de la circulación

instaurándose rápidamente la hemoglobinuria y la ictericia. Sin embargo, sólo una pequeña

proporción de casos son fatales (Kakoma y Mehlhorn 1994; Zintl y cols. 2003). Por el contrario, B.

bovis puede causar la muerte a más de la mitad de los animales susceptibles infectados. En la fase

inicial de la enfermedad se observa un marcado descenso del hematocrito debido en gran parte a la

hemodilución asociada al estasis circulatorio más que a la destrucción eritrocítica (Wright y Kerr

1977). Los eritrocitos infectados sufren un secuestro en los capilares, especialmente en el cerebro y

pulmón desencadenando una disfunción cerebral (forma nerviosa) y pulmonar asociada a la

infiltración de neutrófilos, con aumento de la permeabilidad vascular y edema (Wright y cols.

1989). Se observa una baja parasitemia en sangre periférica (0.2–0.04%) y una anemia no

hemolítica. En los casos agudos los animales mueren de forma fulminante mostrando un shock

hipotensivo severo. En los casos en que no se produzca la muerte, en el curso de la enfermedad

causada por B. bovis se llega a instaurar una anemia hemolítica (Kakoma y Mehlhorn 1994).

Además, la sobreproducción de citoquinas proinflamatorias que se excretan durante la respuesta

inmune del hospedador contribuye a la gravedad del proceso (Ahmed 2002).

Las infecciones subagudas se caracterizan por una hipertermia leve sin hemoglobinuria.

Frecuentemente se producen en animales jóvenes procedentes de zonas endémicas que han recibido


43


41

una protección pasiva a través del calostro o poseen una inmunidad adquirida. En el caso de

superar la fase clínica de la infección, el animal quedará como portador asintomático del parásito

una vez alcanzado un equilibrio entre su sistema inmune y el parásito. Sin embargo, este estado de

equilibrio puede desaparecer a consecuencia de una situación de estrés como el parto, transporte u

otros procesos concomitantes que sufra el animal, dando lugar a recidivas (Radostis y cols. 2000).

En los animales que sufren un cuadro severo de curso rápido, como hallazgos postmortem

generalmente se observan ictericia y anemia generalizadas. En la mayoría de los órganos y tejidos

aparece congestión, hemorragia y edema generalizado como consecuencia del aumento de la

permeabilidad vascular. En el bazo se observa esplenomegalia, congestión y consistencia friable. El

hígado presenta hepatomegalia, color amarillento, y la vesícula biliar distendida con bilis espesa.

Asimismo, los riñones se encuentran aumentados de tamaño con una coloración oscura. La vejiga

contiene orina de color marrón rojizo característico de la hemoglobinuria. En los pulmones se

pueden observar hemorragias y edema alveolar, mientras que en el corazón aparecen equimosis e

hidropericardias (Radostis y cols. 2000). En cuanto al sistema nervioso central, en las infecciones

agudas de B. bovis se observa congestión en el cerebro (Callow y McGavin 1963). En los animales

que desarrollaron un cuadro subagudo o crónico, se encuentra una marcada emaciación y se

observan las mismas lesiones que en el cuadro agudo, pero con una menor gravedad, y sin la

presencia de hemoglobinuria (Radostis y cols. 2000).

La enfermedad en el ganado equino es de curso rápido, con un periodo de incubación entre 12

y 30 días y una hipertermia persistente (Schein 1988). Aparte de los signos descritos anteriormente,

son característicos el edema en las partes distales y los trastornos gastrointestinales, como cólicos y

diarreas (Radostis y cols. 2000). En el ganado ovino la infección por B. ovis cursa con fiebre,

ictericia y hemoglobinuria y con una anemia severa en los animales jóvenes. No se observa

secuestro de hematíes infectados en los capilares del cerebro (Yeruham y cols. 1998). Sin embargo,

las lesiones histológicas observadas sugieren que la enfermedad cursa con un shock hipovolémico

(Habela y cols. 1991). En los perros se observa una variación en las manifestaciones clínicas

dependiendo de la especie o subespecie, siendo B. canis rossi la más patógena. Los hallazgos

clínico-patológicos principales son la anemia hemolítica, neutropenia y trombocitopenia

(Furlanello y cols. 2005). Sin embargo, también se ha descrito en los perros el padecimiento de

anemia no hemolítica y una baja parasitemia durante la fase aguda de la enfermedad (Schetters y

cols. 1998).

1.2.3 EL GÉNERO THEILERIA

Koch (1898) fue el primero en detectar Theileria parva en el vacuno del este de África, aunque

inicialmente pensó que el organismo era un estadio temprano de B. bigemina. Posteriormente

Dschunkowsky y Luhs (1904) identificaron Piroplasma annulatum (T. annulata) junto con


44


42

Piroplasma bigeninum (B. bigemina), siendo ésta la primera referencia de infección mixta por

piroplasmas. El papel de las theilerias como patógeno del ganado vacuno se difundió a principios

del siglo XX, cuando se identificó a Piroplasma parvum (T. parva) como el agente causal del brote

de “East Coast Fever” o “Rhodesian tick fever” (ECF) que arrasó Rhodesia (Zimbabwe) y

Sudáfrica entre 1902 y 1910 (Theiler 1903). Posteriormente Theiler (1906), realizó la descripción

de otro parásito, Piroplasma mutans (Theileria mutans), que también afectaba al ganado vacuno

causando fiebre moderada. Levine (1988) revisó las especies de theilerias identificadas hasta la

fecha y recopiló información de aproximadamente una treintena de especies. Hoy en día si bien se

han descrito nuevas theilerias (Theileria sp. (China 1), Theileria sp. (China 2) y T. annae)

solamente se ha estudiado ampliamente la epidemiología y caracterización molecular de algunas de

ellas (Tabla 4).

Tabla 4. Principales especies de theilerias y características de hopedador, vector y distribución

Especie Hospedador Vector Distribución Año

descripción

T. annae perro, carnívoros I. hexagonus ? Europa, Japón, EE.UU. 2000

T. annulata vacuno, búfalo Hyalomma spp. Europa, Asia, África 1904 T. buffeli/orientalis/sergenti vacuno Haemaphysalis spp., H. punctata Mundial 1912 T. capreoli corzo ? 1939 T. cervi cérvidos Amblyomma americanum EE.UU. 1907

T. equi équidos Dermacentor spp., Hyalomma spp., Rhipicephalus spp. Mundial 1901

T. lestoquardi ovino Hy. anatolicum anatolicum Europa, Asia, África 1924

T. mutans vacuno, búfalo Amblyomma spp., Rhipicephalus spp., Haemaphysalis spp., Boophilus spp. África, Caribe 1909

T. ovis ovino Rhipicephalus spp., Haemaphysalis spp. Europa, Asia, África 1916 T. parva vacuno, búfalo Rhipicephalus spp., Hyalomma spp. África 1904 T. recondita ovino H. punctata Europa 1929 T. separata ovino R. evertsi África 1974 T. taurotragi vacuno Rhipicephalus spp. África 1960 T. velifera vacuno Amblyomma spp. África, Caribe 1964 Theileria sp. ciervo sika ? Japón 2004 Theileria sp. (China 1) ovino H. qinghaiensis China 2002 Theileria sp. (China 2) ovino H. qinghaiensis China 2002

Theileria sp. MK ovino ? Turquía 2007 ?: vector desconocido o no demostrado. Fuente: Altay y cols. 2007; Inokuma y cols. 2004; Levine 1988; Soulsby 1982;

Uilenberg 1995; Yin y cols. 2002; Zahler y cols. 2000a.

1.2.3.1 Las theilerias bovinas

Se han identificado al menos seis especies de Theileria que infectan al ganado vacuno y al

búfalo: T. parva y T. annulata, especies ambas muy patógenas, y T. mutans, T. velifera, T.

taurotragi y el grupo de T. buffeli/orientalis/sergenti (Uilenberg 1995), al parecer, de baja

patogenicidad. Estas últimas no producen una sintomatología clínica a menos que el animal


45


43

padezca situaciones de estrés, como el parto, cambios de manejo, etc, u otras infecciones

concurrentes (Cossio-Bayugar y cols. 2002; Kakuda y cols. 1998).

Globalmente la especie más importante, debido a su patogenicidad es T. parva. Cursa con una

alta mortalidad (90-100%) en animales no inmunes que se introducen por primera vez en zonas

endémicas, donde las razas locales (Bos indicus) son más resistentes. Esta especie posee una

distribución limitada y asociada al vector, en el este, centro y sur de África. Es transmitida por

garrapatas del género Rhipicephalus, siendo R. appendiculatus su vector principal (Konnai y cols.

2006; Ogden y cols. 2003; Watt y cols. 1997). En las áreas más secas de Sudáfrica los vectores

implicados podrían ser Rhipicephalus zembeziensis y Rhipicephalus duttoni (Perry y Young 1993).

El búfalo africano del Cabo (Syncerus caffer) y el antílope cobo (Kobus defassa) se han descrito

como los hospedadores naturales y asintomáticos de T. parva (Morrison 1996; Stagg y cols. 1994).

T. annulata es el agente causal de la theileriosis tropical o mediterránea en el ganado vacuno y

en búfalos (Mehlhorn y cols. 1994; Osman y Al Gaabary 2007). Esta theileria posee una

distribución más amplia, aunque sin superponerse con T. parva. Se han descrito casos en el norte

de África, en la India, China y en el sur de Europa en países como Turquía, Grecia e Italia (Aktas y

cols. 2006; Flach y Ouhelli 1992; Georges y cols. 2001; Luo y Lu 1997; Manuja y cols. 2006;

Papadopoulos y cols. 1996a; Torina y cols. 2007b). La patogenicidad de T. annulata es más

variable que la de T. parva, dándose una tasa de mortalidad que oscila entre el 10 y 90% (Levine

1985). T. annulata se transmite por garrapatas del género Hyalomma (Levine 1985; Reid y Bell

1984; Uilenberg 1995). En España la mayoría de los casos clínicos se localizan en el centro, este y

sur del país, donde sus vectores Hyalomma lusitanicum y Hyalomma marginatum marginatum son

abundantes (Almería y cols. 2002; Estrada-Peña y cols. 2004; Gubbels y cols. 1999; Habela y cols.

1999; Viseras y cols. 1999).

El término theileriosis oriental engloba los procesos causados por un grupo de theilerias de

baja patogenicidad (T. buffeli/orientalis/sergenti) de distribución mundial, morfológicamente

indistinguibles y transmitidas por las garrapatas del género Haemaphysalis (Uilenberg 1995). En

Europa está ampliamente distribuida (Almería y cols. 2002; Brigido y cols. 2004; Georges y cols.

2001; Papadopoulos y cols. 1996a). Hasta la fecha no se ha llegado a un consenso para considerar a

este grupo como una única especie, aunque Gubbels y cols. (2000a) sugirieron que T. buffeli sería

el nombre más apropiado para esta theileria que constituiría una única especie.

1.2.3.2 Las theilerias de los pequeños rumiantes

La especie más patógena que afecta al ovino y caprino es T. lestoquardi (syn. Theileria hirci)

(Hooshmand-Rad y Hawa 1973a), responsable de la theileriosis maligna de las ovejas y cabras. Se

encuentra distribuida por el norte de África, Asia y sureste de Europa (Friedhoff 1997). Su


46


44

transmisión ha sido atribuida a varias especies de garrapatas, aunque la única confirmada es Hy.

anatolicum anatolicum (Hooshmand-Rad y Hawa 1973b). T. lestoquardi posee características

morfológicas e inmunológicas semejantes a T. annulata (Brown y cols. 1998) y su cercana relación

filogenética ha sido confirmada por el estudio del gen 18S rRNA (Katzer y cols. 1998).

Recientemente se han descrito en China dos genotipos de Theileria altamente patógenos para

los pequeños rumiantes, Theileria sp. (China 1) y Theileria sp. (China 2) transmitidos por

Haemaphysalis qinghaiensis (Yin y cols. 2002). Inicialmente, Luo y Yin (1997) pensaron que se

trataba de una única Theileria, probablemente T. lestoquardi (T. hirci). Sin embargo, en estudios

posteriores determinaron molecularmente que correspondían a dos genotipos diferentes (Schnittger

y cols. 2003; Yin y cols. 2004). A estas dos theilerias se les ha comenzado a denominar como

Theileria luwenshuni y Theileria uilenbergi, respectivamente (Ahmed y cols. 2006; Yin y cols.

2004).

Entre las theilerias benignas descritas en el ganado ovino y caprino se encuentran T. ovis, T.

separata, T. recondita y Theileria sp. MK. T. ovis se transmite por R. bursa, R. evertsi y H.

punctata, y experimentalmente se ha demostrado su transmisión por R. haemaphysaloides. Su

distribución incluye África, Asia y Europa (Estrada-Peña y cols. 2004; Levine 1985; Neitz 1972;

Uilenberg 1995). En cambio, T. separata se localiza únicamente en África y es transmitida

solamente por R. evertsi (Uilenberg 1995). La tercera theileria benigna de los pequeños rumiantes,

T. recondita, posee una identidad controvertida. Según Uilenberg (1995) la Theileria descrita por

Alani y Herbert (1988a) y Enigk (1953) es diferente a la T. recondita descrita por Lestoquard en

1929. La única especie de theileria descrita en España entre los pequeños rumiantes es T. ovis

(Ferrer y Castellá 1999; Juste y cols. 1986). Gracias a la biología molecular Altay y cols. (2007)

han identificado recientemente un nuevo genotipo, Theileria sp. MK, ampliamente distribuido entre

la población sana de ganado ovino y caprino de Turquía, y por tanto considerado de momento

como apatógeno.

1.2.3.3 Las theilerias equinas

Al comienzo de este estudio los únicos piroplasmas descritos en el equino eran B. caballi y B.

equi, esta última reclasificada por Mehlhorn y Schein (1998) como T. equi, si bien algunos autores

siguen utilizando la acepción antigua de B. equi. Las características de esta theileria se han descrito

en el apartado de las babesiosis equinas.

1.2.3.4 Las theilerias de los rumiantes silvestres

Bettencourt y cols. (1907) describieron por primera vez la presencia de una theileria en los

eritrocitos de un gamo (Cervus dama) en Portugal a la que denominaron Theileria cervus. A


47


45

mediados del siglo XX, en Estados Unidos Kreier y cols. (1962) identificaron una Theileria en

ciervo (Dama virginiana) a la que Schaeffler (1963) denominó T. cervi. En un estudio realizado

años más tarde por Kocan y cols. (1987) sobre la susceptibilidad del gamo (Cervus dama) a T.

cervi, concluyeron que ambas descripciones podrían no corresponder a la misma especie. En

estudios posteriores se ha descrito T. cervi en varias especies de cérvidos como el ciervo de cola

blanca (Odocoileus virginianus), ciervo axis (Axis axis), ciervo sika (Cervus nippon), ciervo mulo

(Odocoileus hemionus) y alce (Cervus elaphus canadensis) (Chae y cols. 1999; Waldrup y cols.

1989; Yabsley y cols. 2005b). T. cervi, considerada una especie benigna, puede ser patógena en

situaciones especiales que provoquen estrés en el animal (Barker y cols. 1973; Yabsley y cols.

2005b). En varios trabajos se ha implicado a A. americanum como el principal vector de T. cervi

(Barker y cols. 1973; Kocan y cols. 1987; Laird y cols. 1988; Waldrup y cols. 1992). Además de T.

cervi se han descrito otras dos theilerias en cérvidos, T. capreoli en el corzo por Rukhlyadev en

1939 y una Theileria sp. en el ciervo sika (Cervus nippon centralis) (Inokuma y cols. 2004). En

España, el único conocimiento que tenemos de piroplasmosis en los rumiantes silvestres es el

hallazgo de una theileria en un ciervo importado y en rebecos del Pirineo (Hofle y cols. 2004;

Hurtado y cols. 2004).

1.2.3.5 Las theilerias caninas

Zahler y cols. (2000a) describieron la existencia de un piroplasma pequeño al que

denominaron T. annae (Babesia microti-like), que afectaba a los perros pero que difería de las otras

babesias descritas en esta especie y se encontraba genotípicamente relacionado con B. microti.

