pr. g. larcher pr. d. prunier pr. s. khiati pr. p. reynier

Faculté de santé d’Angers - département PluriPASS

Année universitaire 2020-2021

Pr. G. Larcher – Pr. D. Prunier – Pr. S. Khiati – Pr. P.

Reynier

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Faculté de Santé

Département PluriPASS

Pr. G. Larcher Pr. D. Prunier Pr. S. Khiati Pr. P. Reynier

BIOCHIMIE METABOLIQUE ................................................................................ 4

I. INTRODUCTION : APPROCHE GLOBALE DU METABOLISME .......................................... 4

II. PLACE DE LA MESSAGERIE ............................................................................................... 5

III. STRATEGIE METABOLIQUE ............................................................................................... 7

IV. SEQUENCES METABOLIQUES ........................................................................................ 11

V. SEQUENCES INTERPRANDIALES .................................................................................... 22

ED : Le métabolisme en période d’activité musculaire du sprinter au marathonien .............................................................................................. 35

I. INTRODUCTION ............................................................................................................... 35

II. ACTIVITE MUSCULAIRE DE FORTE INTENSITE, DE COURTE DUREE (SPRINT) .............. 35

III. ACTIVITE MUSCULAIRE D’INTENSITE MOYENNE, LONGUE DUREE (MARATHON) ...... 40

IV. LES PRODUITS DOPANTS : LES MODULATEURS METABOLIQUES ............................... 43

Récapitulatif ............................................................................................. 46

Notes ....................................................................................................... 48

Entrainements .......................................................................................... 49

Corrections ................................................................................................ 51

ENZYMOLOGIE ................................................................................................ 53

CHAPITRE N°1 : LA LIAISON PROTEINE-LIGAND ......................................... 53

I. ASPECTS MOLECULAIRES DE LA LIAISON ..................................................................... 53

II. CARACTERES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND ......................................................... 55

III. PARAMETRES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND......................................................... 61

IV. EXEMPLES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND .............................................................. 64

V. CONCLUSION ................................................................................................................... 65

Récapitulatif ............................................................................................. 66

Notes ....................................................................................................... 68

APPLICATIONS PRATIQUES ................................... ERREUR ! SIGNET NON DEFINI.

ED N°1 : LA LIAISON PROTEINE-LIGAND ET ENZYMOLOGIE Erreur ! Signet non défini.

I. PROTEINE-LIGAND ................................................................... Erreur ! Signet non défini. II. PARAMETRES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND.................. Erreur ! Signet non défini. III. ENZYMES-SUBSTRATS............................................................. Erreur ! Signet non défini.

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Récapitulatif ............................................................. Erreur ! Signet non défini.

Notes ....................................................................... Erreur ! Signet non défini.

ED N°2 : ANALYSE DES PROTEINES ........................ Erreur ! Signet non défini. I. QU’EST-CE QU’UNE PROTEINE ? .............................................. Erreur ! Signet non défini. II. WESTERN BLOT= IMMUNOBLOT DES PROTÉINES ................. Erreur ! Signet non défini. III. IMMUNOCYTOCHIMIE .............................................................. Erreur ! Signet non défini.



ED N°3 : EXPLORATION DES MITOCHONDRIES ......... Erreur ! Signet non défini. I. ORIGINE DES MITOCHONDRIES ............................................... Erreur ! Signet non défini. II. PROPRIETES DE LA MITOCHONDRIE ....................................... Erreur ! Signet non défini. III. L’ADN MITOCHONDRIAL .......................................................... Erreur ! Signet non défini. IV. DIAGNOSTIC DES MALADIES MITOCHONDRIALES ................ Erreur ! Signet non défini.



ED N°4 : LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ..................... Erreur ! Signet non défini. I. C’EST QUOI LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ? .......................... Erreur ! Signet non défini. II. LA METHODOLOGIE DE RECHERCHE ...................................... Erreur ! Signet non défini. III. LA RECHERCHE FONDAMENTALE ........................................... Erreur ! Signet non défini. IV. LA RECHERCHE APPLIQUEE ..................................................... Erreur ! Signet non défini. V. APPREHENDER LA COMPLEXITE DU VIVANT A L’ERE DES « OMIQUES » . Erreur ! Signet non défini.



Entrainements .......................................................... Erreur ! Signet non défini.

Corrections ............................................................... Erreur ! Signet non défini.

ENZYMOLOGIE .............................................................................................. 109

CHAPITRE N°2 : LES ENZYMES ................................................................. 109

I. PROTEINE ENZYMATIQUE ............................................................................................ 110

II. CATALYSE ENZYMATIQUE ............................................................................................ 114

III. SUBSTRAT ...................................................................................................................... 127

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132

IV. REGULATION ENZYMATIQUE ....................................................................................... 133

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V. ENZYME DANS L’ORGANISME ...................................................................................... 139

Récapitulatif ............................................................................................ 142

Notes ...................................................................................................... 143

Entrainements ......................................................................................... 144

Corrections .............................................................................................. 148

BIOENERGETIQUE ......................................................................................... 153

CONVERSION ENERGETIQUE ET RESPIRATION CELLULAIRE .................... 153

I. Métabolisme énergétique ............................................................................................... 153

II. Bioénergétique ............................................................................................................... 156

III. Glycolyse (=dégradation ANAérobie du glucose) ............................................................ 167

IV. Respiration cellulaire ....................................................................................................... 175

V. Oxydation des acides gras................................................................................................ 177

VI. Oxydation du pyruvate (décarboxylation oxydative du pyruvate) ................................... 179

VII. Cycle de l’acide citrique = cycle de Krebs ........................................................................ 184

VIII. La chaine respiratoire...................................................................................................... 188

Récapitulatif ............................................................................................ 195

Notes ...................................................................................................... 198

Entrainements ......................................................................................... 199

Corrections .............................................................................................. 201

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I. INTRODUCTION : APPROCHE GLOBALE DU METABOLISME

Les parties de notre corps formées de cellules regroupées en tissus sont organisées de façon à former une

unité cohérente et chacune de ces parties a une/des tâches précises spécifiques à accomplir pour que le corps

fonctionne comme un tout. Il s’en suit que les différents systèmes collaborent, communiquent, s’adaptent… pour

assurer un état d’équilibre dynamique ou homéostasie de l’organisme, gage de bonne santé.

Il y a différents niveaux : l’organe constitué de tissus étant formés de cellules comprenant des molécules

(protéines, glucides, lipides).

L’organisme humain (et donc les cellules qui le constituent) se révèle être un excellent gestionnaire de

ses ressources (consommation d’énergie optimisée, peu de déchets, beaucoup de recyclage, …).

Les structures déterminent les fonctions et ainsi tout changement de structure retentit sur les fonctions.

Les organismes vivants sont soumis à de nombreuses « modifications » de leur environnement qui conduisent les

cellules, tissus et organes à s’adapter. Cette adaptation oriente les voies métaboliques et entraîne des

transformations pouvant être réversibles.

Le corps humain fonctionne dans un état d’équilibre dynamique appelé HOMEOSTASIE* (voir déf) :

On a ainsi un équilibre entre les voies de synthèse (= ANABOLISME*, qui est favorisé après un repas) qui

utilisent de l’énergie, et les voies de dégradation (= CATABOLISME*) qui produisent de l’énergie. Cet ensemble

forme alors le métabolisme. Cette dernière assure le fonctionnement de base (à minima - au repos) qui, à lui seul

requiert, environ 65 % de l’énergie, le reste correspondant aux besoins pour l’activité physique, la thermogenèse,

la digestion des nutriments.

Le métabolisme est régulé par les voies de signalisation (= messagerie cellulaire), les disponibilités en

substrats, l’action des enzymes qui sont très précises avec des spécificités d’actions et de substrats, et par la

combinaison de nombreuses voies de signalisation appartenant à la messagerie cellulaire, système clé de gestion

de l’organisme… On va avoir une régulation à court, moyen et long terme.

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II. PLACE DE LA MESSAGERIE L’organisme s’adapte à l’environnement en captant des signaux grâce à la messagerie cellulaire.

La messagerie cellulaire est une séquence d’évènements :

1 - Il y a un message : ex « trop ou pas assez de glucose », « toxique », « chaud » …

2 - cela génère la synthèse d’un premier messager extracellulaire (c’est souvent une hormone) : il va être sécrété

et libéré dans le sang pour aller au niveau des organes

3 - Il y a ensuite interaction du 1er messager avec le récepteur cellulaire (spécificité des récepteurs)

Il y en a deux types :

- Soit le récepteur est dans la membrane cellulaire dans la partie extracellulaire (le + fréquent)

- Soit le 1er messager rentre dans la cellule et agit dans le noyau (ex : hormone thyroïdienne)

4 - Il y a déclenchement de relais intracellulaire ou second messager.

Les réponses de la cellule sont ADAPTEES.

Exemple avec le glucose :

1) Le message inducteur est : « trop de glucose dans le sang » : la glycémie monte

le pancréas a des récepteurs qui vont capter cette information, il va ainsi sécréter de l’insuline qui est

libérée dans le sang = c’est le 1er messager.

2) L’insuline va interagir avec son récepteur, qui est un dimère (avec la partie extracellulaire du récepteur)

3) Cela implique une modification de la conformation du récepteur. Cela émet un signal qui entraine la

production de second messager intracellulaire. On parle de partenaires relais et amplificateurs (en effet,

généralement, il y a plusieurs partenaires par récepteur, ce qui amplifie le signal)

4) Les seconds messagers ont différentes cibles intracellulaires : génomes, voie métabolique, cytosquelette….

5) La réponse biologique est adaptée, dans cet exemple, c’est la baisse du taux de glucose à 1 g/L.

Définition/point clé :

Homéostasie : maintien des composantes biologiques (température, pression artérielle, hydratation,

composition du milieu intérieur) par des mécanismes de régulations à l’état d’équilibre.

Anabolisme : = synthèse, voies de réductions

Catabolisme : = dégradation, voies d’oxydations, son but est de récupérer de l’énergie par oxydation des

nutriments.

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Exemple du Ca2+ :

C’est un second messager universel (peut également être un 1er messager !) qui participe au contrôle d’un

très grand nombre de processus biologiques tels que :

o La contraction musculaire

o La mémorisation

o La fertilité

o La sécrétion

o La transcription des gènes

o Le trafic cellulaire

o Le métabolisme

o La croissance et l’adhérence cellulaire ou bien encore l’apoptose

Un même messager peut avoir des effets divers selon les tissus (que ce soit un premier ou un second

messager). Les concentrations en calcium sont donc très finement régulées dans l’organisme.

Certains processus infectieux mais aussi toxiques viennent perturber le signal émis par ce second

messager déclenchant alors des altérations tissulaires :

o Agents infectieux ( bactérie entéropathogènes, Salmonella)

o Toxiques (Intoxication au plomb)

o Médicaments (Bloqueurs des canaux calciques : ex : Vérapamil pour l’arythmies)

o Chélateurs de Ca2+ (anticoagulants : ex : oxalate, héparine)

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Exemple de l’insuline comme 1e messager : (ne pas apprendre mais bien comprendre le fonctionnement)

Le récepteur à l’insuline entraine une cascade de réactions induisant :

1) La mobilisation du récepteur du glucose (GLUT4) vers la membrane pour faire entrer le glucose dans la

cellule = ça entraine une baisse de la glycémie. L’insuline va dans le sens de la synthèse de glycogène : le

glucose entre dans la membrane pour fabriquer du glycogène.

2) Il y a une orientation et une régulation métabolique qui agit sur la glycolyse et la synthèse de glycogène,

acides gras, protéines, ...

3) Il peut aussi activer la croissance des cellules

Le glucose a besoin de transporteurs (GLUT) ; Glut 4 est insulinodépendant (il va constituer un canal pour

favoriser l’entrée du glucose). C’est grâce à l’insuline que le glucose rentre.

Si pas d’insuline, pas de GLUT 4 : diabète, glucose séquestré. Tous les transporteurs ne sont pas

insulinodépendants.

Il y a des organes qui peuvent s’en passer d’autre non. Certains organes coupent leur flux de glucose s’il

n’y en a pas assez pour que le glucose aille au cerveau.

III. STRATEGIE METABOLIQUE

La prise alimentaire est discontinue alors que les besoins énergétiques sont continus. Ce qui implique

qu’il y a :

- mise en réserve des composés énergétiques après un repas : c ’est le stockage en post-prandial.

- libération des réserves entre les repas : c’est le déstockage en période interprandiale (cela commence

environ 3 – 4 h après le repas)

Lors des prises alimentaires, on ingère des aliments.

On ne pourra récupérer cette énergie qu’une fois que les aliments auront été dégradés car leur énergie

n’est pas directement utilisable. Les polymères que l’on absorbe grâce aux aliments sont :


Messagerie cellulaire : mécanisme complexe indispensable au bon fonctionnement de l’organisme

(Dérèglement = pathologie).

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- L’amidon, (principalement, polymère d’origine végétale de glucose : sucre lent)

- Le glycogène (polymère de glucose d’origine animale, dans la viande par exemple mais négligeable par

rapport à la quantité de sucre lent)

- Des triacylglycérols=TAG (ou triglycérides)

- Des protéines : animales (dans la viande) et végétales (lentilles...).

Lors de la DIGESTION, les polymères sont ramenés en monomères* car ils ne peuvent pas passer la

barrière intestinale :

➢ L’amidon et le glycogène sont découpés en glucose

➢ Les triacylglycérols sont découpés en acides gras et glycérol

➢ Les protéines sont découpées en acides aminés.

Il y a ensuite ABSORPTION de ces monomères : quand ces monomères arrivent dans l’intestin, ils passent

dans les entérocytes (les cellules intestinales) puis passent dans le sang (car ils sont suffisamment petit)

=>transport dans la circulation sanguine.

Puis il y a la DISTRIBUTION de ces monomères : ils passent tous par le foie qui va distribuer, et vérifier

qu’il n’y a pas de produit toxique… Les monomères sont ensuite utilisés par les organes, les tissus : il y a différents

destins métaboliques.

Les acides aminés sont principalement destinés vers le structural ou les acides nucléiques, les acides gras

seront stockés en graisse, le glucose va être utilisé ou stocké en glycogène…

A) Après ingestion d’un repas : post-prandial, objectif de stockage

Après ingestion d’un repas, il y a un afflux de nutriments en provenance de l’intestin :

o Du glucose issu de l’amidon pour l’essentiel

o Des acides gras issus des triacylglycérols (TAG)

o Des acides aminés issus de la dégradation des protéines.

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Le métabolisme est orienté vers LA SYNTHESE ou ANABOLISME :

❖ De constituant de réserve : Le glycogène (polymère de glucose) stocké principalement au niveau des

muscles et du foie.

Les triacylglycérols (= triglycérides, cad du glycérol estérifié par des acides gras) : stocké au niveau du

tissu adipeux et un peu des muscles.

❖ De composés pour le fonctionnement de l’organisme. Le glucose est dégradé par la glycolyse pour faire

de l’énergie. Les acides gras sont aussi utilisés pour faire de l’énergie. Les acides aminés vont servir à

structurer (très peu utilisés pour faire de l’énergie).

B) A distance des repas : interprandial, objectif de déstockage

A distance des repas, il y a mobilisation des réserves (le glycogène et les triacylglycérols) afin de maintenir

la glycémie.

Le métabolisme est orienté vers la DEGRADATION ou CATABOLISME de substances oxydables

contenant de l’énergie :

o Le glucose à partir du glycogène

o Les acides gras à partir des TG

o Les corps cétoniques (qui sont des dérivés secondaires d’acides gras). Plus on est privé en sucre, plus on

fabrique de corps cétoniques.

L’objectif de ces mécanismes est le maintien de la composition corporelle :

EQUILIBRE ENTRE L’APPORT ALIMENTAIRE ET LES DEPENSES ENERGETIQUES

Un excès d’apport alimentaire et/ou une diminution de la dépense énergétique conduira à une élévation

du poids (masse grasse). Longtemps lors de l’évolution l’homme était en déficit d’alimentation → ce n’est plus le

cas maintenant où la nourriture est en abondance et les efforts physiques moindres. En fait l’organisme est

toujours en équilibre, on passe de l’anabolisme au catabolisme en permanence.

De nombreux facteurs neuronaux et hormonaux, vecteurs d’information, assurent une régulation

harmonieuse de cet équilibre et entraînent une (des) réponse(s) adaptées en agissant sur l’expression et/ou sur

l’activité de nombreuses enzymes régulatrices. Grand principe de régulation = phosphorylation /

déphosphorylation des enzymes.

A l’état normal, l’organisme (les cellules) est en équilibre métabolique grâce à des centaines de réactions

chimiques = METABOLISME* ;

- Voies convertissant les aliments en énergie biologiquement utilisable ou CATABOLISME*.

- Voies consommant de l’énergie pour la synthèse de molécules et l’entretien ou ANABOLISME*.

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L’acétyl-CoA est un carrefour métabolique au sein de l’organisme, elle se situe dans la mitochondrie. Elle

est issue soit de la glycolyse avec le pyruvate, soit de la lipolyse avec les acides gras (après la β-oxydation). Elle

est dégradée par le cycle de Krebs qui fonctionne avec la chaine respiratoire car il produit des éléments

hydrogénés. Lorsqu’elle ne va pas dans le cycle de Krebs, elle produit des corps cétoniques acide gras non

estérifié. Tous les jours, on dégrade des protéines : cela crée des acides aminés. Acide aminé : amine éliminée

d’abord lors de l’uréogenèse et la partie carbonée sera ensuite dégradée par le cycle de Krebs.


Aliments : Ce sont des polymères dont l’énergie n’est pas directement utilisable : ce sont des polymères de

glucides, les lipides, les protéines.

Monomère : un produit de digestion de petite taille (constitué d’une seule molécule)

Nutriments : tous les composants des aliments (gluc, lip, prot, minéraux, vitamines, fibres) utilisés/absorbés

par un organisme car tout n’est pas utilisé dans un aliment.

Métabolisme : ensemble de réactions chimiques couplées et coordonnées assurant les conversions

moléculaires

Catabolisme : dégradation de molécules complexes, macromolécules ou polymères comme les glucides,

lipides et protéines (exemple : aliments) fournissant de l’énergie et permettant les activités, l’entretien et/ou

la croissance cellulaire.

Anabolisme : synthèse de nouvelles macromolécules comme les glucides, lipides ou protéines à partir de

molécules simples ou monomères.

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IV. SEQUENCES METABOLIQUES

A) Les voies anaboliques après un apport alimentaire

Elles sont mises en œuvre dans l’organisme lorsque les apports en énergie sont suffisants (après les repas)

et elles visent à mettre en réserve de l’énergie pour les périodes de « manque » comme par exemple à distance

des repas, lors d’un effort physique ou dans certaines situations pathologiques (cancer).

L’alimentation apporte des polymères (macromolécules) tels que :

- L’amidon (+++), le glycogène,

- Les triacylglycérols

- Et les protéines

La digestion transforme en molécules de petite taille (molécules simples ou monomères) appelés

nutriments :

- Glucose,

- Acides gras

- Et acides aminés

Ceux-ci peuvent alors rentrer dans les cellules intestinales via des transporteurs : c’est l’absorption

intestinale.

Ils passeront dans la circulation sanguine pour parvenir au foie, plaque tournante du métabolisme. Le rôle

du foie est de maintenir la glycémie. De là, ils seront ensuite distribués aux divers tissus de l’organisme via la

circulation sanguine.

Grâce à l’insuline, une mise en réserve pourra se faire. En augmentant la pénétration du glucose au niveau

de divers organes insulino-dépendants (foie, muscle, tissus adipeux), et de AG par le tissus adipeux (TAG) :

- L’insuline va stimuler :

. La synthèse du glycogène (foie et muscle) = glycogénogenèse

. Et des triglycérides (foie, tissus adipeux) = lipogenèse

. Elle peut aussi stimuler la glycolyse pour avoir de l’énergie

•Alimentation

Polymères

•Digestion

Nutriments

(GLC, AG, AA)•Absorption

intestinale via transporteurs

•Circulation sanguine

Sécrétion d'insuline •Foie, plaque

tournante •Distribution aux organes

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- En outre, elle inhibe, s’oppose activement à :

. La néoglucogénèse,

. La glycogénolyse (foie)

. Et la lipolyse c’est-à-dire la libération des AG à partir des triacylglycérols du tissu adipeux.

Seuls le glucose et les acides gras peuvent être mis en réserve.

Les acides aminés ne sont pas stockés car ils sont sous forme de protéines. Les acides aminés ne sont pas

des composés énergétiques, mais dans certaines conditions de jeune prolongé (exemple : chez des naufragés…)

les muscles se dégradent ce qui libèrent des acides aminés pour faire de l’énergie, mais ça ne dure pas très

longtemps sinon on menace les fonctions des organes. Ces acides aminés par la NEOGLUCOGENESE servent à

fabriquer du glucose. Ce sont des acides aminés glucoformateurs.

Conclusion : Les protéines ne sont pas des substrats énergétiques mais en privation on peut les dégrader

en acides aminés. L’excès azoté protéique est éliminé sous forme d’urée.

B) Mise en réserve du glucose sous forme de glycogène = Glycogénogenèse (synthèse du glycogène)

Le glycogène est l’amidon du monde animal mais en étant beaucoup plus ramifié, plus dense.

-Où et comment ?

1) Le foie : c’est un tissu stratégique :

On peut y stocker 150g soit 10 % du poids du foie (un foie normal fait 1,5 kg chez un homme de 70kg).

Le foie redistribue le glucose à l’ensemble de l’organisme (le glycogène stocké est à usage public).

Lorsque la glycémie baisse, le foie déstocke le glycogène et le transforme en glucose pour le remettre

dans le sang et maintenir la glycémie → le foie ne stocke pas du glucose pour lui mais il est là pour assurer la

glycémie et le taux de glucose des autres organes. On dit que le foie a un usage public.

2) Les muscles : ce sont de gros consommateurs :

On y stocke 300 g (soit les 2/3 du glycogène total). Cela représente 1 % du poids des muscles (une

personne de 70 kg possède 30 kg de muscle). Un muscle stocke pour son compte (le glycogène stocké est à usage

privé).

Au total : Il y a environ 450 g de glycogène stocké (dans le foie et les muscles). En état de privation, cela

correspond à 24 h d’autonomie énergétique.

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Ce n’est pas le glycogène qui nous sauvera si on est en période de privation.

-Les étapes de la synthèse :

La synthèse du glycogène se fait en 3 phases : amorçage ; élongation de l’amorce ; ramification des

chaînes.

A) Amorçage

Il y a deux amorçages nécessaires :

• Fabrication de l’UDP-glucose → (on parle d’activation de la molécule)

• Fabrication de l’amorce du glycogène

Dans un premier temps, il y a déplacement du phosphate du G6P qui est en position 6 à la position 1 pour

donner le G1P. Ceci est fait par une PHOSPHOGLUCOMUTASE.

A ce moment, l’UTP peut se fixer sur le G1P. L’UTP perd un phosphate, de même que le G1P et il y a

formation d’UDP-glucose. La molécule est maintenant activée.

C’est une PYROPHOSPHORYLASE qui permet cette transformation.

Les 2 phosphates associés qui sont libérés sont coupés par une pyrophosphatase pour former deux

phosphates inorganiques (Pi)

Sous forme activée, le glucose est incorporé sur une amorce constituée de 8 UDP- glucose reliés en α 1-4

à partir d’une protéine auto-glycosylable, la glycogénine.

B) Elongation de l’amorce

La glycogène synthase sous forme active (voir régulation) assure l’addition des résidus glucose (sous

forme d’UDP-glucose) sur l’amorce par liaisons osidiques α1-4 permettant la formation de longues chaînes

linéaires de type amylose (voir amidon).

Rappel : Synthase = pas besoin d’ATP, synthétase = besoin d’ATP

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C) Ramification des chaînes

Les ramifications sont permises grâce à l’Amylo α 1-6 glucane transférase ou enzyme branchante : il y a

transfert de 6 à 8 glucoses liés en α 1-4 sur l’OH en position 6 d’un glucose.

Les ramifications en α 1-6 sur les chaînes linéaires se font tous les 3 à 5 glucoses (pour l’amidon c’est plutôt

tous les 20 glucose).

Le glycogène est une structure très dense, riche en fonctions alcools retenant beaucoup de molécules

d’eau (les molécules de glycogènes sont des granules denses)

Remarque : La liaison de branchement d’une ramification est une liaison α 1-6, les liaisons suivantes de la

ramification sont des α 1-4. Dans la chaîne principale les liaisons sont α 1-4.

les glucoses sur lesquels démarre une branche de ramification sont branchés en 1,4 et 6. Les autres ne

sont branchés qu’en 1 et 4.

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-Il y a sur le glycogène des extrémités réductrices et des extrémités non réductrices.

Justification : le glucose est un aldohexose (cad 6 carbone et une fonction aldéhyde).

La fonction aldéhyde est réductrice. Lors de la cyclisation du glucose, il y a sur le carbone 1 (le carbone

anomérique) un OH (c’est un reliquat de la fonction aldéhyde) → le glucose est considéré comme réducteur.

Le fructose lui est un cétohexose. Le saccharose est non réducteur car les 2 carbones sont engagés dans les

liaisons !

RETENIR : Dans une chaîne α 1-4, il y a 2 extrémités dont le carbone 1 libre et l’autre le 4 :

L’extrémité où le carbone 1 est libre (c’est le 4 qui est lié) est l’extrémité réductrice

L’extrémité où le carbone 4 est libre (c’est le 1 qui est lié) est l’extrémité non-réductrice

Ces extrémités réductrices et non réductrices auront leurs importances dans la dégradation du

glycogène.

Rappel : pour savoir si un sucre est réducteur, on le fait réagir avec de liqueur de Fehling (passe du bleu au

rouge).

= Branchement en 1-6 (en début de ramification)

AU BILAN : les extrémités du glycogène où le carbone 1 est libre sont les extrémités réductrices du

glycogène, et les extrémités où le carbone 4 est libre sont les extrémités non-réductrices du glycogène.

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D) Régulation

Après la prise alimentaire, l’afflux de glucose dans la circulation entraîne la sécrétion d’insuline par le

pancréas.

Celle-ci, en venant agir sur ses récepteurs, oriente le métabolisme vers la mise en réserve de glucose en

activant la protéine phosphatase qui active la glycogène synthase par déphosphorylation. L’insuline favorise

l’absorption du glucose vers l’intérieur des cellules en activant GLUT 4 et inhibe la glycogénolyse et la

néoglucogenèse au niveau du foie, elle bloque aussi la lipolyse. Certains organes sont gluco-dépendant donc on

va leur réserver du glucose, c’est par exemple le cerveau car les acides gras ne parviennent pas jusqu’à lui, les

globules rouges car elles ne sont plus que des sacs qui transportent l’hémoglobine, ils ont perdu le noyau et leur

mitochondries.

Les organes gluco-dépendant sont les organes qui ne peuvent pas gérer les acides gras. Pour maintenir

la glycémie au niveau de ses organes, l’organisme va s’orienter vers les acides gras pour économiser le glucose.

Cette régulation résulte d’un couplage entre la mise en réserve (glycogénogenèse) et la dégradation du

glycogène (glycogénolyse).

C’est une régulation par allostérie et par modification covalente (phosphorylation/déphosphorylation).

C) Mise en réserve du glucose sous forme de lipide par synthèse d’acide-gras = néolipogenèse

L’excès de glucose ingéré peut également servir à la synthèse hépatique d’acides gras dénommée

néolipogenèse.

Les acides gras seront ensuite mis en réserve sous forme triacylglycérols ou triglycérides (= esters de

glycérol) dans le tissu adipeux.

Les cellules humaines sont ainsi capables de mettre en réserve une quantité importante d’énergie sous

forme de lipides hydrophobes dans le tissu adipeux.

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Cette réserve correspond à une autonomie énergétique bien supérieure à celle du glycogène puisqu’elle

est d’environ 30 jours (attention c’est théorique, seulement en terme énergétique).

Attention : l’homme peut produire des acides gras à partir du glucose mais pas l’inverse !

-Caractéristiques

Le précurseur immédiat est l’acétyl-CoA qui provient pour une grosse part des glucides (dégradation du

glucose). Le glucose peut être dégradé jusqu’au stade acétyl-CoA.

Elle se déroule dans le cytoplasme sur le complexe multi enzymatique de l’Acide Gras Synthase (AGS).

Le mécanisme est une addition séquentielle de 2 carbones (acétyl-CoA) après que celui-ci ait été activé

sous forme de malonyl-CoA (3C) → on fabrique de l’acide palmitique.

Elle requiert du NADPH + H+, une forme particulière d’énergie réductrice. LE NADH se retrouve plus dans

les étapes de dégradation alors qu’on retrouve le NADP plus dans les étapes de synthèse.

Les acides gras saturés fabriqués sont à nombre pairs à 16 ou 18 carbones et seront les produits de cette

synthèse cytoplasmique. Ils pourront ensuite subir diverses transformations telles que des élongations et/ou des

désaturations (ajout de doubles liaisons).

Elle est régulée par des phénomènes allostériques (activation/désactivation par des molécules) et

hormonaux (par phénomènes de phospho/ déphospho).

Schématiquement la synthèse de l’acide palmitique à 16 carbones (acide gras saturé) nécessitera un

acétyl et 7 malonyl. Ensuite, on enlève l’acétyl pour récupérer une CoA et 7 CO2 des malonyls :

-Les étapes

A) Amorçage par la synthèse de malonyl-CoA

A partir d’acétyl-CoA et en présence de CO2, une acétyl-CoA-carboxylase va permettre la fabrication de

malonyl-CoA à 3C. Cette réaction de carboxylation se réalise sur l’enzyme grâce à la présence de biotine

(vitamine B8).

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Cette étape qui se fait en début de synthèse est lente, limitante, irréversible et elle engage la synthèse.

C’est une étape de régulation.

Outre une régulation allostérique (acétyl CoA carboxylase est une enzyme allostérique) : citrate, un

contrôle hormonal est également exercé (stimulation par l’insuline et inhibition par le glucagon en inter prandial).

B) Elongation de l’acétyl-CoA sur l’Acide Gras Synthase

Ce complexe protéique multifonctionnel est formé par l’association de 2 monomères identiques.

Sur chaque monomère se trouvent :

-2 protéines transporteuses (ACP, Acyl Carrier Protein) qui correspondent à un long bras flexible et mobile

terminé par un groupement SH. Les thiols SH sont nécessaires à l’élongation ou addition répétitive de 2 carbones

(fournis par les malonyls) sur la chaîne d’acide gras en voie de synthèse.

Les fonctions thiols sont les sites de fixation du malonyl (3c) et permettent les échanges.

-2 enzymes condensantes (CE) assurent par leur groupe SH porté par la cystéine, la fixation du premier acétyl

(2C) puis fixation de la chaîne d’acide gras saturé en cours d’élongation.

L’organisation spatiale des deux monomères tend à rapprocher l’ACP-SH d’un monomère avec le SH de

l’enzyme condensant de l’autre monomère.

