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がん遺伝子解析の最前線

次世代シーケンスとデジタルPCR の活用例

ライフテクノロジーズジャパン株式会社

テクニカルサポート

大滝 真作 Ph.D.

2

本日の内容

•デジタル PCR の原理

•デジタル PCR による造血幹細胞移植後のキメリズム解析

• RNA シーケンスによる融合遺伝子の探索とデジタル PCR による検証

•微量の融合遺伝子を網羅的に検出できる最新ツール

Ion Proton™ シーケンサ QuantStudio® 3D

デジタル PCR システム

Ion PGM™ シーケンサ

3

デジタル PCR の原理

4

デジタルPCRとは？

反応液を多数の微細ウェルに分配してPCRを行い、多数の個別ウェルでそれぞれPCR増幅を行う。ターゲット配列の存在したPositiveウェル数と、ターゲット配列が入らなかった増幅しないNegativeウェル数をカウントすることで、サンプルの絶対濃度（copies/ μL）を直接的に算出する手法。

5

Ct

Conc. PCR Cycles

リアルタイムPCR: スタンダードサンプルと増幅サイクル数(Ct値)を比較することにより定量

検量線サンプルの準備（希釈系列）

対象サンプル

溶液

デジタルPCR: 増幅したウェルの数をカウントし定量

1ウェルごとにPCRでターゲット増幅 エンドポイントで増幅の有無をカウント

XX コピー /μL

1 コピー/反応に分配

PCR カウント

直接的な定量

間接的な定量

qPCR サイクル数に依存した定量 ダイナミックレンジが広い ⇒ 高濃度域を幅広く測定 検量線（比較対象）が必要

dPCR 目的分子のコピー数を算出 低濃度域を高感度に検出 わずかな濃度差を識別可能 検量線が不要 増幅効率に依存しない

互いに補完し合う技術

リアルタイムPCRとデジタルPCRの違い

6

Molecule Counting Requires A “Correction” Factor

• Problem: ランダムに分配されるので、全てが1コピー/ 反応になるわけではない

• 少なくとも1反応は0コピーの反応がなくてはならない

• ポワソンモデルにより複数コピーの分配を補正し、0、１、２、３etc. コピーの分配確率を導くことができる

7

Poisson Distribution

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

90.00%

100.00%

0.001 0.01 0.1 1 10

Average Copies per Reaction

Percen

t R

eacti

on

s

1 Copy

2 Copies

3 Copies

Positive Reactions

ポワソン分布

％陽性反応数

平均コピー数/反応

Molecule Counting Requires A “Correction” Factor

どれもPositive wellとして1カウント

補正

8

デジタル PCR による

造血幹細胞移植後のキメリズム解析

Quantification of donor/recipient chimerism in bone

marrow transplants of leukemia samples

–Dr. Jiménez-Velasco –Carlos HayaHospital

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造血幹細胞移植後におけるキメリズム

完全キメラ

混合キメラ

再発の可能性

再発なし

赤: 白血病細胞、青: 正常細胞

化学療法

放射線 移植前 移植後 幹細胞

再発の可能性をできるだけ早くモニタリングしたい

デジタル PCR 法の活用

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デジタル PCR による患者由来細胞の検出

患者の DNA を検出するアッセイ (ターゲット): FAM でラベリング

患者とドナー の DNA を検出するアッセイ (リファレンス): VIC でラベリング

キメリズム (%)= (ターゲット/リファレンス) サンプル / (ターゲット/リファレンス) 移植前

11

デジタル PCR によるキメリズムの検出

患者 (移植前) ドナー 62 日目

147 日目 174 日目 192 日目

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リアルタイム PCR とデジタル PCR のキメリズム解析の比較 （再発症例）

デジタル PCR の方が検出感度が高い

デジタル PCR とリアルタイム PCR の結果が相関

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リアルタイム PCR とデジタル PCR のキメリズム解析の比較 （非再発症例）