Hasta la actualidad no se ha demostrado la fase exoeritrocítica del ciclo biológico de este agente,

uno de los criterios clásicos de clasificación de Theileria spp. (Uilenberg 2006), como

consecuencia algunos autores prefieren denominarla Babesia annae. La información disponible

sobre este agente es escasa, aunque recientemente se ha descrito su presencia en perro, gato, zorro,

mapache, mofeta y ardilla de Estados Unidos, Japón, Portugal y España (Criado-Fornelio y cols.

2003d, 2007; Goethert y Telford, III 2003; Kawabuchi y cols. 2005; Tsuji y cols. 2006). En España

ha sido descrita en perros de Galicia y zorros de Guadalajara (Camacho y cols. 2001; Criado-

Fornelio y cols. 2003b). El único conocimiento que se posee del vector es el estudio llevado a cabo

en Galicia en el que relacionaron a I. hexagonus como su vector potencial (Camacho y cols. 2003).

Anecdóticamente, se ha detectado molecularmente la presencia de T. equi y T. annulata en el perro

(Criado-Fornelio y cols. 2003b, 2006).

1.2.3.6 Theileriosis: sintomatología y lesiones

Al igual que en las babesiosis, el cuadro clínico varía desde una forma aguda a la crónica. El

cuadro agudo suele aparecer en los animales que no han tenido contacto previo con el parásito,


48


46

como en el caso de la introducción de animales procedentes de zonas indemnes a zonas endémicas.

La forma crónica se puede observar en el ganado ya sensibilizado o portador que sufre otro proceso

concomitante, reactivándose la theileriosis.

El primer signo clínico que desarrollan los animales afectados es la linfadenopatia regional

próxima al lugar de la picadura de la garrapata. Las theilerias se diseminan a través de la vía

linfática a otros órganos linfoides, donde tiene lugar la necrosis y depleción linfoide con la

destrucción de los linfocitos parasitados y consiguiente inmunosupresión del animal, aumentando

su susceptibilidad a padecer otro proceso concomitante. Posteriormente, el parásito invade los

eritrocitos dando lugar a una anemia hemolítica y ligera ictericia (Mehlhorn y cols. 1994). Los

mecanismos que desencadenan la anemia no están del todo claros. Se le ha relacionado con una

serie de procesos que desencadenan la destrucción masiva de los eritrocitos ya sea por la vasculitis,

los microtrombos desarrollados o por la destrucción por proteasas, unido al daño oxidativo

originado en los mismos. También le han sido asignadas causas de origen autoinmune (McGavin y

Zachary 2007; Mehlhorn y cols. 1994; Radostis y cols. 2000). Esta última fase, característica de los

casos de curso agudo o subagudo de la infección causada por T. annulata, es infrecuente en las

infecciones por T. parva (Mehlhorn y cols. 1994; Radostis y cols. 2000).

Los animales afectados por T. annulata, tras un periodo de incubación de entre una y tres

semanas, desarrollan un síndrome febril con falta de apetito, debilidad, taquipnea y taquicardia y

una reducción drástica de la producción lechera. Al igual que en la babesiosis, la pirexia puede

provocar el aborto. Asimismo, es frecuente observar lagrimeo, sialorrea, fluido nasal abundante y

fases alternadas de constipación y diarrea que dan paso a una diarrea que puede llegar a ser

sanguinolenta en los casos graves. En algunas ocasiones más del 80% de los hematíes circulantes

se encuentran parasitados. En estos animales se observa ictericia y linfadenomegalia

(especialmente en la forma aguda). La muerte sobreviene a los 15-20 días de los primeros signos

clínicos a causa de la anemia y emaciación. En ocasiones se observa bilirrubinenia y

hemoglobinuria previas a la muerte del animal. En la necropsia se observa la canal muy pálida y

ligeramente ictérica. También se han descrito petequias en las mucosas, submucosas y tejido

conjuntivo subcutáneo. Además, se observa esplenomegalia, hepatomegalia e hipertrofia

ganglionar. Otro hallazgo de necropsia es la presencia de una vesícula biliar repleta de una bilis

espesa. En el bazo se observa hemosiderosis. En el aparato digestivo se han descrito úlceras

abomasales en los casos más graves, y lesiones de tipo inflamatorio de distinto grado. En los

riñones destaca la glomerulonefritis, así como la nefritis intersticial. También se observan infartos

renales. Es constante la presencia de un edema pulmonar leve (Mehlhorn y cols. 1994; Soulsby

1982).


49


47

Los signos clínicos que se observan en los animales afectados por T. parva son similares, si

bien cursa de forma más severa y con una pirexia constante hasta la muerte del animal. Uno de los

primeros síntomas que se origina es la linfadenomegalia, para instaurarse en los dos días siguientes

los síntomas ya detallados anteriormente. En pocos días el animal muere por asfixia, como

consecuencia del fallo cardiorrespiratorio desencadenado. Las lesiones postmortem son similares a

las producidas en las infecciones por T. annulata, si bien la lesión más característica y de mayor

relevancia es la congestión y el edema pulmonar masivo que se acompaña de hiperemia, hidrotórax

e hidropericardio. Las hemorragias afectan a casi todos los tejidos y órganos (Mehlhorn y cols.

1994; Radostis y cols. 2000; Soulsby 1982).

Acompañando al síndrome sobreagudo se han descrito casos de theileriosis cerebral por T.

parva y esporádicamente por T. annulata. En los animales afectados preceden a la muerte del

animal diversos síntomas nerviosos como convulsiones, parálisis espástica, seguida de parálisis

flácida, producidas por los microinfartos corticales, formados por el secuestro de linfoblastos

infectados en los capilares sanguíneos (Dabak y cols. 2004; Mehlhorn y cols. 1994; Radostis y cols.

2000).

La piroplasmosis equina producida por T. equi es de curso más severo que por B. caballi. El

periodo de incubación es algo menor, oscilando entre 12 y 15 días. A diferencia de las infecciones

por B. caballi, la hipertermia es intermitente, si bien T. equi y B. caballi comparten un cuadro

lesional similar. No obstante, el síntoma diferencial de T. equi es la linfadenopatia y la anemia

profusa producida por una parasitemia masiva (Schein 1988).

En los perros afectados por T. annae se observa una anemia regenerativa severa,

trombocitopenia y hemoglobinuria. Los signos clínicos más frecuentes, como en otras

piroplasmosis, son la apatia, anorexia, hipertermia aunque tambien son frecuentes los signos

neuromusculares y en algunas ocasiones se observa linfadenopatia, problemas digestivos y

respiratorios (Camacho y cols. 2001, 2005b, 2006; Guitian y cols. 2003). La forma hiperaguda

suele cursar en los animales esplectomizados (Camacho y cols. 2002).

El complejo T. buffeli/orientalis/sergenti provoca un cuadro de curso benigno en el ganado

bovino (Uilenberg y cols. 1985). Sin embargo, en ocasiones en que el animal se encuentra

inmunocomprometido, puede presentarse una expresión clínica de theileriosis exacerbada (Cossio-

Bayugar y cols. 2002). De forma similar sucede en las infecciones por T. cervi (Barker y cols.

1973; Yabsley y cols. 2005b).


50


48

1.3 EPIDEMIOLOGÍA DE LAS PIROPLASMOSIS

La epidemiología de las piroplasmosis de una zona varía en función de la interacción de varios

factores como las especies animales presentes y su manejo, la presencia de reservorios de la

enfermedad, la interacción entre el parásito y las especies de garrapatas de la zona, y el nivel de

infestación por garrapatas.

La mejora de las producciones en los animales de abasto ha traído consigo la introducción de

líneas mejoradas a zonas donde históricamente el ganado local, el vector y el agente, mantenían un

equilibrio estable. El vacuno europeo, Bos taurus, es extremadamente susceptible a la infección por

T. annulata. Según los estudios realizados en varias razas indígenas Bos indicus de zonas

endémicas, éstas muestran un grado de resistencia mayor que B. taurus a este agente (Bakheit y

Latif 2002; Glass y cols. 2005). Se ha observado una resistencia similar a T. parva (Paling y cols.

1991) y a T. sergenti (Terada y cols. 1995). Igualmente, las razas B. indicus desarrollan una

sintomatología clínica menos severa en la primoinfección por Babesia (Bock y cols. 1997, 1999b).

Se sospecha que este fenómeno es resultado de una relación evolutiva entre Bos indicus, la

garrapata vectora y Babesia spp. (Dalgliesh 1993). En cualquier caso, aunque la mayoría de los

estudios concluyen que las razas locales son mucho más resistentes, existen ciertas ambigüedades

en la bibliografía (Bock y cols. 1999a; Ndungu y cols. 2005).

La epizootiología estudia el conjunto de interacciones entre el protozoo, las garrapatas

vectoras, el hospedador vertebrado y los factores ambientales (Estrada y cols. 1985). La

epizootiología de las babesiosis ha sido objeto de diversos estudios en los que se han utilizado

distintos modelos matemáticos (Joyner y Donnelly 1979; Mahoney 1974; Mahoney y Ross 1972),

también aplicados en el estudio de otras ETG, como la anaplasmosis y la cowdriosis (Carrique y

cols. 2000; O'callaghan y cols. 1998). La relación entre el nivel de infección en la garrapata, la tasa

de letalidad, la seroprevalencia y la incidencia de la enfermedad, puede dar lugar a dos situaciones

epidemiológicas diferentes, situación enzoótica estable o enzoótica inestable (Perry y Young 1995)

(Figura 3).

Figura 3. Modelo de estabilidad enzoótica o endémica en las ETG. Fuente: Perry y Young (1995) adaptado

por L'Hostis y Seegers (2002).

Alta

Alta Baja

Baja Nivel de infección por garrapatas

Incidencia de los casos clínicos de ETG

Tasa de letalidad de las ETG

INESTABILIDAD ENZOÓTICA ESTABILIDAD ENZOÓTICA Alta incidencia Baja incidencia Prevalencia de anticuerpos

frente a agentes causales de ETG


51


49

La estabilidad enzoótica o endémica es el estado en que la relación que existe entre el

hospedador, el agente infeccioso, el vector y el medio ambiente es tal que la enfermedad no sucede

o lo hace de forma ocasional (Perry 1996). En diferentes estudios relacionados con la babesiosis

bovina, se ha observado que los animales de zonas endémicas expuestos continuamente desde el

nacimiento, no sufren enfermedad o ésta es de menor intensidad, y desarrollan una inmunidad

sólida y duradera (Dalgliesh 1993; Kudamba y cols. 1982; Mahoney 1974). Estos animales están

protegidos por una inmunidad innata no específica hasta los nueve a doce meses de edad

(Christensson 1989; Zintl y cols. 2005). Podría pensarse que esta protección podría deberse a la

inmunidad materna, sin embargo, los terneros permanecen resistentes tras la desaparición de los

anticuerpos transmitidos pasivamente por la madre y esta resistencia es independiente del estado

inmunológico de la madre (Christensson 1987). Esta resistencia también se ha observado, aunque

en menor grado, en los novillos de hasta dos años de edad (Christensson y Thorburn 1987; L'Hostis

y cols. 1995). El mecanismo subyacente a este fenómeno no es del todo conocido. La

susceptibilidad observada en terneros esplectomizados y en gerbos (Meriones unguiculatus)

jóvenes sugiere que está relacionada con un mecanismo celular (Zintl y cols. 2005). Este fenómeno

denominado como “inverse age resistance” o resistencia inversa a la edad se ha descrito

ampliamente en las babesiosis del ganado vacuno (Figura 4). Además, se ha observado que algunos

hospedadores no bovinos, como los gerbos menores de ocho semanas infectados

experimentalmente por babesias bovinas son más resistentes que los adultos (Langley y Gray

1987). En la edad adulta la inmunidad se mantiene por los sucesivos contactos con el agente,

llegando a ser permanente. Esta resistencia inversa a la edad es inusual en otras infecciones por

babesias no bovinas o por theilerias donde los animales jóvenes, no protegidos por los anticuerpos

maternales, se ven más gravemente afectados que los adultos (Bai y cols. 2002; Koch y cols. 1990;

Martinod y cols. 1986; Yeruham y cols. 1998).

Figura 4. Esquema de los cambios inmunes en terneros nacidos de madres inmunizadas, en lo referente a la

inmunidad calostral e inmunidad innata no específica frente a la babesiosis bovina. Fuente: Dalgliesh 1993.

En las áreas donde la babesiosis o theileriosis bovina es endémicamente estable, los casos

clínicos suelen ser poco frecuentes (L'Hostis y Seegers 2002; Mahoney y Ross 1972; Perry y

Young 1995). En estas áreas la enfermedad sucede cuando se rompe dicha estabilidad por

fluctuaciones en los niveles de garrapatas (debido a las condiciones climáticas o al empleo de

3 9 12 15 6 0

Niv

el d

e re

sist

enci

a

Inmunidad pasiva específica (calostral)

Inmunidad innata no específica

Periodo de protección frente a la infección Incremento de susceptibilidad a la infección clínica

Edad (meses)


52


50

pesticidas) o por la introducción de animales procedentes de zonas indemnes (Smith y cols. 2000).

La severidad de los casos clínicos es mayor en las áreas de baja densidad de garrapatas o en las

zonas de prevalencia intermedia. Asimismo, la introducción de animales infestados por garrapatas

en áreas libres puede dar lugar a la aparición de nuevos brotes (Smith y cols. 2000; Zintl y cols.

2003) (Figura 3).

Tras la recuperación de la enfermedad, el animal se convierte en portador. Estos animales

portadores se caracterizan por el bajo número de parásitos en sangre circulante, indetectables en los

exámenes microscópicos de extensiones de sangre (Figueroa y cols. 1992; Todorovic 1974), y por

una fluctuación de los niveles de parasitemia (Calder y cols. 1996; Ueti y cols. 2005). Los animales

permanecen en estado de portador durante un tiempo variable en función de la especie de

piroplasma, especie animal y raza. Mahoney y cols. (1973) observaron que el ganado vacuno

europeo portador de B. bovis podía permanecer en este estado toda su vida. Sin embargo, en el

ganado vacuno de raza cebú el organismo se elimina en unos tres años (Johnston y cols. 1978).

Según los estudios realizados en la especie B. bigemina este periodo varía, aunque parece que se

elimina más rápidamente que B. bovis (Johnston y cols. 1978; Mahoney y cols. 1973). Se ha

demostrado experimentalmente la permanencia de T. annulata en el ganado vacuno y de B. ovis en

el ovino durante al menos dos años (d'Oliveira y cols. 1995; Habela y cols. 1990a). En el caso del

ganado equino algunos autores postulan que estos animales podrían permanecer crónicamente

infectados por T. equi durante toda la vida del animal y por B. caballi durante un periodo más corto

que oscilaría entre uno y cuatro años (American Veterinary Medical Association 2006; Schein

1988). Estudios experimentales recientes sugieren que ciertas cepas podrían no inducir el estado de

portador en los animales, como se ha descrito para T. parva (Skilton y cols. 2002).

La infección prolongada que se desarrolla en estos animales sirve de reservorio de la

enfermedad y fuente continua de infección para nuevas garrapatas (Calder y cols. 1996; Gubbels y

cols. 1999; Ueti y cols. 2005). Este hecho, postulado a lo largo de numerosos trabajos

epidemiológicos, ha sido demostrado experimentalmente gracias a la adquisición y transmisión de

T. equi por garrapatas de la especie B. microplus alimentadas sobre animales portadores (Ueti y

cols. 2005).

Se dispone de poca información sobre el estado de portador en el hombre debido a la escasa

sensibilidad de las técnicas diagnósticas utilizadas en el pasado. Si bien la mejor evidencia de su

existencia es la transmisión o adquisición de la babesiosis en las transfusiones sanguíneas

(Herwaldt y cols. 2002; Kjemtrup y cols. 2002). Gracias a la aplicación de las técnicas moleculares

se ha demostrado que, sin tratamiento, el hombre podría permanecer como portador de B. microti

durante un periodo prolongado que oscila entre meses o años (Krause y cols. 1998).