Cystéine qui possède le groupe thiol

Bras long lié à ACP terminé par la fonction

thiol SH : site de fixation du malonyl

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Il faut bien comprendre qu’à chaque tour il faut « REDUIRE-DESHYDRATER-REDUIRE » pour transformer

le C=O en CH2.

A la fin, pour la terminaison, pour libérer l’acide gras de Pan, il y a une enzyme thioestérase (TE) qui vient

couper la liaison entre Pan-S et l’acide gras.

Malonyl : une fonction acide de chaque côté

Pour débuter, l’actylCoA se fixe sur Cys-SH

et le malonylCoA se fixe sur Pan-SH grâce à

une de ses fonctions acides.

1-Puis il y a la première réaction : la

condensation : on enlève sur le malonyl un

carbone : c’est la décarboxylation du

malonyl.

S’en suit le transfert de l’acétyl sur le reste

en C2 (les deux CoA s’en vont ainsi qu’un

groupe CO2). On a donc une chaîne de 4

carbones

La décarboxylation et le déplacement de

l’acétyl au bout de la chaîne est assurée par

la β cétoacyl synthase.)

Pour faire un acide gras, il faut enlever le

C=O qui est au milieu de la chaîne et le

transformer en CH2. Cela se fait en trois

temps :

2-Réaction 2 : réduction : Une réductase à

NADPH + H+ permet de passer de la

fonction cétone à une fonction alcool (en

ajoutant des hydrogènes sur la liaison C=O)

Réaction 2 : Réduction : Une réductase à NADPH+ H+, permet de réduire la fonction carbonyle en alcool.

Réaction 3 : déshydratation : Une déshydratase permet d’enlever la fonction alcool et d’obtenir une double liaison

C=C =>c’est donc un acide gras insaturé.

Réaction 4 : Réduction : Une réductase à NADPH + H+, réduit l’insaturation et donne une chaîne saturée en ajoutant

des hydrogènes.

A ce stade, on a donc une chaîne linéaire saturée de 4 carbones seulement. Il faut donc recommencer toute cette

séquence pour aller jusqu’à 16. Pour cela, il y a déplacement de la chaîne saturée en voie de synthèse sur l’enzyme

CE-Cys-SH.

Un malonyl se lie au bras Pan-S et le 2ème tour peut alors commencer….

On fait en tout 7 tours => 2 carbones initiaux + 2*7 = 16 carbones (acide palmitique)

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L’AGS (Acide gras synthase) est bien une chaîne de montage car sur ce complexe enzymatique, il y a les

activités : β cétoacyl synthase, réductase à NADPH + H+, déshydratase, thioestérase.

Un tour correspond bien à 4 réactions :

1. Condensation par la β cétoacyl synthase.

2. Réduction par la réductase à NADPH + H+

3. Déshydratation par la déshydratase

4. Réduction par la réductase à NADPH + H+

C) Régulation

La régulation de toute cette synthèse se fait dès le début, sur la réaction de synthèse du malonyl, c'est-à-

dire lors de l’étape d’amorçage.

Elle se fait sur l’acétyl-COA-carboxylase (ACC).

L’acétyl-COA-carboxylase (ACC) est activé :

- par allostérie simple : par le citrate quand l’organisme est en suffisance énergétique (cad qu’il a

suffisamment d’énergie dans l’organisme et donc on peut stocker)

- par allostérie covalente : activation par déphosphorylation de ACC déclenchée par l’insuline.

Et est inhibé :

- par allostérie simple : par les acyls en C16 ou C18 (un acyl est en fait un acyl-CoA c'est-à-dire une chaîne

carbonée d’acide gras qui est encore lié au CoA)

Il s’agit d’une régulation par rétrocontrôle : les produits finaux fabriqués viennent inhiber leur propre

formation quand ils sont en quantité suffisante. C’est ce que l’on appelle le feedback control.

- par allostérie covalente : inactivation par phosphorylation de ACC par le glucagon (et l’adrénaline)

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Principe de la régulation :

L’ACC inactive est activée, par le citrate et passe par un stade où elle est en voie d’activation. Pour être

complètement active, il faut qu’elle soit déphosphorylée par une enzyme protéine phosphatase qui est activée

par l’insuline.

En fin de phase de stockage, le glucagon et l’adrénaline activent une protéine kinase AMPc dépendante,

qui phosphoryle l’ACC active. Elle la fait passer en voie intermédiaire d’inhibition. Les acides gras synthétisés C16

et C18 finissent de la désactiver.

On voit bien qu’il y a régulation allostérique et covalente, le tout étant dominé par les hormones.

Synthèse des triacylglycérols et stockage dans le tissu adipeux :

Les acides gras issus de l’alimentation et ceux fabriqués par le foie (excès de glucose) qui ne sont pas

utilisés par les tissus seront stockés dans le tissu adipeux sous forme de triacylglycérols (TAG).

C’est environ 10 kg de TAG qui sont ainsi stockés dans le tissu adipeux (chez une personne de 70kg)

Ils représentent la voie finale de stockage énergétique et représentent l’équivalent d’environ 30 jours

d’énergie disponible.

Conclusion : D’une durée moyenne d’environ 4 heures, la période post prandiale se caractérise, dans sa phase

précoce (dans les 1 à 2 heures après le repas), par un apport de nutriments qui va déclencher une sécrétion

d’insuline.

Cette phase sera suivie d’un stockage des composés énergétiques : glycogène dans le foie et les muscles,

triacylglycérols dans le tissu adipeux.

L’excès d’apport énergétique alimentaire conduit à une mise en réserve d’énergie sous forme de triacylglycérols

stockés dans le tissu adipeux. L’insuline en est le chef d’orchestre.

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V. SEQUENCES INTERPRANDIALES

Après la digestion et entre les prises alimentaires, il faut d’une part maintenir un apport énergétique

régulier à l’organisme et d’autre part maintenir le taux de glucose sanguin constant (la glycémie).

Le glucose est le substrat énergétique préférentiel du cerveau (les AG n’accèdent pas au cerveau à cause

de la barrière hémato-encéphalique) et exclusif des tissus et des cellules sans mitochondries (hématies). Les

hématies ne font que la glycolyse.

La mobilisation des réserves (glucides et lipides) permettra d’assurer la couverture énergétique =

Glycogène et néoglucogénèse (foie) assureront le maintien de la glycémie.

Les mitochondries permettent de produire beaucoup plus d’énergie :

- Elles permettent de dégrader les AG par le β-oxydation

-Elles permettent de pousser beaucoup plus loin la dégradation du glucose (jusqu'à l’émission de CO2 et H2O)

Les substrats oxydables sont essentiellement le glycogène et les triacylglycérols (cf. partie structure), et

accessoirement les protéines dont l’hydrolyse libérera des acides aminés oxydables.

L’inversion de la balance insuline/glucagon (il diminue) sera l’un des facteurs essentiels de cette

adaptation.

Juste après un repas, la sécrétion d’insuline par le pancréas va augmenter. En période interprandiale,

l’insuline diminue et une autre hormone est secrétée par le pancréas : le glucagon. Le glucagon est sécrété par

les cellules alpha de Langherans et l’insuline par les cellules béta de Langherans. Le rapport insuline/glucagon

augmente après un repas et diminue et période interprandiale.

A) Mobilisation des réserves glucidiques : Utilisation du glycogène

La dégradation du glycogène en glucose s’appelle la glycogénolyse (à ne pas confondre avec la glycolyse

qui est la dégradation du glucose !!)

Son objectif est de fournir du glucose pour assurer la couverture énergétique.

La glycogénolyse consiste à découper le glycogène en glucose.

C’est un mécanisme de phosphorolyse par l’enzyme glycogène phosphorylase active.

Cette enzyme va couper et phosphoryler en même temps.

La glycogénolyse se déroule dans le foie (pour maintenir la glycémie) et les muscles (là ou est stocké le

glycogène)

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A) Les étapes de la glycogénolyse

Il y a scission des liaisons osidiques en α1-4 par la glycogène phosphorylase active, c’est une hydrolyse.

Plus on a de structures denses (animaux par rapport aux végétaux) plus on peut libérer du glucose.

= Cad élimination séquentielle de glucose-1-phosphate à partir des extrémités non réductrices du glycogène

Il y a arrêt au voisinage des ramifications α1-6 (quand il reste 4 unités de glucose avant le carrefour) car la

glycogène phosphorylase ne sait pas couper les liaisons α1-6 seulement les α 1-4.

Intervient alors une enzyme débranchante, qui va déplacer 3 glucoses liés en α 1-4, pour les transférer sur une

chaîne liée en α 1-4 de façon à ne laisser que le glucose lié en α 1-6. Elle a 2 activités en une. C’est une enzyme à

activité glucane transférase mais aussi à une enzyme à activité α 1-6 glucosidase (elle coupe), hydrolyse alors le

glucose restant lié en α 1-6

Une fois le glucose α 1-6 hydrolyser, la scission repart en α 1-4 grâce à la glycogène phosphorylase

jusqu’au prochain carrefour en α 1-6

Les glucoses sont éliminés de la chaîne par phosphorolyse (sauf ceux du carrefour) et non hydrolyse.

En effet pour libérer les glucoses, la glycogène phosphorylase coupe la chaîne comme une hydrolyse mais en plus

elle phosphoryle le glucose.

Il y a donc libération de beaucoup de glucose 1 phosphate (G1P) et peu de glucose libre (sans phosphate)

(ce sont juste les glucoses des carrefours qui sont hydrolysé par la α 1-6 glucosidase). G6P va intégrer la glycolyse.

Le glucose est phosphorylé car pour continuer sa transformation il faut qu’il soit phosphorylé et non libre

(quand un glucose est libre il peut sortir d’une cellule, alors que quand il est phosphorylé il est bloqué à l’intérieur)

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B) Devenir des produits de phosphorolyse

Une phosphoglucomutase magnésium dépendante va isomériser le G1P en G6P (phosphorylé le glucose

permet de l’empêcher le repartir).

Dans le muscle, le G6P servira de substrat énergétique via la glycolyse

Alors que dans le foie son destin principal sera d’être hydrolysé par une glucose-6-phosphatase. Cette

enzyme, essentiellement hépatique, permet de libérer du glucose libre (non phosphorylé) dans la circulation

grâce à un transporteur membranaire assurant ainsi à 90 % le maintien de la glycémie (10% par la

néoglucogénèse).

C) Régulation du métabolisme du glycogène

La régulation du métabolisme du glycogène se déroule essentiellement au niveau hépatique et

musculaire. Il s’agit d’un processus couplé et coordonné entre synthèse et dégradation du glycogène, qui permet

d’activer l’une en inactivant l’autre. Il y a une sorte d’équilibre qui s’établie.

Le contrôle hépatique est essentiel au maintien de la glycémie.

Les régulateurs sont :

- insuline

- glucagon (action sur le foie)

- adrénaline (action sur le foie et muscle)

- glucose (élément allostérique).

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L’insuline va dans le sens de la glycogénogénèse et le glucagon ou l’adrénaline plus dans le sens de la

glycogénolyse.

La concentration sanguine en glucose et les sécrétions hormonales (insuline et glucagon agissant sur le

foie ainsi que l’adrénaline agissant plutôt sur le muscle mais également sur le foie…) résultantes vont être des

éléments importants de la régulation.

Au niveau musculaire où la contraction est exigeante en énergie et en calcium, c’est le Ca2+ (élément

allostérique) et l’adrénaline qui seront des régulateurs importants. Beaucoup de calcium→ beaucoup de

contraction→ besoin d’énergie → augmentation de la glycogénolyse.

C’est un couplage des réactions de phosphorylations/déphosphorylations via des messagers hormonaux

(rapport insuline/glucagon, adrénaline) qui assure la régulation coordonnée du métabolisme.

Les hormones déclenchent une série d’évènement qui phosphoryle ou déphosphoryle.

Schématiquement, l’augmentation du glucagon ou de l’adrénaline conduit à une augmentation de

l’AMPc (transformation à partir de l’ATP) qui déclenche une activation de protéines kinases. On va donc dans le

sens de la phosphorylation.

Le glucagon et l’adrénaline déclenche l’adénine cyclase ce qui, après plusieurs étapes, phosphoryle

- La glycogène phosphorylase = ce qui l’active

- La glycogène synthase = ce qui la désactive

L’augmentation de l’insuline (pas une voie AMPc dépendante) conduit à une hydrolyse de l’AMPc

(diminution de son taux s’opposant à l’action du glucagon ou de l’adrénaline car elle active une enzyme, la

phosphodiestérase) et à une activation des protéines phosphatases. Donc déphosphorylation qui

- Active la glycogène synthase

- Inactive la glycogène phosphatase

L’insuline intervient dans la voie du glucagon en

l’inhibant. Elle hydrolyse l’AMPc pour bloquer l’action du

glucagon pour renforcer son action. Tandis que le

glucagon a une action inverse mais n’interfère pas

directement dans l’action de l’insuline.

Le calcium conduira au niveau musculaire aux

mêmes effets que l’adrénaline et le glucagon.

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D) Devenir du glucose

Le glucose qu’on consomme est le D-glucose, il est le principal carburant de la plupart des organismes

vivants, des tissus et des cellules quelle que soit la situation.

Sa dégradation (combustion) commence toujours par une dégradation partielle dans la partie soluble du

cytoplasme des cellules : c’est la glycolyse.

La glycolyse :

- existe dans la plupart des tissus et son but est d’assurer une production d’énergie indispensable.

- Permet la dégradation du glucose, squelette à 6 carbones, aboutira à 2 molécules d’acide pyruvique (CH3-

CO-COOH) ou pyruvate (état ionisé plus présent dans les milieux aqueux) à 3 carbones après que le

glucose ait été activé en glucose 6P.

Cette combustion partielle produira :

2 molécules de transporteurs d’hydrogène du type NADH + H+ (issu de la vitamine B3 = coenzyme de

déshydrogénase)

+ 2 molécules porteuses d’énergie utilisable : l’ATP (monnaie énergétique).

Les NADH seront rapidement utilisés dans le cytosol (passage du pyruvate en lactate), ou dans les

mitochondries (chaîne respiratoire) afin de régénérer du NAD, 1er oxydant accepteur d’H+ issus de la glycolyse.

Les pyruvates (=acides pyruviques) subiront une oxydation dans les mitochondries : PDH puis cycle de

Krebs puis chaîne respiratoire.

Sinon ils subiront la fermentation (anaérobiose) : le lactate déshydrogénase forme du lactate et permet

de régénérer le NAD.

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Bilan du catabolisme du glucose : 2 bilans :

Bilan brut :

NADH = 3 ATP,

FADH2 = 2 ATP

et Acétyl-CoA = 12 ATP donc le catabolisme du glucose donne 36-

38 ATP.

Bilan net : si l'on tient compte d’une dépense énergétique

(0,5 ATP) pour transloquer l’ADP/ATP de la mitochondrie, dans ce

cas le bilan net est de :

NADH = 2,5 ATP,

FADH2 = 1,5 ATP

et Acétyl-CoA = 10 ATP

donc le catabolisme du glucose s'approche de 30 ATP.

B) Utilisation des acides gras

Ils représentent une grande réserve d’énergie quasi inépuisable, accumulée dans le tissu adipeux en une

masse relativement peu importante (10 à 15 Kg).

Pourquoi AG (TAG), forme privilégiée de réserve ?

Les acides gras sont très réduits (très peu d’oxygène), plus que les glucides. On part de beaucoup plus

loin pour l’oxyder donc on va récupérer beaucoup plus d’énergie.

- Structures extrêmement réduites : rendement énergique après oxydation 2 fois supérieur (9 kcal versus

4 kcal par gramme)


Acyl-CoA : acide gras activé par du CoA (coenzyme A) = CH3-(CH2)n-CO-SCoA.

Acétyl-CoA: CH3-CO-SCoA.

Acides Gras : courts = C4 à C6, moyens = C8 à C12, longs = C14 à C20, très longs à partir de C22.

Les AG C16 (acide palmitique) et C18 (acide stéarique) sont très abondants.

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- Ils sont hydrophobes : 1 g de glycogène retient 2 g d’eau donc 1 g de lipides anhydres équivaut

énergétiquement à 6 g de glycogène hydraté, si on remplaçait nos TAG du tissu adipeux par du

glycogène, ça ferait un excès de poids de 35 kilos pour un homme de 70kg).

Les acides gras sont activés en acyls-CoA (= acide gras + coenzyme A) (à ne pas confondre avec l’acétyl CoA)

Transport dans la mitochondrie : navette carnitine ne sera nécessaire pour que les acides gras à longues

chaînes (à partir de 14 à 24 carbones)

Catabolisme mitochondrial oxydatif = β-oxydation (dépendante de la chaîne respiratoire)

Libération de n molécules d’Acétyl coA et NADH + H+ et FADH2 (coenzymes réduits) puis recyclage NADH

Il existe une pathologie chez les enfants qui se traduit par un déficit enzymatique ne permettant plus de

transporter les AG dans la mitochondrie. On donne à ces enfants un régime particulier à base d’AG court (pas

besoin de ces enzymes pour les transporter dans la mitochondrie).

β-oxydation = énergie potentielle, donc ne produit pas directement d’énergie utilisable sous forme de

monnaie d’énergie (ATP). Ce qui produit l’ATP c’est la réoxydation du NADH+H+ et du FADH2 au niveau de la

chaine respiratoire, et la dégradation de l’actétyl-Coa dans le cycle de Krebs. La β oxydation fournit l’acétyl-Coa

et ses coenzymes qui permettront de produire de l’ATP (de l’ordre de 130).

Les chaînes carbonées saturées des acides gras seront dégradées dans les mitochondries, centrales

énergétiques de nos cellules et lieu de nombreuses oxydations.

C16 et C18 → acide gras longs. C16 (palmitique) riche dans le beurre.

Polymères d’acétyls (n C2)

Quand et où ?

- Signal : carence cellulaire en énergie

- Message : Mobilisation des acides gras à partir des réserves de TAG : lipolyse adipocytaire

- Réactions : libération d’AG dans le sang et de glycérol par suite de l’action de la lipase qui agit au niveau

du tissu adipeux sur les TAG → Pénétration cellulaire → Transport intra-mitochondrial et β-oxydation :

o - n Acétyl-CoA brûlés dans le cycle de Krebs

o – libération de coenzymes NADH+H+ et FADH2 : ré-oxydation au niveau de la chaîne respiratoire

- Réponse : Production d’ATP

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Régulation

o Demande en énergie représentée par le rapport ATP/ADP. Si le rapport ATP/ADP (numérateur

augmente) est élevé alors on a assez d’énergie disponible donc on met en réserve. En revanche si l’ADP

(dénominateur augmente) est plus élevé que l’ATP, alors on a besoin d’énergie (ATP) ce qui active la

lipolyse. On parle de suffisance énergétique.

o Disponibilité en « substrats oxydables » : Concentration intra-cellulaire en AG dépendante de la

concentration plasmatique en AG non estérifié sous contrôle nutritionnel et hormonal.

o Glucagon et adrénaline sont activateurs du catabolisme des TAG et donc hyperlipémiants.

o Besoins en coenzyme A (vitamine B5) pour activer les acides gras (acyls). En effet, il ne peut pas avoir

d’énergie sans vitamines, car il n’y a pas de coenzymes et donc pas d’AG activés.

Oxydation mitochondriale de l'acide palmitique C16H32O2

Une réserve d’énergie importante

Les conversions en ATP à connaître :

Bilan total brut : environ 130 ATP pour l’acide palmitique (12x8 + 3x7 + 2x7 = 131) (bien supérieur au

rendement brut du catabolisme du glucose).

Les végétaux produisent du glucose avec la photosynthèse → CO2 + H2O. Tandis que les animaux

consomment du glucose avec la respiration → CO2 + H20. On a une boucle entre végétaux et animaux.

Conclusion :

Les conditions aboutissant à la mobilisation des AG sont nombreuses : stress, jeûne, effort prolongé,

problèmes pathologiques

Les acides gras vont représenter des combustibles supplémentaires :

Transporteurs réduits Formes activées des acides organiques seules métabolisables

8CH3-CO~SCoA + 7(NADH + FADH2) CH2-(CH2)14-CO~SCoA

➢ Chaque Acétyl-CoA est l’équivalent de 12ATP (cycle de Krebs + chaîne respiratoire)

➢ Chaque NADH permet de fournir 3ATP (chaîne respiratoire)

➢ Chaque FADH2 permet de fournir 2ATP (chaîne respiratoire)

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o Permettant une épargne glucidique

o Contribuant indirectement au maintien de la glycémie

Lipolyse adipocytaire (lyse triaclycérols du tissu adipeux) : réponse quasi-immédiate à une alerte

métabolique comme hypoglycémie, qui mobilise donc le glucagon pour activer la lipolyse.

Objectif : Maintenir un taux de glucose circulant suffisant pour les tissus glucodépendants tels que le

cerveau, les hématies

C) Néoglucogenèse (NGG)

Définition : C’est la synthèse de glucose à partir de précurseurs non glucidiques

Elle permet le maintien de la glycémie et la restauration des réserves de glycogène.

On a 6 molécules énergétique : coûte cher

C’est une voie consommatrice d’ATP, de GTP donc d’énergie. Elle a lieu dans le cytosol.

Caractéristiques :

o Conditions : lorsque l’organisme n’a plus assez de glucose pour les tissus glucodépendants. (Par

exemple : en situation de jeûne, ou inter prandiale, plus la privation se prolonge plus la NGG est

importante, exercice physique intense, chez les diabétiques…)

o Lieu : Se déroule dans le foie, au niveau du cytosol principalement (passage par la mitochondrie)

o Trois espèces moléculaires principales, des précurseurs non glucidiques (constitué de 3C) :

- Alanine d’origine protéique

- Lactate issu de la fermentation (par recyclage au niveau du foie)

- Glycérol issu des TAG dégradés par une lipase, squelette sur lequel les acides gras sont stockés

en période post prandiale.

GTP et ATP sont équivalents sur le plan énergétique. La NGG est quasiment une inversion de la glycolyse,

mais ce n’est pas l’inverse de la glycolyse.

6 H2O + 2 CH3 -CO-COOH C6H12O6 + 6 Pi

Acide pyruvique Glucose

+ 4 ATP +2 GTP

+ 4 ADP +2 GDP

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-Nécessite un passage obligatoire par la mitochondrie

-Consommatrice d’énergie.

Étapes :

1. Amorçage mitochondriale de la NGG

Le pyruvate entre dans la mitochondrie, il subit en fonction des régulations :

- Soit l’action de la pyruvate déhydrogénase (PDH) donnant l’actétyl-CoA : voie de la glycoyse aérobie

- Soit l’action de la pyruvate carboxylase donnant de l’oxaloacétate : NGG

Pyruvate carboxylase : enzyme de carboxylation à biotine (vitamine B8), pyruvate → oxaloacétate

Réduction par malate déhydrogénase mitochondriale : pas de transport d’oxaloacétate donc réduction

de l’oxaloacétate en malate

2 Oxaloacétate + 2 NADH,H 2 Malate + 2 NAD+

Puis sortie du malate de la mitochondrie

2. Étapes cytosoliques

Malate déshydrogénase cytosolique : malate issu des mitochondries redonne naissance à oxaloacétate

o Formation de phosphoénolpyruvate (PEP) : Décarboxylation phosphorylante en présence de

Phosphoénolpyruvate carboxykinase ou PEP, carboxykinase, oxaloacétate → PEP

2 Oxaloacétate + 2 GTP 2 PEP + 2 GDP + 2 CO2

PEP : composé à haut potentiel d’hydrolyse

o Transformations : du PEP au Fructose-1,6-bisphosphate : étapes inverses de la glycolyse

2 CH3-CO-COOH + 2 CO2+ 2 ATP 2 HOOC-CH2-CO-COOH + 2 ADP + 2 Pi

Oxaloacétate

Pyruvate

Pyruvate carboxylase

PEP carboxykinase

Malate déshydrogénase

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Pas de contraintes énergétiques : réactions réversibles

PEP + 2 H2O + 2 ATP + 2 NADH,H+ Fructose-1,6-bisphosphate + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+

o Transformations : du fructose-1,6-bisphosphate au glucose

Trois réactions vont être nécessaires dont une réversible

- Hydrolyse du Fructose-1,6-bis P en Fructose 6-P : étape inverse de la glycolyse avec PFK 1, étape

irréversible catalysée par le fructose 1-6 bisphosphatase ou FBP1

Fructose-1,6-bisP + H2O Fructose 6-P + Pi

- Isomérisation du Fructose 6-P en Glucose 6-P : réversible car c’est une simple étape à double sens

d’isomérisation de fonction, étape inverse de la glycolyse

Fructose 6-P Glucose 6-P

-Hydrolyse du glucose 6-P en glucose : irréversible, catalysée par glucose-6-phosphatase hépatique,

assure à 90 % la libération de glucose dans le sang pour la glycémie

Glucose 6-P Glucose + Pi

Régulation :

Régulation coordonnée des deux voies : Néoglucogenèse et glycolyse

➢ Par métabolites effecteurs : rapport ATP/AMP, citrate vont agir sur les kinases et phosphatases

Par exemple, si le rapport ATP/AMP est bas (= besoin d’énergie) :

- Activateur de la PFK1 : Glycolyse

- Inhibiteur de la FBP1 : NGG

Fructose 1-6 bisphosphatase (FBP1)

6

Isomérase

6

Glucose-6-phosphatase

hépatique

6 On contourne donc 3 étapes irréversibles de la glycolyse :

-Étape du pyruvate au PEP de la pyruvate kinase : contournée par les étapes mitochondriales et la

PEP carboxykinase

-Étape de la PFK1 (phosphofructokinase) : contournée par la fructose-1-6 bisphosphatase

-Étape de la glucokinase/hexokinase : contournée par la glucose-6-phosphatase

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et vice versa.

➢ Régulation hormonale contribue à cette coordination

- Rapport insuline/glucagon lui-même dépendant de l’alimentation.

o Insuline : hormone post-prandiale orientant vers la mise en réserve d’énergie

o Glucagon : hormone inter-prandiale déclenche les voies cataboliques car on dégrade des produits pour

obtenir de l’énergie, il déclenche aussi la néoglucogénèse qui est une voie de synthèse/anabolique. La

fonte musculaire est déclenchée dans un premier temps sous l’effet du glucagon. On a donc :

- Mobilisation des réserves d’énergie

- Activation de la NGG.

Conclusion sur la période inter-prandiale

La diminution de la sécrétion d’insuline est probablement le phénomène endocrinien le plus important.

Sa chute, très rapide, est l’élément permettant l’activation de la lipolyse, de la glycogénolyse et de la mise

en route de la néoglucogenèse.

L’augmentation de la sécrétion du glucagon : contribue à transformer le foie en un organe

glycogénolytique et néoglucogénique.

Au niveau moléculaire les variations des flux de substrats énergétiques ne sont possibles que grâce à une

régulation spécifique au niveau moléculaire. Les flux s’adaptent parce que les activités enzymatiques s’adaptent.

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ED : Le métabolisme en période d’activité musculaire du sprinter au marathonien

I. INTRODUCTION

L’adaptation métabolique est déclenchée par des hormones et principalement par

o Noradrénaline (système nerveux sympathique)

o Adrénaline (médullo-surrénales et système sympathique)

Les molécules sources d’énergie sont différentes selon l’exercice physique effectué :

o Anaérobiose : pour le sprint

o Aérobiose : pour le marathon

Il est donc important de considérer les fibres musculaires impliquées dans l’exercice.

L’ATP fournit directement l’énergie à la myosine, protéine responsable de la conversion de l’énergie

chimique en mouvement. (En effet l’interaction actine myosine demande de l’énergie).

II. ACTIVITE MUSCULAIRE DE FORTE INTENSITE, DE COURTE DUREE (SPRINT)

A) Fibres musculaires du sprinter

Les fibres musculaires peuvent être divisées en 3 types :

- Type I

- Type IIA

- Type IIB

Les Sprinters ont une proportion élevée (> 70 %) de fibres de type IIB = Fast Twitch ou contraction rapide :

signal transmit rapidement. L’entraînement favorise les fibres de type IIB, certains champions ont une proportion

plus élevée. Les fibres IIB permettent la fuite chez l’animal.

Ces fibres IIB ont une bonne innervation par des grandes cellules nerveuses ce qui permet :

- Une transmission rapide de l’influx nerveux

- Un cycle de contraction / relâchement courts : donne la vitesse au mouvement

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B) Sources d’énergie

Les fibres IIB sont blanches, elles sont dites glycolytiques :

- Pauvres en myoglobines (= demi-hémoglobines) : moins d’apport en d’O2

- Peu d’apport sanguin (c’est pour ça qu’elles sont blanches)

- Peu de mitochondries : utilisation de la glycolyse anaérobie

On est en condition d’anaérobiose (on compte sur la glycolyse : 2 ATP donc faible rendement, le sportif

compense en engageant beaucoup de glucose).

Les enzymes impliquées en aérobiose sont peu actives tandis qu’activité élevée des enzymes de la

glycolyse, de la créatine kinase (très présentes dans le muscle, on peut en faire le dosage).

Si on a peu d’apport sanguin, le muscle puisera son énergie à partir de ses réserves soit :

- Glycogène musculaire (seulement musculaire : 1 %, glucose engagée dans la glycolyse et pas hépatique

car pas d’apport en sang et exercice trop rapide)

- Créatine phosphate (= phosphagène) présente au niveau du muscle (liaison phosphate riche en E, plus

énergétique que l’ATP, il permet de retransformer l’ADP en ATP ainsi créatine phosphate créatine)

La contraction musculaire entraine une consommation d’ATP :

ATP + H2O → ADP + Pi + H+

Le rapport ATP/ADP diminue : ADP déclenche la production d’ATP à partir de la créatine phosphate (qui

donne son phosphate à l’ADP) permettant la formation D’ACTOMYOSINE à partir desactine et myosine et

inversement (ATP vers ADP en donnant son phosphate à la créatine par la créatine kinase)

Enzyme = Créatine Kinase présente dans les muscles à La créatinine est filtré par le rein et utilisé pour

diagnostiquer une insuffisance rénale

Fonctionne dans les deux sens

C) Séquences métaboliques impliquées

Durant les 4 premières secondes (période alactate) de sprint :

o L’énergie est fournie par la créatine phosphate

o Suivie de la glycolyse (> 4sec) à partir du glycogène (période lactate) qui fournira du lactate

(fermentation lactique) à partir du pyruvate qui permet de recycler le NAD.

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Physiologiquement : concentration de 17 µmol/g en créatine phosphate musculaire

Consommation durant 4sec : 13 µmol/g (l’énergie pour un démarrage sur 4 secondes)

Cette période est nommée « alactate » de production d’énergie (c’est-à-dire que la glycolyse n’est pas

encore mise en place donc on ne produit pas de lactate, le transfert d’énergie est seulement entre la créatine

phosphate et ATP/ADP.

Permet à la glycolyse de prendre le relais :

Fermentation : dégradation des molécules en l’absence d’oxygène

o La fermentation transforme le NADH en NAD (réoxydation) en anaérobie.

