power point final imuno
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Docente: Professora Doutora Sandra Soares
Universidade Fernando Pessoa
Ciências Farmacêuticas
Imunologia
Discentes:
Catarina Oliveira......................n.º 17182Elisabete Ramos......................n.º 13067Isabel Cardeal .........................n.º 14133Maria Sofia Bucho …….………nº 16543
Imunocitoquímica Localização de proteínas numa célula ( ou população de células)
Fundamento da técnica utilização de anticorpos específicos contra proteína (antigénio) que se pretende identificar e localizar
Neste trabalhoidentificar e detectar linfócitos T em sangue periférico
receptores específicos CD3
Princípio da TécnicaPrincípio da Técnica Anticorpo especifico antigénio
Observação microscópica
liga-se
Dois métodos
- Directo (anticorpo primário marcado)
- Indirecto ( anticorpo primário e anticorpo secundário
marcado)
anti – CD3 contém anticorpo que
reconhece
(reconhece o antigénio) anticorpo primário
Princípio da TécnicaPrincípio da Técnica
Utilização :
- anticorpo primário (anti-CD3) para
reconhecimento
- anticorpo secundário biotinilado (anti-anti-CD3)
do antigénio
Enzima ---- Streptavidina peroxidase que reage com a biotina
Liga-se ao substracto cromogénio (DAB)
Coloração castanha
(quando ocorre degradação do substrato
pela enzima)
Material e ReagentesMaterial e Reagentes
Material Reagentes
•Algodão •Álcool
•Lanceta •Solução metanol/acetona (50/50)
•Lâmina •Solução PBS
•Pipeta de Pasteur •Bloqueador das peroxidases endógenas
•Gobelé •Soro proteico (UV protein block)
•Micropipeta de 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl e respectivas pontas
•Anticorpo primário (anti-CD3) Santa Cruz Biotechnology – diluição 1 /10000
•Recipiente para despejos bio-perigosos •Anticorpo secundário biotinilado (biotinylated secondary antibody)
•Microscópio •Streptavidina Peroxidase (HRP)
•Tubo Falcon •Solução de DAB (DAB Chromogen/substract kit high contrast – Scytek Laboratorics)
•Estufa •H2O2 a 3% (Lote 09216)
•Eppendorfs
ProcedimentoProcedimento
ProcedimentoProcedimento
ProcedimentoProcedimento
ProcedimentoProcedimento
ProcedimentoProcedimento
Receptor Linfócito T (CD3)
1º anticorpo (anti-CD3)
2º anticorpo (anti-anti-CD3) biotinilado
Biotina
Avidina Peroxidase
DAB
Cor castanha
ResultadosResultados
Discussão e ConclusãoDiscussão e Conclusão
De acordo com os resultados obtidos, não foi possível identificar a presença de linfócitos T.
Este facto pode estar associado a uma incorrecta execução da técnica, relativamente ao procedimento do esfregaço sanguíneo, que ficou muito espesso.
Discussão e ConclusãoDiscussão e Conclusão
Pode também dever-se a um incumprimento dos tempos de espera relativamente aos reagentes utilizados, nomeadamente dos marcadores.
Uma má coloração das células, constitui também um motivo para a obtenção de tais resultados, pois pode ser difícil ou até mesmo impossível identificar e detectar as células T.
BibliografiaBibliografia
Weir, Donald M., Stewart. John., Imunologia básica aplicada, 8ª edição.
Abbas, et. al., Cellular and Molecular Immunology, 2000.
Arosa, Fernando A., Cardoso, Elsa M., Pacheco, Francisco C., Fundamentos de Imunologia, Ed. Lidel, 2007.
B. Per, The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry, Journal of Immunological Methods 216, 1998, págs. 49-67
Golsby, R.A., et al (2000) 4ªed. Kuby Immunology, W.H. Freeman and company, New York
Roitt, I., et al (2000) 3ª ed. Immunology, Manole LTDA, Lisboa
Janeway, C., et al (2001), Immunobiology, New Yrk, Gerland Publishing
Pacheco, F. C., Arosa, F.A., et al, (2007), Fundamentos de Imunologia, Lisboa, Lidel
Imboden, J. B., Terr, A. I., et al (1997), Medical Immunology, USA, 10ª ed. , McGraw - Hill
Bueno, E. C., Takei, K., et al, (2007), Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan
http://www.ichworld.com/immunocytochemistry.htm