53


51

Tradicionalmente, uno de los criterios utilizados para la clasificación de los piroplasmas se ha

basado en la especificidad del hospedador (Mehlhorn y Schein 1984). Este criterio dejó de ser

aplicable desde el descubrimiento de que los parásitos B. microti y B. divergens no eran específicos

de los micromamíferos o del ganado vacuno, sino que también podían infectar al hombre y los

rumiantes silvestres. Tras la llegada de la biología molecular se han detectado más ejemplos de esta

amplitud de hospedadores como la presencia de B. odocoilei en bóvidos y en cérvidos, y de B.

divergens en varias especies de cérvidos, o la presencia de Babesia sp. EU1 en el hombre y

cérvidos (Duh y cols. 2005b; Gray y cols. 2002a; Herwaldt y cols. 2003; Holman y cols. 2000;

Schoelkopf y cols. 2005). Otros ejemplos de este hecho son el hallazgo de T. equi en perros, B.

canis canis en gatos y de B. bigemina, B. bovis y B. canis canis en caballos (Buling y cols. 2007;

Criado-Fornelio y cols. 2003b, 2003d, 2006) o la persistencia de B. divergens, bajo condiciones

experimentales, en ovejas esplectomizadas (Chauvin y cols. 2002).

Los animales pueden estar infectados simultáneamente por varias especies de piroplasmas

(Almería y cols. 2002; Gubbels y cols. 1999). Dicha coinfección puede causar una modulación del

sistema inmune conduciendo a una inmunodepresión en los animales (Adachi y cols. 1993; Homer

y cols. 2000) que favorezca el efecto patógeno de otros organismos. Sin embargo, la situación

contraria es también posible, es decir, la presencia de otros organismos puede facilitar la infección

por piroplasmas (Homer y cols. 2000), e incluso incrementar la resistencia frente a otros

organismos, como se ha observado frente a la infección por Anaplasma marginale en el ganado

vacuno infectado crónicamente con T. buffeli (Gale y cols. 1997). Por otro lado, también en las

garrapatas se ha demostrado que pueden coexistir agentes diversos dando lugar a coinfecciones por

patógenos del mismo o diferente género de piroplasmas o por la combinación de piroplasmas y

otros virus o bacterias (Alekseev y cols. 2004; Bishop y cols. 1994; Halos y cols. 2005; Oliveira-

Sequeira y cols. 2005).


54


52

1.4 CLASIFICACIÓN Y SISTEMÁTICA DE LOS PIROPLASMAS

La Filogenia (del griego phylon = tribu, raza y genetikos = relativo a la génesis o nacimiento)

es la disciplina que estudia las relaciones evolutivas entre los organismos reconstruyendo la historia

de su diversificación. Además, la filogenia proporciona las bases para la clasificación de los

organismos en grupos taxonómicos o taxones (taxonomía) a los que ha de asignarse un nombre

correcto según unos principios establecidos (nomenclatura). Una vez establecido el sistema de

clasificación se definen los caracteres diagnósticos que se utilizarán en la identificación de los

organismos. Así, la Sistemática es el estudio de la diversidad de los organismos y sus

interrelaciones, de manera que engloba nomenclatura, taxonomía e identificación.

El análisis filogenético de secuencias es una herramienta utilizada para estudiar la historia

evolutiva de los organismos. El objetivo de este análisis es convertir la información de las

secuencias nucleotídicas en un árbol evolutivo de las mismas. Las secuencias objeto de análisis se

comparan con las secuencias depositadas en las bases de datos (ej. mediante búsquedas de tipo

Blast en la base GenBank del NCBI - National Center for Biotechnology Information).

Posteriormente se realiza el alineamiento entre ellas, que consiste en la comparación de las

secuencias homólogas para localizar las inserciones, deleciones o cambios puntuales en los

nucleótidos que se hayan podido producir en el proceso de divergencia evolutiva desde el ancestro

común. Los programas más empleados para realizar alineamientos utilizan el método Clustal

(Thompson y cols. 1994). Para alineamientos múltiples Clustal realiza alineamientos progresivos

en los que en primer lugar se alinean aquellas secuencias más similares, y posteriormente y de

manera progresiva se van alineando las secuencias más divergentes. Dado que entre dos secuencias

siempre hay un ancestro común, la medida de la divergencia entre dos secuencias puede ser

utilizada para estimar el número de cambios evolutivos ocurrido entre ellas. Sin embargo, en una

misma posición pueden haberse sucedido varias sustituciones, de manera que si esta acumulación

de sustituciones no se tuviese en cuenta estaríamos infraestimando la distancia evolutiva. Para

corregir esta superposición de mutaciones se han descrito varios métodos, si bien los modelos más

utilizados en la bibliografía son los de Jukes-Cantor y Kimura. El método Jukes-Cantor (1969)

asume iguales frecuencias para las cuatro bases nucleotídicas, así como semejantes probabilidades

de cambio entre las cuatro bases. Sin embargo, asumiendo que la probabilidad de producirse una

transición o sustitución entre purinas (G→C, C→G) o pirimidinas (A→T, T→A) es mayor que la

probabilidad de producirse una transversión o sustitución entre purina-pirimidina o viceversa;

Kimura (1980) propuso un método para estimar el número de sustituciones nucleotídicas dando una

probabilidad diferente a las transiciones y a las transversiones. Las relaciones filogenéticas se

representan en diagramas con forma de árbol, compuesto por nodos (puntos de bifurcación), ramas

(líneas de conexión) y raíz (presente en aquellos árboles en los que se especifica el ancestro común

más reciente). La inferencia de árboles filogenéticos puede realizarse mediante diferentes métodos,


55


53

siendo los más usados los basados en matrices de distancias (como el Neighbor-joining), los

métodos basados en la obtención de la máxima parsimonia y los métodos de máxima verosimilitud

(McCormack y Clewley 2002). El método de Neighbor-joining (Saitou y Nei 1987) para la

construcci n de árboles se fundamenta en el principio de mínima evolución con la búsqueda del

árbol que presente una menor longitud de sus ramas. En los árboles obtenidos por métodos basados

en matrices de distancia, las longitudes de las ramas son proporcionales a las distancias genéticas.

El principio de máxima parsimonia se basa en la búsqueda e identificación de la topología que

requiera el menor número de cambios evolutivos para explicar las diferencias observadas. Los

métodos de búsqueda de árboles filogenéticos mediante los procedimientos de máxima

verosimilitud, buscan e identifican la topología que posea la mayor probabilidad para explicar los

cambios nucleotídicos que se observan entre las diferentes secuencias. Una vez obtenido un árbol

se puede evaluar su fiabilidad mediante la técnica de bootstrap (Felsenstein 1985) o confianza del

nodo del cluster o clado, un tipo de cálculo estadístico basado en los intervalos de confianza de la

filogenia inferida. El método está basado en técnicas de remuestreo, en el que a partir de las

posiciones nucleotídicas originales utilizadas en la construcción del árbol se realizan muestreos al

azar de manera que se obtiene un nuevo conjunto de datos del mismo tamaño que los originalmente

comparados, y a partir de estos datos se calcula una nueva filogenia. Este proceso se repite un

numero determinado de veces (normalmente 100-1000 réplicas) y las topologías obtenidas se

comparan con las del árbol original. Posteriormente se calcula cuántas de las réplicas obtenidas

agrupan los nodos tal y como aparecen en el árbol original, y esos valores se muestran sobre cada

nodo para indicar el porcentaje de árboles del remuestreo que apoyan esa agrupación concreta y por

tanto, el grado de confianza del nodo.

El número de estudios encaminados a esclarecer las relaciones filogenéticas entre los

miembros del phylum Apicomplexa es limitado y probablemente sea consecuencia de la gran

cantidad de especies descritas. La mayoría de los trabajos se han centrado en el estudio de los

géneros agrupados dentro del phylum Apicomplexa con cierta importancia médica o veterinaria.

Dentro de los Apicomplexa la clase Hematozoea está formada por un grupo monofilético y dentro

de ella el orden Piroplasmida forma un clado distinto y separado del resto de los miembros del

phylum Apicomplexa (Morrison y Ellis 1997). Tradicionalmente, la clasificación de los

piroplasmas se ha basado en criterios biológicos como la morfología, tamaño y localización del

estadio intraeritrocitario de las theilerias y babesias, y en características relativas a su ciclo

biológico tales como el modo de transmisión por el vector y la especificidad del hospedador. Los

miembros del género Theileria se diferenciaban del resto de piroplasmas por la presencia de la

forma de tétrada o “cruz de malta” del merozoito intraeritrocitario y la existencia de un estadio

extraeritrocitario. Por otro lado, las babesias “verdaderas” o sensu stricto se caracterizaban por su

transmisión transovárica en la garrapata vectora, opuestamente a lo que sucede en las theilerias que


56


54

se transmiten exclusivamente de forma transestadial (Mehlhorn y Schein 1984). Además, las

babesias se han agrupado en “grandes piroplasmas”, mayores de 3 m y en “pequeños

piroplasmas”, menores de 3 m (ver apartado 1.2.2 Tabla 3). Por su parte, la fase intraeritrocítaria

de las especies de Theileria es menor de 1-2 m (ver apartado 1.2.3 Tabla 4) (Mehlhorn y Schein

1984).

Actualmente, los avances moleculares no sólo han contribuido a mejorar el diagnóstico de los

piroplasmas sino también a definir la relación y posición filogenética de estos agentes. Son

numerosos los estudios filogenéticos realizados a partir del análisis de los genes ribosómicos,

considerados buenos “cronómetros moleculares” debido a su distribución universal, poseer una

constancia funcional (de modo que la presión selectiva que actúa sobre la molécula es mínima) y

estar sometidos a una tasa de cambio tal que permite detectar relaciones evolutivas (Woese 1987).

Los RNA ribosómicos (rRNA) se clasifican según su coeficiente de sedimentación medido en

Svedbergs (S) y mientras que en organismos procariotas existen tres rRNA distintos (5S, 16S y

23S), en organismos eucariotas son cuatro (5S, 5.8S, 18S y 28S). En eucariotas los 5S, 5.8S y 28S

rRNA forman parte de la subunidad mayor de los ribosomas, mientras que el 18S rRNA forma

parte de la subunidad menor.

Los genes que codifican los RNA ribosómicos están organizados en operones, unidades de

trascripción ribosómica, que están constituidos por los genes rRNA 18S, 5.8S y 28S, separados por

regiones variables, las regiones espaciadoras ITS (“internal transcribed spacers”) que son

eliminadas durante el proceso de maduración (Hillis y Dixon 1991). Los organismos eucariotas

tienen dos regiones espaciadoras, ITS-1 que se localiza entre los genes 18S y 5.8S, e ITS-2 entre

los genes 5.8S y 28S (Hillis y Dixon 1991) (Figura 5). Estas regiones son variables en su

composici n y tamaño, lo cual sirve como una herramienta en la identificaci n y diferenciaci n.

Los genes ribosómicos sin embargo combinan regiones conservadas y otras más divergentes, con lo

cual además de poder usarse para la identificación aportan información evolutiva (“cronómetro

molecular”).

18S rRNA 5.8S rRNA 28S rRNA

ITS1 ITS2

Figura 5. Esquema del pre-rRNA de organismos eucariotas. Fuente: Hillis y Dixon 1991.

El gen 28S rRNA o LSU (subunidad grande) puede resultar demasiado largo y por tanto más

problemático a la hora de determinar su secuencia, aunque aporte mayor información, mientras que

el gen 5.8S rRNA es demasiado corto. En cambio, el gen 18S rRNA o SSU (subunidad pequeña),

análogo al 16S de los organismos procariotas, posee unas características idóneas para el análisis

filogenético, por lo cual se ha utilizado ampliamente para estudiar la filogenia de gran cantidad de


57


55

organismos (Hillis y Dixon 1991; Olsen y Woese 1993) y existen numerosas secuencias

disponibles en las bases de datos. A diferencia de lo que sucede en otros miembros de los

Apicomplexa (por ejemplo Toxoplasma gondii posee hasta 110 copias del gen SSU (Guay y cols.

1993)), la escasa información disponible en la bibliografía parece indicar que los piroplasmas no

poseen tantas copias del gen, así B. bovis presenta tres copias y T. parva únicamente dos

(Dalrymple 1990; Kibe y cols. 1994).

Allsopp y cols. (1994) fueron de los primeros en evaluar las relaciones filogenéticas y

evolutivas de los piroplasmas a partir del análisis del 18S rRNA. Utilizando un número limitado de

especies de Babesia, Theileria y Cytauxzoon observaron que la mayoría de las Babesia spp.

(Babesia sensu stricto) y de las Theileria spp. se agrupaban en grupos monofiléticos distintos. Sin

embargo, describieron la presencia de un tercer grupo formado por Babesia rodhaini, B. equi

(ahora T. equi) y Cytauxzoon felis ancestral de las Theileria. Años más tarde Carret y cols. (1999)

estudiaron la identidad y la filogenia de las subespecies de B. canis observando que las tres

subespecies se agrupaban dentro de las Babesia sensu stricto, si bien B. canis canis y B. canis rossi

se agrupaban juntas y B. canis vogeli se agrupaba de forma separada dentro de un grupo con B.

odocoilei y B. divergens. Posteriormente, Kjemtrup y cols. (2000) analizando un mayor número de

especies que incluían las nuevas descripciones de piroplasmas del hombre y de la fauna silvestre

del oeste de EE.UU., infirieron cuatro grupos diferentes: el grupo de Babesia sensu stricto, el grupo

de las theilerias, un nuevo grupo denominado Western Babesia spp. (o “babesias del oeste”, que

contenía las nuevas descripciones de piroplasmas del hombre y la fauna silvestre) y un cuarto clado

formado por B. microti, ancestral a los otros tres grupos. Recientemente el mismo equipo ha

caracterizado molecularmente una nueva especie detectada en los perros, B. conradae,

relacionándola filogenéticamente con el grupo de las “babesias del oeste” (Kjemtrup y cols. 2006).

El análisis del gen 18S rRNA de aislados de pacientes europeos con babesiosis sirvió para

identificar y clasificar una nueva babesia, Babesia sp. EU1, aislada posteriormente en los cérvidos

de Europa, más cercana filogenéticamente a B. odocoilei que a B. divergens (Duh y cols. 2005a;

Herwaldt y cols. 2003), y que se agrupaba dentro del clado de las babesias “verdaderas” (Holman y

cols. 2000). Posteriores revisiones de las relaciones filogenéticas de los Piroplasmida (Criado-

Fornelio y cols. 2003c) propusieron que éstos se agrupaban hasta en cinco grupos: un grupo

ancestral a los otros piroplasmas (que incluía a T. annae, B. microti, Babesia rodhaini y Babesia

felis), el grupo de las theilerias, el de las babesias de ungulados (B. bovis, B. ovis, B. bigemina y B.

caballi), el de las babesias de los perros (B. canis y B. gibsoni), y el grupo de los piroplasmas

descritos en EE.UU. En el mismo año Schnittger y cols. (2003) estudiando las relaciones

filogenéticas de los piroplasmas descritos en los pequeños rumiantes identificaron la presencia de

dos nuevas theilerias en la población ovina de China, concluyendo que las theilerias de los

pequeños rumiantes formaban un grupo heterólogo, no restringido únicamente a T. ovis. Asimismo,


58


56

observaron que los piroplasmas se dividían en dos grandes grupos, aparentemente relacionados con

sus características biológicas. Un grupo que incluía a las theilerias y a T. equi, B. rodhaini y B.

microti (Babesia sensu latu) y otro constituido por las babesias verdaderas (Babesia sensu stricto).

En cualquier caso, la clasificación taxonómica y las relaciones filogenéticas entre los Apicomplexa

se hallan en continua redefinición y siguen siendo objeto de debate.


59


57

1.5 DIAGNÓSTICO DE LAS PIROPLASMOSIS

El principal propósito de las pruebas diagnósticas es la detección e identificación de los

agentes responsables de la enfermedad. La variedad de métodos y técnicas de análisis de los

piroplasmas es amplia, y cada una goza de ventajas y de limitaciones. Aunque el examen

microscópico de extensiones sanguíneas teñidas es la técnica de diagnóstico rutinario más utilizada,

las técnicas serológicas y moleculares son herramientas muy útiles en el desarrollo de estudios

epidemiológicos. Sin embargo, las técnicas moleculares son mucho más sensibles y específicas que

las serológicas.

1.5.1 DIAGNÓSTICO CLÍNICO

Como en todas las enfermedades transmitidas por artrópodos, la distribución de las

piroplasmosis está condicionada a la presencia de su vector. Por ello previamente al diagnóstico

laboratorial, el veterinario realizará una anamnesis o diagnóstico clínico-epidemiológico. Este

diagnóstico, de carácter orientativo, se basa en el estudio de la sintomatología característica de las

piroplasmosis (anemia, fiebre, hemoglobinuria, ictericia, y posible afección ganglionar) y de los

datos epidemiológicos de la explotación tales como la zona geográfica, la época del año, la

presencia del vector, los antecedentes clínicos, la presentación de la enfermedad en la zona

(endemia), la edad de los animales afectados, y la introducción de nuevas compras de animales,

entre otros.