Défi lors du sprint : augmentation de la glycolyse pour atteindre un flux très élevé de glucose estimée d’un

facteur 1000 (en 4sec), cette glycolyse ne produit pas énormément d’énergie (2 ATP)

Solution : engagement majeur de molécules de glucose (facteur 1000)

Comment ? Actions sur l’étape majeure de la régulation de la glycolyse :

o Phosphofructokinase (1PFK1, étape irréversible dans la glycolyse)

o Fructo 1,6 biphosphatase (F1,6BPase, contourne la PFK1 (NGG))

1. Athlète au repos avant compétition

o Flux glycolytique faible

o Activités basses pour PFK1 et F1,6BPase (un peu plus d’activité pour PFK1)

Pour 55 molécules de glucose engagées : environ 50 molécules de glucose dégradées et 5 recyclées,

retransformer par la NGG.

(Toutes les séquences ne sont jamais en mode ON/OFF, ainsi on peut accélérer la séquence sans avoir à

la redémarrer).

Glycogène musculaire Glc1P Glc6P Pyruvate Lactate

Glycogénolyse Glycolyse Fermentation lactique (via

lactate déshydrogénase)

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Quand on glycolyse, on a toujours un petit peu de glycogénogénèse.

2. Athlète dans les starting blocks

o Flux glycolytique faible mais c’est l’étape de recyclage qui va augmenter. Il y a 2000 molécules de

glucose qui rentre : 1950 sont recyclées, et 50 molécules sont dégradées.

o Décharge dans le sang des catécholamines (hormones du stress), on a alors une augmentation de

l’activités de PFK1 et F16BPase

3. Athlète en sprint

o Pendant les 4 premières secondes :

- Diminution de la créatine phosphate et l’ATP

- Augmentation de l’AMP, du phosphate et de F1,6BPase

o Ensuite, la glycolyse prend le relai : flux et recyclage élevés (après 4sec de sprint). Le recyclage est élevé

mais a un peu baissé, avec 50 000 molécules de glucose qui rentre on a 1000 molécules qui sont recyclées,

suffisamment d’énergie est mobilisé.

Le glycogène est plein de ramification, il est donc attaqué à plusieurs extrémités donc un maximum de

glucose est libéré.

On a une production de beaucoup de lactate.

5

Glc6P F6P F1,6BP

55

50* 50 Lac

PFK1

F1, 6BPase

Glc6P F6P

2000

F1,6BP 50* 50

Lac

PFK1

F1, 6BPase

1950

Glc6P F6P

51 000

F1,6BP 50 000 50 000

Lac

PFK1

1000

F1, 6BPase

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• Est-ce que les réserves énergétiques sont suffisantes pour le sprinter ?

- 1g de muscles contient 80 µm de glycogène → 240 µmol d’ATP pour 80 secondes de sprint

Or durée maximale pour un sprint est égale à 20 secondes. La fatigue n’est donc pas due à l’épuisement

des réserves en glycogène.

D) Base métabolique de la fatigue

1. Fatigue périphérique

La fatigue périphérique désigne la fatigue au niveau musculaire, les éléments physiologiques.

o Durant le sprint, deux composés s’accumulent le lactate et le H+.

Hypothèse de la fatigue due à l’accumulation de lactate ?

Des expériences montrent que la contraction musculaire n’est pas perturbée par des concentrations

élevées en lactate.

Avec l’augmentation de la concentration en proton, on a une baisse du pH c’est-à-dire une acidification

au niveau de la fibre, ce qui provoquerait la fatigue musculaire.

Diminution du pH (acidification) entraine soit (ou les deux) :

o Séquestration du Ca2+ : le calcium permet la contraction musculaire, il se retrouve séquestré dans le

réticulum sarcoplasmique sous pH acide.

o Inhibition PFK1 : enzymes sensibles au pH, la PFK1 est inhibé on a donc une diminution du flux

glycolytique et donc d’ATP

On estime que l’acidification s’accentue avec la longueur de l’épreuve : 100m, 200m, 400m, etc. D’où

nécessité d’une capacité élevée à tamponner pour les sprinters longue distance.

→ Nécessité d’avoir une bonne réserve alcaline.

Les bicarbonates luttent contre l’acidification.

Sportif = capacité à tamponner

2. Fatigue centrale

o Éléments psychologiques : baisse de moral

On a de nombreux signaux peu connus, sensation de fatigue au niveau central

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III. ACTIVITE MUSCULAIRE D’INTENSITE MOYENNE, LONGUE DUREE (MARATHON)

A) Fibres musculaires du marathonien

On trouve une forte proportion de fibres de type I (dites oxydatives) dont les caractéristiques

physiologiques et biochimiques sont à l’opposé des fibres de types II :

o Beaucoup de myoglobines (réserve en O2)

o Bonne irrigation sanguine

o Beaucoup de mitochondries

On est donc en condition d’aérobiose et les fibres sont rouges.

On a une activité élevée des enzymes du Cycle de Krebs, de la Chaine Respiratoire et de la β-oxydation.

Par contre conduction nerveuse lente : « secousse lente ».

➢ Bien irriguées et peu innervées

B) Sources d’énergie

Les principaux carburants brûlés au cours du marathon sont le glucose, et les AG.

o Le glucose : diverses sources

- Réserves de glycogène : musculaire et hépatique (apport en sang)

- Néoglucogenèse hépatique

- Alimentation (boissons sucrées) d’origine intestinale

o AG issus de :

- Graisses du tissu adipeux (hypolyse du tissus adipeux)

- Graisses musculaires

Les réserves en glycogènes sont limitées (24-48h) et sources de glucose (NGG et boissons) sont

quantitativement négligeable. Le marathonien ne doit pas épuiser tous son glycogène car sinon il tombe en

hypoglycémie, il doit économiser son Glc et glycogène. Il faut déporter la fourniture énergétique sur les AG pour

maintenir un taux de glycémie constant, on épargne ainsi la consommation de glucose.

L’oxydation est complète en aérobiose à partir des réserves énergétiques à haute capacité (glycogène

hépatique, graisses adipeuses) :

o Permet un bon rendement énergétique mais l’ATP est régénérée beaucoup plus lentement

o Ainsi on a des vitesses différentes entre la course du sprinter en anaérobiose et du marathonien en

aérobiose et en anaérobiose

Un marathon ferait 6h si l’énergie n’était fournie qu’exclusivement à partir des AG et non 2h.

Les coureurs d’élite utilisent des quantités égales de glycogène et d’AG à V = 5,5 m/s.

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La réduction de la vitesse est liée aux vitesses de séquences métaboliques.

• Pour une course de plus de 2h, il faut éviter l’épuisement des réserves en glycogène :

- Risque d’hypoglycémie

- Chute de puissance rapide

- Fatigue subite

• Les coureurs de haut niveau, l’endurance dépend de leur capacité :

- A mettre en réserve de grandes quantités de glycogène

- A utiliser parcimonieusement le glycogène, maintien de la glycémie jusqu’à la fin de l’effort

- A brûler préférentiellement les AG (rendre le tissu plus sensible à l’utilisation des AG)

• L’entrainement favorise :

- Accumulation des graisses au niveau musculaire

- Capacité du muscle à utiliser préférentiellement les AG que le glucose

- Accroissement de la sensibilité du tissu adipeux aux hormones lipolytiques (glucagon, catécholamines,

ACTH, THS, …)

• La limite de l’endurance : la chute de glycémie avant la fin de l’épreuve

Avant : proscrire ration glucidique juste avant l’épreuve (postérieur à 3h avant la course)

→ Risques en ingérant du glucose :

- Augmentation de l’insuline par le pancréas qui est antilipolytique

-Pic insulinique en réaction à cette glycémie qui augmente : réduction de l’utilisation des AG et risque

d’hypoglycémie

Pendant : prendre des boissons sucrées pendant l’épreuve n’est pas gênant, en effet le glucose passant

dans le sang est utilisé très rapidement donc la glycémie n’augmente pas assez pour déclencher une sécrétion

d’insuline

Pour limiter cet inconvénient :

- Fractionner les prises en rations successives

- Tester d’autres sucres (fructose : index glycémique plus bas, moins de libération d’insuline)

Pas de boissons miraculeuses !

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C) Stratégies d’apport glucidique lors d’effort d’endurance

o Avant la course : pas à moins de 3h

Maximiser les réserves en glycogène par repas riches en glucides complexes tels que riz, pâtes, les

lentilles, les pommes de terre, le maïs (pas de sucre rapide qui entrainent une sécrétion importante d’insuline)

o Dans l’heure qui précède la course :

Proscrire la prise de glucides rapides afin d’éviter l’effet insulino-sécréteur (inutile de le faire avec les

lipides, ils seront non métabolisés et seules les graisses endogènes sont utilisées).

o Pendant la course :

Possibilité de rations glucidiques (20 à 50 g/h) car le risque d’hypoglycémie réactionnelle disparait. Inutile

de le faire avec les lipides.

Exemple : ration énergétique, barre énergétique

A consommer durant l’effort, remet rapidement les réserves d’énergie à niveau, on a un apport d’hydrate

de carbone et de protéines. La faible dose de fibres et de graisses fait que ces barres sont faciles à digérer. Elle

contient des sucres lents et des sucres rapides.

D) Régulation hormonale

Pendant l’effort on a une augmentation de l’adrénaline et baisse de l’insuline (effet hypoglycémiant).

- Active la glycogénolyse musculaire

- Active glycogénolyse hépatique

- Lipolyse au niveau du tissu adipeux

→ L’objectif est de sauvegarder la glycémie

Lors de l’exercice prolongé la concentration plasmatique de d’autres hormones augmentent : glucagon,

cortisol, hormones de croissance, etc

Dans le cas du marathonien on va dans le sens de la glycogénolyse, la lipolyse, la NGG (néoglucogenèse).

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E) Bases métaboliques de la fatigue

La fatigue du marathonien serait due à l’épuisement des réserves de glycogène (GG), ce qui entraine ainsi

une baisse de la glycolyse, d’où la nécessite d’utiliser les AG (entraînement) et de constituer des réserves en GG

avec un régime adapté.

o Habitude des marathoniens : boire un café fort avant la course. En effet la caféine stimule la lipolyse et

mobilise les graisses provoque la libération des AGNE (AG non estérifié).

IV. LES PRODUITS DOPANTS : LES MODULATEURS METABOLIQUES

Ils sont synthétisés dans un but thérapeutique (à la base comme médicament mais ça ne marchait pas

donc on les a dérivés en produits dopants) : les modulateurs métaboliques comme l’AICAR et le GW501516 sont

considérées comme molécules dopantes de demain.

A) AICAR

o AICAR ou acadésine (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucléotide)

Il a été mis en avant lors des JO de Pékin en 2008. Composé testé sur des souris : perte de poids et gain

de 44% en endurance.

- Structure : Dérivé nucléotidique, analogue de l’AMP

-Mécanisme d’action : Agoniste de l’AMP kinase (enzyme qui phosphoryle), enzyme ubiquitaire activée par l’AMP

lors de situations de stress

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➢ Si rapport AMP/ATP augmente (plus d’AMP) → AMP kinase activée, formation d’ATP à partir d’AMP

-Modulateur métabolique :

- Augmentation des séquences métaboliques fabricant l’ATP : glycolyse, béta-oxydation

- Baisse des séquences anaboliques consommant l’ATP (hormis l’activité musculaire)

B) GW501516

-Objectif : augmenter le taux d’HDL-cholestérol (bon cholestérol ramené vers le foie) mais effets toxiques chez

les animaux.

Par contre, il augmente l’endurance de souris génétiquement modifiées au niveau du récepteur PPARẟ =

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, elles se fixent sur ADN et déclenche l’expression des gènes

-Structure : Dérivé de l’acide phénoxyacétique

- Mécanisme d’action : PPAR sont des récepteurs nucléaires agissant comme facteurs de transcription de gènes

cibles

- PPARẟ est un récepteur ubiquitaire mais surtout au niveau des muscles squelettiques

- GW501516 est un ligand de PPARẟ

C) Effets recherchés par les sportifs

1. Effets musculaires

o GW501516 : entraine un remaniement des fibres glycolytiques II en fibres oxydatives I.

D’où augmentation des fibres de type I : augmentation de l’endurance du sportif et évite l’entrainement.

o AICAR : entraine le même effet en agissant indirectement sur le récepteur PPARẟ.

o Parallèlement, le nombre de mitochondries augmente, accentuant le métabolisme énergétique aérobie.

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2. Effets sur le métabolisme lipidique au niveau du muscle

o GW501516 active les récepteurs PPARẟ impliqués dans :

- la traversée de la membrane cellulaire du myocyte par les AG

- la β-oxydation

→Arrivée constante d’énergie pour le muscle squelettique : sur activité permanente du muscle, qui est boosté

anormalement.

o AICAR agit :

- Indirectement sur PPARdelta : même effet que précédemment

- Directement en phosphorylant l’acétyl-CoA carboxylase (ACC) et donc inhibition de la lipogenèse réservant

les AGNE pour la β-oxydation, on favorise donc la lipolyse.

➢ Prise de GW501516 + AICAR chez la souris entraine :

- Perte de masse graisseuse

- Gain d’endurance de 70 %

3. Effets sur le métabolisme glucidique au niveau du muscle

→ AICAR par l’intermédiaire de l’AMP kinase :

- Facilite le transport du glucose dans le muscle indépendamment de l’insuline (GLUT4 : insulino-

dépendant, GLUT 1 et 3 : non insulino-dépendant)

- Inhibe la glycogène synthase réservant le glucose pour l’énergie

D) Effets secondaires

Si les molécules sont utilisées à des fins dopantes par les sportifs on a des risques d’effets indésirables

encore peu connus.

Chez l’animal :

- Effet cancérigènes : tumeurs malignes chez le rat ce qui a stoppé le développement de GW501516 par

le laboratoire GSK

- Effets neurologiques : tumeurs malignes chez le rat : retard psychomoteur, voire autisme provoqué

par AICAR

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POINTS IMPORTANTS

I. LES VOIES ANABOLIQUES

= après un apport alimentaire

But : mettre en réserve l’énergie pour les périodes de manque

GLYCOGENOGENESE : synthèse de glycogène à partir du glucose

- Amorçage (UDP-glucose + amorce du glycogène)

- Elongation (Amorce + x UDP glc = chaine linéaire de n résidus de glc

liés en alpha-1-4 = glycogène ramifié (tous les 3 à 5 résidus glc))

- Ramification (Ramification alpha-1-6)

NEOLIPOGENESE : mise en réserve du glc sous forme de lipide par synthèse d’AG

-Amorçage (synthèse du malonyl-CoA)

-Elongation (sur Acide Gras Synthase)

II. LES SEQUENCES INTERPRANDIALES

But : maintenir un apport énergétique et le taux de glucose sanguin

GLUCOGENOLYSE : utilisation du glycogène

Dégradation du glycogène en glucose

UTILISATION DES AG : utilisation du TAG

Libération de n molécules d’acétyl-CoA et de NADH+ H+ et FADH

NEOGLUCOGENESE : synthèse de glycogène à partir de précurseurs non glucidiques

- Amorçage mitochondriale (synthèse d’oxaloacétate, malate)

- Étapes cytosoliques (PEP, Fructose-1,6-bisphosphate, glucose)

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III. ED :

Sprinter Marathonien

Forte intensité, courte durée Fibres musculaires : Fibres IIB (glycolytiques) Innervation élevée Vascularisation faible Myoglobine faible Mitochondries faibles Conditions : Anaérobiose Enzymes : Créatine kinase Sources d’énergie : Glycogénolyse musculaire Créatine phosphate Fatigue : présence d’H+

Faible intensité, longue durée

Fibres musculaires : Fibres I (oxydatives) Innervation faible Vascularisation élevée Myoglobine élevée Mitochondries élevées Conditions : Aérobiose Enzymes : CK, CR et β-oxydation Sources d’énergie : Glycogénolyse musculaire et hépatique NGG hépatique β-oxydation Fatigue : épuisement des réserves de GG

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QCM 1 – Concernant la stratégie métabolique, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) La prise alimentaire est continue pour des besoins énergétiques qui sont discontinues B) C’est en post-prandial qu’il y a mise en réserve C) Les aliments sont des polymères ( glucides, lipides, protéines) contenant de l’énergie inutilisables

directement. Ils doivent être dégradés en molécules simples en cours de la digestion D) L’acétyl-CoA est considéré comme le carrefour métabolique, il va vers le cycle de Krebs en fonctionnant avec

la chaîne respiratoire E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 2 – Concernant le stockage du glycogène, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Le glycogène est l’équivalent de l’amidon du monde animal B) Le foie est un tissu stratégique qui utilise le glycogène pour son compte = usage privé C) L’amorce du glycogène est constituée de glycogénine qui est une protéine auto-glycosylable D) La ramification des chaînes fait intervenir une enzyme débranchante E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte

QCM3 – Concernant la néoglucogènèse, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) La NGG ne nécessite pas de passage par la mitochondrie et ne consomme pas beaucoup d’énergie. B) Les précurseurs de la NGG sont non glucidiques, on retrouve l’alanine, le lactate et la glycérine. C) Lors de l’amorçage mitochondriale, le malate déshydrogénase mitochondriale réduit le malate en

oxaloacétate pour lui donner la possibilité de sortir de la mitochondrie. D) L’isomérisation du Fructose-6-P en Glucose 6-P est une étape irréversible et est une étape inverse de la

glycolyse. E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 4 – Concernant le métabolisme en période d’activité musculaire, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Les fibres de type I oxydatives contiennent beaucoup de myoglobines et une bonne irrigation sanguine et sont sollicités en condition d’aérobiose.

B) Le glucose provient de 3 sources différentes : l’alimentation, les réserves de glycogène, NGG hépatiques. C) Lors de l’effort on a une baisse d’adrénaline et une augmentation d’insuline. D) Chez le marathonien on va dans le sens de de la lipolyse, de la néolipogenèse, et de la NGG. E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

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Exercice 1 :

Complétez le texte avec les mots correspondants

Activation 30 triacylglycérol= triglycéride phosphorylation

Multienzymatique de l’AGS 18 cytoplasme allostérique

Le tissus adipeux hormonal Désactivation 16

déphosphorylation

Durant la néolipogénèse, il y a une mise en réserve des acides gras en ……………. dans ……………………… .

Cette réserve entraîne une autonomie d’environ …….. jours. Cette étape se déroule dans le …………….. sur le

complexe …………………………………… . Elle entraîne ainsi la formation d’un AG à …. Ou … carbones.

Il y a évidemment un contrôle tout d’abord ……………. ( ……………. / …………….. par des molécules) et

………………….. ( ………………….. / ……………….).

Exercice 2 :

Donnez les définitions des mots suivants

Aliment :

Catabolisme :

Messagerie cellulaire :

Exercice 3 :

Complétez le tableau suivant


Activité musculaire

Fibres musculaires

Conditions

Enzymes

Sources d’énergie

Fatigue

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QCM 1 – Concernant la stratégie métabolique, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) FAUX, La prise alimentaire est discontinue pour des besoins énergétiques qui sont continus B) VRAI C) VRAI D) VRAI E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 2 – Concernant le stockage du glycogène, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) FAUX, Le glycogène est l’équivalent de l’amidon du monde végétal B) FAUX, Foie = usage public Muscle = usage privé C) VRAI D) FAUX, La ramification fait intervenir une enzyme branchante = amylo alpha-1-6 glucane transférase E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM3 – Concernant la néoglucogènèse, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) FAUX, passage par la mitochondrie et consomme énergie ++ (6 molécules énergétiques). B) FAUX, alanine, latate, GLYCÉROL C) FAUX, le malate déshydrogénase mitochondriale réduit l’oxaloacétate en malate D) FAUX, l’isomérisation du Fructose-6-P en Glucose 6-P est une étape RÉVERSIBLE et est une étape inverse

de la glycolyse E) VRAI, Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 4 – Concernant le métabolisme en période d’activité musculaire, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) VRAI B) VRAI C) FAUX, c’est l’inverse D) FAUX, chez le marathonien on va dans le sens de de la lipolyse, de la glycogénolyse, et de la NGG. E) FAUX, Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

Exercice 1 :


Durant la néolipogénèse, il y a une mise en réserve des acides gras en triacylglycérols = triglycérides dans le tissus

adipeux .

Cette réserve entraîne une autonomie d’environ 30 jours. Cette étape se déroule dans le cytoplasme sur le

complexe multienzymatique de l’AGS . Elle entraîne ainsi la formation d’un AG à 16 Ou 18 carbones.

Il y a évidemment un contrôle tout d’abord allostérique ( activation / désactivation par des molécules) et hormonal

( phosphorylation / déphosphorylation).

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Exercice 2 :


Aliment : Ce sont des polymères dont l’énergie n’est pas directement utilisable : ce sont des polymères de glucides, les lipides,

les protéines.

Catabolisme : dégradation de molécules complexes, macromolécules ou polymères comme les glucides, lipides et protéines

(exemple : aliments) fournissant de l’énergie et permettant les activités, l’entretien et/ou la croissance cellulaires.

Messagerie cellulaire : mécanisme complexe indispensable au bon fonctionnement de l’organisme (Dérèglement =

pathologie).

Exercice 3 :



Activité musculaire Forte intensité, courte durée Faible intensité, longue durée

Fibres musculaires Fibres IIB (glycolytiques) Innervation élevée Vascularisation faible Myoglobine faible Mitochondries faible

Fibres I (oxydatives) Innervation faible Vascularisation élevée Myoglobine élevée Mitochondries élevée

Conditions Anaérobiose Aérobiose

Enzymes Créatine kinase CK, CR et β-oxydation

Sources d’énergie Glycogénolyse musculaire Créatine phosphate

Glycogénolyse musculaire et hépatique NGG hépatique β-oxydation

Fatigue Présence d’H+ Épuisement des réserves de GG

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CHAPITRE N°1 : LA LIAISON PROTEINE-LIGAND

Une des propriétés des protéines est de lier d'autres molécules appelées ligands (liaison protéine-ligand

- Scatchard - 1954). Cette liaison entraine un changement de conformation de la protéine liante, la

transconformation, et provoque une modification de l'activité biologique de cette protéine.

Exemple de liaison protéine ligand : absorption du glucose (vu en détail dans les cours du Pr. Reynier)

Exemples : ENZYMES-substrat ; TRANSPORTEURS- ions, métabolites ; RECEPTEURS-hormones ;

ANTICORPS-antigène ; INTERACTIONS CELLULAIRES ; EDIFICES SUPRA-MOLECULAIRES

I. ASPECTS MOLECULAIRES DE LA LIAISON

La liaison protéine ligand est constituée de deux étapes : la reconnaissance moléculaire qui doit être

efficace puis la transconformation.

A) La reconnaissance moléculaire

La plupart du temps, il y a choc élastique car les

conditions ne sont pas réunies pour que l’interaction se fasse. La

liaison n’aura donc pas d’effet biologique car la liaison protéine-

ligand n’est pas formée.

La liaison est efficace lorsque le ligand adopte la

configuration optimale (bon conformère) et que le site de liaison

de la protéine liante s'ajuste exactement à ce ligand (ajustement induit). Cette fois, la liaison va entraîner un

effet biologique.

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Il faut une concordance structurale entre le ligand et la protéine (modèle main-gant). La liaison protéine-

ligand n’est pas aléatoire, le ligand va se fixer sur une protéine spécifique.

Cette reconnaissance moléculaire efficace permet la transconformation ou changement de

conformation de la protéine liante.

Deux modèles tentent d'en rendre compte :

- Clé/serrure (Fisher) : C'est un modèle statique impliquant une concordance structurale rigide, préalable

à toute liaison, entre le ligand et le site protéique. Ce modèle a été abandonné.

- Main/gant (Koshland) : C’est un modèle dynamique dans lequel le ligand doit se présenter dans le bon

conformère et le site liant doit s'adapter au ligand par ajustement induit. C’est le modèle actuellement

retenu.

B) La transconformation

La transconformation c’est la modification de la protéine.

La transconformation est l'expression de la flexibilité des

protéines par leurs coudes, anses libres et parties terminales.

La structure 3D d'une protéine oscille entre deux états conformationnels extrêmes (carré/ rond sur le

schéma), l'un totalement actif sur le plan biologique et l'autre totalement inactif.

Il existe bien sûr d'innombrables états intermédiaires dépendant des conditions de liaison et

d'environnement et qui rendent compte de la souplesse d’adaptation fonctionnelle de la matière vivante.

Cette transconformation va générer secondairement l’effet biologique. La transconformation est

relativement lente à s'établir par rapport à la liaison. La transconformation déclenche ou modifie une activité de

la protéine, suivie d’un effet biologique. Les protéines se comportent comme des variateurs d’effet biologique.

Elle peut être évaluée par une constante de vitesse qui est la sommation de plusieurs constantes

individuelles, chacune correspondant à une étape de la réponse biologique.

La transconformation est aussi lente à disparaître qu'à s'établir et l'effet biologique peut survivre un

certain temps à la dissociation du complexe qui l'a engendré.

55

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C) Quels sont les facteurs qui déterminent que le choc soit élastique ou efficace ?

Il va y avoir des échanges d’énergie entre le système et le milieu extérieur

→H = Energie totale , G= Energie échangeable et S entropie

Une partie de l’énergie libre G du système peut être échangée avec l’extérieur et provoquer un choc efficace.

Il faut une énergie libre suffisante pour que la protéine puisse avoir un choc efficace pour réaliser la réaction.

Si il n’y a pas assez, alors on parle de choc élastique.

Deux possibilités :

Non spontanée

Spontanée car libère de l’NRJ

II. CARACTERES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND

Un phénomène biologique est basé sur une liaison protéine ligand quand sont présents les 5 caractères

suivants :

- Spécificité pour une molécule

- Saturation par une molécule

- Inhibition spécifique par des analogues structuraux

- Régulation physiologique de la liaison

- Anomalies héréditaires/ congénitales

Ces caractères sont des éléments qui apportent la preuve de cette liaison. Si un phénomène biologique

présente deux de ses 5 caractéristiques, on peut être sûr qu’il est basé sur une liaison protéine ligand.

A) Spécificité

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56


La liaison protéine-ligand n'est pas aléatoire. Elle implique une concordance structurale entre le ligand

et une zone étroite de la protéine, le site de liaison.

Les motifs stéréochimiques des ligands qui sont reconnus par le site de liaison de la protéine sont en

nombre finis dans la nature ce qui explique que des substances provenant d'une espèce peuvent agir sur d'autres

espèces.

On distingue :

- Les agonistes qui sont des analogues structuraux naturels

ou artificiels du ligand biologique, qui se lient au même site

et qui produisent le même phénomène biologique. Par

exemple, la contraception par des œstro-progestatifs sont

des molécules qui sont des analogues des hormones

produites naturellement.

- Les antagonistes qui sont des analogues structuraux naturels ou artificiels du ligand biologique, qui se

lient aux mêmes sites de liaison que le ligand naturel, sans pour autant que la liaison soit suivie d'effet

biologique.

Ces molécules rentrent en compétition avec le ligand pour se lier à la protéine.

Cette spécificité peut être plus ou moins importante :

- Large, la protéine va reconnaître une famille de composés. Exemple : Albumine qui est la

protéine la plus abondante du sérum et permet le transport non spécifique d'hormones, de la bilirubine,

de médicaments…

- Etroite, la protéine reconnaît un seul type de composés. Exemple : le transporteur intestinal

glucose/Na+ qui ne transporte que le glucose et le galactose.

- Exclusive, la protéine ne reconnaît qu'un seul des deux énantiomères. Exemple : l’hexokinase

phosphoryle le D glucose mais pas le L glucose.

On utilise ainsi des protéines liantes (enzymes, anticorps, récepteurs) pour détecter et doser des substrats

avec une spécificité bien plus grande que par les méthodes chimiques.

De

+ en

+ s

péc

ifiq

ue

Définitions/ points clés : agonistes (analogues structuraux du ligand, même phénomène biologique) ≠

antagonistes (analogues structuraux du ligand mais n’entrainant pas forcément d’effet biologique)

Spécificité large, étroite ou exclusive

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B) Saturation

Les sites de liaison d’une protéine sont en nombre limité (un seul ligand peut se lier par récepteur) et sont

plus ou moins occupés par le ligand. La liaison entre la protéine et le ligand peut être évaluée par :

- Le pourcentage de liaison qui correspond à la proportion de complexes protéine-ligand qui est formé.

- L’effet biologique qui croit de façon hyperbolique avec la concentration en ligand et la proportion de

complexes protéine-ligand formés.

Ces deux mesures évoluent vers un maximum, la saturation.

Celle-ci indique que tous les sites de liaison, qui sont en nombre limité, sont occupés par le ligand et que

la transconformation est maximale dans ces conditions expérimentales.

La saturation permet de comprendre le phénomène de compétition entre plusieurs ligands pour le site

de liaison. Ainsi un ligand mis en excès va saturer le site de liaison pour la protéine et le rend indisponible pour

d’autres.

C) Inhibition spécifique

Dans le cadre de l’inhibition compétitive, des analogues structuraux se lient aux mêmes sites de liaison

que le ligand naturel, sans pour autant que la liaison soit suivie d'effet biologique. Ils inhibent donc par

compétition l'action du ligand naturel (antagonistes). Le plus souvent, cette inhibition est réversible et peut être

levée par un excès du ligand naturel qui sature lui-même les sites.

Définition/point clé : % de liaison, effet biologique

Saturation= transconformation maximale, tous les sites de liaisons sont occupés

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Exemple AZT contre VIH : analogue structural de la thymidine donc compétition entre les deux, et l’AZT

permet d’empêcher la synthèse d’ADN

L’inhibition est généralement non compétitive et

réversible. L’inhibiteur peut se fixer à un autre endroit sur la

protéine et inhiber l’action du ligand. L’inhibiteur n’est, dans ce

cas, pas un analogue structural du ligand.

L’inhibition réversible peut aussi être compétitive. Il y

aura donc une compétition entre l’inhibiteur et le ligand car

l’inhibiteur est un analogue structural du ligand. Cette inhibition

peut être levée par un excès de ligand naturel qui va saturer lui-

même les sites.

Cependant, certaines molécules se fixent de façon covalente sur les sites liants ce qui inhibe

définitivement l'effet biologique, c’est une inhibition irréversible. On les nomme poisons de la liaison protéine-

ligand. On a une perte de l’effet biologique par modification de la conformation de la protéine et/ou blocage du

site actif

Ces caractères sont mis à profit dans l'utilisation thérapeutique de substances chimiques, et représentent

les bases moléculaires de la pharmacologie.

Exemple de l’aspirine : anti-inflammatoire et antiagrégant plaquettaire

(traitement en cas d’infarctus du myocarde) → inhibition de la Cox. Il faut 7 jours

pour que le renouvellement des plaquettes permette de resynthétiser des Cox

→ pbs plaquettaires pendant 7 jours. L’aspirine transforme la protéine, elle ne

peut plus synthétiser de prostaglandines à partir d’acide arachidonique.

D) Régulation

La liaison entre une protéine et un ligand est régulée soit au niveau de la protéine, soit au niveau du ligand.