デジタル PCR とリアルタイム PCR の結果が相関

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まとめ

•デジタル PCR によって造血幹細胞移植後のキメリズムを検出可能であった

• リアルタイム PCR よりも、デジタル PCR の方が高感度でキメリズムを検出できた

•高感度にキメリズムが検出できれば、早期に再発について検討できる

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RNA シーケンスによる融合遺伝子の探索と

デジタル PCR による検証

大滝真作、千賀一徳、砂山智子、浅野士郎、石倉隆、橋詰航

ライフテクノロジーズジャパン株式会社 テクニカルサポート

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融合遺伝子とは？

• 染色体の転座、挿入、逆位などの組み換えの結果、複数の遺伝子が連結されて生じる新たな遺伝子。

• 融合タンパク質が細胞増殖シグナルを活性、あるいは分化シグナルを抑制する場合はがん化の原因となり得る。

• 白血病の BCR-ABL1、肺がんの

EML4-ALK などの融合遺伝子がドライバー遺伝子として広く知られている。

Image from Fusion Gene Wikipedia

Gene A Gene B

Break point

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RNA シーケンシングによる融合遺伝子の探索

FusionGene Reads PosA PosB NCBI ID

BCR-ABL1 20 chr22: 23632601 chr9:133655755 AJ131466.1

MBD1-CCDC11 9 chr18: 47799047 chr18: 47788589 -

RRM2-C2orf48 9 chr2: 10269281 chr2: 10281981 -

PILRB-STAG3 7 chr7: 99936512 chr7: 99811630 NR_103720.1

RNA シーケンスで検出された融合遺伝子

ゲノムにマッピングした融合遺伝子(PILRB-STAG3) のリード

Break point

Break point

【方法】

• K562 （白血病細胞株）の Poly(A) RNA を用意

• cDNA を合成後、フラグメントライブラリを作成

• Ion Proton™ シークエンサによりシーケンス

• FusionMap により融合遺伝子を検出

【結果】

• トータル 6,600 万リードを取得

• 白血病原因遺伝子のBCR-ABL1 を検出

• BCR-ABL1 の他にも MBD1-CCDC11、RRM1-

C2ofr48、PILRB-STAG3などを検出

• 配列情報を基に、break point を検出

Ion ProtonTM シーケンサ

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TaqMan® Gene Expression Assays の 融合遺伝子検出 Assay のラインナップ

【TaqMan® Gene Expression Assays 検索ページ】 https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=ABGEKeywordSearch&catID=600689

Fusion Transcripts を選択

融合遺伝子名を入力

①

②

③ 検索

合計 193 種類の

融合遺伝子検出する

Assay のラインナップ

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Assay 検索結果と詳細について

Assay 検索結果

Assay 詳細

検出できる Fusion Transcripts

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TaqMan® Assays をカスタムで設計

PILRB-STAG3

CATCGTCATAGCTGGAAACAGTCAGAGCCACCAGCCAATGATCTTTTCAATGCTGCGAAAG

CTGCCAAAAGTGACATGCAGGATTTCTGACAGGACTCTGGGCCCCTCCCCAGCTCCACTC

CCTACCTCAAGAATGTGACCATTTGGAAAAGGCAAAGAGAAAAGGAGCAAAATGAAGCATT

Fwd Primer

Rev Primer

TaqMan® MGB Probe

• Break Point 上に TaqMan® MGB

Probe を設計し、融合遺伝子のみが検出される設計にした

Break Point

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リアルタイム PCR による K562 cDNA をサンプルとした 各 TaqMan® Assay の増幅

BCR-ABL1 MBD1-CCDC11

RRM2-C2orf48 PILRB-STAG3

• カスタム設計を行った Assay

でも増幅が確認された。

• これらの融合遺伝子は RNA-

Seq とリアルタイム PCR で検出されたため、確かにサンプル中に存在していることが確認された。

• リアルタイム PCR で絶対定量を行う場合は、検量線が必須である。

22

デジタル PCR による各融合遺伝子の絶対定量結果

11.9 13.0

30.8

1.4

0

5

10

15

20

25

30

35

40

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

co

pie

s / n

g (

cD

NA

)