A la hora de realizar el diagnóstico diferencial de las piroplasmosis se deben de distinguir de

otras enfermedades transmitidas por el mismo grupo de vectores, como el caso de la anaplasmosis

y erlichiosis (Brown y cols. 2006; Hofmann-Lehmann y cols. 2004). Asimismo, habrá que

descartar otras patologías que cursen con signos clínicos semejantes. Así, en el ganado vacuno se

deben de descartar otras enfermedades que cursen con hemoglobinuria, como la hemoglobinuria

postparto, la hemoglobinuria bacilar (Clostridium haemolyticum / Clostridium novyi tipo D),

leptospirosis (Leptospira interrogans serovar pomona) y la intoxicación crónica por cobre. Las

enfermedades a diferenciar y que cursan con hematuria en el vacuno son la hematuria enzoótica

(intoxicación por helechos) y la pielonefritis enzoótica bovina (Corynebacterium renale). En el

ganado equino deberán considerarse las enfermedades que cursan con anemia y edema, como la

anemia infecciosa equina (Retrovirus), púrpura hemorrágica/paperas (Streptococcus equi), peste

equina (Orbivirus), arteritis viral equina (Togavirus), estrongilosis y edema angioneurótico (por

alérgenos) (Radostis y cols. 2000). En los perros también se deben descartar otras enfermedades

transmitidas por vectores como la hepatozoonosis, o la leishmaniosis, especialmente si los animales

han viajado a zonas endémicas.


60


58

Además del estudio clínico, puede ser de gran ayuda el estudio hematológico con objeto de

comprobar el porcentaje de hematocrito y los niveles de hemoglobina disminuidos a causa de la

anemia, así como alteraciones en el recuento leucocitario. Finalmente, el diagnóstico diferencial

definitivo se obtendrá mediante el estudio conjunto de los datos obtenidos en la anamnesis, la

historia clínica y en el diagnóstico laboratorial.

1.5.2 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

1.5.2.1 Estudio microscópico

Tradicionalmente el diagnóstico de las piroplasmosis se ha basado en la detección de las

especies de Theileria y Babesia mediante el examen al microscopio de extensiones de sangre

periférica o de biopsias/improntas de linfonodos y/u órganos como el bazo del hospedador

previamente teñidas por el método de Giemsa. Otras tinciones también utilizadas son May-

Grunwald-Giemsa, Leishmann y Wright. La sensibilidad del examen de los frotis sanguíneos es

muy baja (Bose y cols. 1995; Mahoney y Saal 1961). La misma técnica se ha aplicado también a

los tejidos de las garrapatas, para la observación al microscopio de las fases del ciclo de los

piroplasmas que acontecen en las glándulas salivares, hemolinfa, ovario y huevos (Blewett y

Branagan 1973; Buscher y cols. 1988; Guglielmone y cols. 1996; Moreno 1995; Piesman y cols.

1986; Young y cols. 1983). Es un método rápido y simple, pero poco específico. Aunque las

tinciones más utilizadas son las de Giemsa y Feulgen, Voigt y cols. ( 1995) llegaron a evaluar hasta

10 métodos diferentes de tinción de las glándulas salivares de R. appendiculatus para la detección

de T. parva.

La microscopía es una técnica económica pero subjetiva ya que depende de la experiencia del

observador y del tiempo que se invierta en el examen de la muestra. La técnica debe utilizarse

como apoyo de otras técnicas diagnósticas, ya que sólo es efectiva cuando la parasitemia es alta,

pudiendo dar un diagnóstico erróneo en el caso de animales portadores o en las fases iniciales de la

enfermedad, donde los niveles de parasitemia son bajos o fluctúan (Mahoney y cols. 1973).

Además, diferenciar ciertas especies entraña una gran dificultad (Conrad y cols. 1992; Purnell

1981; Zintl y cols. 2003), lo cual es de gran importancia para diferenciar las especies patógenas de

las no patógenas (especialmente en el caso de las theilerias).

1.5.2.2 Infección experimental

En casos de sospecha de presencia de piroplasmas no demostrable por las técnicas

anteriormente descritas, se ha utilizado la infección experimental de animales esplenectomizados

con sangre de un individuo sospechoso. Es un método costoso y largo que exige disponer de

animales de experimentación susceptibles a la especie de piroplasma, y que requiere de varios días

hasta que se reproduce la enfermedad y se evidencia la presencia de los piroplasmas en sangre


61


59

circulante (Juste y cols. 1986; Krause y cols. 1996; Mahoney y cols. 1973). Asimismo, este método

se ha aplicado en el estudio de la patogenénesis de las piroplasmosis (Alani y Herbert 1988b;

Holman y cols. 2005b).

1.5.2.3 Cultivo in vitro

El cultivo in vitro de los piroplasmas es una técnica alternativa a las infecciones

experimentales basada en el mantenimiento de células provenientes de sangre o tejidos infectados

en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH,

aireación y humedad controladas. De esta forma se aseguran la supervivencia y multiplicación de

los agentes. El cultivo in vitro es un método muy sensible que permite incluso la identificación de

portadores (Holman y cols. 1993, 1998; Malandrin y cols. 2004; Thomford y cols. 1993;

Zweygarth y cols. 1997). Además, se utiliza como técnica de apoyo en la caracterización de los

piroplasmas (Holman y cols. 2005a, 2005b; Spencer y cols. 2006). Otra de las aplicaciones de está

técnica, es la atenuación de la virulencia del piroplasma mediante pases en los medios de cultivo,

propiedad aplicada en la obtención de cepas vacunales para la inmunización de hospedadores

susceptibles (Kuttler y cols. 1988; Shkap y Pipano 2000; Yunker y cols. 1987). A pesar de su buena

sensibilidad para la detección de animales portadores y la buena correlación que presenta con otras

técnicas diagnósticas (Malandrin y cols. 2004; Zweygarth y cols. 1997), la aplicación de esta

técnica al diagnóstico laboratorial se encuentra muy limitada por la necesidad de costosas

instalaciones y de personal experto, por el tiempo requerido para el desarrollo de la técnica y por su

bajo rendimiento (Bose y cols. 1995).

1.5.2.4 Diagnóstico serológico

Los métodos inmunológicos o serológicos son pruebas diagnósticas indirectas basadas en la

detección de anticuerpos específicos circulantes. Los anticuerpos aparecen a los 15-20 días de la

primoinfección, dependiendo del agente y del hospedador, aumentando posteriormente, para

mantenerse en fase de meseta durante varios meses. Tras este periodo terminan por decrecer hasta

niveles basales en ocasiones indetectables. Las técnicas serológicas que se utilizado con mayor

frecuencia en la detección de piroplasmas son la reacción de fijación de complemento (FC), la

técnica de Inmunofluorescencia Indirecta o “Immunofluorescent Antibody Test” (IFI/IFAT), la

técnica ELISA (“Enzime-Linked Inmunosorbent Assay”) (Bose y cols. 1995). A día de hoy la FC

está prácticamente en desuso. La técnica ELISA por su capacidad de automatización, es una de las

más utilizadas en el diagnóstico de las piroplasmosis, tanto en el diagnóstico rutinario como en

estudios epidemiológicos y está aceptada por el Código Zoosanitario Internacional, junto con la

técnica IFI, para la detección de animales portadores de piroplasmosis bovina y equina. Los

principales inconvenientes asociados al diagnóstico serológico son la falta de relación entre la


62


60

presencia del parásito y el título de anticuerpos y los derivados de la dificultad de purificación de

los antígenos crudos, dando lugar a problemas de sensibilidad, especificidad y de reacciones

cruzadas entre las diferentes especies de piroplasmas (Calder y cols. 1996; el Ghaysh y cols. 1996;

Papadopoulos y cols. 1996c). Actualmente para superar las limitaciones mencionadas, se está

reemplazando el uso de los antígenos crudos por los antígenos obtenidos a partir de proteínas

recombiantes o mediante el empleo de técnicas ELISA de competición.

1.5.2.5 Métodos moleculares

Los métodos de detección e identificación molecular se basan en el análisis de la información

genética propia de cada organismo. Por tanto la secuencia diana seleccionada para la detección

deberá estar presente en el organismo objeto de estudio, y deberá ser lo suficientemente específica

como para conseguir el nivel de identificación deseado. El análisis genético más exhaustivo se

consigue a través de la secuenciación de la cadena nucleotídica, pero ésta es una técnica demasiado

cara y laboriosa para el diagnóstico de rutina, de manera que son fundamentalmente las técnicas

basadas en la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) las más

habituales.

En cualquiera de los casos, previamente a la aplicación de estas técnicas de detección es

necesario obtener una muestra de DNA lo más pura posible a partir de la muestra de partida. Para

ello se han utilizado varios métodos de extracción del DNA, algunos de ellos disponibles de

manera comercial. Un proceso de extracción ideal debería aislar, concentrar y purificar el DNA

presente en las muestras, liberándolas de inhibidores. En la práctica, deben evaluarse varios

aspectos a la hora de seleccionar un método apropiado de extracción: el origen y la cantidad de

muestra disponible, la sensibilidad que se desea alcanzar, la toxicidad de los reactivos, la eficacia

de la eliminación de inhibidores, el tiempo que dura el proceso de extracción y la infraestructura

disponible para cada procedimiento.

Puesto que los piroplasmas son organismos hemotrópicos, la sangre de los hospedadores

vertebrados es una de las muestras de elección, de fácil obtención y fácil procesado. En aquellas

situaciones en las que no se dispone de sangre (por ejemplo, cuando las muestras proceden de

animales muertos), la extracción del DNA a partir de órganos hematopoyéticos como el bazo ha

dado buenos resultados. Asimismo, las técnicas moleculares se pueden aplicar al estudio de la

presencia de los piroplasmas en las garrapatas. El estadio adulto de las garrapatas recogidas de

animales o de vegetación es el que con mayor frecuencia se utiliza en los estudios moleculares

debido a la facilidad en la manipulación de ejemplares individuales, y al buen rendimiento obtenido

en la extracción (mayor cantidad de DNA que las ninfas y/o larvas), si bien también es posible

realizar la extracción de los estadios inmaduros e incluso de los huevos, pero en estos casos se


63


61

suele trabajar con lotes. Por lo general las garrapatas recogidas de los animales suelen estar

alimentadas, con lo que la presencia de sangre digerida del hospedador puede llegar a ocasionar

problemas en la extracción, así como dificultades en la interpretación de los resultados. En estos

casos la forma más recomendable de proceder es la extracción del DNA a partir de la disección de

los tejidos de la garrapata como las glándulas salivares (que refleja la presencia de los parásitos que

han migrado del intestino a las glándulas salivares) o el intestino (para detectar la presencia de

parásitos en la sangre digerida). En las garrapatas recogidas de vegetación se puede proceder de

igual forma o realizar una extracción a partir de un homogenizado de la garrapata completa.

Algunos estudios sobre las vías de transmisión de los organismos en las garrapatas, precisan que las

garrapatas adultas alimentadas pongan huevos, extrayendo el DNA a partir de los propios huevos o

de las larvas ya eclosionadas.

Entre los métodos de extracción del DNA más utilizados se encuentra la extracción con

proteinasa K y fenol-cloroformo seguida de una precipitación alcohólica. Este método aporta muy

buenos resultados pero es lento y utiliza agentes tóxicos como el fenol por lo que está siendo

sustituido paulatinamente por kits comerciales que utilizan columnas o resinas para separar el

DNA. En algunos trabajos se ha descrito un método algo más grosero de extracción del DNA a

partir de garrapatas mediante el hervido de la garrapata en una solución de hidróxido de amonio

(Schouls y cols. 1999).

Una vez purificado el DNA se puede proceder a examinar la presencia o ausencia del DNA

específico del organismo objeto de estudio mediante la amplificación de una región concreta de su

genoma. La PCR es una técnica que permite la amplificación enzimática in vitro de un segmento

específico de DNA (DNA molde) mediante el empleo de un par de cebadores (oligonucleótidos de

unas 18-24 bases) que hibridan específicamente con la región complementaria del DNA molde.

Mediante la repetición de varios ciclos que incluyen una fase de desnaturalización de la doble

hebra de DNA, la unión específica de los cebadores y la síntesis de nuevas copias mediante la

incorporación de los dNTPs por la acción de la DNA polimerasa, se consigue la amplificación

exponencial del DNA molde. El protocolo original fue publicado en 1985 (Saiki y cols. 1985) y

ampliado en los años siguientes por Mullis y cols. (Mullis y cols. 1986; Mullis y Faloona 1987).

Inicialmente, estos autores utilizaban la DNA polimerasa extraída de la bacteria Escherichia coli

para catalizar la extensión. Puesto que esta enzima se inactiva a las elevadas temperaturas

requeridas para la desnaturalización del DNA, Saiki y cols. (1988) modificaron el método

introduciendo una DNA polimerasa termoestable (Taq DNA polimerasa) purificada a partir de la

bacteria termófila Thermus aquaticus. Cualquier fragmento de DNA puede ser amplificado por

PCR siempre que se conozcan las secuencias flanqueantes de la región diana. La eficiencia

diagnóstica de esta técnica depende tanto de la región diana seleccionada como de la especificidad

de los cebadores diseñados.


64


62

Las técnicas moleculares han revolucionado la detección e identificación de los organismos

causantes de enfermedades infecciosas en animales (Belak y Thoren 2001). En lo referente a las

ETG, las técnicas moleculares, debido a su alta sensibilidad, son especialmente útiles en el

diagnóstico de animales portadores o con niveles bajos de infección, o para la identificación de los

vectores. Además, a la hora de elegir un tratamiento, realizar ensayos de vacunación o evaluar la

necesidad de implantar programas de erradicación, son necesarias técnicas específicas que permitan

discriminar las especies patógenas de las apatógenas. Tanto por su sensibilidad como por su

especificidad, la PCR constituye una valiosa herramienta para el estudio de la epidemiología de

estos organismos. Sin embargo, precisamente su alta sensibilidad puede ser el origen de falsos

positivos como consecuencia de contaminaciones debidas a malas prácticas en el laboratorio. La

aplicación de medidas preventivas, tales como la separación de áreas de trabajo, el uso de puntas

con filtro o la irradiación del instrumental y el equipo con luz ultravioleta, reducen

considerablemente dichos problemas (Persing 1991; Sarkar y Sommer 1990).

Inicialmente, el uso de la PCR como técnica de detección de piroplasmas fue aplicado a la

detección de los agentes patógenos más importantes en la sanidad animal y humana, como son B.

bovis, B. bigemina y B. microti, demostrando un alto grado de sensibilidad y especificidad

(Fahrimal y cols. 1992; Figueroa y cols. 1992; Persing y cols. 1992). Desde el inicio de la

aplicación de estas técnicas al diagnóstico de los piroplasmas se han buscado y, actualmente se

siguen buscando, regiones o secuencias genéticas específicas de estos organismos. Se han utilizado

varios genes para la detección de los piroplasmas como son el gen del apocitocromo b (Fahrimal y

cols. 1992; Salem y cols. 1999); el gen que codifica para la proteína del antígeno de superficie del

merozoito (Azambuja y cols. 1994; d'Oliveira y cols. 1995; Figueroa y cols. 1993, 1996; Kirvar y

cols. 1998, 2000; Suárez y cols. 1991) y el gen 18S rRNA (Alhassan y cols. 2005; Allsopp y cols.

1994; Altay y cols. 2005; Birkenheuer y cols. 2003; Calder y cols. 1996; Carret y cols. 1999;

Criado-Fornelio y cols. 2003d; de Kok y cols. 1993; Devos y Geysen 2004; Duh y cols. 2005b;

Gubbels y cols. 1999; Guerrero y cols. 2007; Kordick y cols. 1999; Schnittger y cols. 2004). En

otros trabajos se han utilizado otros genes ribosómicos como el 5.8S rRNA o los espaciadores

intergénicos (ITS-1 y ITS-2) (Zahler y cols. 1998).