1. Dû à la protéine liante

- La concentration de la protéine liante peut être modifiée par régulation de la biosynthèse ou de la

dégradation de la protéine liante.

La liaison elle-même peut protéger le complexe contre la dégradation (protection des enzymes par leur

substrat) ou au contraire la faciliter (complexes antigène-anticorps). La protéine (ex : récepteur) peut être

internalisée si on ne veut plus avoir d’effet biologique.

Définition/point clé : Inhibiteurs irréversibles= poisons

Inhibiteurs réversibles= inhibiteurs compétitifs ou non compétitifs

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- Les isoformes sont des variants de la protéine liante, ils peuvent exister de façon constitutive

(expression tissu spécifique) ou adaptative (expression variable au cours du développement ou des

conditions environnementales). Les facteurs vont être synthétisés pour des raisons différentes. Ils ont

en règle générale des concentrations, capacités de liaison et de transconformation différentes.

Exemple d’expression du tissu spécifique : La glucokinase qui phosphoryle le glucose avec une faible

affinité n'est présente qu'au niveau du foie où elle permet lors de concentrations élevées de glucose la synthèse

de glycogène.

A l'inverse, l'hexokinase présente dans tous les organes a une affinité plus grande pour le glucose

permettant la phosphorylation de celui-ci à des concentrations faibles et l'utilisation du glucose vers la glycolyse.

La conjonction de tous ces phénomènes entraîne une modulation extrêmement fine de la réponse

biologique à une liaison protéine-ligand.

- La régulation allostérique, sera vue plus en détail dans le chapitre d'enzymologie. La liaison d'un ligand

ou l'effet biologique qui s'en suit peuvent être modulés par :

o Allostérie simple : des effecteurs allostériques se lient à des sites différents du site de liaison du

ligand (site allostérique) et la transition allostérique modifie la réponse de la protéine à son

ligand principal.

o Allostérie covalente : par exemple la phosphorylation-déphosphorylation des protéines liantes

va modifier leur réactivité.

o Affinité et transconformation : La conjonction de tous ces phénomènes entraîne une

modulation extrêmement fine de la réponse biologique à une liaison protéine-ligand.

2. Dû aux ligands

La concentration du ligand peut être régulée au niveau de :

- Sa biosynthèse

Exemple : Le taux de glucose sanguin doit être stable quels que soient les apports en glucose au cours de

la journée. Cette régulation est entre autres assurée par des hormones telles que l’insuline. En post prandial, le

taux de glucose disponible augmente entrainant une sécrétion d’insuline au niveau de la membrane pour stocker

le glucose sous forme de glycogène. L’insuline (ligand) va se lier à son récepteur (protéine) et entrainer des effets

biologiques qui vont diminuer le taux sanguin de glucose.

- Sa dégradation

Exemple : L’acétylcholine (ligand) est un neurotransmetteur relargué au niveau synaptique. Il se lie via

une liaison protéine ligand à son récepteur (protéine) sur les cellules cholinergiques post synaptiques. Son action

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doit être de courte durée c’est pourquoi l’acétylcholine est hydrolysée par l’acétylcholinestérase en choline et

acétate.

- Sa disponibilité→ Régulation avec le caractère hydrophobe ou hydrophile du ligand

Exemple : Certaines hormones liposolubles ( =hydrophobes, exemple des hormones thyroïdiennes) ont la

capacité d'entrer dans la cellule et de se fixer sur des récepteurs intra cellulaires tels que les récepteurs nucléaires

(régulent la transcription) alors que d’autres hormones hydrophiles (exemple de l’insuline) ne peuvent traverser

la membrane cellulaire et interagissent avec des récepteurs membranaires.

Compétition - familles de ligands

Une même protéine peut avoir plusieurs ligands naturels avec des affinités variables. Presque tous les

ligands existent en effet sous forme de familles. L'effet biologique est donc modulé par cette compétition entre

les ligands susceptibles de se fixer sur la protéine liante.

Exemple : sulfamides (antibiotique). Les sulfamides sont des analogues structuraux de l'acide para-

aminobenzoïque ou PABA avec lequel ils entrent en compétition lors de la synthèse d'acide folique (vitamine B9)

qu'ils perturbent : réaction enzymatique réalisée chez la bactérie mais pas chez l’homme.

E) Anomalie congénitale

Certains variants pathogènes de l'ADN entraînent :

- Une absence de protéine (exemple : animaux KO, utilisés pour test symptômes) ex : souris ob/ob (gène

on inhibe la leptine= obésité car pas d’arrêt de la sensation de faim)

- Une protéine non fonctionnelle (exemple : mutation du site de liaison) : pas de liaison ou pas de

transconformation

- Un mauvais adressage (exemple : perte du signal d’adressage)

- Une destruction prématurée (exemple : mauvaise conformation)

La liaison avec le ligand devient impossible. La disparition de la capacité de liaison qui affecte un

organisme de façon héréditaire, avec disparition de l'effet biologique correspondant, est une preuve de

l'intervention d'une protéine liante.

Définition/point clé : différentes familles ➔ différentes affinités

Protéine : régulation en fonction de sa concentration, des isoformes et de son activité.

Ligand : régulation en fonction de sa concentration (biosynthèse, dégradation, disponibilité), de sa nature

(affinité variable) et de la compétition

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En dehors des variants pathogènes, des polymorphismes génétiques peuvent affecter la qualité de la

liaison et de l’effet biologique.

Ces polymorphismes sont responsables en partie de la différence entre les individus.

Si un phénomène biologique présente 2 de ces 5 caractères, on peut être sûr qu’il est basé sur une

liaison protéine-ligand.

III. PARAMETRES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND

A) Méthodes d’étude

Pour étudier les paramètres moléculaires de la liaison, on utilise un ligand marqué, mis en présence d'une

solution de protéines liantes de concentration initiale (PT) : méthode de dialyse à l'équilibre. Deux

compartiments sont séparés par une membrane semi-perméable qui ne laisse diffuser que le ligand libre.

Dans un compartiment, on met la protéine, dans l'autre le ligand. Seul le ligand libre va diffuser.

Un équilibre va s'établir entre les 2 compartiments pour le ligand libre, le ligand lié n'intervenant pas.

Un excès de substrat sera constaté dans le compartiment comportant la protéine, il correspond à la

quantité de ligand lié.

On porte ensuite une expression du ligand lié, (PL), (PL)/(LT), ou (PL)/(L) au choix, en fonction de la

concentration initiale de ligand (LT), et la courbe obtenue (hyperbole) tend vers un maximum, la saturation, où

(PL) = (PT).

Définition/point clé : problèmes au niveau des protéines, polymorphismes génétiques

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B) Equation de Scatchard

Cette équation permet de définir la capacité et la constante de dissociation. Seule la

liaison est prise en compte (pas l'effet biologique) et la liaison P-L obéit à la loi d'action de

masse

Sachant que l'on a :

Avec :

k1 : constante de vitesse d'association

k-1 : constante de vitesse de dissociation, dépend de la concentration en complexe.

KA : constante d’affinité = K1/K-1

KD : constante de dissociation =K-1/K1

Les constantes de vitesse dépendent des caractéristiques de la molécule. Elle traduit la capacité de la

protéine à se déplacer quelque part.

A l'équilibre, on a

On a autant de complexes formés que de complexes qui se dissocient.

(P) étant la concentration de sites protéiques inoccupés : (P) = (PT) - (PL), on en tire l'équation de

Scatchard, du 1er degré (pas à apprendre) :

On remarquera que le pourcentage d'occupation des sites a une expression de type Michaëlien : la

constante KD a la dimension d'une concentration. C'est celle du ligand lorsque la moitié des sites de liaison

protéique sont occupés. C’est la constante de demi-saturation.

C) Expression graphique de l’équation de Scatchard

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C'est une droite dont la pente est -KA et l'abscisse à l'origine est (PT), exprimée en concentration de ligand

lié.

schéma

D) Paramètres moléculaires de la liaison protéine-ligand

Ils sont déduits de l'équation de Scatchard :

(PT) représente la capacité totale de liaison. S'il y a n sites par molécule protéique, c'est n(PT). Elle est

comprise entre 10-6 M (µM) et 10-15 M (fM).

KA est l'affinité de la liaison qui varie de 104 à 1010 M-1. Elle est reliée à énergie libre de la réaction. On utilise

volontiers la constante de dissociation KD qui a la dimension d’une concentration. C’est la concentration du ligand

lorsque 50% des sites sont occupés (constante de demi-saturation). S’il y a n sites liant par molécules de protéines

liantes, on aura n PT

On distingue 2 types de liaison :

- Faible affinité, forte capacité (par exemple l’albumine du sérum),

- Forte affinité, faible capacité (par exemple les récepteurs d’hormones).

Une liaison est donc d'autant plus forte et spécifique que le complexe n'a pas tendance à se dissocier. Le

temps de rétention du ligand par la protéine est donc élevé et la structure protéique concentre le ligand.

DONC :

La liaison PL obéit à la lois d’action de masse

Elle est caractérisée par

- Constante de dissociation ➔KD constante de demi-saturation

- Capacité ➔Concentration de la protéine liante totale

Les liaisons PL forment la base moléculaire du vivant. La plupart des pathologies impliquent des interférences

avec des liaisons protéines ligands.

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IV. EXEMPLES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND

A) Enzymes

La protéine est l’enzyme, le ligand s'appelle le substrat.

Le site de liaison enzymatique est le site actif et la transconformation entraîne l'effet biologique que l’on

nomme effet catalytique.

L’étude de la liaison protéine-ligand est la meilleure introduction à celle de l’enzymologie.

B) Transporteurs solubles

Des protéines plasmatiques lient et transportent de petites molécules, telles la transcortine pour le

cortisol, la transferrine pour le fer, l’hémoglobine pour l'oxygène.

C) Transporteurs transmembranaires

La perméabilité sélective des cellules dépend de protéines de transport.

La liaison du ligand sur ces transporteurs entraîne l'internalisation spécifique du ligand.

D) Récepteurs

Les hormones vont agir via un récepteur spécifique.

Seules les cellules qui présentent ce récepteur peuvent répondre à cette hormone : on parle de cellules

cibles.

Cette expression sélective du récepteur est un mode de régulation du signal hormonal.

E) Anticorps

La réponse immunologique de l'organisme se fait selon deux modalités :

Immunologie humorale où les immunoglobulines solubles (anticorps) lient spécifiquement l'antigène,

suivie de phagocytose du complexe par le système réticulo-endothélial.

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Immunologie cellulaire où les lymphocytes détruisent les cellules considérées comme étrangères

(lymphocytes tueurs par des interactions cellulaires complexes).

F) Interactions supramoléculaires

Protéines-protéines :

- Structure quaternaire des protéines (hémoglobine).

- Complexes multienzymatiques (pyruvate déshydrogénase).

- Association d'enzymes agissant en séquence métabolique (métabolon).

- Chaperons (facilitant et protégeant le repliement des protéines).

- Assemblages structuraux (cytosquelette, ancrage).

Protéines-lipides (biomembranes, lipoprotéines plasmatiques).

Protéines-glucides (fibres conjonctives, adhésion cellulaire…).

Protéines-acides nucléiques :

- Ribosomes et polyribosomes.

- Chromatine (nucléosome).

- Nucléoles.

- Complexes de transcription.

- Particules d’excision épissage (RNP).

V. CONCLUSION

Ainsi, les liaisons protéines-ligands ou de façon plus large, les interactions moléculaires protéiques, sont

responsables des fonctions les plus élevées des organismes vivants. Les cascades de transmission de signaux

combinent toutes les interactions précédentes, elles tiennent sous leur dépendance les événements essentiels

de la vie des organismes (régulation hormonale, neurotransmission, développement et différenciation cellulaire,

cycle cellulaire et mort cellulaire programmée…). Leur perturbation est un des facteurs de nombreuses

pathologies.

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POINTS IMPORTANTS

I. ASPECTS MOLECULAIRES DE LA LIAISON :

➢ Reconnaissance moléculaire → choc élastique (pas d’effet biologique) ou liaison efficace (ajustement induit va entrainer la transconformation)

➢ 2 modèles : Koshland (main/gant, modèle dynamique, retenu à l’heure actuelle) et Fischer (clé/serrure, modèle statique)

➢ Transconformation → modification structurale de la protéine (lente à s’installer et lente à disparaitre)

➢ Transconformation fait apparaitre 2 états conformationnels extrêmes l’un totalement actif et l’autre inactif + beaucoup d’intermédiaires

➢ Transconformation génère l’effet biologique

II. CARACTERES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND

Si un phénomène biologique présente 2 de ces 5 caractères, on peut être sûr qu’il

est basé sur une liaison protéine-ligand.

➢ Spécificité → liaison protéine-ligand n’est pas aléatoire, il faut une concordance structurale. La spécificité peut être large, étroite ou exclusive.

➢ Saturation → pourcentage de liaison et effet biologique tendant vers un maximum : la saturation. Il y a une compétition entre plusieurs ligands pour un même site de liaison

➢ Inhibition spécifique → inhibition réversible qui peut être compétitive (analogues structuraux) ou non compétitive VS inhibition irréversible (poisons)

➢ Régulation → modulation de la réponde biologique à la liaison protéine-ligand en fonction

De la protéine : concentration, isoforme, activité (allostérie)

Des ligands : concentration (biosynthèse, dégradation, disponibilité),

nature (affinité), compétition

➢ Anomalie congénitale → entraine une absence de protéine, des protéines non fonctionnelles, un mauvais adressage et/ou une destruction prématurée de la protéine. La liaison avec le ligand est impossible.

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III. PARAMETRES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND

➢ Méthode de dialyse à l’équilibre. ➢ L’hyperbole tend vers la saturation où (PL)=(P) ➢ La constante KD constante de dissociation, a la dimension d'une

concentration ➢ 2 types de liaisons : faible affinité et forte capacité OU forte affinité et

faible capacité

➢

➢

➢

➢

IV. EXEMPLES DE LA LIAISON PROTEINE-LIGAND

➢ Enzymes-substrat → effet catalytique ➢ Transporteurs solubles : protéines plasmatiques- petites molécules ➢ Transporteurs transmembranaires → internalisation spécifique du ligand ➢ Récepteurs : hormones- cellules cibles portant des récepteurs spécifiques ➢ Anticorps : immunologie humorale ou cellulaire ➢ Interactions supramoléculaires : protéines peuvent se lier à d’autres

protéines, à des lipides, glucides ou encore à des acides nucléiques

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ED N°1 : LA LIAISON PROTEINE-LIGAND ET ENZYMOLOGIE

I. Protéine-ligand

A) Caractères de la liaison protéine-ligand

- Spécificité : pas aléatoire, large étroite ou exclusive, agonistes et antagonistes

- Saturation : sites de liaison sont limités. % de liaison, effet biologique hyperbolique

- Inhibition : souvent réversible (inhibiteurs compétitifs)

- Régulation physiologique :

o Protéine : isoformes, concentration, activité avec effecteur/ modifications, par allostérie

o Ligands : concentration, type (famille de ligands)

- Déficit congénital : mutation ou absence de la protéine

B) Thermodynamique enzymatique

La réaction se produit quand les molécules ont atteint un état activé par acquisition d’une quantité

d’énergie appelée énergie d’activation EA.

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Caractéristiques d’une enzyme : (catalyseur)

- Diminue l’énergie libre d’activation →

augmente la vitesse de réaction

- Respecte les conditions thermodynamiques

- Ne modifie pas l’équilibre de la réaction

- Retrouvée intacte à la fin de la réaction

- Action basée sur une liaison protéine ligand

II. Paramètres de la liaison protéine-ligand

A) L’équation de Scatchard

La loi d’action de masse :

(Retenir les ordres de grandeur)

Vitesse d’association v1 plus rapide que vitesse de dissociation v-1 → k1 supérieur à k-1

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Paramètres moléculaires de la liaison protéine-ligand :

La constante KD est la concentration du ligand qui permet d’occuper la moitié des sites. KD est appelée

constante de demi-saturation.

Avec (PT) : quantité de protéine

totale et (PL) : quantité de

protéine engagée dans une

liaison protéine-ligand

Equation de Scatchard du 1er degré :

B) Expression graphique de l’équation de Scatchard

Ka est la pente, Ka [Pt] est l'ordonnée à

l'origine (type ax+b)

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III. Enzymes-substrats

A) Interactions enzymes-substrats

Ce modèle respecte certains caractères : spécificité, saturation, inhibition spécifique et régulation.

Les holoenzymes ne seront pas

abordées en QCMs car trop

compliqué en P1

B) Le site actif : fixation et catalyse

C’est la région fonctionnelle qui fixe le substrat et qui permet de le transformer en produit. Il a donc un

rôle de fixation et de catalyse.

Il est formé d’acides aminés :

- Principaux ou dits « de contact »

- Auxiliaires ou « collaborateurs »

- Accessoires

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C) Représentations graphiques

1. Equation de Michaelis-Menten

Vi= Vmax/2 lorsque S=Km

Constante de Michaelis-Menten :

2. Le diagramme (/ représentation/ transformation) de Lineweaver-Burk

D) Mesure de la cinétique enzymatique

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Il faut connaître : la température optimale, le substrat et le produit, le coenzyme et l’effecteur, le pH

optimum, l’influence de la force ionique du milieu, la constante d’affinité et l’ordre de la réaction.

La mesure de l’activité enzymatique se traduira par une mesure de vitesse de réaction réalisée dans

les conditions optimales.

Unité internationale : quantité d’enzyme qui transforme 1µmole de substrat en 1 minute dans les

conditions optimales.

KATAL : quantité d’enzyme qui catalyse 1 mole de substrat par seconde. C’est une unité ENORME donc

l’activité est mesurée en pratique en µkatal. 1UI= 1/60 µkatal= 16,67 nkatals

E) Inhibiteurs

Inhibiteurs enzymatiques

(cinétique Michaelienne)

Traduction au niveau des schémas :

- Inhibition compétitive : Km est modifié mais la vitesse va toujours atteindre la vitesse maximale

Vmax

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- Inhibition non compétitive : Km reste le même mais Vmax change

Les courbes en rouge correspondent aux courbes de base.

F) Enzymes allostériques

1. Propriétés de l’allostérie

-

Allostérie : changement de la conformation d’une protéine à la suite de l’attachement d’un effecteur

allostérique.

Dans le cas des enzymes, l’interaction a lieu en dehors du site catalytique. La fixation de l’effecteur

allostérique entraîne une augmentation ou une diminution de l’activité enzymatique.

→ La courbe de saturation d’une enzyme allostérique a une allure sigmoïde.

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→ Couplée à un activateur, cette courbe reprend une allure michaelienne. Couplée à un inhibiteur, celle-ci devient

encore plus sigmoïde.

2. Définitions

- Désensibilisation : la sensibilité allostérique peut disparaître sous l’effet d’un traitement chimique ou

physique. La désensibilisation entraîne une normalisation de la cinétique enzymatique, qui revient donc a une

cinétique Michaelienne hyperbolique

- Dénaturation : perturbation de la stabilité conformationnelle de l’enzyme : modification de la

conformation de la protéine, de la protonation du site actif, etc

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POINTS IMPORTANTS

I. Protéine-Ligand :

➢ Caractères : spécificité, saturation, inhibition, régulation et déficit congénital (voir cours du Pr. Prunier)

➢ L’enzyme joue le rôle de catalyseur ➢ Thermodynamique enzymatique :

▪ Réaction endergonique→ nécessite un apport d’énergie extérieure (∆G>0)

▪ Réaction exergonique → réaction spontanée (∆G<0)

II. Paramètres de la liaison protéine-ligand

➢ Equation de Scatchard ➢ KD constante de dissociation est la concentration en ligand/ substrat. KD est

appelée constante de demi-saturation. ➢ A l’équilibre : v1=v-1 donc :

➢ 𝐾𝐴 =1

𝐾𝐷

III. Enzymes-substrats

➢ Les caractères des interactions enzymes-substrats : spécificité, saturation, inhibition spécifique et régulation

➢ Le site actif va permettre la fixation du substrat et se transformation en produit (=catalyse). Ce site actif est composé d’acides aminés principaux (=de contact), auxiliaires (=collaborateurs) et accessoires.

➢ Les représentations graphiques sont l’équation de Michaelis-Menten et le diagramme de Lineweaver-Burk.

➢ Mesure de la cinétique enzymatique → mesure de la vitesse de la réaction réalisée dans des conditions optimales très précises.

➢ Inhibiteurs compétitifs (augmentation du KM mais même VMAX) ou non compétitifs (diminution du VMAX mais même KM)

➢ La courbe de saturation d’une enzyme allostérique a une allure sigmoïde. Couplée à un activateur, cette courbe reprend une allure michaelienne. Couplée à un inhibiteur, celle-ci devient encore plus sigmoïde.

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ED N°2 : ANALYSE DES PROTEINES

I. Qu’est-ce qu’une protéine ?

Une protéine est un polymère d’AA liés par des liaisons peptidiques entre fonction carboxyle et fonction

amine. Il existe 20 AA dont 9 essentiels (on doit les apporter par l’alimentation car non synthétisés par

l’organisme). Les fonctions au sein d’une cellule sont assurées par les protéines :

C’est pour cela qu’il est nécessaire de pouvoir les analyser.

Types de blotting :

- Southern blot : détection de l’ADN, Edwin Southern, 1975

- Norther blot : détection de l’ARN, J. Alwine et G. Stark, 1977

- Western blot, détection des protéines, G. Stark, 1979, durant la même année, plusieurs autres

chercheurs ont travaillé sur cette technique comme H. Towbin et N. Burnet. En 1981, elle prend son

nom actuel.

II. Western blot= immunoblot des proteins

= Technique de détection des protéines spécifique dans un lysa cellulaire.

Cette technique est basée sur :

- La séparation électrophorétique des protéines en fonction de leur poids moléculaire (= leur taille)

- La détection des protéines avec des anticorps spécifiques de la protéine à analyser

A) Quelle utilisation ?

- Vérifier la présence ou l’expression d’une protéine dans des échantillons

- Vérifier la pureté d’une protéine

- Analyser la stabilité ou la dégradation d’une protéine

- Purifier une protéine

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B) Réaliser un Western blot

1. Etape 1 : Préparation des échantillons

On commence par décrocher les cellules de leur support de culture. On ajoute donc de la trypsine qui est

une protéase qui dégrade les protéines. On va ensuite centrifuger et éliminer tout le surnageant pour récupérer

le culot.

Lyser les échantillons :

- Tampons de lyse : contiennent des détergents (triton ou sodium dodécyl-sulfate) qui permettent de

lyser les cellules et libérer les protéines. On doit aussi toujours maintenir les protéines à 4°C.

- Anti-protéase : inhibent des protéases, donc inhibent la dégradation des protéines.

o Métalloprotéases inhibées par EDTA, EGTA

o Sérine protéases inhibées par phénylméthylsulfonylfluoride (PMSF), Aprotinine

o Cystéine protéases inhibées par leupeptine

En général, on utilise des cocktails de protéases.

- Inhibiteurs spécifiques : pour étudier une modification post-traductionnelle, il faut ajouter des

désacétylases et des anti-phosphatases :

o Sérine/thréonine phosphatases : sodium fluoride, sodium pyrophosphatase

o Tyrosine phosphatase inhibée par sodium orthovanadate

o Histone désacétylases : vorinostats, FK228

Il faut éliminer l’ADN génomique des échantillons, sinon la migration sur gel ne se fait pas correctement.

Pour cela, on centrifuge pour culoter l’ADN. Parfois on peut aussi casser l’ADN en petits fragments à l’intérieur

de notre lysat avec la sonication, ce qui permet de ne pas abîmer les protéines.

Dosage des protéines : Quantification des protéines avec une méthode colorimétrique. Plus la

concentration en protéines est importante, plus la coloration est augmentée et donc plus l’absorbance sera

importante.

o Méthode de Bradford : le bleu de Coomassie Brillan se lie à l’arginine, la tyrosine, l’histidine

et la phénylalanine. En solution, il a une forme cationique rouge qui absorbe à 470 nm. Lié

aux protéines, il a une forme anionique bleue qui absorbe à 595 nm. Sensible : 5-100 µg/mL

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o Méthode du biuret : elle prend son nom du composé biuret (H2NCONHCONH2). Le cuivre

sous forme de sel (CuSO4 = sulfate de cuivre) réagit avec les liaisons peptidiques en

conditions alcalines et la solution se colore en violet qui absorbe à 550 nm. Peu sensible, on a

besoin d’une concentration en protéine d’au moins 1-6 mg/mL

o Méthode de Lowry : c’est une modification de la méthode du biuret. Le cuivre réduit (Cu+) est

utilisé pour réduire le réactif de Folin-Ciocalteu qui passe du jaune au bleu. On lit l’absorbance

à 750 nm. Le cuivre (2+) se réduit en oxydant les AA tyrosine et tryptophane. Peu sensible

mais plus que le biuret : 100 µg-1,5 mg/mL

On prépare ensuite une gamme étalon avec la BSA (albumine bovine) et on trace la courbe étalon en

fonction des concentrations connues en protéines.

Les protéines sont très hétérogènes : tailles et charges très différentes, + structures tridimensionnelles

complexes. Or, le western blot ne sépare les protéines que par rapport à leurs tailles, on doit donc impérativement

uniformiser les protéines afin de permettre leur migration seulement en fonction de leurs tailles. Pour cela, on

ajoute un tampon de charge :

- Sodium dodécyl-sulfate (SDS) →dénaturant + donne une charge négative aux protéines

- Β-mercaptoéthanol ou dithiothréitol → réducteurs pour rupture des ponts disulfures

- Chauffage à 95°C

2. Deuxième étape : préparation du gel d’électrophorèse (SDS-PAGE)

SDS-Page : Sodium dodécyl sulfate polyacrylamide Gel électrophoresis.

Pour réaliser un gel polyacrylamide, il faut :

- Acrylamide et N, N Méthylène bisacrylamide

- Ammonium persulfate (APS), tétraméthyléthylènediamine (TEMED)

- SDS et tampon avec un pH stable

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Le gel est formé suite à la copolymérisation de l’acrylamide et du bisacrylamide. La réaction de

polymérisation se fait grâce au TEMED et l’APS, anions hyper réactifs qui enclenchent la polymérisation.

Lors de la polymérisation, des pores vont être formés dans le gel. La porosité est directement liée au

pourcentage de polyacrylamide : plus il est élevé, plus la taille des pores est petite. Plus les pores sont petits plus

on peut séparer les protéines de petites tailles. Une porosité de gel donnée n’est optimale que pour une gamme

de taille de protéines relativement réduite.

Taille des protéines en kDa % en polyacrylamide

5-40 20

15-70 12.5

40-200 8-6

Le gel d’électrophorèse est composé de deux parties :

- Le gel de stacking (de tassement) : sert à entasser toutes les

protéines (peu importe la taille) en bande très minces pour

augmenter la résolution de la séparation. Il a un % en

polyacrylamide très bas (5%)

- Le gel de séparation (migration) : sert à séparer selon le poids

moléculaire. Le gel de séparation à un pourcentage en

polyacrylamide variable, il dépend des protéines qu’on veut analyser :

o Petites protéines => gel à fort pourcentage (petits pores)

o Grosses protéines => gel à faible pourcentage (gros pores)

3. Troisième étape :

- Migration des échantillons à travers le gel

Application d’un champ électrique. Sous l’effet d’un champ électrique, les ions se déplacent. Les anions

migrent vers l’anode et les cations migrent vers la cathode. Les protéines migrent à travers le gel sous les effets

conjugués de la force exercée par le champ électrique et la force de friction exercées par le gel. Le gel entraîne les

protéines sur des membranes.

Plus le champ électrique est fort, plus la migration est accélérée.

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- Transfert des protéines sur les membranes : ce transfert permet de rendre les protéines accessibles

à la détection par les anticorps et de garder d’une façon stable les protéines séparées. Le transfert se

fait sous l’effet d’un champ électrique. Il existe deux types de membranes :

o PVDF : très résistante, nécessite une activation avec éthanol : liaisons hydrophobes et

électrostatiques

o Nitrocellulose : très résistante, pas d’activation : liaisons hydrophobes

Les protéines chargées négativement migrent vers l’anode sous l’effet d’un champ électrique.

4. 4ème étape :

- Saturation des sites non spécifiques :

But de la saturation : bloquer ou saturer la membrane avec les protéines pour qu’il n’y ait aucun espace

libre entre elles. Elle sert à empêcher la fixation non spécifique des anticorps.

Comment : en mettant la membrane dans une solution de BSA (bovine serum albumine) ou de lait demi-

écrémé. Ainsi, les protéines du lait ou du BSA se fixent de façon non-spécifique dans les espaces libres.

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- Hybridation avec l’anticorps primaire :

Incubation avec l’anticorps primaire pour reconnaître la protéine d’intérêt spécifiquement. Les anticorps

peuvent être issus de différentes espèces. Certaines espèces sont particulièrement employées pour produire des

anticorps : lapin, souris, rat, chèvre, mouton. L’anticorps primaire peut-être monoclonal ou polyclonal (reconnaît

plusieurs épitopes de l’antigène). La durée et la température d’incubation varie selon l’anticorps.

- Hybridation avec l’anticorps secondaire : Rinçage pour éliminer les anticorps primaires non-liés.

Incubation avec l’anticorps secondaire, qui est anti-espèce de l’anticorps primaire afin de reconnaître

les immunoglobulines de l’espèce dans laquelle l’anticorps primaire est produit.

L’anticorps secondaire sera couplé soit à :

o Une peroxydase pour détecter le signal avec la chimiluminescence

o Un fluorophore pour détecter le signal avec la fluorescence

5. 5ème étape : détection du signal

- Détection par chimiluminescence : si l’anticorps

secondaire est couplé à une peroxydase

- Détection par fluorescence : si l’anticorps est

couplé à un fluorophore

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- L’appareil de révélation est équipé de LED capable d’émettre de la lumière quand elle est parcourue

par un courant électrique et d’une caméra CCD (récepteur à transfert de charge).

6. Contrôles

- Un témoin négatif (absence de la protéine) et positif (présence de la protéine). Ça permet de dire que

l’anticorps primaire utilisé est bien spécifique de notre protéine cible.

- Un marqueur de taille pour savoir si la protéine cible est détectée à la bonne taille.

- Un marqueur de charge pour vérifier que la quantité chargée en protéines totales entre les différents

échantillons est la même.