391.5

310.4 285.3

0.6 0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

co

pie

s / n

g (

cD

NA

)

57.5

8.8

31.9

47.5

0

10

20

30

40

50

60

70

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

co

pie

s / n

g (

cD

NA

)

1635.2

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

co

pie

s / n

g (

cD

NA

)

BCR-ABL1

RRM2-C2orf48 PILRB-STAG3

MBD1-CCDC11

Not Detected

23

K562 における各融合遺伝子の発現比較

11.9

57.5

391.5

1635.2

0 500 1000 1500 2000

PILRB-STAG3

MBD1-CCDC11

RRM2-C2orf48

BCR-ABL1

copies / ng (cDNA)

• デジタル PCR は検量線を使用しなくても絶対定量が可能。

• デジタル PCR はエンドポイントで検出するので、PCR 効率の影響を受けにくい。

• 絶対量を求めることができれば、融合遺伝子間の比較をすることもできる。

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リアルタイム PCR (ddCT 法) と デジタル PCR のデータ比較

• Brain を refernce とし、リアルタイム

PCR (ddCT 法) とデジタル PCR のデータを相対定量で比較による相対定量結果

• リアルタイム PCR の方が値が高めに出るのは、PCR 効率の影響の可能性

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

dPCR

qPCR

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

dPCR

qPCR

0.00

200.00

400.00

600.00

800.00

1000.00

1200.00

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

dPCR

qPCR

MBD1-CCDC11

RRM2-C2orf48 PILRB-STAG3

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まとめ

•次世代シーケンスにより、新規融合遺伝子配列を取得できた

•融合遺伝子配列を基に TaqMan® Assay を設計し、検出することができた

•デジタル PCR により、融合遺伝子の絶対定量が可能であり、融合遺伝子間の比較ができた

•デジタル PCR は PCR 効率の影響を受けにくい

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微量の融合遺伝子を網羅的に検出できる最新ツール

Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2

Ion PGM™ シーケンサ

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次世代シーケンサを活用した肺癌研究を促進させる OncoNetwork コンソーシアム

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Ion AmpliSeq™ RNAワークフロー

逆転写(ランダムプライマー)

ターゲットの増幅

プライマー配列の部分的な消化

アダプターの付加と精製

ライブラリの増幅と精製

Ion OneTouch™ 2 による

テンプレート調製へ

ライブラリ濃度の調製

(複数ライブラリを１つにまとめる*）

領域A 領域B

A P1

マルチプレックスPCR

プライマー配列の消化

アダプターの付加*

ライブラリ

RNA

Bioanalyzer®もしくはqPCRによる

ライブラリ定量

cDNA

逆転写

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Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2

•肺癌関連融合遺伝子 (ALK, ROS1, RET) を網羅的に検出

• FFPE 由来の total RNA (10ng) に対応

•現在、製品開発中

30

Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2

計 38 種類

31

製品の検証結果

1% の spike-in を検出 FFPE サンプルの融合遺伝子を検出可能

1 回の実験で複数融合遺伝子を同時に検出

32

他の手法との比較

他の融合遺伝子検出手法と高い相関性が認められた

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• Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2 は肺癌に関連する融合遺伝子を網羅的に検出することができる

• 1% の Spike in を検出できるほどの高い感度がある

• FFPE 由来の融合遺伝子でも検出可能で、複数の融合遺伝子を同時に検出することができる

• FISH など、他の融合遺伝子検出手法と比較して、高い相関性が認められた

まとめ

(注意) Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2 は現在開発中の製品です。

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研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。

記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。

販売条件はこちらをご覧ください。 www.lifetechnologies.com/TC

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TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc. Used under permission and license.

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電話 0120-477-392

E-mail jptech@lifetech.com

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