Aunque la PCR es mucho más sensible que la microscopía o las técnicas serológicas (Calder y

cols. 1996; Figueroa y cols. 1996; Hove y cols. 1998; Krause y cols. 1996), en ocasiones se utilizan

métodos de detección post-PCR para mejorar la sensibilidad y confirmar la especificidad de la

técnica, como la PCR-ELISA (Thammasirirak y cols. 2003) o la hibridación posterior con sondas

de DNA (Calder y cols. 1996; Fahrimal y cols. 1992; Figueroa y cols. 1992; Kirvar y cols. 1998;

Posnett y Ambrosio 1991). En otros casos, la sensibilidad puede incrementarse realizando una

segunda reacción de PCR (PCR anidada) (Birkenheuer y cols. 2003; Guerrero y cols. 2007; Liu y

cols. 2007), aunque una de las desventajas asociadas a la PCR anidada es el mayor riesgo de


65


63

contaminación. Los valores de sensibilidad de las distintas PCRs descritas para la detección de

piroplasmas abarcan un amplio rango en función de su diseño, la especie de piroplasma y el tipo de

muestra. El método de evaluación de la sensibilidad de la PCR más extendido en el estudio de las

piroplasmosis consiste en el análisis de diluciones seriadas de sangre con una parasitemia conocida.

Sin embargo, se debe tener cautela a la hora de interpretar el limite de detección calculado a través

de las diluciones seriadas de sangre debido a las variaciones en el nivel de eritrocitos en función de

la especie de hospedador (Birkenheuer y cols. 2003). Para evitar dichas fluctuaciones se puede

estimar la sensibilidad de la PCR en base al número de copias genómicas amplificadas usando

plásmidos a los que se ha insertado la secuencia diana.

Más recientemente ha surgido una técnica, la PCR a tiempo real, que permite monitorizar en

tiempo real la acumulación de copias durante el proceso de amplificación mediante el marcaje con

fluorescencia de las sondas o los amplicones, de manera que es posible además cuantificar la carga

parasitaria en la muestra. Además esta técnica elimina la necesidad de detectar el producto por

electroforesis en geles de agarosa de manera que disminuye el riesgo de contaminaciones (Belak y

Thoren 2001; Mackay 2004). Su mayor sensibilidad la hace una técnica útil en la detección de

infecciones crónicas y su capacidad para cuantificar es muy interesante para determinar el nivel de

infección (parasitemia). Ampliamente introducida en la detección e identificación de otros agentes

patógenos, la PCR a tiempo real comienza a ser utilizada también en la detección de piroplasmas,

aunque no son abundantes las publicaciones al respecto; se ha descrito su aplicación en la detección

de T. sergenti, T. parva, B. bovis, B. bigemina y B. gibsoni (Buling y cols. 2007; Jeong y cols.

2003; Konnai y cols. 2006; Matsuu y cols. 2005).

A pesar de sus ventajas, las PCRs especie-específicas tradicionales no permiten el diagnóstico

simultáneo de varios patógenos en una misma muestra. Una variante es la PCR múltiple, en la que

el uso combinado de varias parejas de cebadores en una misma reacción permite detectar en un

único tubo diferentes secuencias diana, permitiendo la detección e identificación simultánea de

distintos genes de un mismo organismo o de diferentes especies en una sola muestra clínica. La

PCR múltiple fue inicialmente aplicada en la detección de las ETG producidas por la infección de

B. bovis, B. bigemina y A. marginale en muestras de origen vacuno (Figueroa y cols. 1993). Sin

embargo su capacidad multiplex es limitada y puede afectar a la sensibilidad del ensayo.

Otra técnica aplicada en la detección e identificación de varios piroplasmas es la PCR-RFLP

(“Restriction fragment length polymorphism” o polimorfismos en la longitud de los fragmentos de

restricción). Consiste en el análisis de los patrones de bandas que aparecen en un gel de agarosa

tras la digestión enzimática de una secuencia de DNA que previamente ha sido amplificada por

PCR. Estas enzimas se conocen con el nombre de endonucleasas y cortan la molécula de DNA en

determinadas secuencias nucleotídicas específicas para cada enzima. La secuencia de corte o diana


66


64

de restricción suele estar compuesta generalmente por 4 o 6 pares de bases (pb). Este método

permite la discriminación de especies o genotipos según los diferentes patrones de bandas

originados. Ha sido aplicado a la discriminación de las subespecies de B. canis (Carret y cols.

1999; Zahler y cols. 1998) o para diferenciar la presencia de T. annulata y T. lestoquardi en los

hospedadores y vectores (Spitalska y cols. 2004) usando como diana genes ribosómicos o los

espaciadores intergénicos. Otro gen utilizado en la identificación por PCR de varios piroplasmas es

el gen de la -tubulina. Caccio y cols. (2000) desarrollaron un protocolo de detección y

diferenciación de varios piroplasmas del ganado vacuno y equino combinando las diferencias en el

tamaño del amplicón y en los patrones obtenidos por la restricción enzimática de dicho amplicón.

Años más tarde, Teglas y cols. (2005) aplicaron este procedimiento al diagnóstico de las

piroplasmosis del equino y vacuno.

Una técnica que permite la detección e identificación simultánea de varios agentes presentes en

una misma muestra es la hibridación por “Reverse Line Blot” (RLB), desarrollada por Kaufhold y

cols. (1994). Fueron Gubbels y cols. (1999) quienes aplicaron por primera vez esta técnica al

diagnóstico de las piroplasmosis. La RLB combina la amplificación por PCR con una pareja de

cebadores genéricos que hibridan con todos los organismos objeto de estudio, con la hibridación de

los productos amplificados a unas sondas específicas para las distintas especies. Las características

anteriormente mencionadas del gen 18S rRNA de combinar regiones conservadas con otras zonas

más variables le convierten en uno de los genes diana idóneos para el desarrollo de esta técnica.

Así, para la amplificación se utilizan cebadores diseñados en zonas del gen 18S rRNA conservadas

en todas las especies de piroplasmas, mientras que las sondas (oligonucleótidos) se diseñan en

zonas específicas para cada una de las especies que se desee identificar. Una de las zonas del gen

18S rRNA que cumple estas características es la región hipervariable V4. Además de las sondas

específicas de especie, se pueden incluir también sondas específicas de género que actúen a modo

de control y que a su vez permitirían detectar la presencia de especies para las que no se haya

incluido una sonda específica. Utilizando un minibloter las sondas se disponen en hileras sobre una

membrana de nylon cargada negativamente a la que se unen covalentemente por un grupo amino

presente en su extremo 5’ terminal (Figura 6). El producto amplificado se añade posteriormente

tras girar 90º el miniblotter, es decir, los productos de PCR se aplican perpendicularmente a la

dirección de las sondas, de manera que los diferentes amplificados de los piroplasmas a detectar

entren en contacto con cada una de las sondas específicas. Tras una serie de lavados la reacción de

hibridación se detecta por quimioluminiscencia, para lo cual uno de los cebadores utilizados en la

PCR deberá estar biotinilado (Figura 6). La incubación de la membrana con una estreptavidina-

peroxidasa detecta la biotina de los productos amplificados, y la posterior exposición de la

membrana al sustrato peroxidasa (ECL o SuperSignal West Dura) da lugar a una reacción

quimioluminiscente que se capta en una película dando lugar al patrón de hibridación (Figura 7).


67


65

Figura 6. Representación esquemática del proceso de la hibridación en la RLB.

Figura 7. Ejemplo del patrón de hibridación obtenido por RLB.

La técnica ofrece una gran sensibilidad, tres órdenes de magnitud por encima del limite de

detección de la PCR, detectando niveles de parasitemia comparables con los que presentan los

animales portadores (Gubbels y cols. 1999). Por tanto, la RLB aúna una alta sensibilidad con la

capacidad de detectar e identificar simultáneamente múltiples agentes, lo que la hace especialmente

interesante para el estudio de las ETG. Al comienzo de este trabajo, la aplicación de la técnica de

RLB a la detección e identificación de especies de piroplasmas era limitada y se centraba

fundamentalmente en las especies que afectan al ganado vacuno (Gubbels y cols. 1999). Si bien

también se había empleado en la detección en rumiantes y/o garrapatas de otras ETG como la

anaplasmosis, ehrlichiosis y la enfermedad de Lyme (Bekker y cols. 2002; Rijpkema y cols. 1995).

En la actualidad y como se tratará en los capítulos de resultados y de discusión de este trabajo su

uso está ya más extendido en la detección de las piroplasmosis y otras ETG.

Productos de PCR Señal Sondas específicas

Sonda genérica

Sondas específicas

Sondas

Productos de PCR

Membrana

Sonda

Producto de PCR

Biotina

Quimioluminiscencia Sustrato peroxidasa

estreptavidina-peroxidasa


68


66

1.6 CONTROL DE LAS PIROPLASMOSIS

El control de las enfermedades transmitidas por garrapatas y más concretamente las

piroplasmosis, contempla varias estrategias de actuación: a nivel individual, ambiental y

profiláctico.

El método de prevención más eficaz es evitar la exposición de los animales a las garrapatas

(Homer y cols. 2000; Smith y Kakoma 1989), sin embargo esta estrategia es difícilmente aplicable

en los animales de producción extensiva o semiextensiva porque en la mayoría de los países de

clima templado el periodo de máxima actividad de las garrapatas coincide con el periodo de

pastoreo. La transmisión del parásito puede limitarse con la retirada de la garrapata entre las

primeras 24-72 horas desde que se adhiere, ya que se ha observado una correlación directa entre el

tiempo de adherencia y la transmisión de esporozoitos (Konnai y cols. 2007; Piesman y Spielman

1980) pero ésta no es tampoco una medida practicable. Hoy en día, las estrategias de control de

población de garrapatas se basan casi exclusivamente en el control químico mediante insecticidas.

Inicialmente se utilizaron los insecticidas organoclorados, que a pesar de su gran eficacia tuvieron

que ser sustituidos por otros con menor persistencia en los animales y menos estables en el medio

como los organosfosforados y carbamatos. Posteriormente, el desarrollo de las piretrinas y

piretroides y avermectinas supuso un gran avance en este campo debido a sus ventajas como la alta

biodegradabilidad, baja toxicidad de sus metabolitos y su rápida excreción. Sin embargo, en la

actualidad, como consecuencia de la aparición de resistencias a estos productos se está

experimentando con nuevos productos del grupo de las benzoilfenil ureas. Representan una nueva

generación de productos químicos que actúan inhibiendo la síntesis de quitina y abren nuevas

posibilidades en el control de los ectoparásitos, pero de momento no hay disponibles en el mercado

este tipo de compuestos para la lucha frente a garrapatas. Respecto a la elección del método de

aplicación del producto, depende de la especie animal, tamaño del rebaño, edad de los animales,

estado productivo, e infraestructura de la explotación. Los métodos más utilizados son los baños,

las duchas portátiles y otros métodos de aspersión, y los procedimientos “pour-on” (aplicación del

insecticida por la línea dorso-lumbar del animal) (García-Pérez y Barral 1999). Otro factor

importante a la hora de diseñar un tratamiento contra garrapatas es el momento del año en el que se

aplica. La administración debe realizarse cuando el riesgo de exposición de los animales a las

garrapatas es más elevado. Esto conlleva la optimización de la relación coste/beneficio del

producto y evita la aparición de las resistencias a los acaricidas. Un conocimiento adecuado de la

dinámica anual de las garrapatas en una zona es la clave para componer un plan de actuación contra

estos parásitos con garantías de éxito. En el caso de la existencia de una ETG en un área interesa

mantener la parasitación por las garrapatas a un nivel por debajo del cuál no puedan darse nuevos

brotes de enfermedad pero que permita a la vez una estabilidad enzoótica. Por el contrario, un

control total y continuo puede conducir a la reaparición de la enfermedad.


69


67

Aunque la aplicación de acaricidas es el método más popular, se han desarrollado otros medios

de lucha no química mediante acciones de tipo directo o indirecto sobre la supervivencia o

desarrollo de las garrapatas, bien modificando el biotopo, exponiéndoles a depredadores,

modificando su potencial reproductor o impidiendo su contacto con el hospedador. Igualmente, los

modelos matemáticos elaborados a partir de datos cuantitativos representan una herramienta de

gran valor en el control de parásitos. Mediante la correlación entre variables abióticas y datos sobre

la presencia o ausencia de garrapatas se crean mapas predictivos útiles a la hora de coordinar las

diferentes estrategias de control en una zona (Estrada-Peña 2001, 2006).

La lista de compuestos efectivos para el tratamiento de las piroplasmosis es extensa, sin

embargo, su utilización se ve supeditada a su disponibilidad comercial y a las leyes administrativas

de cada país. El éxito del tratamiento depende del diagnóstico precoz, la rapidez en la efectiva

administración del fármaco, la especie de piroplasma y de la tolerancia del hospedador al fármaco

(Vial y Gorenflot 2006). El tratamiento de elección para la babesiosis es el dipropionato de

imidocarb administrado por vía subcutánea o intramuscular. Además es el único fármaco

quimioprofiláctico del mercado que ofrece una protección frente a la fase clínica de la enfermedad

durante un periodo suficientemente prolongado como para permitir un nivel mínimo de infección

para el desarrollo de inmunidad en las áreas donde la babesiosis es endémica (Bock y cols. 2004;

Vial y Gorenflot 2006). La eliminación completa del parásito puede conseguirse con dosis altas del

fármaco, pero puede ser contraproducente si estamos de ese modo evitando que los animales

adquieran inmunidad al parásito. El problema más grave de esta estrategia es la presencia de

residuos en la carne y la leche, que ha llevado a la retirada del imidocarb en muchos países

europeos (Zintl y cols. 2003). Otro fármaco con buenos resultados frente a las babesiosis bovinas

es el aceturato de diminazeno (Bock y cols. 2004). Se han observado también buenos resultados

frente a las piroplasmosis equinas: es efectivo frente a B. caballi y en la eliminación de los signos

clínicos producidos por T. equi (Bruning 1996). T. equi es más refractario al tratamiento que B.

caballi, siendo el estado de portador difícil de eliminar (Kuttler y cols. 1987). Los fármacos

theilericidas derivados de hidroxinaftoquinona, como la parvacuona y buparvaquona, tienen una

eficacia limitada frente a la theilerosis equina. Parece que son efectivos contra la fase aguda de la

theilerosis equina, aunque en combinación con el imidocarb dan buenos resultados (Zaugg y Lane

1992). Por el contrario, la buparvaquona si que ofrece buenos resultados frente a las theileriosis

bovinas (Wilkie y cols. 1998). Sin embargo, el tratamiento de las theileriosis es caro y sólo es

efectivo en las primeras fases de la enfermedad. De lo contrario, los animales tratados mueren o

bien sobreviven pero sin recuperar su capacidad de producción (Morrison y McKeever 2006).

Además, hay que añadir que estos fármacos no están comercializados en todos los paises por lo que

los antibióticos de amplio espectro (oxitetraciclina) son los únicos fármacos disponibles en

ocasiones para combatir esta enfermedad (Soulsby 1982). Sin embargo, el efecto de la

2. ESTUDIOS


70


68

oxitetraciclina es eficaz en el inicio de la infección, no mostrando mejoría una vez que la

enfermedad está avanzada (Soulsby 1982). En los animales de gran valor suele ser aconsejable el

tratamiento complementario con antiinflamatorios no esteroideos para paliar el proceso

inflamatorio asociado a las infecciones o la transfusión sanguínea en los animales muy anémicos

(Vial y Gorenflot 2006).

Con respecto a la profilaxis vacunal de la enfermedad, hace unos años era común la práctica de

la inmunización de los animales procedentes de zonas libres de garrapatas y de enfermedad antes

de introducirlos en las zonas endémicas. Consistía en la inoculación de sangre infectada de

animales portadores seguida de un tratamiento específico en cuanto la sintomatología resultaba

aparente, minimizando de esta forma la acción del parásito y permitiendo el establecimiento de la

infección crónica, con el consiguiente desarrollo de inmunidad (Pipano y cols. 1987). Sin embargo,

en vista del grave riesgo de enfermedad y la posibilidad de cotransmisión de otros agentes

infecciosos como bacterias y virus, esta práctica dejó de aplicarse. La mayoría del trabajo realizado

en el desarrollo de vacunas frente a los piroplasmas se ha centrado en las babesias bovinas, y como

resultado se han desarrollado vacunas vivas, vacunas atenuadas, vacunas que utilizan antígenos

solubles a partir de cultivos in vitro y vacunas recombinantes (de Waal y Combrink 2006; Homer y

cols. 2000). Debido a las limitaciones propias de las vacunas vivas, la tendencia actual va

encaminada al desarrollo de vacunas de subunidades (Morrison y McKeever 2006), que utilizan

solamente aquellos fragmentos antigénicos más adecuados para estimular una respuesta

inmunitaria. A pesar de los estudios experimentales de vacunación realizados con cepas españolas

(Gubbels y cols. 2000b), en la actualidad no se encuentran disponibles este tipo de vacunas en

Europa. En España la única vacuna comercializada actúa frente a la babesiosis del perro

(Pirodog®).