III. Immunocytochimie

Méthode d’analyse des cellules in situ par une technique d’immunofluorescence. La technique permet

de révéler la protéine cible directement dans la cellule. On utilise un fluorochrome couplé à :

- Anticorps primaire : immunofluorescence directe

- Anticorps secondaire : immunofluorescence indirecte

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POINTS IMPORTANTS

IV. Qu’est-ce qu’une protéine ?

➢ Polymère d’acides aminés liés par des liaisons peptidiques entre fonction carboxyle et fonction amine

➢ 20 acides aminés dont 9 essentiels (non synthétisés par l’organisme)

V. Western blot= immunoblot des protéines

➢ Séparation des protéines selon leur poids moléculaire et détection des protéines avec des anticorps spécifiques

➢

VI. Immunocytochimie

➢ Méthode d’analyse des cellules in situ par une technique d’immunofluorescence (direct avec l’anticorps primaire, indirecte avec le secondaire)

➢ Permet de révéler la protéine cible directement dans la cellule

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ED N°3 : EXPLORATION DES MITOCHONDRIES

I. Origine des mitochondries

En 1857, Albert von Kolliker a révélé la présence de centaines de granules dans le cytoplasme des cellules

eucaryotes et en 1898, Carl Benda leur a attribué la dénomination « mitochondries », qui provient du grec mitos

pour filament et chondrion pour granule.

La microscopie électronique a montré que les mitochondries sont entourées d’une membrane. Ainsi,

cette observation a conduit à la théorie endosymbiotique, qui propose que les mitochondries dérivent de

procaryotes (bactéries) qui se sont établis au sein de cellules eucaryotes primitives.

Arguments en faveur de la théorie endosymbiotique :

- Double membrane

- ADN propre

- Réplication/ transcription de l’ADNmt indépendantes de l’ADNn

- Renouvellement des mitochondries indépendant du cycle

cellulaire

II. Propriétés de la mitochondrie

De quelques mitochondries à plusieurs milliers par cellules :

- Aucune pour les hématies

- Une dizaine pour les plaquettes

- 1000 pour les cellules hépatiques

- 30 à 40 % du volume des cardiomyocytes

Formes et tailles hétérogène :

- Granulaire (foie), filamenteuses (corticosurrénales)

- D’un µm à des dizaines de µm avec un diamètre d’environ 0,5 à 1µm

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Distribution cellulaire particulière :

- Entre les myofibrilles (cœur)

- Autour du flagelle du spermatozoïde

Alors qu’elles ont longtemps été représentées comme des organites indépendants, des études de

microscopie optique réalisées au cours des années 1990 ont montré que les mitochondries forment de grands

réseaux interconnectés très dynamiques.

Deux mécanismes dans le cycle des mitochondries :

- Fusion / fission, la fusion étant médiée par Mfn 1 ou Mfn 2 et Opa 1, et la fission étant médiée par

DRP1 et Fis 1

- Biogenèse (synthèse des mitochondries), par PGC1α et β/ mitophagie (dégradation des

mitochondries), par Pink et Parkin

III. L’ADN mitochondrial

A) Propriétés

Les mitochondries ont leur propre ADNmt, codant uniquement pour des

protéines de la chaîne respiratoire. Il ne contient pas d’introns.

En revanche, plusieurs protéines de la chaîne mitochondriale sont codées

par l’ADN nucléaire, de même que des milliers de protéines nécessaires au bon

fonctionnement des mitochondries. Tous les facteurs impliqués dans la

maintenance de l’ADNmt sont codés par l’ADNn. Ce sont par exemple des

protéines de la fusion/fission, de l’apoptose, du cycle de Krebs, de la

réplication/transcription/traduction de l’ADN mt.

L’ADNmt est un ADN double brin, circulaire, de petite taille (16569pb). Il

code pour 37 gènes :

- 13 ARNm

- 22 ARNt

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- 2 ARNr

La chaîne respiratoire est codée à la fois par l’ADN mt et par l’ADN n :

Il est transmis uniquement par la mère. L’ADN mt est présent en 1 à 10 copies par mitochondries selon

les types cellulaires. Les cellules contiennent donc des centaines à des milliers de copies de cet ADN.

Le taux de mutations de l’ADN mt est 6 à 7 fois supérieur que dans l’ADNn, car il ne contient pas d’histones

de protection, et il est proche de la chaîne respiratoire donc des radicaux libres. De plus, il n’a pas de mécanismes

de réparation.

B) Hétéroplasmie

Dans une cellule, l’ADN mt muté et l’ADN mt sauvage coexistent, c’est ce qu’on appelle l’hétéroplasmie.

A contrario, l’homoplasmie correspond au fait qu’il n’y ait qu’un seul type d’ADN mt dans une cellule. Selon le

taux d’hétéroplasmie, les différents tissus ne seront pas atteints de la même façon.

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IV. Diagnostic des maladies mitochondriales

A) Pathologies

Si on dépasse un certain seuil de copies mutées, les symptômes et les pathologies apparaissent.

Effet seuil

Les pathologies mitochondriales peuvent avoir pour origine des mutations de l’ADNmt ou de l’ADNn

Les maladies mitochondriales sont très hétérogènes. Les pathologies peuvent être liées à un

dysfonctionnement des mitochondries et de la chaine respiratoire.

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B) Diagnostic des maladies mitochondriales

Parcours de diagnostic : on n’a pas de test de dépistage spécifique, donc on a besoin d’une stratégie

diagnostic en entonnoir basée sur les éléments cliniques et biochimiques.

➔ Eléments cliniques : intolérance à l’exercice, transmission maternelle, atteinte des tissus qui

nécessitent beaucoup d’énergie : cœur

Tests réalisés lors de diagnostic des maladies mitochondriales :

- Test génétiques sur l’ADN mt pour rechercher des mutations, délétions, hétéroplasmie

- Exploration métabolique : dosage du lactate et du pyruvate dans le sang et le LCR. Si le dosage est

supérieur à 25, on a un défaut métabolique.

- Biopsie musculaire :

o Marquage cytochimique avec DAB qui vise la COX (identifie le complexe IV) et la succinate

déshydrogénase SDH (identifie le II) couplée au NTB

o Exploration de la chaîne respiratoire : de l’assemblage de la chaîne (BN-PAGE) et la

respiration cellulaire (oxygraphie)

- BN PAGE : ressemble au western blot, mais on ne dénature pas les protéines, elles sont natives

(protéines dénaturées dans le WB). On sépare les complexes selon leur poids moléculaire sur gel.

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- OXYGRAPHIE :

o De routine

o Non couplée à la synthèse d’ATP : on met au début de l’oligomycine qui va inhiber le complexe V

Ensuite, à l’aide des techniques de séquençage nouvelle génération, on détermine la position de la

mutation génomique.

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POINTS IMPORTANTS

VII. Origine des mitochondries

➢ Théorie endosymbiotique→ les mitochondries dérivent des procaryotes (bactéries)

VIII. Propriétés de la mitochondrie

➢ Nombre, taille, forme, distribution différente en fonction des cellules dans lesquelles les mitochondries sont retrouvées

➢ 2 mécanismes : fusion/ fission et biogenèse/mitophagie

IX. L’ADN mitochondrial

➢ L’ADNmt code pour les protéines de la chaine respiratoire

➢ Il ne comporte pas d’introns

➢ Il comporte 37 gènes : 13 ARNm, 22 ARNt et 2 ARNr

➢ Hétéroplasmie : l’ADN mt muté et l’ADN mt sauvage coexistent

X. Pathologies mitochondriales

➢ Les maladies mitochondriales apparaissent à un certain seuil → ≈70% de copies mutées

➢ Pas de tests de diagnostic spécifiques → diagnostic à partie de tests génétiques, d’exploration métabolique et de biopsie musculaire.

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ED N°4 : LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

I. C’est quoi la recherche scientifique ?

Investigation ou étude d’une situation ou d’un phénomène naturel pour valider une connaissance

existante ou obtenir une nouvelle connaissance.

« Tout grand progrès scientifique est né d’une nouvelle audace de l’imagination » J. Dewey

Ubn al-Haytham : fondateur de la méthode scientifique expérimentale

Ubn al-Haytam est mathématicien, physicien et philosophe. Il développe la méthode scientifique

expérimentale dans l’optique. Son expérimentation rigoureuse lui permet de traduire des phénomènes

d’optique sous forme de lois mathématiques.

Avec ses études du mécanisme de la vision, il montra que l’œil était un instrument d’optique, il

rationalisa les lois de la réflexion de la lumière sur une surface et il confirma la propagation rectiligne de la

lumière. Il pressentait déjà que la lumière avait une vitesse considérable mais finie.

Il fut l’un des premiers à énoncer les lois de la démarche scientifique : une méthode systématique et

implacable pour débarrasser son raisonnement de tout préjugé.

II. La méthodologie de recherche

A) 1ère étape : Observations/questions

Cette 1ère étape consiste à formuler une problématique de recherche.

L’observation : observer un phénomène ou un phénotype sans interférer ou modifier ces

observations. Certains moyens d’enquête ou d’observation peuvent être utilisés.

La question : elle donne des indications sur ce qu’on souhaite résoudre. Elle présente une pertinence

scientifique et/ou sociale et suscite la curiosité du chercheur.

Il y a souvent une question principale et des questions sous-jacentes. La question de recherche

principale doit être claire et précise. Elle doit également être réaliste et faisable.

B) 2ème étape : Formuler une hypothèse

La 2ème étape consiste à formuler une hypothèse. L’hypothèse est une réponse anticipée à la question

que l’on se pose. Avant de formuler l’hypothèse, on investit la littérature scientifique.

Explorer la littérature scientifique : réaliser l’inventaire et l’examen critique de ce qui a déjà été publié

sur le sujet étudié.

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Objectifs spécifiques :

- Identifier les concepts utiles au traitement du sujet

- Identifier les approches et les outils méthodologiques utilisés dans les travaux ultérieurs

- NE PAS REITERER LA MEME ETUDE

- Donner une direction à notre recherche et identifier notre hypothèse

Article scientifique= nouvelle connaissance

Article de revue= synthèse de tout ce qui a été fait ultérieurement.

En général, on cherche sur PubMed car très complet.

C) 3ème étape : Tester l’hypothèse (expérimentation)

Les expérimentations sont les stratégies mises en place pour tester l’hypothèse formulée. Les

modèles et les expériences de recherches doivent être en adéquation avec les capacités du chercheur : le

temps, les financements et la faisabilité. On répète plusieurs fois l’expérience pour s’assurer qu’elle conduit

toujours aux mêmes résultats.

L’expérimentation vise à déterminer une relation cause-effet pour confirmer ou infirmer

l’hypothèse. Pour choisir une expérimentation scientifique, il faut :

- Définir le modèle d’étude, qui doit s’approcher le plus possible de la réalité (cellules, animaux,…)

- Définir la population (échantillon)

- Savoir si on a besoin d’un groupe contrôle

- Définir les variables (dépendantes et indépendantes)

- Définir avec précision les mesures scientifiques qui vont être utilisées

D) 4ème étape : Observations à partir des résultats obtenus

Les mesures sont réalisées dans les mêmes conditions et d’une façon objective. Elles peuvent être

quantitatives ou qualitatives. Le même paramètre est observé/ mesuré. Lors des mesures, il faut limiter les

biais qui peuvent venir du choix de l’échantillon/ population, des outils et technologies utilisés et/ou du

manipulateur/chercheur

La qualité de la recherche est une question de :

- Validité : repose sur l’expérimentation (modèle paramètre évalué)

- Fiabilité : résultats doivent être reproductibles (analyse statistique des résultats)

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E) 5ème étape : Analyse des données (bio-informatique)

L’analyse des résultats nécessite deux phases :

- Résultats bruts : la lecture de ces résultats permet de constater les changements entre le début

et la fin de l’expérience.

- L’interprétation des résultats de l’expérience : la lecture se fait par comparaison entre le test et le

témoin. L’interprétation correspond à une analyse critique des différences entre les deux

échantillons. Seule une analyse critique des résultats peut aboutir à une conclusion.

F) 6ème étape : Conclusion

La conclusion rend compte des liens établis par l’expérience entre les résultats et le problème posé.

La vérification de l’hypothèse constitue la réponse au problème. Souvent la conclusion s’ouvre sur d’autres

questionnement et d’autres hypothèses.

G) Valorisation de l’étude

Cette valorisation se fait par la communication des résultats au public.

Communication orale :

- Congrès scientifiques et symposium

- Echanges avec le grand public

- Réunions de laboratoires, conseils scientifiques

Communication écrite :

- Publication dans des journaux scientifiques (reconnaissance par les pairs)

- Brevets

- Rapports de recherche

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- Mémoires de thèse

- Posters

Corps de l’article :

- Titre accrocheur

- Liste des auteurs : premier = celui qui fait l’étude ; dernier = celui qui a encadré

- Résumé

- Introduction

- Matériel et méthodes

- Résultats

- Discussion et conclusion : comparaison des résultats par rapport aux études antérieures

III. La recherche fondamentale

La recherche fondamentale (ou la recherche pure) est alimentée par la curiosité du chercheur et par

l’intérêt pour une question scientifique. Son but principal est d’élargir les connaissances, donc de produire

des savoir et de comprendre les phénomènes naturels. Ses résultats sont imprévisibles. Elle constitue la base

pour la recherche appliquée.

IV. La recherche appliquée

La recherche appliquée est une étude scientifique qui vise à résoudre un problème pratique. Elle est

utilisée afin de trouver des solutions aux problèmes de tous les jours, pour guérir des maladies, pour

développer des technologies innovantes, …

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V. Appréhender la complexité du vivant à l’ère des « Omiques »

L’approche multi-omique vise à appréhender et à comprendre la complexité du vivant dans son

ensemble. On obtient une vue globale du phénotype étudié. Cette approche génère des données massives et

complexe qui ne peuvent être analysées qu’à l’aide d’outils informatiques.

A) La génomique : étude du génome

Identification de variants en lien avec des maladies et aux réponses aux traitements. Des milliers de

patients et de contrôles sont génotypés pour des millions de variants. La différence entre les contrôles et les

patients est considérée comme un marqueur et le lien est ainsi établi entre variant et maladie.

B) La transcriptomique : étude du transcriptome

Etude de l’ensemble de l’ARN :

- Quantitativement : niveau d’expression

- Qualitativement : transcrits présents

L’ARN est la molécule intermédiaire entre le génome et les protéines. Il est considéré comme le

premier marqueur fonctionnel de l’ADN.

C) La protéomique : étude du protéome

Consiste à étudier l’ensemble des protéines d’un échantillon. Les objectifs de la protéomique sont

d’identifier et de quantifier les protéines présentes dans un échantillon à un instant T. Le produit final de

l’ADN étant les protéines, on considère que ces études révèlent l’état le plus proche de ce qui se passe

réellement dans un échantillon, plus que le génome ou le transcriptome.

D) La métabolomique

Caractérise l’ensemble des métabolites retrouvés dans un échantillon biologique à un instant T avec

la méthode d’extraction X. On identifie la molécule et sa concentration dans l’échantillon. Deux approches :

- Ciblée : on identifie seulement les molécules souhaitées

- Non ciblée : on identifie toutes les molécules

L’intégration de toutes les données massives des omiques permet de comprendre la complexité du

vivant dans son ensemble. On peut personnaliser les traitements selon les signatures multi-omiques des

patients.

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POINTS IMPORTANTS

XI. C’est quoi la recherche scientifique ?

➢ Ubn al-Haytham est le fondateur de la méthode scientifique expérimentale

XII. La méthodologie de recherche

➢

XIII. La recherche fondamentale

➢ Son but est d’élargir les connaissances, donc de produire des savoir et de comprendre les phénomènes naturels. Ses résultats sont imprévisibles.

XIV. La recherche appliquée

➢ Etude scientifique qui vise à résoudre un problème pratique

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XV. Appréhender la complexité du vivant à l’ère des « Omiques »

➢ Génomique : étude des génomes ➢ Transcriptomique : étude du transcriptome ➢ Protéomique : étude des protéines ➢ Métabolomique : étude des métabolites

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QCM 1 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Le modèle de Fisher (main/gant) est un modèle dynamique, retenu par les chercheurs à notre époque B) Le modèle de Koshland (clé/ serrure) est un modèle statique C) La structure 3D de la protéine est présente sous 2 états conformationnels extrêmes : l’un totalement

actif et l’autre totalement inactif D) La transconformation est lente à apparaitre mais disparait rapidement après rupture du complexe E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 2 – CONCERNANT LE WESTERN BLOT, LAQUELLE (LESQUELLES) DES PROPOSITIONS CI-DESSOUS

EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) La séparation électrophorétique des protéines se fait en fonction de leur structure spatiale B) La méthode de Bradford est une technique sensible qui utilise le bleu de Coomassie Brillan C) La méthode de Lowry est une modification de la méthode de Bradford D) Le Β-mercaptoéthanol est un réducteur de ponts disulfures E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.


A) Les protéines du lait ou du BSA permettent la saturation des sites non spécifiques B) L’anticorps secondaire est une sous-espèce de l’anticorps primaire C) On utilise la détection par fluorescence si l’anticorps primaire est couplé à un fluorochrome D) On utilise la détection par chimiluminescence si l’anticorps secondaire est couplé à une peroxydase E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 4 – CONCERNANT L’ADN MITOCHONDRIAL, LAQUELLE (LESQUELLES) DES PROPOSITIONS CI-

DESSOUS EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) La chaine respiratoire est codée uniquement par de l’ADNmt B) L’ADNmt code pour 37 gènes C) L’ADNmt ne contient pas d’introns, tout comme l’ADNn D) L’hétéroplasmie entraine systématiquement des pathologies E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 5 – CONCERNANT LES MALADIES MITOCHONDRIALES, LAQUELLE (LESQUELLES) DES

PROPOSITIONS CI-DESSOUS EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Les maladies mitochondriales sont transmises par les deux parents B) Les pathologies mitochondriales peuvent avoir pour origine des mutations d’ADNmt et/ou d’ADNn C) Il n’y a pas de tests de dépistage spécifiques aux maladies mitochondriales D) Le diagnostic des maladies mitochondriales peut se faire à partir des tests génétiques, de l’exploration

métabolique et de biopsie musculaire E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

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Exercice 1 :


La plupart du temps, il y a ……. car les conditions ne sont pas réunies pour que l’interaction se fasse.

La liaison n’aura donc pas d’effet biologique car la liaison protéine-ligand n’est pas formée.

La liaison est ……. lorsque le ligand adopte la configuration optimale (bon ………) et que le site de

liaison de la protéine liante s'ajuste exactement à ce ligand (……. …………). Cette fois, la liaison va entraîner

un …… ……….

Il faut une ……… ………. entre le ligand et la protéine. La liaison protéine-ligand n’est pas aléatoire, le

ligand va se fixer sur une …….. ……….

Cette reconnaissance moléculaire efficace permet la …………… ou changement de conformation de

la protéine liante.

Exercice 2:


Spécificité :

Saturation :

Inhibition spécifique :

Régulation :

Anomalie congénitale :

Exercice 3 :

Rappeler les 6 différentes étapes de la recherche scientifique :

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A) FAUX, inversion dans les items A et B : Fischer= modèle clé/serrure et Koshland= modèle main/gant B) FAUX C) FAUX, la structure 3D OSCILLE entre ces deux états → il y a une multitude d’états intermédiaires D) FAUX, la transconformation est aussi lente à disparaitre qu’à apparaitre E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 2 – CONCERNANT LE WESTERN BLOT, LAQUELLE (LESQUELLES) DES PROPOSITIONS CI-DESSOUS


A) FAUX, la séparation se fait en fonction de leur poids moléculaire B) VRAI C) FAUX, la méthode de Lowry dérive de la méthode de Biuret D) VRAI E) FAUX


A) VRAI B) FAUX, l’anticorps secondaire est l’ANTI-espèce de l’anticorps primaire C) FAUX, c’est l’anticorps secondaire qui est couplé au fluorochrome D) VRAI E) FAUX

QCM 4 – CONCERNANT L’ADN MITOCHONDRIAL, LAQUELLE (LESQUELLES) DESPROPOSITIONS CI-

DESSOUS EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) FAUX, les protéines de la chaine respiratoire sont codées l’ADNmt ET l’ADNn B) VRAI C) FAUX, vrai pour l’ADNmt mais l’ADNn contient des introns D) FAUX, les pathologies arrivent autour d’un seuil de 70% de copies mutées E) FAUX

QCM 5 – CONCERNANT LES MALADIES MITOCHONDRIALES, LAQUELLE (LESQUELLES)

DESPROPOSITIONS CI-DESSOUS EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) FAUX, les maladies mitochondriales sont transmises uniquement par la mère B) VRAI C) VRAI D) VRAI E) FAUX

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Exercice 1 :


La plupart du temps, il y a choc élastique car les conditions ne sont pas réunies pour que l’interaction

se fasse. La liaison n’aura donc pas d’effet biologique car la liaison protéine-ligand n’est pas formée.

La liaison est efficace lorsque le ligand adopte la configuration optimale (bon conformère) et que le

site de liaison de la protéine liante s'ajuste exactement à ce ligand (ajustement induit). Cette fois, la liaison

va entraîner un effet biologique.

Il faut une concordance structurale entre le ligand et la protéine. La liaison protéine-ligand n’est pas

aléatoire, le ligand va se fixer sur une protéine spécifique.

Cette reconnaissance moléculaire efficace permet la transconformation ou changement de

conformation de la protéine liante.

Exercice 2 :


Spécificité : La liaison protéine-ligand n'est pas aléatoire. Elle implique une concordance structurale entre le ligand et

une zone étroite de la protéine, le site de liaison.

Saturation : transconformation maximale, tous les sites de liaisons sont occupés

Inhibition spécifique : des inhibiteurs peuvent empêcher la liaison protéine-ligand de se former

Régulation : modulation extrêmement fine de la réponse biologique à une liaison protéine-ligand.

Anomalie congénitale : des problèmes génétiques ou des polymorphismes peuvent entrainer des disfonctionnements

au niveau des protéines. La liaison protéine-ligand ne peut plus se former.

Exercice 3 :

109

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CHAPITRE N°2 : LES ENZYMES LES ENZYMES SONT DES CONSTITUANTS ESSENTIELS DES ORGANISMES.

Elles dirigent les processus métaboliques des organismes et participent à la structure de la matière

vivante.

L’enzymologie clinique est un élément important des investigations paracliniques en pathologie.

Les enzymes sont majoritairement des molécules protéiques qui ont parfois besoin de cofacteurs pour

fonctionner. On distingue les homo-enzymes constituées uniquement d’acides aminés et les hétéro-

enzymes constituées d'une partie protéique nommée apoenzyme associée à une partie non protéique

nommée cofacteur, groupement prosthétique ou coenzyme. On a aussi les ribozymes ou les abzymes qui

sont des enzymes particulières.

→ Les enzymes présentent tous les caractères de la liaison protéine-ligand :

❖ Spécificité

❖ Saturation

❖ Inhibition spécifique

❖ Régulation, autant pour l'activité que pour la synthèse

❖ Déficit congénital entraînant une "erreur innée du métabolisme" héréditaire

Il faut au moins 2 de ces 5 caractères pour que le phénomène biologique soit basé sur une liaison protéine-ligand.

→ Les enzymes transforment leur substrat en produit :

La protéine liante s’appelle enzyme et le ligand s’appelle

substrat.

L’enzyme se fixe à son substrat : on a formation d’un

complexe enzyme-substrat.

Dans un deuxième temps on a l’effet biologique avec la

formation d’un produit à partir du substrat qui va être libéré

de l’enzyme, l’enzyme se retrouve à l’état libre (sorte de

cycle) c’est à dire elle peut à nouveau fixer un substrat.

Cette réaction s’appelle la catalyse.

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110


→ Représentation schématique de ce qui se passe au cours du temps :

En ordonné la concentration et en abscisse le temps :

Lorsque l’on met l’enzyme E en présence d’un substrat S, le

substrat va être transformé en produit.

On va donc avoir une disparition du substrat et de l’enzyme libre

au cours du temps. En revanche on va avoir une synthèse du

produit.

On a donc la formation d’un complexe enzyme-substrat.

En rose le produit est nul au temps 0.

I. PROTEINE ENZYMATIQUE

A) Constitution chimique des enzymes

→ Les enzymes sont majoritairement des protéines. Une enzyme est purifiée, caractérisée, hydrolysée, dénaturée et cristallisée comme une protéine.

Homo-enzymes : Enzymes constituées uniquement de protéines.

Hétéro-enzymes : Enzymes qui ont besoin d’autres facteurs pour fonctionner qui ne sont pas forcément

protéiques.

→ L’hétéro-enzyme est alors constituée de 2 parties :

− Apoenzymes = partie protéique

− Cofacteurs = partie non protéique (groupement prosthétique, coenzyme…)

Particularités :

− Ribozymes (pas des protéines mais des ARN)

− Abzymes

Des substances autres que les protéines enzymatiques peuvent présenter des activités enzymatiques, tels de

rares anticorps (abzymes) et certains ARN (ribozymes).

Cofacteurs

▪ Certaines enzymes fonctionnent avec des coenzymes ou cofacteurs (sans eux l’enzyme n’est pas

fonctionnelle).

▪ Les coenzymes ou cofacteurs sont des métabolites non protéiques & de faible masse moléculaire

comparée à la masse moléculaire des enzymes :

− Les coenzymes ont des fonctions d’accepteurs et de transporteurs radicaux libérés au cours de la

catalyse et qui la facilite.

111

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− Elles agissent à faible concentration et doivent, comme les enzymes être régénérées à la fin d’une

réaction ou d’une séquence de réactions.

− Elles sont libres ou associées à l’enzyme. (FAD associé alors que NAD libre)

→ Les coenzymes fonctionnent de deux façons :

▪ Groupement prosthétique : si la liaison est COVALENTE (ex : FAD)

▪ Co substrat : si la liaison est plus faible et qu’il se comporte plus comme un ligand (ex : NAD)

COFACTEURS VITAMINIQUES

De nombreuses vitamines justifient ainsi leur impact en biologie, mais doivent être au préalable transformées

en coenzymes.

Vitamines du groupe B

- PP (NAD+, NADP+)

- B6 (phosphate de pyridoxal)

- B1 (thiamine pyrophosphate)

- B9 (tétrahydro folate) → synthèse des bases nucléiques

- B2 (FMN, FAD)

- B12 (méthyl et désoxyadénosyl Cbl)

- B5 (Coenzyme A, phosphopantéthéine)

- H (biotinyl-lysyl enzymes)

Vitamine C, vitamine K

COFACTEURS IONIQUES

Il peut s'agir des ions banals de l'organisme (Ca++, Mg++, Cl-, K+), de cations métalliques moins abondants (Fe++, Cu++, Zn++) ou des oligo-éléments qui justifient ainsi leur importance biologique (Se, Mn++, Mo++).

COFACTEURS HEMINIQUES

Les hémo-enzymes portent un groupement prosthétique ferro-porphyrinique (catalase).

COFACTEURS NUCLEOTIDIQUES

Essentiellement l'ATP, mais aussi les autres nucléosides triphosphates, des activateurs de substrats (UDP glucose, CDP choline), et des coenzymes vitaminiques, dans la molécule desquels les nucléotides entrent pour partie (NAD+, NADP+, FAD, Coenzyme A).

AUTRES COFACTEURS

Protéiques coenzymatiques (cytochromes), acides nucléiques (ribosomes) ou phospholipides (membranes), dont l'action tient plus de l'interaction macromoléculaire que d'un véritable rôle coenzymatique.

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112


B) Site actif A) PREUVES DE SON EXISTENCE

La notion qu'une partie discrète de l'enzyme, complémentaire du substrat au point de vue structural, est

responsable de l'activité catalytique vient de :

− La taille comparée des enzymes et de la plupart des substrats

− La spécificité des substrats, agonistes et antagonistes compétitifs

− Le phénomène de saturation

− L'action des poisons

− La digestion du tiers de la papaïne sans que l'activité disparaisse

− La connaissance de la structure tridimensionnelle pour certaines enzymes.

B) CONFIGURATION DU SITE ACTIF

❖ Les enzymes sont protégées par leur substrat contre la dénaturation.

❖ Le site actif réunit des acides aminés éloignés les uns des autres dans la structure primaire.

❖ Le site actif de l'enzyme est la région fonctionnelle de la molécule qui "accueille" le substrat permettant

ainsi sa transformation.

❖ Il occupe une part relativement réduite du volume total d'une enzyme (image)

❖ Le site actif se trouve généralement dans une profonde fissure de la structure tri-dimensionnelle de

l’enzyme et constitue une cavité sorte de microenvironnement dont le caractère polaire augmente les

forces de liaisons au substrat.

→ Il est entouré d’une poche hydrophobe au fond de cette fissure (Acides aminés accessoires)

❖ L’action chaotropique de l’eau y est nulle : la présence d’eau au niveau de ce site diminuerait les forces

entre atomes constitutifs des molécules d’enzymes et de substrat, en contractant des liaisons

hydrogènes avec ses deux partenaires. Il se produirait alors une compétition entre le substrat et l’eau pour

occuper le site actif de l’enzyme d’où une fragilité du complexe et une perte d’efficacité enzymatique

❖ Les transferts électroniques nécessaires à la réaction peuvent s’y dérouler

à l’abri de l’eau.

− Le substrat est lié aux enzymes par des forces relativement faibles.

− Il s'agit le plus souvent de liaisons hydrogènes qui permettent d'orienter

le substrat et jouent un rôle essentiel dans le degré de spécificité entre

l'enzyme et son substrat.

C) COMPOSITION DU SITE ACTIF

Le site actif présente généralement 2 parties : un site de positionnement qui

permet de maintenir et d’orienter le substrat et un site catalytique qui réalise la catalyse.

→ Le site actif réunit des ACIDES AMINÉS éloignés les uns des autres dans la structure primaire

→ On distingue 3 catégories d'acides aminés au niveau du site actif selon leur rôle dans l'activité.

113

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1) ACIDES AMINES PRINCIPAUX OU DITS DE "CONTACT"

Ils assurent la liaison temporaire du substrat au site actif par des liaisons de faible énergie (ioniques faibles,

hydrogène, Van der Waals). Par leur réactivité, ils participent aux transferts électroniques de la réaction et

certains de leurs atomes peuvent s'échanger individuellement avec ceux des substrats. Ce sont des acides

aminés polaires SER, GLU, ASP, LYS, ARG, HIS, CYS, TYR. Ce sont des acides aminés souvent chargés qui

se trouve dans des zones chargé hydrophobes ne permettant pas la réaction avec l’eau. Quand s'y ajoutent

un ou plusieurs coenzymes (ions, coenzymes nucléotidiques et vitaminiques), on parle de centre catalytique

En clair ils créent les charges et font l’interaction avec le substrat

Ne pas connaître la liste des ACIDES AMINÉS !!

2) ACIDES AMINES AUXILIAIRES OU "COLLABORATEURS"

Ils sont chargés. Ils créent un environnement favorable à l'action catalytique (+ orientation du substrat) :

− Les uns, par une zone polaire de signe approprié, orientent les substrats

− Les autres participent à la zone hydrophobe (apolaire) centrale.

3) ACIDES AMINES ACCESSOIRES

Configuration correcte de la protéine + substrat a la bonne place. : ils permettent la réaction du site actif et

son environnement

Ils assurent le maintien de la structure tertiaire par l’intermédiaire d’autres liaisons et repliement stabilisant

le site actif et n'interviennent pas directement dans l'activité.