Estudio I.

Nagore D., García-Sanmartín J., García-Pérez A. L., Juste R. A., Hurtado A.

Detection and identification of equine Theileria and Babesia species by reverse line blotting: epidemiological survey and phylogenetic analysis.

Veterinary Parasitology 2004; 123: 41-54.

PMID: 15265570

Abstract

Specific oligonucleotide probes were designed to develop a new and highly sensitive

reverse line blot assay to detect and identify simultaneously different Theileria and

Babesia species in horses. The amplified hypervariable V4 region of the 18S rRNA gene

was hybridised against different generic and species-specific probes. The survey was

conducted over 243 samples of equine blood divided into three different groups: group 1,

24 horses presented as possible clinical piroplasmosis; group 2, 181 clinically healthy free-

ranging horses exposed to ticks; group 3, 38 riding horses with unrelated pathologies and

low or no contact with ticks. The study demonstrated a high piroplasm prevalence in the

first two groups of animals. Two Theileria genotypes sharing 96.8% similarity between

their 18S rRNA gene sequences and two Babesia genotypes sharing 97.4% similarity, were

identified. The biologic meaning of such genotypes is discussed in terms of their

phylogenetic relationships and potential pathogenicity.

Estudio III .

García-Sanmartín J., Nagore D., García-Pérez A. L., Juste R. A., Hurtado A.

Molecular diagnosis of Theileria and Babesia species infecting cattle in Northern Spain using reverse line blot macroarrays.

BMC Veterinary Research 2006; 2: 16.

PMID: 16684356 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1746-6148-2-16.pdf

Abstract

BACKGROUND: Piroplasmosis in cattle is caused by tick-borne haemoprotozoan

parasites of the genera Theileria and Babesia. Molecular detection techniques offer higher

sensitivity and specificity than microscopy examination methods and serological tests. A

reverse line blot (RLB) macroarray that included generic and species-specific probes for

Theileria annulata, Theileria buffeli, Babesia bovis, Babesia bigemina, Babesia divergens

and Babesia major was used to study the presence and identity of the piroplasm species

infecting 263 bovine blood samples from 79 farms, most of them in Northern Spain.

Microscopy examination of blood smears and haematology were also performed whenever

possible to identify animals with parasitaemia. RESULTS: RLB hybridisation identified

infection in 54.0% of the samples, whereas only 28.8% were positive by microscopy

examination. The most frequently found species was T. buffeli, present in 42.6% of the

samples. T. annulata was found in 22 samples (8.4%) from 12 farms, including 9 farms (14

samples) located in Northern Spain where presence of the vector is not very common.

Babesia infections were less frequently detected: B. major was found in 3.0% of the

samples, B. bigemina in 2.7%, B. bovis in 2.3% and B. divergens in 1.1%. Mixed infections

were detected in 14 samples, accounting for six different combinations of species.

CONCLUSION: This is the first report in which B. major and B. divergens have been

detected in Spain using molecular identification techniques and the first time that B. bovis

has been detected in Northern Spain. The detection of T. annulata in Northern Spain

suggests that the distribution of Mediterranean theileriosis might be changing. Samples

with positive RLB hybridisation but negative microscopy had haematology values within

the normal ranges suggesting that they corresponded to chronic carriers that may serve as

reservoirs of the infection. In this sense, sensitive and specific laboratorial tests like RLB

that clearly identify the parasite and can detect subclinical infections are essential to

establish good control measures.

Estudio II .

Nagore D., García-Sanmartín J., García-Pérez A. L., Juste R. A., Hurtado A.

Identification, genetic diversity and prevalence of Theileria and Babesia species in a sheep population from Northern Spain.

International Journal for Parasitology 2004; 34: 1059-1067.

PMID: 15313132

Abstract

The genetic diversity and prevalence of virtually all Theileria and Babesia species in a

sheep population were studied using a specifically designed reverse line blot macroarray.

The amplified hypervariable V4 region of the 18S rRNA gene was hybridised against

generic and species-specific probes. In a first screening (Study I), 320 apparently healthy

animals corresponding to 32 flocks located in the Basque Country (Northern Spain) were

analysed. The survey demonstrated a high prevalence of subclinical infections (64.7%).

Three Theileria genotypes were identified, sharing 96.7-97.0% similarity between their

18S rRNA gene sequences: Theileria ovis, Theileria sp. OT1 (99.6% similarity with the

recently described pathogenic piroplasm Theileria sp. China 1), and Theileria sp. OT3.

Two Babesia species sharing 91.5% similarity were also detected: Babesia ovis and

Babesia motasi. The complete 18S rRNA gene sequences of these and other piroplasm

species were phylogenetically analysed. Prevalence of piroplasms was also investigated in

a second group of 80 sheep from 16 flocks reared in mountain areas that had been heavily

exposed to ticks and had suffered a recent abortion episode (Study II). The screening

revealed a significantly higher (P < 0.05) prevalence (78.7%) of piroplasm infections

compared to Study I. Although the prevalence rates for some piroplasm species were

significantly related to abortion (e.g. Theileria sp. OT3), decreases in the red cell

parameters were not significant. The widespread distribution of Theileria spp. in the

studied sheep population suggests that the parasites involved are of relatively low

pathogenicity, in contrast to what has been reported for Theileria sp. China 1 in other

countries.

Estudio IV.

García-Sanmartín J., Aurtenetxe O., Barral M., Marco I., Lavín S., García-Pérez A. L., Hurtado A.

Molecular detection and characterization of piroplasms infecting cervids and chamois in Northern Spain.

Parasitology 2007; 134: 391-398.

PMID: 17076924

Abstract

Wildlife can act as reservoir of different tick-borne pathogens of veterinary and zoonotic

importance. To investigate the role of wild ruminants as reservoir of piroplasm infection,

28 red deer, 69 roe deer and 38 chamois from Northern Spain were examined by reverse

line blot (RLB) hybridization. The survey detected a prevalence of 85.7% in red deer,

62.3% in roe deer and 28.9% in chamois. Four different piroplasms were identified:

Theileria sp. OT3 (previously described in sheep) as the most prevalent (85.7% in red deer,

46.4% in roe deer and 26.3% in chamois); Theileria sp. 3185/02 (previously described in a

red deer in Central Spain) more abundant in red deer (53.6%) than in roe deer (10.1%) but

absent from chamois; Babesia divergens detected in 6 roe deer; Theileria ovis present in 1

chamois. Mixed infections (Theileria sp. OT3 and Theileria sp. 3185/02) were only found

in red and roe deer. Sequencing analysis of the 18S rRNA gene confirmed the RLB results

and showed 99.7% identity between Theileria sp. 3185/02 and T. capreoli, suggesting that

they are the same species. Tick distribution and contact of wild ruminants with domestic

animals are discussed in terms of piroplasm infection. The results suggest that a

considerable number of wildlife ruminants are asymptomatic carriers that may serve as

reservoirs of the infection posing a serious concern in terms of piroplasmosis control.

Estudio V.

García-Sanmartín J., Barandika J. F., Juste R. A., García-Pérez A. L., Hurtado A.

Distribution and molecular detection of Theileria and Babesia in questing ticks from Northern Spain.

Medical and Veterinary Entomology 2008; 22: 318-325.

PMID: 19120958

Abstract

A total of 562 questing adult ixodid ticks, collected during 2003-05 in 10 recreational

mountain areas in northern Spain, were analysed for piroplasm infection. Reverse line blot

(RLB) analysis using a panel of probes for 23 piroplasm species identified 16 different

piroplasms, with an overall prevalence of 9.3%. Most were Theileria spp.-positive (7.7%),

3.0% were positive for Babesia spp. and 1.4% of ticks harboured both genera. Ixodes

ricinus (Linnaeus, 1758), the most abundant tick in the vegetation, ranked third with regard

to piroplasm infection prevalence (11.4%) after Rhipicephalus bursa (Canestrini &

Fanzago, 1878) (16.0%) and Haemaphysalis punctata (Canestrini & Fanzago, 1878)

(13.5%). Infection was detected in 6.2% of Dermacentor reticulatus (Fabricius, 1794) and

in 1.1% of Haemaphysalis inermis (Birula, 1895), but was absent from Haemaphysalis

concinna (Koch, 1844). Ixodes ricinus carried more piroplasm species (13), followed by H.

punctata (10), D. reticulatus (8), R. bursa (3) and H. inermis (1). Although most of the

positive ticks harboured a single infection (76.9%), mixed infections with two or three

different piroplasm species were also detected (23.1%). The various tick-pathogen

associations found are discussed and prevalences of infection in ticks are compared with

previous results on piroplasms infecting animals in the same region.

3. DISCUSIÓN GENERAL

discusión generAl

139

Discusión general

137

Discusión general

Las piroplasmosis son enfermedades de difusión mundial asociadas a la presencia de las

especies de garrapatas vectoras, que provocan importantes pérdidas económicas en el sector

ganadero, particularmente en aquellos sistemas de producción en los que, como en la CAPV, el

pastoreo en zonas comunales juega un importante papel. Por tanto, el estudio de esta enfermedad

requiere la investigación tanto de los agentes causales (los protozoos intraeritrocitarios de los

géneros Theileria y Babesia) en la población de hospedadores susceptibles, como de las garrapatas

vectoras de la zona de estudio. Desde la descripción de los primeros casos producidos por Babesia

o Theileria en el ganado vacuno (Babes 1888; Koch 1898), paulatinamente se fueron realizando

nuevas descripciones de piroplasmas. Funallet Matas (1947) realizó una recopilación de los casos

de piroplasmosis en España en la que señalaba que prácticamente todas la zonas ganaderas se

encontraban afectadas. En la CAPV, Sáiz (1930) describió por vez primera casos de piroplasmosis

en toros andaluces lidiados en San Sebastián. En el momento de plantearse este estudio los datos

disponibles en la CAPV se limitaban a los obtenidos a partir de los casos clínicos remitidos al

Servicio de Diagnóstico de NEIKER, a los hallazgos de un estudio experimental llevado a cabo en

ovino (Juste y cols. 1986) y a un estudio de la presencia de babesias en la hemolinfa de garrapatas

recogidas en el ganado vacuno y ovino (Moreno 1995). Los estudios realizados en otras regiones de

España tampoco eran abundantes. En la década de los 80, con el fin de aclarar la situación

epizootiológica de las piroplasmosis en Salamanca, Simón-Vicente y cols. (1987) realizaron un

estudio epidemiológico de los piroplasmas presentes en el ganado vacuno y ovino utilizando

técnicas de microscopía. Posteriormente, se realizaron diversos estudios epidemiológicos utilizando

técnicas serológicas (IFI) que demostraron una exposición frecuente a estos agentes en el ganado

equino (Camacho y cols. 2005a; Coleto 1999; Habela y cols. 1989) y los pequeños rumiantes

domésticos y silvestres (Ferrer y cols. 1998b, 1998a, 1998c; Ferrer y Castellá 1999). Las técnicas

de biología molecular como la PCR se comenzaron a aplicar a finales de los 90 para el estudio de la

theileriosis mediterránea (Habela y cols. 1999; Martín-Sánchez y cols. 1999). La técnica de RLB

fue aplicada por primera vez en España por Almería y cols. (2001b, 2002) para la detección de los

piroplasmas en el ganado vacuno.

Actualmente los métodos de rutina que con mayor frecuencia se utilizan en los laboratorios de

diagnóstico para la detección de estos organismos son la demostración por microscopía de la

presencia de piroplasmas en los frotis sanguíneos teñidos por el método de Giemsa o el estudio del

estado inmunológico de los animales mediante las técnicas serológicas. A pesar de ser técnicas

sencillas disponibles en cualquier laboratorio son numerosas sus limitaciones, fundamentalmente

debido a su baja sensibilidad y especificidad, lo que limita su utilidad para detectar las fases

iniciales o crónicas de la enfermedad, identificar infecciones mixtas y diferenciar ciertas especies

entre sí. Estas carencias pueden dar como resultado una infraestimación del estado de portador en


140

Discusión general

138

los estudios epidemiológicos y el empleo inadecuado de medias profilácticas. En los últimos años

la aplicación de la biología molecular en el campo del diagnóstico de las piroplasmosis ha

conducido al desarrollo de varias PCRs útiles y específicas para la detección de distintas especies

de babesias y theilerias. Sin embargo, la capacidad de detección simultánea de varios agentes por

PCR es limitada, y requiere la aplicación de varias reacciones lo que encarece y retrasa el

diagnóstico. Los laboratorios de diagnóstico reciben multitud de muestras de diversas especies

animales por lo que requieren de técnicas capaces de detectar todos estos agentes de una forma

rápida y simultánea. Además, las garrapatas son vectores de multitud de agentes por lo que es

frecuente que estos organismos se presenten de forma simultánea en el mismo hospedador.

Igualmente, los estudios epidemiológicos requieren técnicas, además de sensibles y específicas,

capaces de identificar simultáneamente un buen número de especies. Una técnica que cumple estas

características es la RLB. La técnica había sido recientemente aplicada al diagnóstico y detección

de algunos piroplasmas del ganado vacuno por Gubbels y cols. (1999). Uno de los objetivos de esta

Tesis Doctoral fue desarrollar métodos basados en la RLB para el diagnóstico de las especies de

piroplasmas que afectan a los animales domésticos y rumiantes silvestres de la CAPV. Una de las

grandes ventajas de la RLB es que permite incluir sondas con distinto nivel de especificidad (ej.

sondas específicas de género, de especie, de genotipo). Los datos previos de distribución de

especies de piroplasmas de los que se disponía provenían del análisis por microscopía de muestras

sospechosas remitidas al Servicio de Diagnóstico, lo que podía representar un espectro incompleto

de las especies presentes de la zona. Por ello, en una primera fase de este estudio se incluyeron

sondas específicas para las especies que con estos datos y los obtenidos de la bibliografía se preveía

encontrar, pero además se incluyeron dos sondas específicas de género, una para el género

Theileria y otra para Babesia. Esta estrategia permitió detectar la presencia de nuevas theilerias y

babesias en las poblaciones de hospedadores estudiadas, para las cuáles se fueron diseñando sondas

específicas. Al finalizar este trabajo se han diseñado un total de 23 sondas específicas que han

permitido detectar e identificar 9 theilerias y 9 babesias distintas en las poblaciones de animales y

garrapatas estudiadas. De esta manera, la metodología basada en la técnica molecular RLB

desarrollada ha demostrado poseer gran especificidad y sensibilidad, y ser muy útil en la detección

de los piroplasmas presentes en los animales y garrapatas de la CAPV. Como ya demostraron

anteriormente Gubbels y cols. (1999), la técnica proporciona una sensibilidad de hasta tres ordenes

de magnitud por encima de la PCR (llegando a detectar una molécula del gen 18S rRNA), y una

especificidad y sensibilidad muy superiores a la técnica de microscopía (Altay y cols. 2007;

Georges y cols. 2001). A diferencia de las PCRs específicas en las que se requiere una cantidad

considerable de DNA para realizar el número necesario de reacciones que detecten todos los

agentes potencialmente presentes en la muestra, el empleo de una única PCR asociada a la RLB

permite analizar la presencia de varios agentes incluso en muestras en las que la cantidad de DNA

disponible es limitada (como el caso de las garrapatas), además se reduce la manipulación y el

discusión generAl

141

Discusión general

139

riesgo de contaminación, tan problemático en las técnicas moleculares. A la vista de sus ventajas, la

RLB se ha convertido en una herramienta relativamente habitual en la detección de piroplasmas

(Almería y cols. 2002; Altay y cols. 2007; Georges y cols. 2001; Gubbels y cols. 1999; Matjila y

cols. 2004, 2005; Nijhof y cols. 2003; Oura y cols. 2004; Schnittger y cols. 2004; Sparagano y cols.