Exemple de la ribonucléase

HIS 119 et HIS 12 : acides aminés de contacts → Polaires : vont réagir directement avec le substrat

Acides aminés auxiliaires : constituent la zone hydrophobe et qui permettent d’isoler cette zone de l’eau et

de l’environnement extérieur et exacerbe les charges des histidines

Acide aminés accessoires qui vont permettre le repliement et qui permettent également la liaison protéine

ligand : création d’une zone basique pour bonne orientation du substrat (chaotropie nulle)

Le reste en blanc : d’autres ACIDES AMINÉS qui vont simplement permettre la formation correcte de la

protéine.

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114


II. CATALYSE ENZYMATIQUE

Les réactions essentielles pour le fonctionnement d'un être vivant sont lentes voire impossibles sans la

présence des catalyseurs biologiques que sont les enzymes. Ces macromolécules accélèrent les réactions voir

assurent un couplage physique entre deux réactions pour permettre de maintenir les systèmes biologiques

compatibles avec son fonctionnement. L'étude de la cinétique enzymatique vise à comprendre les

mécanismes réactionnels mais aussi à établir de manière quantitative comment une enzyme est capable

d'accélérer spécifiquement une réaction chimique.

A) Caractères généraux de la catalyse enzymatique

A) DEFINITION DE LA CATALYSE

→ La catalyse est l'action d'un catalyseur sur une transformation chimique.

→ Ce catalyseur réalise les actions suivantes (présente 4 caractéristiques) :

− Il augmente les vitesses de réaction.

− Il respecte les conditions thermodynamiques ( ne changent pas les caractères initial thermodynamique = une réaction endergonique le restera )

−

− Il se retrouve intact en fin de réaction (peut faire un nouveau cycle)

− Il agit à l'état de trace : concentration faible (en principe, car il est des cas où la quantité de protéines

enzymatiques est loin d'être négligeable).

B) EFFETS DE LA CATALYSE

Seuls les 2 premiers effets de sa définition nous intéressent ici : accroissement de la vitesse de réaction et

respect des conditions thermodynamiques.

Energie d’activation

On associe le système biologique à un système, ce système va pouvoir échanger avec le milieu extérieur

(chaleur, énergie …). Ce système et ce milieu extérieur est compris dans un univers, dans un système plus

global.

On va notamment avoir des échanges d’énergie :

→ Energie de l’univers : constante

→ Le système va avoir une énergie totale nommée H (l’enthalpie) séparé en 2 sous unités :

115

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− G : énergie libre du système qui va pouvoir s’échanger avec le milieu extérieur → c’est sur cette

énergie que se joue le fait que ce soit une réaction qui donne de l’énergie ou qui reçoit de l’énergie

(endergonique ou exergonique)

− L’entropie S : en revanche ne va pas changer.

Lien avec le système catalytique :

Les chocs élastiques sont plus fréquents que les chocs efficaces c'est-à-dire que les molécules se rencontrent,

se percutent et restent inchangées. Certaines collisions sont plus violentes, les chocs entrainent alors des

modifications électroniques qui entrainent un déplacement d’électrons puis une rupture ou une formation de

liaisons. Dans ce cas le choc est efficace car il modifie les entités chimiques.

Pour que le choc soit efficace (≠ élastique) il faut que le système passe par un niveau énergétique plus

élevé : énergie libre d’activation.

Exemple de la décomposition de l’eau oxygénée qui est facilitée par la catalyse :

Transformation d’une molécule d’eau oxygénée en eau et oxygène.

Spontanément, sans choc la transformation se fait avec une énergie G=18Kcal/mol.

Elle peut se faire spontanément mais demande un échange énergétique avec le milieu extérieur qui

n’est pas négligeable

Avec une catalase on a besoin de moins de 2kcal/mol car les conditions sont plus faciles pour la réalisation.

− On va pouvoir faire plus efficacement les liaisons et donc l’effet biologique.

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116


− Les enzymes vont permettent d’augmenter la vitesse de réaction en abaissant l’énergie libre

d’activation.

C) ACCROISSEMENT DES VITESSES DE REACTION

Pour exprimer cette réaction on regarde la vitesse de formation de cette réaction. Elle peut être mesurée

par la disparition du substrat en fonction du temps ou par l’apparition du produit en fonction du temps.

➢ Les enzymes augmentent la vitesse de réaction en abaissant l’énergie libre d’activation.

➢ Une décroissance de ΔGA de 1 ,5 Kcal/ mole multiplie la vitesse de réaction par 10.

D) RESPECT DES CONDITIONS THERMODYNAMIQUES

On ne joue pas sur l‘énergie libre, il existe un équilibre thermodynamique qu’on soit en présence ou non

d’enzymes (bien que l’énergie libre d’activation est abaissée).

A l’équilibre on a une réaction si on a beaucoup de substrat qui atteint un équilibre de saturation de façon

stable.

Les variations des énergies libres sont dépendantes de notre activité du couple enzyme/substrat. Ici, on a à

l’équilibre de la réaction, la constante d’activité K qui dépend bien des conditions thermodynamiques.

117

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Exemple de la réaction catalysée par la

phosphohexoisomérase : elle catalyse l’isomérisation du glucose

6 phosphate en fructose 6 phosphate. Que l'on parte de l’un ou

de l’autre réactant, l'équilibre n'est pas changé par l'enzyme et

dépend du seul DG0 de la réaction. Il est atteint plus rapidement

en présence de l'enzyme, qui accélère aussi bien la réaction directe

que la réaction inverse. A l'équilibre on a 65.8% de G6P et 34.2%

de F6P et NON 50% de chaque réactif

Que l’on parte de l’un ou de l’autre substrat, on aboutit au bout de 20 minutes au même équilibre.

L’enzyme permet l’équilibre mais ne va pas le modifier.

➢ Une réaction enzymatique ne change pas les conditions d’un équilibre.

➢ Elle accélère aussi bien la réaction directe que la réaction inverse.

→ Certaines réactions ne sont pas réversibles.

→ Une chaine métabolique peut être irrémédiablement dirigée dans un seul sens lorsqu’une étape

irréversible est franchie.

→ Cela dépend :

− Du déséquilibre substrat/ produit (B)/(A)

− De l’obstacle thermodynamique (ΔG0)

− Des caractéristiques moléculaires de l’enzyme (Km)

→ Pour renverser le courant il faut :

− Soit déséquilibrer le rapport produit/substrat

− Soit coupler la réaction endergonique avec l’hydrolyse exergonique de l’ATP

En général il faut pour cela une enzyme différente. Nombreuses sont les voies métaboliques ou, dans une

majorité des réactions à l’équilibre, il y a quelques étapes décisives. Un couplage d’enzyme c’est à dire, selon

la régulation, le métabolisme vers la synthèse ou la dégradation, avec un certain recyclage des substrats.

Le premier principe de thermodynamique stipule que l'énergie

de l'univers (système + milieu extérieur) est constante.

Donc les échanges d'énergie au cours d'une transformation

sont égaux à la variation d'enthalpie du système.

ΔG =ΔH -TΔS

• ΔG Variation d'énergie libre du système

• ΔH Variation d'énergie totale du système ou enthalpie. Le

système peut échanger sous forme de chaleur ou de

"travail"

• ΔS Variation d'entropie. Elle correspond à la mesure du

désordre du système.

• T ΔS Représente l'énergie non transférable au milieu extérieur.

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118


Par convention toute énergie reçue par le système est considérée comme positive, elle est négative

lorsqu'elle est perdue. Lors de la transformation chimique l'énergie libre peut :

− Augmenter, la réaction est Endergonique (_G>0), il faut fournir de l'énergie au système pour qu'elle

puisse se réaliser. Elle est thermodynamiquement possible seulement avec un apport d'énergie

extérieur (couplage)

− Diminuer, la réaction est Exergonique (_G<0), de l'énergie est donnée au milieu extérieur. Elle est

thermodynamiquement possible spontanément.

Une enzyme ne permet pas de reverser le cours d’une réaction réversible

A l'équilibre la variation d'enthalpie libre est nulle.

Exemple :

Enzymes différentes pour la réaction directe et la réaction inverse :

Glucose se transforme en glucose 6 phosphate : réaction qui nécessite de l’énergie donc couplage avec la

décomposition Exergonique de l’ATP

Les enzymes respectent les conditions thermodynamiques des réactions biochimiques. Elles ne modifient

pas les conditions d'un équilibre et ne permettent pas le renversement de réactions irréversibles. De même

une réaction endergonique ne pourra pas se réaliser spontanément même en présence d'une enzyme, elle

devra être associée à une réaction exergonique.

B) Cinétique enzymatique

→ La cinétique enzymatique étudie la vitesse des réactions enzymatiques.

→ C’est lorsqu’on étudie la variation de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction de la

concentration initiale en substrat.

→ Pour caractériser l’enzyme, on étudie la cinétique enzymatique : Valable pour un seul couple

enzyme/substrat

▪ Une courbe de saturation est réalisée

▪ Des paramètres moléculaires sont calculés (capacité, affinité, vitesse maximales)

▪ Les conditions expérimentales sont précisées :

− Conditions optimales (l’enzyme va pouvoir fonctionner correctement) & reproductibles

− Conditions reproductibles donc initiales

119

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A) COURBE DE SATURATION

Expression de la vitesse de réaction :

Disparition du substrat

Apparition du produit

La vitesse initiale (Vi) de la réaction augmente avec la concentration en substrat (S) et tend vers une

vitesse maximale (Vmax). C’est la saturation de l’enzyme par son substrat. (Plus on apporte du substrat

plus on va en transformer)

La vitesse maximale est une vitesse initiale car elle dépend de la concentration initiale en substrat (plus il y

aura de substrat plus Vmax sera élevée)

Définition de la vitesse initiale :

➢ On parle de Vi lorsque moins de 10% du substrat a été consommé.

Pourquoi la vitesse initiale ?

➢ Les conditions sont connues et reproductibles,

➢ Enzyme active (S) connue

➢ (P) négligeable et non inhibiteur (négligeable car initial c’est à dire pas encore formé)

→ Coubre 1 : Peu de substrat donc peu de produit créé et la quantité fini par être stable

→ Courbe 2 : Avec plus de substrat, on voit apparaitre une concentration en produit plus importante

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120


→ Courbe 3 : Vitesse qui ne bouge presque plus → Saturation → Vitesse maximale ( mais une vitesse initial

Variation de Vi en fonction de [S]

Lorsqu’on étudie la variation de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction de la concentration

initiale en substrat, on voit la courbe évoluer de façon hyperbolique vers une vitesse maximale (Vmax) qui

représente la saturation de l’enzyme par son substrat.

Cette courbe de saturation est l’expression graphique de l’équation de Michaelis Menten.

Km : constante de Michaelis

On a toutes les vitesses initiales obtenues en fonction de la concentration en substrat. A un moment on a

tellement de substrat qu’il sature totalement l’enzyme. On pourra rajouter du substrat mais l’enzyme ne

pourra pas aller plus vite quoi qu’il arrive : la courbe sature !

L’analyse de la courbe de saturation permet d’obtenir les paramètres moléculaires de l’activité

enzymatique : VMAX et KM.

La vitesse maximale est une vitesse initiale !!!!!

➢ Équation de Michaelis et Menten

→ Les études de Henri, puis Michaelis et Menten ont permis d’analyser mathématiquement la courbe de

saturation.

→ Cas simple :

− Un seul substrat (S) est transformé en un seul produit (P)

− La réaction est irréversible.

→ On peut decomposer cette réaction en 2 étapes

→ Les hypothèses de départ :

121

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− il y a formation d’un complexe enzyme substrat (ES) dont la constitution et la destruction sont

rapides.

− La liaison est rapide et reversible.

− La transformation est lente et impose sa vitesse à la reaction enzymatique.

− Il y a un équilibre entre formation et dissociation du complexe.

− La concentration du complexe reste constante tout au long de la réaction (état stationnaire ou

d’equilibre).

Première partie de la réaction : assez rapide à se mettre en place et reversible (E+S ES)

Deuxième partie de la réaction : lente et irréversible, c’est cette transformation qui va imposer la

vitesse a l’ensemble de la réaction

A l’équilibre : autant de complexes qui se forment et que se dissocient : concentration du complexe ES

est stable

Du fait que la deuxième partie de la réaction soit irréversible : on va négliger V4.

A l’équilibre la concentration du complexe reste constante :

→ La liaison protéine-ligand obéit à la loi d’action de masse

Avec :

- K1 : constante de vitesse d’association

- K-1 : constante de vitesse de dissociation

A l’équilibre :

Dans le contexte d’enzyme substrat :

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122


Constante de Michaëlis :

- (S) est grand par rapport à (E), et n’est pas supposer varier notablement au debut de la réaction.

- E varie par contre : (E)=(Et)-(ES)

On utilise par commodité Km, constante de Michaëlis

Km a une grandeur en concentration.

Km est le reflet de l’affinité du substrat pour l’enzyme : plus KM est grand moins l’enzyme aura

d’affinité pour son substrat ! ➔ KM est la concentration du substrat lorsque la moitié des sites de

liaison de l’enzyme sont occupés

Km est équivalente à une constante de dissociation (inversion de la fraction définit par ES/E+S).

Expression de Vi :

Les hypothèses de départ : la transformation est lente et impose sa vitesse

Si on simplifie, Vi=V3

Vitesse maximale :

21

Les conditions requises sont une concentration du complexe (ES) constante tout au long de la réaction

(«steady state» ou état stationnaire = équilibre).

A l'équilibre, on a v1 = v-1 + v3 d'où : k1 (E)(S) = k-1 (ES) + k3 (ES)

On en tire : (ES)

(E)(S)

k

k k

1

-1 3

=+

(eq. 1)

On utilise par commodité son inverse, la constante de M ichaëlis :

K k k

kM

-1 3

1

=+

Taux d'occupation des sites :

Avec (E) = (ET) - (ES), (ET) étant la concentration initiale d'enzyme, on déduit :

(ES)

(E

(S)

K (S)T M)=

+ (eq. 2)

On voit que KM a la dimension d'une concentration. C'est la 1/2 saturation, concentration de substrat

(S) pour laquelle la moitié des sites actifs est sous forme de complexe (ES).

Vitesse maximale (V M AX)

D'après l'équation 2, et puisque vi = v3, on déduit :

v k (ES) = k E (S)

K (S)i 3

3 T

M

=+

( )

k3 ET est la vitesse pour laquelle l'enzyme est saturé par le substrat et tous les sites sont sous

forme de complexes enzyme-substrat (ES) = (ET). C'est la vitesse maximale (VMAX)

VMAX = k3 (ET) (eq. 3)

On obtient ainsi l'équation de M ichaelis :

v = V * (S)

K + (S)i

MAX

M (eq. 4)

Pour les valeurs extrêmes de concentration du substrat :

(S)® ¥ et KM est négligeable devant (S) soit (S)>50KM .alors la Vi tend vers la VMAX Le substrat

sature les sites catalytiques de l'enzyme nous obtenons une vitesse qui est indépendante de la

concentration en substrat, la réaction est d'ordre 0.

21

Les conditions requises sont une concentration du complexe (ES) constante tout au long de la réaction

(«steady state» ou état stationnaire = équilibre).

A l'équilibre, on a v1 = v-1 + v3 d'où : k1 (E)(S) = k-1 (ES) + k3 (ES)

On en tire : (ES)

(E)(S)

k

k k

1

-1 3

=+

(eq. 1)

On utilise par commodité son inverse, la constante de M ichaëlis :

K k k

kM

-1 3

1

=+

Taux d'occupation des sites :

Avec (E) = (ET) - (ES), (ET) étant la concentration initiale d'enzyme, on déduit :

(ES)

(E

(S)

K (S)T M)=

+ (eq. 2)

On voit que KM a la dimension d'une concentration. C'est la 1/2 saturation, concentration de substrat

(S) pour laquelle la moitié des sites actifs est sous forme de complexe (ES).

Vitesse maximale (V M AX)

D'après l'équation 2, et puisque vi = v3, on déduit :

v k (ES) = k E (S)

K (S)i 3

3 T

M

=+

( )

k3 ET est la vitesse pour laquelle l'enzyme est saturé par le substrat et tous les sites sont sous

forme de complexes enzyme-substrat (ES) = (ET). C'est la vitesse maximale (VMAX)

VMAX = k3 (ET) (eq. 3)

On obtient ainsi l'équation de M ichaelis :

v = V * (S)

K + (S)i

MAX

M (eq. 4)

Pour les valeurs extrêmes de concentration du substrat :

(S)® ¥ et KM est négligeable devant (S) soit (S)>50KM .alors la Vi tend vers la VMAX Le substrat

sature les sites catalytiques de l'enzyme nous obtenons une vitesse qui est indépendante de la

concentration en substrat, la réaction est d'ordre 0.

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Equation de Michaëlis :

Interprétation de la courbe de saturation :

❖ Réaction d’ordre 0 :

Quand Km devient très important, étant au dénominateur, il devient négigeable.

Si (S) tend vers l'infini (saturation par le substrat),

Km est négligeable devant (S) et vi tend vers Vmax. La vitesse est alors indépendante de la concentration en substrat.

Réaction d’ordre 0 :

❖ Réaction d’ordre 1 :

Dans ce cas de figure, Km n’est plus négligeable.

Si (S) tend vers 0, (S) est négligeable devant Km, et la vitesse devient :

Réaction d’ordre 1 :

Expression graphique de l’équation de Michaelis :

Courbe rouge :

❖ au debut Plus on ajoute de substrat plus la vitesse augmente : on

est dans une vitesse de réaction d’ordre 1.

❖ Et a un moment la vitesse va devenir independante de la

concentration en substrat. Quelque soit la quantité de substrat

on a une vitesse initiale qui ne bouge pas : on est donc dans une

vitesse de réaction d’ordre O

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124


(S)et KM est négligeable devant (S) et V i max sur V max. La vitesse est alors indépendante de la

concentration en substrat et (la réaction est d'ordre 0)

(S) 0 et (S) est négligeable devant KM et vi sur V max(S)/ K M (réaction d'ordre 1)

La courbe de saturation ne permet pas une mesure précise de VMAX, (asymptote) ni de KM (car il faudrait

de nombreuses mesures cinétiques pour l'établir). On préfère des transformations linéaires permettant une

mesure avec seulement 5 cinétiques.

possibilité pour linéarisée :

lineweaver Burk : 1 sur vi en fonction de 1

sur S

− coupure axe des Y : 1/vi

− coupure axe des X : -1/Km

Eadie-Hoffstee Vi sur S en fonction de vi

− Pente de la droite : -1/Km

− Axe des X : Vmax

Mesure expérimentale des paramètres :

Avec plusieurs substrats et plusieurs enzymes et avec des réactions réversibles, les expressions se

compliquent.

Il faut bien comprendre que :

→ Si on définit un Km et une Vmax c’est pour une enzyme et un substrat donné.

→ Certaines enzymes on 3-4 substrats. Pour chaque substrat la Vmax sera différente.

125

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B) PARAMETRES MOLECULAIRES

Selon l’equation de tout a l’heure, la constante de michaelis peut etre différente de la constante de

dissociationdu complexe (ES) étant donné la faible valeur de k3 par rapport a k-1 :

Constante de Michaëlis :

Elle est peu différente de Kd, la constante de dissociation (K3 faible)

• Km est un reflet de l’affinité du substrat pour l’enzyme.

• Plus Km est bas, plus l’affinité est forte (de 10-4 à 10-9 M)

On remarque que KM a la dimension d'une Concentration. C'est celle de la demi-saturation des sites, pour laquelle la vitesse de la réaction est la moitié de la Vmax

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126


Vitesse maximale :

En présence de concentrations croissantes d’enzymes, l’etude de la cinétique d’une réaction enzymatique

montre qu’il y autant de produit formé que la concentration en enzyme augmente.

La Vmax qui reflète la capacité de l’enzyme est proportionnelle à 2 facteurs :

− (ET) : l’etude de la cinétique enzymatique montre qu’il y a d’autant plus de produit formé que la

concentration en enzyme augmente.

− K3 chiffre le nombre de molécules de substrat transformées en produit par unité de temps et par molécule

d’enzyme dans les conditions de saturation de l’enzyme par son substrat. (conditions non

physiologiques.)

o La constante K3, activité enzymatique moléculaire (AEM), représente l’activité spécifique de

catalyse

Km → AFFINITE Vmax → CAPACITE

la concentration d’enzyme Et :

o Reflète la capacité de l'échantillon biologique à métaboliser le substrat. o Permet le dosage de l'enzyme par l'évaluation de son activité dans des conditions

optimales.

L’activité enzymatique moléculaire :

o Elle représente le nombre de substrat transformé par molécule d’enzyme o On parle plutôt de kcat sommation de plusieurs constantes catalytiques.

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Efficacité enzymatique :

On évalue la perfection enzymatique par la valeur du rapport kcat /KM qui au maximum tend vers k1.

La vitesse d’action d’une enzyme dépend en effet de la disponibilité de son substrat. L’efficacité enzymatique

est souvent du même ordre de grandeur que la constante de diffusion (D) du substrat (10-9 cm/s-1). C'est

surtout vrai lorsqu’une union supramoléculaire d'enzymes, un métabolon, réalise une tunnelisation des

substrats (channeling) par transmission directe de sites à sites.

C) EFFETS DES AGENTS PHYSIQUES OU CHIMIQUE SUR LA CINETIQUE

ENZYMATIQUE

❖ Concentration et nature du substrat

❖ Température

❖ pH

❖ Concentration et nature des effecteurs de la réaction enzymatique

III. SUBSTRAT

1- NATURE DU SUBSTRAT ET SPECIFICITE ENZYMATIQUE

❖ Spécificité du substrat

❖ Spécificité de l’enzyme

→ Agoniste : un substrat artificiel peut être utilisé pour la commodité avec laquelle le produit est evalué

dans un dosage enzymatique.

→ Spécificité d’action : un meme sustrat pouvant subir des réactions différentes catalysées par des

enzymes distinctes.

Les paramètres moléculaires sont spécifiques d’un couple enzyme-substrat

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128


2- CONCENTRATION EN SUBSTRAT

❖ Les conditions d’evaluation de la cinétique enzymatique doivent être reproductibles : conditions

initiales et optimales.

A) TEMPERATURE

▪ Augmentation de la vitesse de réaction avec la température : Augmentant les

mouvements moléculaires, la température accroit la probabilité des chocs

efficaces, et accélère les réactions chimiques. En général un doublement de la

vitesse de réaction s’observe lorsque la température s’élève de 10 C°.

▪ La dénaturation thermique de la protéine enzymatique avec la température :

La température et la dénaturation thermique obeissent a une loi logarithmique.

▪ La résultante est une température optimale : courbe presentant un maximum,

la température optimale, variable de 10 à 100°C selon les enzymes (dosage en 30

et 37°C) . La température idéale est en général 37 °C.

La mesure des activités enzymatiques ne se fait en général pas à la température optimale, trop variable, mais

de façon conventionnelle, afin que les résultats puissent être comparés. En fait, on tend de plus en plus à

s'aligner sur les USA. Il faut donc une thermostatisation des réactifs, de l'incubation jusqu'à la quantification

finale.

B) PH

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L’activité enzymatique varie en fonction du pH avec un pH optimal encadré de deux pH d’arrêt, qui permet

de séparer des enzymes à pH optimal d’action acide, neutre ou alcalin. Les pH d’arrêts renseignent sur la

nature des acides aminés du site actif.

C) EFFECTEURS DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE

Ils sont de deux sortes :

o Activateurs

o Inhibiteurs

Activateurs :

− Coenzymes : Indispensables à l'activité de certaines enzymes, en participant au site actif, ils peuvent

être liés de façon covalente (groupements prosthétiques), ou se comporter comme des substrats, ou

transporteurs de groupements d'une enzyme à l'autre (cosubstrat).

− Ions métalliques : ils sont indispensables à l'activité enzymatique, parfois facilitant la bonne

conformation du substrat.

− Protecteurs de groupements SH : CYS fait partie du site actif de nombreuses enzymes et aurait

tendance à former des dimères inactifs en l'absence de protecteurs de groupement SH

(β mercaptoéthanol, BAL etc.). Le glutathion joue ce rôle à l'état physiologique.

− Activateurs de proenzymes : Par exemple l'entérokinase pour le trypsinogène.

On distingue les inhibiteurs réversibles, souvent utilisés en thérapeutique et les poisons

irréversibles.

Inhibiteurs réversibles

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130


o Inhibiteurs compétitifs

▪ Analogues structuraux ▪ Compétition, mais antagonistes ▪ Elèvent en apparence la KM ▪ Ne changent pas la VMAX ▪ Inhibition levée par un excès de substrat.

o Inhibiteurs non compétitifs ▪ Ils ne se lient pas au site actif. ▪ Ils ne modifient pas la KM. ▪ Baissent la VMAX. ▪ Leur action n'est pas levée par un excès de substrat.

1) Les inhibiteurs REVERSIBLES peuvent être compétitifs ou non compétitifs : ▪ Compétitifs - Analogues structuraux, ils entrent en compétition avec le substrat naturel pour le site

actif avec lequel ils ont une affinité (KI), mais n'entraînent pas d'effet catalytique (antagonistes) : c'est

une action spécifique qui semble élever la KM, mais ne touche pas VMAX, car leur action est levée par

un excès de substrat. Leur nature renseigne sur la structure du site actif et la transconformation

enzymatique.

Ex : AZT ou ddl sont deux traitements anti-HIV qui sont des analogues de la desoxythimidine utilisée par la transcriptase inverse du virus.

▪ Non compétitifs - Ils ne se lient pas au site actif, et leur action n'est pas supprimée par un excès de

substrat (baisse de la VMAX, KM intact). Ainsi sont les chélateurs métalliques, et les bloqueurs de

groupements SH.

Compétitif → ne change pas la Vmax mais le Km augmente (diminution de l’affinité)

Non compétitif → la Vmax (capacité va être modifiée : elle diminue) en revanche le Km est inchangé (aucun

impact sur l’autre substrat)

Remarque : il existe aussi des inhibiteurs incompétitifs qui gênent aussi bien la fixation sur le site actif que la

transconformation éventuellement par effet stérique mais que nous n'étudierons pas ici.

Inhibiteurs irréversibles :

o Agents dénaturants

o Poisons :

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▪ Cyanure et COX-CO et Hb

▪ DPF-Organophosphorés (SER estérases)

2) Les inhibiteurs IRREVERSIBLES entraînent une perte des propriétés catalytiques de l'enzyme, soit par modification de sa conformation (agents dénaturants) soit par blocage du site actif de l'enzyme (poisons)

▪ Agents dénaturants - Les enzymes sont particulièrement sensibles à la dénaturation, surtout thermique,

et sont protégées par la fixation des substrats.

▪ Poisons - Il s'agit de réactifs qui interagissent avec les résidus d'acides aminés du site actif. On peut citer

l'aspirine pour la sérine du site actif des cyclooxygénases, le disopropyl fluorophosphate (DFP) pour les

sérines estérases, le cyanure pour le cytochrome oxydase.

▪ Deux cas particuliers :

❖ Marquage par photo affinité - Un substrat est fixé de façon covalente par une réaction photochimique

et son marquage aide à la purification de l'enzyme.

❖ Substrat-suicide - La décomposition catalytique du substrat fixe le produit à l'enzyme de façon covalente

(AC. Clavulanique, inhibiteur des b lactamases qui inactive la pénicilline)

D) CONDITIONS OPTIMALES

Elles fixent par convention les paramètres expérimentaux de saturation en substrat, de température, de pH, et d'effecteurs, pour effectuer la mesure d'une activité enzymatique.

Sans elles, une cinétique enzymatique n’a aucun sens. Elles permettent le dosage enzymatique.

E) DOSAGE ENZYMATIQUE

C'est la mesure de l'activité enzymatique dans les conditions optimales. ➔ Les conditions optimales sont recommandées par la Société Française de Biologie Clinique (SFBC)

- L'importance pratique de la cinétique enzymatique est la possibilité de doser les enzymes c'est-à-dire de

mesurer leur concentration dans les liquides biologiques.

- L'augmentation de certaines enzymes peut en effet être le signe de la libération du contenu enzymatique

d'une cellule suite à une destruction cellulaire.

- Par exemple augmentation de l'enzyme CKMB au cours de l'infarctus du myocarde.

- On distingue l'évaluation de la concentration par la mesure de la Vmax et le dosage massique

Vmax et dosages enzymatiques :

- Cependant, il faut bien voir que la Vmax n'est pas une mesure directe de (ET), mais une activité biologique

dépendante de kcat, c'est à dire de l'AEM.

- Nous avons vu que de nombreux paramètres peuvent faire varier la cinétique enzymatique : température,

pH, substrat… Pour faire ces dosages les conditions expérimentales doivent être rendues optimales et

reproductible pour que l'on ait une mesure juste.

Les Conditions optimales :

o Elles sont conseillées sur le plan national par les recommandations de la Société Française de

Biologie Clinique (SFBC), avec un consensus international.

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o Elles concernent les paramètres de la réaction enzymatique, c'est à dire la concentration et la

nature des substrats ou des agonistes, la température, le pH et la nature et concentration des

effecteurs éventuels.

Unités internationales :

Une unité internationale (UI) d'activité enzymatique transforme 1 μmole de substrat en 1 minute, dans les conditions optimales, et par unité d'échantillon biologique.

Dans le dosage d'une activité enzymatique, la mesure de Vmax :

o N’est qu'un reflet de (ET),

o Elle représente la concentration d'enzyme à la seule condition que les conditions optimales

de la mesure soient respectées.

o C’est une activité, pas une concentration

o Si on veut une concentration vraie, il faut un dosage massique

On ne mesure pas l’activité de l ’enzyme mais sa CONCENTRATION RÉELLE

• On utilise le plus souvent des anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine à étudier (immuno analyse).

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IV. REGULATION ENZYMATIQUE

A) Allostérie

Le changement de conformation dans une protéine à la suite de l’attachement d’un composé appelé effecteur

allostérique en dehors du site catalytique est synonyme d’enzymes allostériques.

ENZYMES ALLOSTERIQUES : elles subissent un changement de conformation (transition

allostérique) qui augmente ou diminue son activité catalytique. (Effecteurs ou inhibiteurs).

Ces effecteurs ou inhibiteurs appelés effecteurs allostériques, ont pour caractères essentiels d’être

spécifiques, différent du substrat et fixés sur un site différent du site actif, le site allostérique. Cette

transition allostérique amène une modification de la Km apparente ou de la Vmax c'est-à-dire de l’AEM.

-Ces enzymes allostériques jouent un rôle fondamental dans la régulation des voies métaboliques chez tous les

êtres vivants et sont appelés enzymes régulatrices. Elles sont le plus souvent situées au début des voies

métaboliques et peuvent être inhibées par le produit terminal lorsqu’il est en excès, on parle de rétro inhibition

par le produit terminal. D’autres facteurs peuvent au contraire activer cette voie.

-Les enzymes allostériques sont dans le plus souvent des OLIGOMERES. Elles présentent une structure

quaternaire faite de protomères, semblable ou différente, en général en nombre pair (ex : homodimère). La

fixation des effecteurs et la transconformation consécutives, s’accompagnent souvent d’une polymérisation

(acétyle CoA carboxylase).L’hémoglobine, transporteur d’O2 des globules rouges, est un exemple

d’hétérotétramère, alors que son équivalent la myoglobine (équivalent musculaire) est un monomère dépourvu

de propriétés allostériques.

Retro-inhibition par le produit terminal (N) qui inhibent une enzyme qui se trouve au début de la réaction

(enzyme régulatrice) par fixation du produit sur le site allostérique des enzymes

Les enzymes Michaëliennes ne sont pas allostériques

▪ Les enzymes michaëliennes n’ont qu’un site catalytique ou se fixe le substrat :

− On obtient une hyperbole avec un Km

▪ Les enzymes allostériques ont deux sites catalytiques, celui ou se fixe le substrat et un ou se fixe

l’effecteur allostérique (effecteur activateur ou inhibiteur) :

− L’effecteur de l’enzyme allostérique a un effet sur la vitesse.

− On obtient une courbe sigmoïde avec un Km apparent (différent du Km michaëlien)

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Ces facteurs allostériques vont favoriser et réguler l’enzyme.

D) CINETIQUE DES ENZYMES ALLOSTERIQUES

Cas simple

Nous n’envisagerons que les enzymes de type K, et uniquement les effets homotropiques du substrat. Lorsque

l'on établit la courbe vi = f (S) pour la thréonine désaminase, on n'observe pas une courbe "michaëlienne"

classique, mais une courbe sigmoïde.

La vitesse de la réaction augmente d'abord lentement avec l'accroissement de la concentration en substrat, puis

de plus en plus rapidement, et devient michaëlienne après un seuil. On interprète ce phénomène comme une

fixation malaisée du substrat à faible concentration, puis de plus en plus facilement au fur et à mesure que sa

concentration augmente : c'est l'effet coopératif du substrat (ou homotropique). Il ne s'agit pas à proprement

parler de KM, mais d'une KM apparente, plus élevée.

L'addition d'effecteurs modifie le comportement cinétique de l'enzyme :

→ L'effecteur inhibiteur aggrave le caractère sigmoïde de la courbe, et élève la KM apparente.

→ L'effecteur activateur en excès rétablit le comportement michaëlien normal (les effecteurs sont supposés à

saturation pour éviter leurs propres effets homotropiques).

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Une dénaturation légère (urée diluée, chaleur douce), incapable de faire disparaître l'activité de l'enzyme, peut

néanmoins supprimer la modulation d'activité de l'enzyme, et ses caractères allostériques expérimentaux

(comportement cinétique, sensibilité aux effecteurs, oligomérie). Elle a alors perdu son oligomérie. On peut

pourtant, malgré cette désensibilisation, montrer la persistance de la liaison des effecteurs sur les sites

allostériques. La transition allostérique est donc liée à l'intégrité de la structure quaternaire des enzymes

allostériques.

Effecteur allostérique qui se fixe modifie l’enzyme et donc le substrat va avoir du mal à se fixer (inhibition)

Cas plus généraux

La variation du taux des effecteurs à substrat constant (effets homotropiques des effecteurs) permet de

constater un effet coopératif des effecteurs, avec des courbes sigmoïdes. De même la variation simultanée du

taux des substrats et des effecteurs révèle des effets hétérotopiques complexes. La VMAX (et non la KM) peut

aussi être altérée (enzymes de type V), mais ce phénomène n'est pas facile à mettre en évidence, car la cinétique

hyperbolique ne semble pas modifiée au premier abord. Cette coopérativité peut même être négative. Il est sans

doute significatif que les enzymes de dégradation soient de type K et les enzymes de synthèse de type V.

On imagine sans peine la complexité de la réalité cellulaire, avec une concentration variable des substrats,

produits analogues métaboliques compétiteurs et effecteurs allostériques, activateurs ou inhibiteurs. Il faut en

outre compter avec une activité modulée par allostérie covalente et l’existence d’isoenzymes compétiteurs.

Aucun modèle théorique prenant en compte tous ces paramètres in vivo, n’a pu être réalisé à ce jour.

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Effecteurs allostériques :

→ Modulation hétérotopique : effecteur allostérique de nature différente du substrat

→ Modulation homotopique : effecteur et substrat sont les mêmes (ex : hémoglobine)

B) Allostérie covalente

❖ Modification covalente réversible : Phosphorylation résidu sérine, thréonine ou tyrosine : réaction

covalente consistant en une estérification des résidus sérine thréonine ou tyrosine de l’enzyme régulée sous

l’effet d’une kinase. La phosphorylation dans la cellule est la plus importante. La réaction inverse est réalisée

par une phosphatase qui permet la déphosphorylation de l’enzyme

❖ D’autre groupements chimiques peuvent permettent également de modifier de façon covalente et

réversible les enzymes conduisant à des changements d’activités :

− Méthylation

− Adénylation

❖ Ces réactions sont rapides et contrôlées par l’action de messagers chimiques générés dans les cellules sous

l’effet d’hormones

❖ Modification post-traductionnelle

❖ Activation et régulation du type « tout ou rien » on passe d’une forme inactive de l’enzyme a une forme active

de l’enzyme ou inversement.

Par exemple une enzyme est non fonctionnelle on la phosphoryle et elle devient alors fonctionnelle.

C’est donc une réponse « on/ off »

Fixation d’un ligand qui va entrainer la phosphorylation du récepteur (il va devenir actif) en devenant actif il va

aller activer des voies intracellulaires, des multiples voies on va donc avoir une amplification du signal et donc un

effet biologique. Pour une molécule fixée on va avoir de nombreuses fonctions.

On va pouvoir réguler cette phosphorylation puisque lorsque le ligand va s’en aller la phosphorylation va

disparaitre et donc on va arrêter l’activation du récepteur. On a une régulation fine. (Pas toujours phosphorylation

= activation.)

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C) Isoenzymes

▪ Enzymes avec activités enzymatiques identiques ou très voisines (même si structure primaire différente) mais

structure différente.

▪ Structure peptidique et des gènes différents (vont avoir un km et une Vmax différente)

▪ Les isoformes sont des expressions différentes d’un même gène.

▪ La distribution est tissu-spécifique, inductible, développementale

Exemple : la lacticodeshydrogénase (LDH). Il s’agit d’un hétérotétramère composé de 2 chaînes différentes (H

pour cardiaque, et M pour musculaire squelettique) dépendant de deux gènes distincts.

➢ H : hépatique

➢ M : musculaire

➢ 4 sous unités.

Les diverses combinaisons font apparaître 5 isoenzymes,

identifiables à l'électrophorèse du sérum sanguin sous forme de 5 bandes H4, H3M, H2M2, HM3, M4. Si les

enzymes intracellulaires sont identifiées dans le sérum on suspecte une lésion de la cellule (cytolyse) et

l'équipement enzymatique spécifique de chaque organe peut aider au diagnostic topographique de la lésion.

D) Proenzymes

→ Ce sont des enzymes synthétisées et souvent sécrétées sous une forme inactive (précurseurs inactif)

❖ Activées par clivage d’un peptide par une protéase spécifique qui agit sur une paire de base basique

(processus irréversible)

❖ Réorganisation de la structure tertiaire

❖ Apparition d’un site actif

❖ Processus irréversible

❖ Cascades d’activation régulées.

❖ Modulée par de nombreux facteurs activateurs et inhibiteurs

Ce phénomène a été décrit initialement à propos des enzymes digestives dont l’activation trop précoce pourrait

être catastrophique pour les organes sécréteurs tels que le pancréas.

❖ Il empêche les activations trop précoces

❖ Il est en réalité un phénomène plus général

Exemple 1 : Coagulation sanguine

→ Lorsque l’on se coupe (stimulus), on entraine un certain nombre de facteurs de coagulations.

→ Un facteur de coagulation sous la forme non clivée s’active alors via son clivage.

→ Activé, il va alors couper une autre protéine activant d’autres facteurs.

→ Ces activations multiples vont permettre la formation de fibrine puis d’un caillot de sang

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Exemple 2 : Synthèse de l’insuline

→ Passage de la pro-insuline qui est la forme

inactivée de l’insuline en insuline

→ Mais on ne peut pas passer de l’insuline à la pro-

insuline

Exemple 3 : Enzymes du pancréas

→ Le pancréas sécrète des enzymes au niveau du tube digestif pour la

digestion des macromolécules tel les protéases : trypsine, chymotrypsine,

carboxypeptidases.

→ Les protéases sont synthétisées sous forme inactive.

→ Le trypsinogène est activé en trypsine par entérokinase produite par

l’épithélium intestinal.

→ La trypsine va ensuite activer les autres protéases par clivage :

chymotrypsinogène, procarboxypeptidases. La trypsine stable à pH acide

est inactivée en quelques heures à pH neutre.

❖

→ Ce phénomène s’observe également au niveau de :

❖ Polymérisation des fibres collagènes

❖ Coagulation sanguine (si besoin d’arrêter un saignement)

❖ Adressage intracellulaire des protéines (coupure peptides signaux)

❖ Maturation d’isoformes tissu spécifique

❖ Libération de protéines membranaires

❖ Système du complément

V. ENZYME DANS L’ORGANISME

A) Classification des enzymes

6 classes ont été définies : réalisée en fonction de l’action qu’elle réalise.

1 - Oxydoréductases (par exemple déshydrogénases, hydroxylases)

2 - Transférases (par exemple ATP-phosphoryle transférases ou kinases)

3 - Hydrolases (par exemple osidases, lipases, protéases, nucléases)

4 - Lyases (par exemple décarboxylases, deshydratases)

5 - Isomérases (phosphohexo isomérase, UDP-galactose 4 épimérase)

6 - Ligases (carboxylases, peptidyl synthétase, acyl Coenzyme A synthétases)

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B) Organisation intracellulaire des enzymes

Les enzymes ne sont pas libres dans la cellule, mais soumis à des relations étroites avec d'autres enzymes ou

protéines voisines. Ils voient alors leurs propriétés catalytiques ou allostériques modifiées (allotopie). On

observe divers degrés d'organisation selon la solidité et la permanence des relations.

Il y a 4 degrés d’organisation supramoléculaire des enzymes intracellulaires :

Complexes multienzymatiques

Enzymes multifonctionnels

Immobilisation sur les structures cellulaires

Métabolons

C) Enzymologie clinique

Le dosage des enzymes des milieux biologiques est réalisé en pathologie :

- Les cytolyses

- Les inductions enzymatiques (augmentation la biosynthèse de certaines enzymes si atteinte organes)

- Les enzymopathies congénitales (étude les enzymopathies congénitales)

• Cytolyse

→ La LDH a un certain poids au niveau sanguin (cf. Chromatographie précédente)

- Simple souffrance cellulaire (réparable)

- Perméabilisation membranaire

- Passage de protéines cytosoliques dans le sang

- Nécrose (irréversible)

- Destruction des organelles

- Passage de protéines des organelles dans le sang

→ Les LDH sont obsolète par rapport aux Créatines Kinases (CK) qui

elles sont assez régulièrement dosées ➔Dosage avec anticorps anti CK-

MB spécifique

Ex : Infarctus du myocarde

➔Blocage des coronaires par des plaques d’athérome ➔Cellules vont

souffrir car plus d’O2. Si souffrance cellulaire, ECG anormal ou modifié ( si

grande taille). AJD on fait aussi des bio marquages car les cellules vont

secrétés des substances car on a lésion des cellules ➔Dosage Troponine.

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Homo-enzymes : Enzymes constituées uniquement de protéines.

Hétéro-enzymes : Enzymes qui ont besoin d’autres facteurs pour fonctionner qui ne sont pas forcément

protéiques

Km : c’est le reflet de l’affinité du substrat pour l’enzyme :plus KM est grand moins l’enzyme aura d’affinité

pour son substrat.

Vmax : la vitesse maximale est en quelque sorte une vitesse initiale car elle dépend de la concentration

initiale en substrat, jusqu’à la saturation. Plus il y aura de substrats, plus vmax sera élevée.

Catalyse : La catalyse est l'action d'un catalyseur sur une transformation chimique.

→ Ce catalyseur réalise les actions suivantes (présente 4 caractéristiques) :

− Il augmente les vitesses de réaction.

− Il respecte les conditions thermodynamiques de la réaction.

− Il se retrouve intact en fin de réaction (peut faire un nouveau cycle)

− Il agit à l'état de trace : concentration faible (en principe, car il est des cas où la quantité de protéines

enzymatiques est loin d'être négligeable).

Les différents acides aminés :

- De contact, ou principaux : assurent la liaison temporaire du substrat au site actif par des liaisons de faible énergie. Ils créent les charges et font l’interaction avec le substrat.

- Auxiliaires ou collaborateurs : créent un environnement favorable à l’action catalytique

- Accessoires : assurent le maintien de la structure tertiaire par l’intermédiaire d’autres liaisons et repliement

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POINTS IMPORTANTS : Chapitre 2 les enzymes

I. PROTEINE ENZYMATIQUE :

➢ Caractères de la liaison protéine-ligand : spécificité, saturation, inhibition

spécifique, déficit congénital héréditaire

➢ Constitution chimique des enzymes : homo-enzymes, hétéro-enzymes

➢ Site actif : preuves de son existence, configuration, composition

➢ Les 3 types acides-aminés

II. CATALYSE ENZYMATIQUE :

➢ La catalyse enzymatique

➢ Cinétique enzymatique : courbe de saturation, Vmax, Km, Vi, (ET), K3

➢ Constante de Michaëlis

➢ Effets des agents physiques ou chimiques sur la cinétique enzymatique :

pH, température, concentration et nature su substrat, concentration et

nature des effecteurs de la réaction enzymatique

➢ Nature du substrat et spécificité enzymatique

➢ Inhibiteurs irréversibles : poisons, agents dénaturants

➢ Inhibiteurs réversibles : compétitifs et non compétitifs

III. REGULATION ENZYMATIQUE :

➢ Allostérie

➢ Allostérie covalente

➢ Isoenzymes

➢ Proenzymes

IV. ENZYMES DANS L’ORGANISME :

➢ Classification des enzymes

➢ Organisation intracellulaire des enzymes

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QCM 1 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES CARACTERISTIQUES DE LA LIAISON

PROTEINE -LIGAND, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) C’est une liaison aspécifique B) C’est une liaison insaturable C) C’est une liaison qui n’est pas régulée D) C’est une liaison qui ne subit pas l’ inhibition spécifique E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 2 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES CHOCS ENTRE UNE PROTEINE ET UN

LIGAND, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Ils n’entrainent pas systématiquement un effet biologique B) Ils peuvent être efficaces (chocs élastiques) C) Ils ne sont pas indépendants du niveau énergétique de la protéine D) Ils ne peuvent pas changer la conformation de la protéine E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 3 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km) POUR

UN COUPLE ENZYME SUBSTRAT, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Elle ne reflète pas l’affinité de l’enzyme pour son substrat B) Plus le Km est élevé, plus l’enzyme a une forte affinité pour son substrat C) C’est la concentration en substrat de la ½ saturation D) L’unité de Km est en m/s (mètre par seconde) E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 4 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LA COURBE DE SATURATION OBTENUE

LORS DE L’ETUDE D’UNE CINETIQUE ENZYMATIQUE, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Elle représente la concentration d’apparition du substrat en fonction de la concentration du produit B) Elle ne représente pas les vitesses initiales de transformation du produit en substrat en fonction de la

concentration du produit C) Elle permet de caractériser les paramètres moléculaires d’un substrat pour une enzyme D) Elle permet d’estimer le Km E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 5 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LA DEFINITION D’UN CATALYSEUR,

LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Il augmente la vitesse de la réaction B) Il doit être présent en grande quantité pour favoriser au mieux la réaction C) Il augmente la durée de la réaction D) C’est une molécule qui se retrouve intacte en fin de réaction E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

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QCM 6 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES PARAMETRES EXPERIMENTAUX QUI

PEUVENT INFLUENCER LA CINETIQUE ENZYMATIQUE, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) La présence d’un inhibiteur B) Le PH C) Une différence de température D) L’absence ou la présence d’une coenzyme nécessaire au fonctionnement de l’enzyme. E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 7 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT UNE REACTION AVEC UN G=-10 kcal/mol ,


A) Cette réaction est endergonique B) Cette réaction est exergonique

C) G température correspond à la variation d’énergie libre du système

D) G température correspond à la variation d’énergie totale du système

E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 8 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES ACIDES AMINES PRINCIPAUX,


A) Ils sont aussi appelés acides aminés auxiliaires B) Ils sont en contact avec le substrat C) Ils sont apolaires D) Ils sont hydrophobes E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 9 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LA REGULATION DE LA FONCTION

ENZYMATIQUE PAR ALLOSTERIE COVALENTE, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Cette régulation est irréversible B) L’activation d’une enzyme par phosphorylation n’est pas un exemple d’allostérie covalente C) Cette régulation est réversible D) L’activation d’une proenzyme par clivage d’un peptide n’est pas un exemple d’allostérie covalente E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 10 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES COFACTEURS D’UNE REACTION

ENZYMATIQUE, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Ils sont toujours liés de façon covalente à l’enzyme B) Ils participent à la formation d’une hétéro-enzyme C) Ils sont indispensables à toutes les réactions enzymatiques D) Ils correspondent à la partie non protéique E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

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Exercice 1 :

Complétez le texte avec les mots correspondants :

Les chocs ……. sont plus fréquents que les chocs ……. c'est-à-dire que les molécules se rencontrent, se percutent et restent ……. Certaines collisions sont plus violentes, les chocs entrainent alors des …………………………. qui entrainent un déplacement d’électrons puis une ……….. ou une formation de liaisons. Dans ce cas le choc est ………. car il modifie les entités chimiques.

Pour que le choc soit ………. il faut que le système passe par un niveau énergétique plus élevé : énergie libre d’activation.

Exercice 2 :

Donnez les différents agents chimiques ou physiques qui peuvent avoir des effets sur la cinétique

enzymatique :

-

-

-

-

Exercice 3 :


Acides aminés de contacts :

Acide aminés auxiliaires :

Acide aminés accessoires :

Homo-enzyme :

Hétéro-enzyme :

Km :

Vmax :

Catalyse :

Choc inefficace/ élastique :

Choc efficace :

Cofacteur :

147

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Réaction exergonique :

Réaction endergonique :

Liaison covalente :

Liaison non covalente :

Inhibiteur compétitif :

Inhibiteur non compétitif :

Exercice 4 :

Certaines enzymes fonctionnent avec des coenzymes ou ………… (sans eux l’enzyme n’est pas ………). Les coenzymes ou ………….. sont des métabolites non ………….. et de faible masse ………… comparée à la masse ………. Des enzymes. Les coenzymes ont des fonctions d’accepteurs et de transporteurs …………. libérés au cours de la catalyse et qui la facilite . Les coenzymes agissent à ……… concentration et doivent, comme les enzymes être ………….. à la fin d’une réaction. Elles sont ……. ou associées à l’enzyme. Les coenzymes fonctionnent de deux façons : ……………….. …………………. ou …………….

Exercice 5 :

Donnez les caractéristiques d’un catalyseur:

-

-

-

-

Exercice 6 :

Vmax qui reflète la capacité de l’enzyme est proportionnelle à deux facteurs. Donnez-les et veuillez

indiquer leurs définitions :

- -

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148



A) C’est une liaison aspécifique FAUX, c’est une liaison spécifique. B) C’est une liaison insaturable FAUX, saturable car si on met un ligand en excès, les sites de liaisons seront

tous occupés. La saturation correspond au fait que plus aucun site de liaison n’est disponible. C) C’est une liaison qui n’est pas régulée FAUX, c’est une liaison qui se régule par allostérie,par les isoformes de

la protéine, la concentration en protéine liante, les familles de ligand et par la concentration du ligand. D) C’est une liaison qui ne subit pas d’inhibition spécifique FAUX, c’est une liaison qui peut être inhibée de

manière covalente par des poisons ou de manière non covalente par des analogues structuraux (inhibition compétitive).

E) VRAI ☺ Réponse : E

QCM 2 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES CHOCS ENTRE UNE PROTEINE ET UN

LIGAND, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Ils n’entrainent pas systématiquement un effet biologique VRAI, les chocs élastiques sont n’entrainent pas d’effet biologique.

B) Ils peuvent être efficaces (chocs élastiques) FAUX, les chocs élastiques sont inefficaces. C) Ils ne sont pas indépendants du niveau énergétique de la protéine VRAI, plus le niveau énergétique est élevé,

plus cela permettra les chocs efficaces. D) Ils ne peuvent pas changer la conformation de la protéine FAUX un choc efficace change la conformation de

la protéine. E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte. FAUX

Réponses :AC

QCM 3 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km) POUR

UN COUPLE ENZYME SUBSTRAT, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Elle ne reflète pas l’affinité de l’enzyme pour son substrat FAUX, elle reflète l’affinité de l’enzyme pour son substrat.

B) Plus le Km est élevé, plus l’enzyme a une forte affinité pour son substrat FAUX, c’est l’inverse ! Plus le Km est faible, plus l’affinité de l’enzyme pour son substrat est forte !

C) C’est la concentration en substrat de la ½ saturation VRAI, c’est la concentration de substrat (S) pour laquelle la moitié des sites actifs est sous forme de complexe (ES).

D) L’unité de Km est en m/s (mètre par seconde) FAUX, Km est une concentration, il s’exprime donc en mol/L. E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte FAUX

Réponse : C

149

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QCM 4 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LA COURBE DE SATURATION OBTENUE

LORS DE L’ETUDE D’UNE CINETIQUE ENZYMATIQUE, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Elle représente la concentration d’apparition du substrat en fonction de la concentration du produit FAUX, lorsqu’on étudie la variation de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique en fonction de la concentration initiale en substrat, on la voit évoluer de façon hyperbolique vers une vitesse maximale (Vmax) qui représente la saturation de l’enzyme par son substrat. Cette courbe de saturation est l’expression graphique de l’équation de Michaelis-Menten.

B) Elle ne représente pas les vitesses initiales de transformation du produit en substrat en fonction de la concentration du produit VRAI, en effet elle ne représente pas cela, elle représente les vitesses initiales de transformation du SUBSTRAT EN PRODUIT en fonction de la concentration du substrat.

C) Elle permet de caractériser les paramètres moléculaires d’un substrat pour une enzyme FAUX, elle permet de caractériser les paramètres moléculaires d’une ENZYME pour un substrat.

D) Elle permet d’estimer le Km VRAI , la courbe de saturation ne permet pas de mesurer précisément le KM mais

une estimation est tout à fait possible. Pour une mesure précise du KM on utilisera des transformations linéaires.

E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte. Réponses :BD

QCM 5 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LA DEFINITION D’UN CATALYSEUR,


A) Il augmente la vitesse de la réaction VRAI, un catalyseur va augmenter les vitesses de réaction. B) Il doit être présent en grande quantité pour favoriser au mieux la réaction FAUX, il doit être présent en petite

quantité. C) Il augmente la durée de la réaction FAUX, puisqu’il augmente la vitesse de la réaction, il diminue la durée de

la réaction . D) C’est une molécule qui se retrouve intacte en fin de réaction VRAI, le catalyseur est régénéré à chaque fin de

réaction. E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

Réponses : AD

QCM 6 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES PARAMETRES EXPERIMENTAUX QUI

PEUVENT INFLUENCER LA CINETIQUE ENZYMATIQUE, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) La présence d’un inhibiteur VRAI, les inhibiteurs vont tous entrainer un ralentissement ou un arrêt total de la cinétique enzymatique.

B) Le PH VRAI, la réaction doit se situer entre deux PH si on ne souhaite pas qu’elle soit ralentie. C) Une différence de température VRAI, il existe une température pour laquelle la réaction va être optimal.

Cependant, il existe un seuil où la température pourra dénaturer les protéines. D) L’absence ou la présence d’une coenzyme nécessaire au fonctionnement de l’enzyme. VRAI, certaines

enzymes nécessitent des coenzymes en bonne proportion afin de fonctionner au maximum. Si le cofacteur est absent, la protéine ne sera pas active et la réaction n’aura pas lieu.

E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte. FAUX Réponses : ABCD

QCM 7 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT UNE REACTION AVEC UN G=-10 kcal/mol ,


A) Cette réaction est endergonique FAUX, G est < à 0

B) Cette réaction est exergonique VRAI, le G est < à 0

C) G température correspond à la variation d’énergie libre du système VRAI, c’est la définition du G

D) G température correspond à la variation d’énergie totale du système FAUX, la variation d’énergie totale

du système correspond à H, c’est-à-dire à l’enthalpie. E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

Réponses : BC

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150


QCM 8 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES ACIDES AMINES PRINCIPAUX,


A) Ils sont aussi appelés acides aminés auxiliaires FAUX, ils sont aussi appelés acides aminés de contact. B) Ils sont en contact avec le substrat VRAI, ils sont même en contact direct avec le substrat. Ils vont permettre

d’établir des liaisons temporaires au niveau du site actif entre le substrat et l’enzyme. C) Ils sont apolaires FAUX, ils sont hydrophiles D) Ils sont hydrophobes FAUX, ce sont des acides aminés polaires et donc hydrophiles E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte. FAUX

Réponse : B

QCM 9 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LA REGULATION DE LA FONCTION

ENZYMATIQUE PAR ALLOSTERIE COVALENTE, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Cette régulation est irréversible FAUX, les modifications covalentes sont réversibles. B) L’activation d’une enzyme par phosphorylation n’est pas un exemple d’allostérie covalente FAUX, la

phosphorylation est bien le cas d’une allostérie covalente. C) Cette régulation est réversible VRAI D) L’activation d’une proenzyme par clivage d’un peptide n’est pas un exemple d’allostérie covalente VRAI,

c’est un exemple de clivage protéolytique. Dans ce cas, les enzymes vont d’abord être sécrétées sous forme de proenzymes (précurseur inactif) et vont ensuite être clivées par une protéase spécifique qui va les activer.

E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte. FAUX Réponses : CD

QCM 10 – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS CONCERNANT LES COFACTEURS D’UNE REACTION

ENZYMATIQUE, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Ils sont toujours liés de façon covalente à l’enzyme FAUX, seuls les groupements prosthétiques sont liés de façon covalente à l’enzyme. Cependant, certains cofacteurs sont des cosubstrats qui sont faiblement liés à l’enzyme et vont facilement s’en dissocier.

B) Ils participent à la formation d’une hétéro-enzyme VRAI, ils participent à l’hétéro-enzyme en formant la partie non protéique.

C) Ils sont indispensables à toutes les réactions enzymatiques FAUX, il y a des réactions enzymatiques qui se déroulent sans cofacteurs, par exemple si elles utilisent des homo-enzymes.

D) Ils correspondent à la partie non protéique VRAI E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte. FAUX

Réponses : BD

Exercice 1 :


Les chocs élastiques sont plus fréquents que les chocs efficaces c'est-à-dire que les molécules se rencontrent, se percutent et restent inchangées. Certaines collisions sont plus violentes, les chocs entrainent alors des modifications électroniques qui entrainent un déplacement d’électrons puis une rupture ou une formation de liaisons. Dans ce cas le choc est efficace car il modifie les entités chimiques.

Pour que le choc soit efficace (≠ élastique) il faut que le système passe par un niveau énergétique plus élevé : énergie libre d’activation.

151

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Exercice 2 :

Donnez les différents agents chimiques ou physiques qui peuvent avoir des effets sur la cinétique enzymatique :

❖ Concentration et nature du substrat

❖ Température

❖ pH

❖ Concentration et nature des effecteurs de la réaction enzymatique

Exercice 3 :

Donnez les définitions des mots suivants :

Acides aminés de contacts : ou principaux, ceux-ci assurent la liaison temporaire du substrat au site actif par des liaisons de

faible énergie. Ils vont également créer les charges et font l’interaction avec le substrat.

Acide aminés auxiliaires : ou collaborateurs, ils vont créer un environnement qui sera favorable à l’action catalytique.

Acide aminés accessoires : ils vont assurer le maintien de la structure tertiaire par l’intermédiaire d’autres liaisons et

repliement.

Homo-enzyme : enzymes constituées uniquement de protéines.

Hétéro-enzyme : enzymes qui ont besoin d’autres facteurs pour fonctionner qui ne sont pas forcément protéiques.

Km : c’est le reflet de l’affinité du substrat pour l’enzyme. Plus Km est grand, moins l’enzyme aura d’affinité pour son

substrat.

Vmax : c’est en quelque sorte une vitesse initiale. Elle dépend de la concentration initiale en substrat, jusqu’à la saturation

(quand tous les sites sont occupés). Plus il y aura de substrats, plus vmax sera élevée.

Catalyse : c’est l’action d’un catalyseur sur une transformation chimique.

Choc inefficace/ élastique : ils sont plus fréquents que les chocs efficaces. Les molécules vont se percuter et rester

inchangées.

Choc efficace : Ce sont des collisions plus violentes. Les chocs vont entrainer des modifications électroniques qui vont

entrainer un déplacement d’électrons puis une rupture ou une formation de liaisons. Puisqu’il modifie les entités chimiques,

le choc est efficace.

Cofacteur : c’est la partie non protéique de l’hétéro-enzyme. On peut aussi l’appeler coenzyme. Ils ont des fonctions

d’accepteurs et de transporteurs radicaux libérés au cours de la catalyse et qui la facilite. Il agit à faible concentration et va

devoir, comme les enzymes, être régénéré à la fin d’une réaction. Nous avons plusieurs types de cofacteurs :

-groupement prosthétique si la liaison est COVALENTE

-co substrat si la liaison est plus faible et qu’il se comporte comme un ligand.

Réaction exergonique : lors de cette réaction, de l’énergie est donnée au milieu extérieur. Elle est thermodynamiquement

possible spontanément. Son ΔG est < 0 !

Réaction endergonique : Dans ce cas de réaction, il faut fournir de l’énergie au système pour qu’elle puisse se réaliser. Elle

est thermodynamiquement possible seulement avec un apport d’énergie extérieur, comme un couplage. ΔG>0 !

Liaison covalente : Lorsque le ligand va se lier de façon covalente, notamment un poison.

Liaison non covalente : Lorsque le ligand va se lier de manière non covalente par des analogues structuraux.

Inhibiteurs compétitifs : Ce sont des inhibiteurs réversibles. Ce sont des analogues structuraux. Ils ne changent pas la vmax

mais ils élèvent en apparence la Km. Leur effet d’inhibition est levé par un excès de substrat.

Inhibiteurs non compétitifs : Ce sont des inhibiteurs réversibles. Ils ne se lient pas au site actif. Ils baissent la vmax mais ne

modifient pas la Km. Leur action ne pas être levée par un excès de substrat.

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152


Exercice 4 :

Certaines enzymes fonctionnent avec des coenzymes ou cofacteurs (sans eux l’enzyme n’est pas fonctionnelle). Les coenzymes ou cofacteurs sont des métabolites non protéiques et de faible masse moléculaire comparée à la masse moléculaire. Des enzymes. Les coenzymes ont des fonctions d’accepteurs et de transporteurs radicaux libérés au cours de la catalyse et qui la facilite. Les coenzymes agissent à faible concentration et doivent, comme les enzymes être régénérés à la fin d’une réaction. Elles sont libres ou associées à l’enzyme. Les coenzymes fonctionnent de deux façons : groupement prosthétique ou cosubstrat.