2000), y otras ETG como la anaplasmosis (Bekker y cols. 2002). Esta técnica ha demostrado una

gran adaptabilidad al amplio abanico de muestras analizadas en este trabajo y habitualmente

remitidas de los laboratorios de diagnóstico como la sangre y tejidos procedentes de diversos

hospedadores animales o las garrapatas. Además, el descenso del coste de los reactivos y del

equipamiento de las técnicas moleculares ha facilitado la accesibilidad a estas técnicas a un mayor

número de laboratorios.

Al igual que en otros estudios (Altay y cols. 2007; Nijhof y cols. 2003), la aplicación de la

técnica de la RLB ha servido para descubrir la presencia de nuevas theilerias y babesias en las

poblaciones estudiadas. Las sondas genéricas diseñadas para los géneros Theileria y Babesia han

garantizado la detección de cualquier especie o genotipo nuevo para los que inicialmente no se

había incluido una sonda específica. La elección del gen ribosómico 18S rRNA, ampliamente

utilizado en estudios de filogenia y taxonomía, ha demostrado ser muy útil para la identificación de

estos organismos. La posterior secuenciación y análisis filogenético han permitido caracterizar

nuevos piroplasmas no descritos anteriormente en el ganado equino, ovino y en los cérvidos. Estos

genotipos mostraron una divergencia genética respecto a la especie filogenéticamente más próxima

comparable con la que presentan otros piroplasmas con rango de especie. En la población equina se

han detectado dos nuevos genotipos, T. equi-like y B. caballi-like, con una similitud del 96,8% y

97,4% con el gen 18S rRNA de T. equi y B. caballi, respectivamente. Recientemente, Criado-

Fornelio y cols. (2004, 2006) han detectado en otras regiones del sur de España los que

probablemente sean los mismos piroplasmas (similitud del 99,4-99,5%). Aunque sería necesario

realizar estudios específicos de patogenicidad para los nuevos genotipos descritos en este estudio,

la alta parasitemia observada entre los caballos positivos a T. equi-like y B. caballi-like con

sintomatología clínica y parámetros hemáticos de la serie roja disminuidos (principalmente en el

caso de T. equi-like) hacen sospechar que estos nuevos genotipos posean un poder patógeno similar

a las especies filogenéticamente más próximas. Asimismo, en este estudio se han detectado otros

tres nuevos genotipos de Theileria en la población de ganado ovino y rumiantes silvestres. En la

población ovina se ha detectado la presencia del genotipo Theileria sp. OT1, genéticamente

relacionado con la patógena Theileria sp. China 1 (Luo y Yin 1997; Schnittger y cols. 2000),

demostrando que la distribución de esta theileria no es exclusiva de China y Japón como se había

sugerido (Schnittger y cols. 2003). La distribución del genotipo Theileria sp. 3185/02,

genéticamente relacionado con una theileria aislada de un corzo de Galicia e identificada como T.

capreoli (similitud del 99,7% en el gen 18S rRNA), se limitó a la población de cérvidos. En


142

Discusión general

140

cambio, Theileria sp. OT3, con un 97,9% de similitud con el gen 18S rRNA de una Theileria

aislada de un ciervo sika y recientemente detectada de forma puntual en la población ovina de

Turquía (con un 99,7% de similitud) (Altay y cols. 2007), se encontró ampliamente distribuida

tanto en la población ovina como en la de cérvidos y rebecos. Este hecho vuelve a confirmar la

diversidad de hospedadores en la que se está detectando el DNA de algunas especies de

piroplasmas (Buling y cols. 2007; Criado-Fornelio y cols. 2003b, 2003d, 2006; Torina y cols.

2007a), si bien está pendiente estudiar la implicación de estos animales como posibles reservorios

alternativos en el ciclo biológico de estos agentes. La alta distribución de los genotipos de Theileria

sp. OT1, Theileria sp. 3185/02 y Theileria sp. OT3 en la población de animales sanos nos hace

sospechar de su probable apatogenicidad.

El análisis filogenético de los piroplasmas presentes en el ganado ovino y equino, confirmó las

diferencias encontradas en las secuencias nucleotídicas. Tal y como sugieren otros autores (Altay y

cols. 2007; Schnittger y cols. 2003), el estudio filogenético de las secuencias del gen 18S rRNA

reafirma la idea de que las especies de Theileria que parasitan el ganado ovino forman un grupo

heterólogo no limitado a T. ovis, T. lestoquardi y T. separata. Los resultados sugieren que estos

nuevos genotipos constituyen nuevas especies más que variaciones debidas a cepas diferentes. Sin

embargo, en ausencia de otras características diferenciales que determinen la entidad taxonómica

de estos nuevos piroplasmas únicamente se pueden considerar como nuevos genotipos, por lo que

será necesario realizar más estudios sobre las características genéticas y biológicas de estos

piroplasmas. Por otro lado, el análisis filogenético de las secuencias del gen 18S rRNA de babesias

y theilerias confirma la existencia de dos grupos monofiléticos distintos, uno de los cuales agrupa a

las babesias y otro a las theilerias, corroborando la entidad de T. equi (Schnittger y cols. 2003).

Además de estos nuevos genotipos, las especies de piroplasmas detectadas en los animales

domésticos y silvestres así como en las garrapatas fueron las esperables en estas latitudes. No

obstante, es la primera vez que B. bovis se detecta en el norte de España; anteriormente había sido

descrita en otras regiones (Almería y cols. 2001b; Cordero del Campillo y cols. 1994). Este nuevo

hallazgo se suma a los casos descritos en otras regiones menos cálidas de Europa como los

detectados en la zona norte de Italia (Torina y Caracappa 2007). Este trabajo ha servido también

para realizar la primera detección por técnicas moleculares de dos especies de Babesia, B. major y

B. divergens, cuya existencia en España se había ya descrito por técnicas tradicionales (Cordero del

Campillo y cols. 1994). Igualmente es la primera vez que se realiza un estudio epidemiológico

molecular de los piroplasmas presentes en los cérvidos de la CAPV y en los rebecos del Pirineo.

Con anterioridad sólo se había reseñado su presencia en un ciervo de España Central importado de

Alemania (Hofle y cols. 2004), y en la cabra pirenaica y el rebeco del Pirineo (Hurtado y cols.

2004; Marco y cols. 2000), o realizado estudios seroepidemiológicos de la presencia de babesias en

el muflón y en la cabra pirenaica (Ferrer y cols. 1998b, 1998c). La detección molecular de B.

discusión generAl

143

Discusión general

141

divergens en los corzos de la CAPV se suma a los hallazgos realizados en los cérvidos de Europa

(Duh y cols. 2005b; Langton y cols. 2003). La secuencia de la región hipervariable V4 del gen 18S

rRNA de las cepas de B. divergens identificadas en la CAPV fueron 100% idénticas a la secuencia

de una babesia (obtenida de un corzo procedente de Francia) y depositada en GenBank como B.

capreoli. Sin embargo, aunque Gray y cols. (1990) han descrito diferencias en especificidad

hospedadora, no se han podido establecer diferencias morfológicas, serológicas ni moleculares

entre B. divergens y B. capreoli que permitan diferenciarlas, por lo que deberían considerarse como

la misma especie parasitando diferentes hospedadores.

Hasta este trabajo la distribución de la theileriosis mediterránea en España (Almería y cols.

2002; Habela y cols. 1999; Martín-Sánchez y cols. 1999; Viseras y cols. 1999) venía definida por

la presencia de garrapatas del género Hyalomma, ya que no se había involucrado a otras garrapatas

en el ciclo natural del parásito. La distribución de las garrapatas del género Hyalomma en España

se restringe a la zona meridional de la Península y las islas Baleares (Almería y cols. 2001b;

Cordero del Campillo y cols. 1994; Estrada-Peña y cols. 2004). Según lo anteriormente indicado, se

podría excluir el norte de España de las zonas de riesgo de esta enfermedad. Sin embargo, la

detección de T. annulata en el ganado vacuno y garrapatas de la especie I. ricinus del norte de

España sugiere que la distribución de la theileriosis mediterránea es más amplia de lo que los datos

anteriores sugerían. No debemos olvidar que los movimientos de ganado juegan un papel

importante en la modificación de los patrones epidemiológicos establecidos. La importación de

animales desde áreas endémicas a zonas indemnes puede provocar la aparición de graves brotes

clínicos de enfermedad, al tratarse de poblaciones altamente susceptibles, facilitando la

implantación posterior de la infección. Por otra parte, el cambio climático global podría alterar la

distribución de los vectores (Bengis y cols. 2004) o facilitar la transmisión de ciertos agentes por

especies de garrapatas de esta región.

La alta sensibilidad de la RLB empleada en este trabajo ha permitido la detección de animales

tanto en fase clínica como animales con infección subclínica. La detección de DNA de piroplasmas

en la población de animales domésticos y silvestres sanos o sin sintomatología aparente, con

niveles de parasitemia no detectables por microscopia y parámetros hematológicos dentro de la

normalidad, demuestra una alta proporción de animales que podrían estar contribuyendo, como

portadores, al mantenimiento de la infección y su distribución a través de la picadura de las

garrapatas (Calder y cols. 1996; Gubbels y cols. 1999; Ueti y cols. 2005). Como consecuencia, la

situación epidemiológica de las piroplasmosis en la CAPV se podría clasificar de endémica, pues

un alto porcentaje del ganado ha tenido contacto con el parásito, encontrándose inmunizado. Sin

embargo, el alto número de muestras recibidas en los últimos años con sospecha clínica de

piroplasmosis en el servicio de diagnóstico de NEIKER nos hace pensar que este estado de

equilibrio parásito-hospedador puede verse roto con más frecuencia de la esperada. En ocasiones,


144

Discusión general

142

podría llegar a producirse una reducción temporal de garrapatas infectadas como consecuencia de

las fluctuaciones climáticas o tratamientos con acaricidas (en determinadas áreas de pastos

comunales es un tratamiento obligatorio), lo cual haría descender la tasa de infección y por tanto de

premunización, aumentando la vulnerabilidad de hospedadores cuando se recuperan las

condiciones climáticas favorables o cesan las medidas de control. Además, la concurrencia de

animales de diferentes estatus sanitario como consecuencia del aprovechamiento de pastos

comunales durante las épocas más calurosas o el solapamiento de áreas con diferentes grados de

estabilidad, puede provocar la aparición de brotes epidémicos de enfermedad en los animales

procedentes de áreas indemnes (Yeruham y cols. 1998; Zintl y cols. 2003).

La alta prevalencia de Theileria spp. respecto a Babesia spp. detectada entre los animales

portadores podría deberse a la suma de un conjunto de factores relacionados con la patogenicidad

de los piroplasmas, la parasitemia de los animales y las medidas profilácticas adoptadas y

disponibles en el mercado. La infección por las theilerias benignas no suele producir ninguna

sintomatología aparente entre los animales por lo que los animales no son tratados, de manera que

se desarrolla una infección prolongada que sirve de reservorio de la enfermedad y fuente continua

de parásitos para la infección de las garrapatas de la zona, las cuales a su vez contribuirían a

mantener la infección en la población de hospedadores competentes, y a favorecer la estabilidad

endémica. La baja prevalencia observada en las infecciones por Babesia spp. podría deberse a las

fluctuaciones en los niveles de parasitemia que se producen durante la fase crónica de la infección

(Calder y cols. 1996; Figueroa y cols. 1992; Gubbels y cols. 1999), al bajo número de eritrocitos

infectados en circulación (Homer y cols. 2000) y al uso continuado de tratamientos efectivos que

contribuirían a una menor tasa de infección en las garrapatas. Esta alta presencia de Theileria spp.

respecto a Babesia spp. también fue detectada entre las garrapatas analizadas. En este caso el

cociente de prevalencia de Theileria / Babesia fue menor. La supervivencia del parásito en el

medio está condicionada por su presencia en el hospedador vertebrado, especialmente en los

reservorios, y la presencia de garrapatas vectoras del agente. Sin embargo, en la transmisión de

Babesia spp., no sólo intervienen estos factores sino que la trasmisión transovárica de la hembra

adulta al estadio larvario, propia de estos piroplasmas, favorecería la supervivencia de estos agentes

en el medio.

En los estudios de distribución de los piroplasmas de ovino y rumiantes silvestres la presencia

de DNA de Babesia spp. estuvo asociada a los animales jóvenes mientras que la presencia

Theileria spp. se encontró distribuida entre los diferentes grupos de edad, detectando una mayor

prevalencia en los animales de más edad. Este hecho ha sido también observado recientemente en

un estudio llevado a cabo el ganado equino donde detectaron que la presencia de T. equi aumentaba

con la edad mientras que la de B. caballi disminuía (Ruegg y cols. 2007). Esta observación no se ha

discusión generAl

145

Discusión general

143

podido verificar en el estudio realizado en el ganado equino por la escasez de datos relativos a la

edad.

En los últimos años se ha observado en la CAPV un aumento de la población de garrapatas

(Barandika y cols. 2006) posiblemente asociado a la expansión que ha sufrido la población de

animales silvestres en la Comunidad como resultado de los esfuerzos de conservación del medio

ambiente o de repoblación de las áreas con especies cinegéticas. Gran parte de esta expansión se ha

producido en la población de cérvidos, que puede estar implicada en el mantenimiento y

multiplicación de las garrapatas en el medio (Gilot y cols. 1994; Pichon y cols. 1999). En la CAPV

los animales domésticos permanecen varios meses al año en los pastos comunales de montaña

donde entran en contacto con la fauna silvestre. La presencia de un alto número de especies de

garrapatas de tres hospedadores en la CAPV, el estrecho contacto entre los animales domésticos y

silvestres y la alta prevalencia de piroplasmas en los animales podrían favorecer la infección de

hospedadores distintos a los inicialmente descritos para ciertas especies de piroplasmas. Por otra

parte, es probable que en el futuro las interacciones entre los animales domésticos y los silvestres

vayan en aumento, debido a los cambios del aprovechamiento de los pastos y de los sistemas de

producción animal (Thompson 2001), de manera que la transmisión de estos agentes entre distintas

poblaciones animales se vea también aumentada, incrementando la casuística de estas

enfermedades.

La mayoría de los estudios epidemiológicos disponibles en la literatura sobre la detección

molecular del DNA de piroplasmas en las garrapatas recogidas de la vegetación han tenido por

objeto el estudio de especies de Babesia, especialmente las especies zoonóticas B. microti y B.

divergens (Alekseev y cols. 2004; Duh y cols. 2001; Halos y cols. 2005; Hartelt y cols. 2004;

Pieniazek y cols. 2006), así como otras especies patógenas para los animales, como T. parva

(Konnai y cols. 2006; Ogden y cols. 2003), T. equi y B. caballi (Battsetseg y cols. 2001), B.

odocoilei (Steiner y cols. 2006) y B. canis (Duh y cols. 2006; Rar y cols. 2005a). Sin embargo, este

es el primer estudio realizado sobre la detección e identificación de un número tan grande de

especies de piroplasmas, permitiendo identificar las especies de piroplasmas presentes en las

garrapatas de la CAPV. En general, las especies de piroplasmas identificadas en las garrapatas

recogidas de la vegetación han coincidido con las detectadas en las poblaciones de animales

domésticos y silvestres estudiados. En este trabajo se observó que I. ricinus, la garrapata más

abundante en la CAPV (Barandika y cols. 2006; Moreno y cols. 1993; Moreno y Estrada-Peña

1997) y por tanto la más importante desde el punto de vista epidemiológico en la zona, fue la

garrapata infectada con mayor diversidad de especies. Sin embargo, la mayoría de las asociaciones

entre especies de piroplasmas y especies de garrapatas observadas en este estudio no habían sido

previamente descritas en la bibliografía. El estudio de las garrapatas de la vegetación ha permitido

identificar por técnicas moleculares nuevas asociaciones garrapata/piroplasma y, en base a los


146

Discusión general

144

datos epidemiológicos de los estudios realizados en las poblaciones de hospedadores, realizar una

selección de aquellas con mayor probabilidad de tener un significado biológico. A partir de ahora

se plantea la necesidad de llevar a cabo estudios que evidencien la capacidad vectorial de las

garrapatas para cada especie de piroplasma con las que se ha encontrado asociada.

El fuerte crecimiento demográfico y el incremento de las actividades al aire libre han

contribuido a alterar el hábitat natural de los animales y vectores así como su distribución,

facilitando con ello la transmisión de los agentes infecciosos al hombre (Daszak y cols. 2000). Este

hecho representa una seria amenaza para la salud y el bienestar del hombre. En los últimos años, el

interés por las garrapatas como transmisoras de agentes infecciosos ha crecido. Sin duda, la

detección de la enfermedad de Lyme en los EE.UU. fue el factor preponderante que demostró que

las ETG representan un significativo problema de salud pública. En Europa la babesiosis es una

enfermedad profesional ligada al ámbito agroganadero y forestal o a las personas que frecuentan el

medio rural (Kjemtrup y Conrad 2000). La mayoría de los casos descritos en Europa han tenido

lugar en Francia y en Reino Unido (Gorenflot y cols. 1998) donde existe una gran concienciación

hacia esta enfermedad. En España la descripción de casos clínicos de babesiosis en el hombre no es

muy numerosa (Calvo de Mora y cols. 1985; Moreno Giménez y cols. 2006; Olmeda y cols. 1997),

posiblemente porque los casos se queden sin diagnosticar. La presencia de B. divergens, el agente

principal de la babesiosis, en la población bovina, en corzos y en garrapatas, y la alta prevalencia

de la especie vectora I. ricinus en la CAPV sugieren un alto riesgo de infección en el hombre. En

consecuencia, el personal médico debería estar alerta para detectar posibles casos de babesiosis por

B. divergens en la región, principalmente entre las personas inmunocomprometidas, sin descartar la

posibilidad de detectar en el futuro la presencia de la también zoonótica B. microti, detectada en la

Comunidad de La Rioja (Estrada-Peña y cols. 2005).

Como conclusión, los diferentes estudios realizados en la presente Tesis Doctoral han

permitido desarrollar una técnica de diagnóstico sensible y específica muy apropiada para la

identificación de los piroplasmas causantes de las infecciones que cursen de forma clínica o

subclínica en los animales, así como en sus vectores, las garrapatas. Se han identificado nuevos

genotipos, que comienzan a ser descritos en otras regiones de España y del continente europeo.

Asimismo, se ha establecido la prevalencia de las especies Theileria y Babesia presentes entre las

poblaciones de ganado ovino, vacuno, equino y rumiantes silvestres en la CAPV, y se han

identificado especies de garrapatas que podrían actuar como vectores de los diferentes piroplasmas.

Todo ello ha servido para esclarecer importantes aspectos sobre la epidemiología de las diferentes

especies de piroplasmas presentes en la CAPV que ayudarán a marcar las pautas más apropiadas

para el control de las piroplasmosis. Se han generado nuevos conocimientos, cuestiones e hipótesis

que abren nuevos caminos para la investigación de estos agentes. .

4. CONCLUSIONES GENERALES

conclusiones generAles

149

Conclusiones generales

147


1. El método de diagnóstico molecular basado en la técnica de RLB y desarrollado en esta

tesis, permite detectar e identificar de forma simultánea 23 piroplasmas que afectan a los

animales domésticos, rumiantes silvestres y al hombre; es aplicable a muestras de sangre,

tejidos y garrapatas, y posee alta sensibilidad y especificidad, de manera que permite

detectar infecciones clínicas en animales enfermos y subclínicas en animales portadores,

además de infecciones sencillas y múltiples. Los estudios llevados a cabo han demostrado

su utilidad en el diagnóstico laboratorial y en la realización de estudios epidemiológicos.

2. La metodología desarrollada ha permitido determinar la diversidad y heterogeneidad

genética de los piroplasmas presentes en animales domésticos y rumiantes silvestres de la

CAPV. Se han detectado e identificado especies de piroplasmas previamente descritas, y

nuevos genotipos no descritos anteriormente: T. equi-like y B. caballi-like en la población

equina, Theileria sp. OT1 en el ganado ovino, Theileria sp. OT3 en el ganado ovino y

rumiantes silvestres (cérvidos y rebecos), y Theileria sp. 3185/02 en cérvidos. El análisis

filogenético sugiere que estos nuevos genotipos podrían constituir nuevas especies y no

meras variaciones de cepas de una misma especie.

3. Este trabajo constituye el primer estudio de epidemiología molecular sobre la distribución

y prevalencia de piroplasmas en la población de ungulados domésticos de la CAPV y la

primera detección por técnicas moleculares de algunas de las especies en España (B. ovis y

B. motasi en ganado ovino, y B. major y B. divergens en vacuno). Además, es la primera

vez que B. divergens se detecta en corzos de la Península Ibérica.

4. Se ha observado una mayor prevalencia de especies de Theileria que de Babesia tanto en

los animales domésticos y silvestres como en las garrapatas de la vegetación. La alta

proporción de animales con infección subclínica detectada entre la población de animales

domésticos y silvestres indica que estos portadores asintomáticos representan un reservorio

potencial de la infección que debe tenerse en cuenta al diseñar medidas para el control de

las piroplasmosis.


150


148

5. Se han encontrado asociaciones entre especies de garrapatas y piroplasmas descritas

anteriormente, pero también otras nuevas. En base a los datos epidemiológicos de los

estudios realizados en las poblaciones de hospedadores, se ha realizado una selección de

aquellas con mayor probabilidad de tener un significado biológico. Entre ellas destaca la

asociación entre I. ricinus y T. annulata (también identificada en el ganado vacuno del

norte de España), lo que sugiere una distribución más amplia de la theileriosis mediterránea

de lo que se había demostrado hasta la fecha. En cualquier caso, la capacidad vectorial de

las garrapatas para cada especie de piroplasma con las que se ha encontrado asociada

deberá demostrarse mediante futuros estudios de transmisión.

6. Los resultados de prevalencia y distribución de piroplasmas encontrados en la población

animal y de garrapatas de la CAPV, y en particular, la detección de DNA de 13

piroplasmas distintos en la garrapata más abundante en la CAPV (I. ricinus), indican que

los piroplasmas constituyen un riesgo para la población animal y humana.

TESIS DOCTORALES PUBLICADAS

Nº 1. La raza Latxa: Sistemas de producción y características reproductivas. Eduardo uriartE EgurcEgui

Nº 2. Estudio y puesta a punto de un método simplificado de control lechero cualitativo en la raza ovina Latxa y su inclusión en el plan de selección. gustavo adolfo Maria lEvrino

Nº 3. Implicaciones tecnológicas de la composición química del pescado con especial referencia a los lípidos. rogElio Pozo carro

Nº 4. Estudio de suelos de Vizkaia. Margarita doMingo urartE

Nº 5. El Maedi o neumonía progresiva en el conjunto de las enfermedades respiratorias crónicas del ganado ovino en la Comunidad Autónoma Vasca. lorEnzo gonzálEz angulo

Nº 6. Estudio experimental de las fases iniciales de la paratuberculosis ovina. raMón a. JustE Jordan

Nº 7. Identificación, origen y factores fisicoquímicos que condicionan la contaminación por elementos metálicos de sedimentos de ríos. Estilita ruiz roMEra

Nº 8. Análisis financiero de proyectos de inversión en repoblaciones forestales. álavaro aunos góMEz

Nº 9. Desarrollo y evaluación del sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS) para la fertilización de las praderas permanentes. Marta Rodríguez Julia

Nº 10. Estudio de las mieles producidas en la Comunidad Autónoma del País Vasco. María tErEsa sancho ortiz

Nº 11. La biomasa microbiana como agente de las transformaciones de nitrógeno en el suelo tras el enterrado de la paja de cereal. JEsús ángEl ocio arMEntia

Nº 12. Análisis jurídico y económico de la implementación de la política agraria comunitaria en la Comunidad Autónoma del País Vasco. BEatriz PérEz dE las hEras

Nº 13. Nemátodos formadores de quistes (Globodera spp.) en patata (Solanum tuberosum L.): caracteri-zación taxonómica, reproducción y actividad de las formas juveniles. azucEna salazar Bayona

Nº 14. Ensayo comparativo de tres métodos de tratamiento antihelmítico estratégico en rebaños de ove-jas latxas. ana luisa gracia PérEz

Nº 15. Estudio sobre una encefalitis vírica similar al Louping-ill en el ganado ovino de la Comunidad Autónoma Vasca. daniEl fErnándEz dE luco Martinéz

Nº 16. Análisis de caracteres involucrados en la selección y mejora de Lupinus hispanicus Boiss. et Reuter. vErónica arriEta Pico

Nº 17. Contribución al estudio de fermentaciones artesanales e industriales de Rioja Alavesa. Milagros viñEgra garcía

Nº 18. Estudio del manejo de la alimentación en los rebaños ovinos de raza Latxa y su influencia sobre los resultados reproductivos y de producción de leche. luis Mª. orEgui lizarraldE

Nº 19. El sector pesquero vizcaíno, 1800-1960. Análisis de la interacción de los elementos ambiental, extractivo y comercial en la pesquería. José agustín Maiz alcorta

Nº 20. Epidemiología, diagnóstico y control de la paratuberculosis ovina en la Comunidad Autónoma del País Vasco. J. J. aduriz rEcaldE

Nº 21. Agrupación de poblaciones locales de maíz (Zea mays L.) mediante caracteres morfológicos y parámetros ambientales. José ignacio ruiz dE galarrEta góMEz

Nº 22. Estudio del potencial melífero de Bizkaia. aMElia cErvEllo MartínEz

Nº 23. Influencia de los procesos de salado y ahumado sobre las características fisicoquímicas del queso Idiazabal (compuestos nitrogenados). francisco c. iBañEz Moya

Nº 24. El Euskal Artzain Txakurra (el perro pastor vasco) descripción y tipificación racial. Mariano góMEz fErnándEz

Nº 25. Evaluación de diferentes ciclos de selección recurrente en dos poblaciones sintéticas de maíz. gotzonE garay solachi

Nº 26. Valoración agronómica de la gallinaza: Compostaje. adolfo MEnoyo PuEllEs

Nº 27. Relación clima-vegetación en la Comunidad Autónoma del País Vasco. aMElia ortuBay fuEntEs

Nº 28. Influencia de los procesos de salado y ahumado tradicional sobre las características microbioló-gicas y organolépticas del queso Idiazabal. francisco J. PérEz Elortondo

Nº 29. Mastitis en la oveja Latxa: epidemiología, diagnóstico y control. Juan c. Marco MElEro

Nº 30. Contribución al conocimiento anatomopatológico y diagnóstico de la tuberculosis caprina y ovina por Mycobacterium bovis. M.ª MontsErrat gutiérrEz cancEla

Nº 31. Estudio de factores que pueden influir en la calidad de la pluma de gallos Eusko-oiloa (Variedad Marradune) para la fabricación de moscas artificiales utilizadas en la pesca de la trucha. rosa M.ª Echarri toMé

Nº 32. Estudio de la fracción lipídica durante la maduración del queso Idiazabal. Influencia de los pro-cesos tecnológicos del tiempo de permanencia en salmuera y ahumado. ana isaBEl náJEra ortigosa

Nº 33.- Influencia del tipo de cuajo y adición de cultivo iniciador sobre los compuestos nitrogenados durante la maduración del queso Idiazabal. M.ª solEdad vicEntE Martín

Nº 34. Estudio de la infección por Borrelia burgdorferi, grupo Ehrlichia phagocytophila y virus de la encefalitis ovina en las poblaciones de ixódidos de la Comunidad Autónoma Vasca. Marta Barral lahidalga

Nº 35. Lipolisis en el queso Idiazabal: efecto de la época de elaboración, del cultivo iniciador, de la pasteurización y del tipo de cuajo. fElisa chavarri díaz dE cErio

Nº 36. Aspectos inmunopalógicos de la paratuberculosis de los pequeños rumiantes. Respuesta inmune asociada a la vacunación. Juan ManuEl corPa arEnas

Nº 37. Desarrollo y evaluación de nuevas técnicas de diagnóstico del Maedi-Visna. ana BElén ExtraMiana alonso

Nº 38. Estudios sobre Patogenia y Diagnóstico de la Adenomatosis Pulmonar Ovina. María MErcEdEs garcía goti

Nº 39. Análisis de los factores de explotación que afectan a la producción lechera en los rebaños de raza Latxa de la CAPV. roBErto J. ruiz santos

Nº 40. Crecimiento y producción de repoblaciones de Pinus radiata D. Don en el Territorio Histórico de Gipuzkoa (País Vasco). luis Mario chauchard Badano

Nº 41. Puesta a punto de técnicas PCR en heces y de Elisa para el diagnóstico de la Paratuberculosis. Estudio de prevalencia en ganado bovino. JosEBa M. garrido urkullu

Nº 42. Epidemiología y diagnóstico de la leptospirosis y la neosporosis en explotaciones de bovino lechero de la CAPV. raquEl achaErandio galdos

Nº 43. Relaciones aire-agua en sustratos de cultivo como base para el control del riego. Metodología de laboratorio y modelización. valEntín tErés tErés

Nº 44. Zonas endémicas de enfermedad de Lyme en la CAPV: estudio del papel de los micromamíferos en el mantenimiento de Borrelia burgdorferi sensu lato en el medio natural. horacio gil gil

Nº 45. Optimización del esquema de mejora de la raza Latxa: análisis del modelo de valoración e intro-ducción de nuevos caractéres en el objetivo de selección. andrés lEgarza alBizu

Nº 46. Influencia de las condiciones de almacenamiento, reimplantación y lluvia ácida en la viabilidad de Pinus radiata D. Don. MirEn aMaia MEna PEtitE

Nº 47. Estudio sobre encefalopatías en peces: patogenicidad del nodavirus causante de la enfermedad y retinopatía vírica (ERV) y transmisión experimental del prión scrapie a peces. raquEl arangurEn ruiz

Nº 48. Enfermedades transmitidas por semilla en judía-grano (Phaseolus vulgaris L.): detección, control sanitario y mejora genética. ana María díEz navaJas

Nº 49. Pastoreo del ganado vacuno en zonas de montaña y su integración en los sistemas de producción de la CAPV. nErEa Mandaluniz astigarraga

Nº 50. Aspectos básicos de la mejora genética de patata (Solanum tuberosum L.) a nivel diploide. lEirE Barandalla urtiaga

nº 51. El cuajo de cordero en pasta: preparación y efecto en los procesos proteolíticos y lipolíticos de la maduración del queso de Idiazabal. Mª. ángElEs BustaMantE gallEgo

Nº 52. Dinámica de la población de atún blanco (Thunnus alalunga Bonnaterre 1788) del Atlántico Norte. Josu santiago Burrutxaga

nº 53. El pino radiata (Pinus radiata D.Don) en la historia forestal de la Comunidad Autónoma de eus-kadi. Análisis de un proceso de forestalismo intensivo. Mario MichEl rodríguEz

nº 54. Balance hídrico y mineral del pimiento de Gernika (Capsicum annuum L., cv Derio) en cultivo hidropónico. Relaciones con la producción. hugo Macía olivEr

nº 55. Desarrollo de métodos moleculares y su aplicación al estudio de la resistencia genética y patoge-nia molecular del Scrapie. david garcía crEsPo

nº 56. Estudio epidemiológico y experimental de la transmisión y control del virus Maedi-Visna en ovino lechero de raza Latxa del País Vasco. vEga álvarEz MaiztEgui

nº 57. Desarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico serológico para el estudio de la transmisión calostral y horizontal del virus Maedi-Visna (VMV) en ovino. Mara Elisa daltaBuit tEst

nº 58. Integral Study of Calving Ease in Spanish Holstein Population. EvangElina lóPEz dE Maturana lóPEz dE lacallE

nº 59. Caracterización Molecular, Detección y Resistencia de Mycobacterium avium subespecie paratu-berculosis. ikEr sEvilla agirrEgoMoskorta

nº 60. Desarrollo de un sistema de fertilización nitrogenada racional en trigo blando de invierno bajo condiciones de clima mediterráneo húmedo. M.ª arritokiEta ortuzar iragorri

nº 61. Estructura y dinámica de la materia orgánica del suelo en ecosistemas forestales templados: de los particular a lo general. nahia gartzia BEngoEtxEa

nº 62. Análisis sensorial del vino tinto joven de Rioja Alavesa: descripción y evaluación de la calidad. iñaki Etaio alonso

nº 63. Biología del gusano de alambre (Agriotes spp.) en la Llanada Alavesa y desarrollo de estrategias de control integrado en el cultivo de la patata. ana isaBEl ruiz dE azúa Estívariz

nº 64. La sucesión en la ganadería familiar: el ovino de leche en el País Vasco. guadaluPE raMos truchEro

ISBN: 978-84-457-3039-3

9 788445 730393

portada 65€¦ · vitoria-gasteiz, 2010 tesis doctorales n.º 65 universidad de zaragoza...

Documents