Exercice 5 :

Donnez les caractéritiques d’un catalyseur :

- il augmente les vitesses de réaction - il respecte les conditions thermodynamiques de la réaction - il se retrouve intact en fin de réaction afin de faire un nouveau cycle - il agit à l’était de trace, c’est-à-dire en concentration faible

Exercice 6 :

Vmax qui reflète la capacité de l’enzyme est proportionnelle à deux facteurs. Donnez-les et veuillez indiquer leurs

définitions :

• (ET) : l’étude de la cinétique enzymatique montre qu’il y a d’autant plus de produits formés que la concentration en enzyme augmente.

➔ Sa concentration reflète la capacité de l’échantillon biologique à métaboliser le substrat

➔ Permet le dosage de l’enzyme par l’évaluation de son activité dans des conditions optimales

• K3 : il va chiffrer le nombre de molécules de substrats transformées en produit par unité de temps et par molécule d’enzyme dans les conditions non physiologiques de saturation de l’enzyme par son substrat.

➔ Représente l’activité spécifique de catalyse

153

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CONVERSION ENERGETIQUE ET RESPIRATION CELLULAIRE

I. Métabolisme énergétique

A) Ce qu’est le métabolisme

A l’intérieur de chacune des cellules, ont lieu des réactions chimiques qui correspondent au métabolisme.

Ces voies métaboliques sont la répétition ordonnées de réactions chimiques grâce aux enzymes. Ces enzymes

sont des catalyseurs biologiques qui permettent d’accélérer de

façon sélective les transformations. Les voies métaboliques sont

organisées en succession d’étapes catalysées par des enzymes

et résultant de produits spécifiques. Le métabolisme est divisé

en catabolisme pour les dégradations et en anabolisme pour les

biosynthèses. Les voies amphiboliques sont celles qui

participent à ces deux processus. Il existe par ailleurs un système

indispensable de régulation et d’interconnexion des voies

métaboliques.

B) Produire de l’énergie à partir des aliments

Le monde vivant utilise la lumière du soleil comme source

d’énergie primaire principale. Les organismes dits autotrophes sont les

végétaux supérieurs et les bactéries photosynthétiques. Leur moyen

d’extraire l’énergie est la photosynthèse. Celle-ci permet l’utilisation de

l’énergie lumineuse pour produire de l’ATP et synthétiser des molécules

organiques. Ces organismes utilisent le CO2 de l’atmosphère comme

unique source d’énergie à partir duquel ils construisent toutes leurs

molécules biologiques contenant du carbone.

Les organismes hétérotrophes sont les animaux supérieurs et la

plupart des microorganismes. Ils n’ont pas la possibilité d’utiliser le CO2

atmosphérique. Pour se procurer de l’énergie, ils prélèvent le carbone

dans leur environnement sous formes de molécules organiques comme

le glucose. Le monde vivant est donc parcouru d’un flux de matière et d’énergie dont le support est représenté

par les chaines alimentaires.

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154


Les végétaux autotrophes créent leur matière organique à partir de matière minérale. Les hétérotrophes

se nourrissent quant à eux, d’autres êtres vivants de manière à constituer leur propre matière. Tous les êtres

vivants constituent leur énergie grâce à la dégradation de la matière organique. Tous ces processus se déroulent

par des réactions d’oxydoréduction.

Le bilan de la photosynthèse est une réduction du CO2 en carbone organique. En revanche, le bilan de la

respiration correspond à une oxydation du carbone en CO2. C’est sous la forme oxydée (CO2) que le carbone est

le plus stable. La photosynthèse est consommatrice d’énergie (sous forme d’énergie lumineuse) tandis que la

respiration libère de l’énergie.

C) Potentiel Phosphorylant

Le rapport ATP/ADP permet d’exprimer le potentiel phosphorylant. L’ATP est synthétisé par un nombre

réduit de réactions qui sont au nombre de 4 :

o 2 sans oxygène : Glycolyse aérobie/anaérobie

o 2 avec oxygène : chaine respiratoire mitochondriale et cycle de Krebs avec la

chaine respiratoire, système OXPHOS comme producteur majeur.

La décomposition de l’ATP est utilisée pour l’ensemble des fonctions cellulaires nécessitant de l’énergie

(biosynthèses, contraction musculaire, potentiels de membranes qui régissent tous les phénomènes nerveux et

osmotiques, etc.).

D) Potentiel Réducteur

Le NADPH2 est l’agent principal qui permet la maintenance réductrice dans les cellules. Pour cela, on

utilise le rapport NADPH2/NADP+. Le NAPH2 est responsable du plus grand nombre des réductions

biosynthétiques. Il est aussi produit par un mode de dégradation du glucose passant par la voie des pentoses.

E) Les 4 caractéristiques principales des voies métaboliques

1) Les voies métaboliques sont IRréversibles,(de part la variation d’énergie libre qui est

négative).

155

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2) Les voies métaboliques sont initiées par une réaction fortement exergonique et

limitante.

3) Les voies métaboliques sont régulées par des enzymes.

4) Les voies métaboliques sont localisées dans des sites cellulaires spécifiques. Ceci

implique un trafic important de molécules au travers des membranes des différents

organites (transporteurs spécifiques et systèmes de navettes).

F) Aspects moléculaires

La vision d’ensemble d’une voie métabolique comprend l’équation réactionnelle qui conduit du substrat

de départ au produit final, sa place et son importance dans le métabolisme de la classe chimique considérée, et

des notions de localisation, tissu spécifique et régulation (on n’a pas besoin de réguler toutes les enzymes).

L’étude des étapes y distingue celles qui se déroulent à l’équilibre et celles qui sont irréversibles. Ces dernières

impliquent souvent un saut de potentiel exergonique et engagent irréversiblement le métabolisme dans un sens

donné.

G) Régulation du métabolisme

Les métabolismes sont constamment ajustés aux exigences de la vie quotidienne. On distingue les

variations à court terme et celles à long termes. La régulation des voies métaboliques s’effectue en général au

niveau de quelques réactions régulatrices ou limitantes.

➢ Régulation à court terme : qui varie de la seconde à la minute. L’immense majorité des

réactions donne lieu à des équilibres obéissant à la loi d’action de masse. Elle est

instantanée et ne dépend en principe que des concentrations en substrats et en produits

et des constantes d’équilibres des enzymes. La régulation des enzymes est due à

l’allostérie.

o Allostérie simple : elle est rapide et locale. Ce mécanisme régule finement le flux

des métabolites à travers une voie en augmentant ou en diminuant

temporairement l’activité d’enzymes essentielles. Ce mécanisme est instantané

er réversible. Par exemple la première enzyme d'une voie métabolique est

généralement inhibée par une action rétroactive négative du produit final de

cette voie. Si le produit final s'accumule, l'entrée de ses précurseurs dans la voie

est inhibée. Bien sûr, ce produit final peut inhiber sa propre synthèse mais aussi

activer une autre voie dont il est le substrat.

o Allostérie covalente : elle est imposée par des signaux hormonaux.

(phosphorylation covalente réversible des enzymes par exemple).

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156


➢ Régulation à long terme : elle correspond à celle du taux d’enzymes par la régulation de

leur synthèse/dégradation

H) Rôles des hormones dans la régulation des métabolismes

Les hormones ont un rôle dans la régulation du métabolisme. L’hormone est une substance chimique

synthétisée en petite quantité par un tissu endocrine spécialisé et transporté dans le sang vers un autre tissu, où

elle agit comme messager pour réguler la fonction du tissu ou de l’organe cible. Ces derniers affectent aussi bien

l’activité des enzymes à court terme que leur taux à long terme. Les hormones coordonnent les voies

métaboliques entre elles. Par exemple : elles peuvent activer la dégradation du glucose (glycolyse) ou bien inhiber

la synthèse su glucose (néoglucogénèse).

Les voies métaboliques peuvent fonctionner sur le mode séquentiel (glycose anaérobie), sous forme de

complexe multienzymatique (PDH), sous la forme de cycle métabolique (cycle de l’acide citrique), sous forme

« d’hélice métabolique » (oxydation des acides gras) et sous la forme de complexes multienzymatiques enchâssés

dans une membrane (chaine respiratoire mitochondriale).

II. Bioénergétique

Les organismes et les cellules vivants doivent effectuer un travail pour demeurer vivants, se reproduire et

croître. La possibilité de prélever de l'énergie à partir de sources variées, et de la canaliser en travail biologique

est une propriété fondamentale des organismes vivants. La bioénergétique est l’étude des transferts d’énergie

se produisant dans les cellules vivantes, et l’étude de la nature des processus chimiques sous-tendant ces

transferts.

Selon le premier principe de la thermodynamique, l’énergie reste constante dans l’univers même s’il y a

eu des modifications physiques ou chimiques. Les cellules vivantes et les organismes sont des systèmes ouverts

qui échangent à la fois de la matière et de l’énergie avec leur environnement.

L’énergie libre de Gibbs (G) nommée également enthalpie libre, exprime la part d’énergie disponible

pour la réalisation d’un travail lors d’une réaction à température et pression constante. C’est l’énergie récupérable

de notre organisme. Lorsqu’une réaction s’accompagne d’une libération d’énergie libre, la variation d’énergie

libre est négative donc on parle de réaction exergonique. Cependant, lorsque le système gagne de l’énergie

libre, ∆G est de signe positive. Le système est à l’équilibre quand la variation d’énergie libre est égale à zéro.

La variation de l’énergie libre standard (∆G°’) exprime cette ∆G dans les conditions biochimiques

standard qui sont pH=7, 25°C, pression constante ou encore concentration initiale de chaque composé de 1M…

Lorsque ∆G°’ est négative, les produits contiennent moins d’énergie libre que les réactifs. Dans ce cas, les

réactions chimiques tendent à aller dans le sens correspondant à une diminution d’énergie libre du système, la

157

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réaction se produit spontanément dans le sens de la formation des produits. Quand la ∆G°’ est positive, cela

signifie que les produits de la réaction contiennent plus d’énergie libre que les réactifs. La réaction va donc tendre

à aller dans le sens retour. Lorsque que ∆G°’ est égale à zéro, cela signifie que la réaction est à l’équilibre.

Retenons que ∆G°’ nous indique donc dans quel sens et avec quelle intensité la réaction va se produire

pour atteindre l’équilibre dans les conditions standard. L’oxydation des composés organiques en CO2 et H2O se

passe avec une très grande diminution d’énergie libre standard. La ∆G°’ de l’oxydation complète du glucose est

égale à -2840 kJ/mol. ∆G°’ est donc le reflet de la quantité maximale d’énergie libre qu’une réaction peut

théoriquement fournir. Cette quantité d'énergie ne pourrait cependant être fournie que s'il existait un dispositif

parfaitement efficace pour canaliser cette énergie. La quantité de travail fournit par la réaction est toujours

inférieure à cette valeur théorique.

Couplage énergétique

Les valeurs de ∆G°’ de réactions chimiques séquentielles sont additives. Ce principe de bioénergétique

explique comment une réaction thermodynamiquement défavorable c’est-à-dire endergonique peut évoluer

dans le sens aller quand elle est couplée à une réaction fortement exergonique grâce à un intermédiaire commun.

Par exemple, la synthèse du glucose-6-phosphate est la première étape de l’utilisation du glucose par de

nombreux organismes :

o Glucose + Pi --> Glucose-6-phosphate + H20 ; ∆G°’ =+13,8 kJ/mol

La valeur positive de ∆G°’ indique que la réaction est endergonique et ne tiendra pas à évoluer dans le

sens décrit ci-dessus.

Une autre réaction cellulaire, l’hydrolyse de l’ATP en ADP+Pi est très exergonique

o ATP+H20 --> ADP+Pi ; ∆G°’ = -30,5 kJ/mol.

Ces deux réactions ont en commun les intermédiaires Pi et H20 et peuvent être exprimées comme des

Réactions séquentielles dont la somme est :

o ATP + Glucose --> ADP + Glucose-6-phosphate

La variation d’énergie libre standard globale est obtenue en additionnant. Les valeurs des réactions individuelles

(-16,7 kJ/mol), la réaction globale est donc exergonique et favorable.

Il faut nécessairement un couplage pour que les réactions se déroulent. Dans la cellule de très nombreuses

réactions endergoniques sont ainsi couplées à l’hydrolyse exergonique de l’ATP. L’énergie stockée dans les

liaisons de l’ATP est utilisée pour permettre la synthèse de glucose-6-phosphate. Dans ce système l’ion

phosphate est l’élément du couplage. Il faut rendre les réactions interdépendantes par l’intervention d’élément

participant aux deux réactions, dans notre exemple l’ion phosphate est l’intermédiaire.

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158


Dans les systèmes biologiques, nous verrons qu’il existe 3 principaux systèmes de couplage (ici le

couplage se fait avec l’ion phosphate) :

o Couplage chimio-osmotique (flux de protons à travers une membrane couplée à la synthèse

d’ATP par exemple dans la chaine respiratoire)

o Couplage osmo-osmotique (le transport actif d’un ion à travers une membrane est couplé au flux

exergonique spontané d’un autre ion)

o Couplage Chimio-chimique (couplage entre deux réactions chimiques)

Les énergies de gradient

Lorsqu’une molécule non chargée traverse une membrane biologique, elle change de concentration de

part et d’autre de la membrane et ce transfert s’accompagne donc d’une variation d’énergie libre. Si ce flux se

réalise dans le sens des concentrations décroissantes, le flux est exergonique. Donc une différence de

concentration de part et d’autre d’une membrane constitue une forme d’énergie potentielle éventuellement

récupérable par la cellule lors de la dissipation de ce gradient. Lorsque la molécule est chargée, la différence de

potentiel électrique est aussi une source d’énergie libre. Il faut donc considérer ce gradient de concentrations et

le gradient électrique. On parle donc de gradient électrochimique. Toutes les cellules utilisent des gradients

électrochimiques comme forme d’énergie potentielle.

Réactions de transfert de groupes de phosphates et rôle central de l’ATP

L’ATP est la forme universelle de transfert d’énergie. Les couples ATP/ADP ou ATP/AMP constituent la

monnaie d’échange énergétique la plus repandue dans les systèmes vivants. On phosphoryle l’ADP en

permanence. Le rapport ATP / ADP est par ailleurs très constant.

Il s’agit de vecteurs d’énergie impliqués dans les réactions faisant intervenir des transferts de groupes

phosphorylés, transferts particulièrement fréquents dans le métabolisme.

Les réactions de formations et d’hydrolyse de l’ATP sont les suivantes :

ATP+H2O ADP +Pi et ATP+H2O AMP+Ppi

Le symbole Pi désigne le phosphate inorganique (P04 3-), c’est-à-dire l’ion phosphate non lié à une

molécule organique. Le symbole PPi correspond au pyrophosphate (P2O74-) constitué de deux ions phosphates

reliés par une liaison anhydre. Certaines réactions ne nécessitent que l’énergie libre résultant de l’hydrolyse d’un

Pi. D’autres nécessitent l’hydrolyse du PPi puis l’hydrolyse supplémentaire du PPi en 2Pi (plus exergonique).

159

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Cycle de l’ATP

L’ATP ne doit pas être considéré comme un réservoir d’énergie libre mais bien comme une entité de

transfert d’énergie libre. En effet, l’ATP est continuellement utilisé et regénéré. On considère qu’un individu

régénère l’équivalent de son propre poids d’ATP par jour alors que la quantité totale d’ATP présente dans

l’organisme n’est que des quelques milligrammes. On consomme donc chaque jour l’équivalent de notre poids en

ATP.

Pourquoi la variation d’énergie libre de l’hydrolyse de l’ATP est-elle élevée et négative ?

La ∆G°’ de l’ATP est égale à -30,5 kJ/mol. L’intérêt énergique de l’ATP réside dans l’instabilité des liaisons

anhydres reliant les phosphoryles dans la molécule. Les produits (ADP+Pi) sont plus stables que le substrat

(ATP). L’ATP est une molécule instable donc on va devoir emmagasiner de l’énergie. L’ATP va vouloir se

stabiliser, donc s’hydrolyser.

En effet, du fait des charges négatives qu’ils portent, ces groupements ont tendance à se repousser les

uns les autres, ce qui joue à l’encontre de la stabilité des liaisons covalentes les reliant. Il faut imaginer que ces

liaisons relient 2 molécules se repoussant fortement à cause d’un ressort comprimé. L’hydrolyse de la liaison rend

disponible alors l’énergie potentielle contenue dans le ressort. Ainsi les liaisons les plus instables sont celles

dont la formation requiert le plus d’énergie et dont l’hydrolyse en libère le plus.

Le terme de « liaison riche en énergie », bien que couramment utilisé, est incorrect et trompeur car il

suggère à tort que la liaison elle-même contient de l’énergie.

➔ L’ATP n’a donc pas de liaison riche en énergie : abus de langage.

En réalité, l’énergie libérée par l’hydrolyse du composé phosphorylé ne provient pas de la rupture d’une

liaison spécifique, mais résulte du fait que les produits de réaction ont un contenu en énergie libre plus faible que

les réactifs. Il est donc préférable d’appeler ces liaisons «liaisons à haut potentiel d’hydrolyse ». Les produits de

la réaction d’hydrolyse de l’ATP (ADP et Pi) sont plus stables (et moins riche en énergie) que l’ATP lui-même ce

qui oriente la réaction dans le sens de l’hydrolyse.

Cette augmentation de la stabilité est due à de nombreux facteurs :

1. L’hydrolyse de liaison anhydre-acide phosphorique terminale de l’ATP diminue en partie les

répulsions électrostatiques des 4 charges négatives de l’ATP.

2. Le Pi (HPO42-) libéré tout seul est stabilisé par la formation de plusieurs formes résonnantes

qui ne sont pas possibles dans l’ATP (chacune des 4 liaison P-O a le même degré de caractère

de double liaison)

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160


3. L’ADP s’ionise immédiatement en libérant un H+ dans un milieu de très faible concentration

en ions H+ (Ph7). La faible concentration des produits favorise, d’après la loi d’action de

masse, la réaction d’hydrolyse.

4. Les produits de l’hydrolyse (ADP et Pi) sont plus solubles que l’ATP lui-même ce qui stabilise

plus les produits que les réactifs. L’ionisation de l’ADP est stabilisante.

D’autres composées ont également des énergies libres d’hydrolyse importantes

Les composés « riches en énergies » ont une

∆G°’ plus négative que -25kJ/mol. Les composés

« pauvres en énergie » ont une ∆G°’ moins négative.

L’ATP est donc un composé riche en énergie tandis

que le glucose-6-phosphate est un composé pauvre

en énergie (car ne possède pas de liaison à haut

potentiel d’hydrolyse). L’ATP est un vecteur

d’énergie mais ce n’est pas la molécule la plus

riche en énergie que l’on puisse trouver dans la

cellule. Bien au contraire, sa position intermédiaire

facilite son rôle de vecteur d’énergie libre. Cette

position intermédiaire lui permet de servir

d’intermédiaire entre des composés donneurs et accepteurs de groupes phosphates. De ce fait les hydrolyses à

∆G°’ plus négatif que celle de l’ATP permettent le transfert de leur groupement phosphate à l’ADP pour former

l’ATP. Celui-ci peut alors transférer son groupe phosphate pour former des produits phosphorylés dont le ∆G°’

d’hydrolyse en valeur négative est plus faible. On voit dans ce tableau que l’hydrolyse du phosphoénolpyruvate,

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du 1,3-biphosphoglycérate et de la créatine phosphate peuvent être couplé à la phosphorylation de l’ADP en ATP

car leur contenu en énergie est supérieur à celui de l’ATP.

L'ATP fournit de l'énergie par transfert de groupement, pas uniquement par simple hydrolyse

Tout au long de cet enseignement, la contribution de l'ATP à une réaction sera représentée par une flèche

simple montrant la conversion de l'ATP en ADP + Pi (ou en AMP + PPi). Présentées de cette façon, ces réactions

semblent être de simples réactions d'hydrolyse et on serait tenté de penser qu'une réaction ATP-dépendante est

rendue possible par l'hydrolyse de l'ATP. Cela n'est pas le cas puisque l'énergie libérée par une telle hydrolyse

serait immédiatement dissipée sous forme de chaleur. La réaction réelle se produit en 2 étapes comme sur le

schéma représentant la réaction catalysée par la glutamine synthétase ATP-

dépendante :

- Le groupement phosphate est dans un premier temps transféré sur

le substrat ou sur l'enzyme. Cette fixation covalente augmente le

contenu en énergie libre du substrat ou de l'enzyme.

- Dans un deuxième temps l'hydrolyse cette liaison à haut potentiel

d'hydrolyse favorise la réaction. Le transfert d'un groupement

phosphate sur un composé introduit de l'énergie libre dans ce

composé pour qu'il ait une énergie libre plus importante à libérer

lors des transformations métaboliques ultérieures (Cf. la glycolyse).

Dans certaines réactions qui impliquent l'ATP, ses deux groupements phosphates terminaux sont libérés

en une fois sous la forme de PPi (pyrophosphate). Simultanément, l'AMP est attaché sur un composé qui se

trouve ainsi activé. Par exemple la première étape de l'activation d'un acide gras avant d'être oxydé, est sa

liaison sur une molécule porteuse, le coenzyme A pour former un acyl-CoA. La condensation directe d'un

acide gras sur le CoA est endergonique, mais la formation de l'acyl-CoA est rendue exergonique par couplage

avec l'hydrolyse en deux étapes de l'ATP comme ceci est montré sur le schéma suivant :

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Dans la première étape, l'AMP est transféré de l'ATP sur

le groupement carboxyle des acides gras avec libération de

PPi. Dans la deuxième étape, le groupement thiol du CoA

déplace l'AMP et forme un thioester avec l'acide gras. La

formation d'acyl-CoA est endergonique (ΔG°'= 27 kJ/mol).

La ΔG°' d'hydrolyse de la liaison entre le deuxième et le

troisième phosphate est de –30,5 kJ/mol comme nous

l'avons vu précédemment. Celle de la liaison entre le premier

et le deuxième phosphate est de –34 kJ/mol. La formation

d'acyl-CoA est rendue énergiquement favorable par une

3ème réaction au cours de laquelle le PPi formé lors de la

première étape est hydrolysé par une enzyme ubiquitaire, la

pyrophosphatase inorganique pour donner 2 Pi :

ATP +H2O → AMP + PPi [ΔG°'= -34 kJ/mol]

PPi + H2O → 2 Pi [ΔG°'= -25 kJ/mol]

L'intérêt de ce dernier type de réaction est lié à la nature également très instable du PPi qui va donc être

hydrolysé. Ainsi, lors de l'activation d'un acide gras, les deux liaisons anhydride phosphorique de l'ATP sont

hydrolysées. La ΔG°' résultante est la somme des valeurs de ΔG°' d'hydrolyse de chacune de ces deux liaisons

: ATP + 2H2O → AMP + 2Pi [ΔG°'= -59 kJ/mol]

L’énergie d’oxydoréduction

De la même manière que les transferts de groupements phosphate, les réactions métaboliques de

transfert d’électrons ont une importance cruciale dans le métabolisme énergétique. Le flux d’électrons dans les

réactions d’oxydoréduction est responsable, directement ou indirectement, de tout le travail fourni par les

organismes vivants. Chez les organismes hétérotrophes, les électrons sont fournis par des composés réduits. Le

chemin suivi par le flux d’électrons dans le métabolisme est complexe. Lors de réactions catalysées par des

enzymes, ils sont pris en charges par des transporteurs d’électrons spécialisés puis ils cheminent

progressivement à travers des transporteurs d’électrons de plus en plus affines. La chaine respiratoire

mitochondriale convertit l’énergie du flux d’électrons en travail utile.

Le flux d’électrons peut fournir un travail biologique

La conversion du flux d’électrons en travail biologique nécessite des transformateurs moléculaires

analogues aux moteurs électriques qui convertissent un flux d’électrons en mouvement mécanique. Dans le

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circuit macroscopique, la source d’électrons est une batterie contenant 2 espèces chimiques qui diffèrent par leur

potentiel redox. Le fil électrique fournit le chemin pour les électrons. Cette force électromotrice peut fournir un

travail si un transformateur (moteur) est couplé à un système mécanique permettant d’accomplir ce travail. Dans

un circuit biologique analogue, la source d’électrons est un composé réduit tel que le glucose. Lors de l’oxydation

du glucose, les électrons se déplacent le long de différents transporteurs vers le transporteur qui a la plus forte

affinité pour les électrons. Cette force électromotrice est convertie par la chaine respiratoire mitochondriale

(transformateur) en un travail chimique : l’ATP est synthétisée à partir de l’ADP + Pi. L’énergie libre de l’ATP

pourra ensuite être utilisée pour différents travaux cellulaires comme le mouvement mécanique par exemple.

Les oxydations biologiques impliquent souvent une déshydrogénation

Dans les cellules vivantes, on peut trouver le carbone sous 5 états

d’oxydation différents. Dans les composés réduits les atomes de carbone

sont riches en électrons et en hydrogènes. Les composés oxydés sont liés à

plus d’oxygène et moins d’hydrogène. Dans cette liste présente ci-dessous,

l’oxydation d’un atome de carbone est synonyme de sa

déshydrogénation.

Dans les molécules organiques les électrons sont transférés d’une

molécule à l’autre par l’un des 4 moyens suivants :

o Ils peuvent transférés directement sous la forme d’électrons

(grâce au fer ou au cuivre qui sont des oxydoréducteurs)

o Les électrons peuvent être transférés sous la forme d’atomes d’hydrogène. Un atome

d’hydrogène est constitué d’un proton (H+) et d’un électron (e-).AH2 <-> A + 2e- + 2H+ (AH2 est

le donneur d'électron ou d'hydrogène). AH2/A constitue le couple redox qui peut réduire un

composé B par transfert d'atome d'hydrogène : AH2 + B <-> A + BH2.

o Les électrons peuvent être transférés sous la forme d’un ion hydrure (H-) qui comprend 2

électrons et un proton.

o Un transfert d’électron peut enfin avoir lieu quand se produit une combinaison directe entre un

réducteur organique et de l’oxygène pour donner un produit dans lequel l’oxygène est incorporé

de façon covalente.

Le terme d’équivalent réducteur est utilisé pour désigner un équivalent d’électron participant à une

réaction d’oxydoréduction qu’il soit la forme d’un électron, d’un atome d’hydrogène, d’un ion hydrure ou d’un

atome d’oxygène fixé.

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Les cofacteurs des processus d’oxydoréduction

Ce sont essentiellement des coenzymes dérivés de vitamines et les hémoprotéines contenant de l’hème.

Les cellules contiennent des enzymes permettant l’oxydation de centaines de composés. Ces enzymes canalisent

les électrons de leur substrat vers certains types de transporteurs universels d’électrons. Les nucléotides NAD,

NADP, FMN, FAD sont des cofacteurs solubles dans l’eau qui subissent une oxydoréduction réversible lors de

nombreuses réactions de transfert d’électrons du métabolisme. Leur réduction au cours de processus

cataboliques se traduira par la conservation de l’énergie libre libérée par l’oxydation des substrats. NAD+ et

NADP+ bougent facilement d’une enzyme à une autre (cosubstrat) tandis que FMN et FAD sont liés de façon

covalente à leurs enzymes (coenzyme vrai ou groupement prothétique). Les quinones sont solubles dans les

lipides. Les protéines à centre fer-soufre et les cytochromes sont des protéines dont les groupements

prothétiques subissent une oxydoréduction réversible.

Nicotinamide adénine dinucléotide

Le rapport NAD+/NADH2 est élevé dans les cellules ce qui favorise la captation de l’ion hydrure sur le

NAD+. En revanche, le rapport NADPH2 /NADP+ est élevé ce qui favorise la perte de l’ion hydrure par NADPH +

H+. Le NAD est principalement utilisé lors des oxydations métaboliques tandis que le NADP est dévolu aux

réductions biosynthétiques et au maintien du potentiel réducteur de la cellule. Plus de 200 enzymes

(oxydoréduction ou déshydrogénases) utilisent ces coenzymes dans la cellule. Les réactions pour passer de l’un à

l’autres sont : NAD+ + 2e- + 2H+ → NADH + H + et NADP+ + 2e- + 2H+→ NADPH + H +

FAD (Flavine Adénine Dinucléotide) et FMN (Flamine Mononucléotide)

Ce sont des coenzymes vraies. Les flavoprotéines sont des enzymes qui catalysent des réactions

d’oxydoréduction en utilisant soit le FMN soit le FAD comme coenzyme. La structure en cycle fusionné des

flavines nucléotides peut subir des réductions réversibles en acceptant un ou deux électrons sous la forme

d’atomes d’hydrogène pris à un substrat réduit (FADH, FMNH ou FADH2 et FMNH2).

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Les cytochromes

Ce sont des protéines de transfert d’électrons, contenant du fer. Leur

couleur brune caractéristique est due à la présence de l’hème. Les hèmes sont les

groupements prothétiques de nombreuses protéines : les hémoprotéines. Elles

assurent le transport de l’oxygène (hémoglobine, myoglobine) ou le transfert

d’électrons (catalases, peroxydases, cytochromes). L’hème appartient au groupe

des porphyrines, caractérisées par un noyau tétrapyrolique. Les quatre noyaux

pyrroles sont unis en un cycle par des groupements méthényls. La molécule est

plane. Le cycle tétrapyrrollique maintient en son centre un ion Fe2+ ou Fe3+ par

liaisons de coordination avec les N pyrroliques.

Protéines fer-soufre

Dans ces protéines de transfert d’électrons contenant du fer.

L’atome de fer est, dans ce cas, associé aux atomes de souffre de résidus

de Cystéines de la protéine. Ces centres fer-soufre vont d’une structure

simple avec un seul atome de fer lié par coordinence à 4 résidus de Cys,

par l’intermédiaire du soufre de leur chaine latérale, à des centre fer-

soufre plus complexes avec 2 ou 4 atomes de fer. Comme dans les

hémoprotéines, le fer oscille entre les état Fe2+ et Fe3+.

Autres métalloprotéines

Des métalloprotéines à cuivre peuvent également jouer un rôle dans les transports d’électrons

L’ubiquinone (UQ), également appelée coenzyme Q

C’est une benzoquinone liposoluble (très longue chaine hydrophobe)

avec une longue chaine isoprénoide. Son rôle biologique est de transporter des

électrons au sein d’une membrane. L’ubiquinone peut accepter un électron

pour se transformer en radical semi-quinone (UQH) ou deux électrons pour

donner l’ubiquinol. Comme les transporteurs flavoprotéiniques , elle peut donc

assurer la jonction entre un donneur de deux électrons et un accepteur d’un seul

électron. Puisque l’ubiquinone est à la fois hydrophobe et de petite taille, elle

diffuse librement dans la bicouche lipidique de la membrane interne de la

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mitochondrie et sert à transporter des équivalents réducteurs vers d’autres transporteurs de la membrane moins

mobiles.

Le coenzyme A – transporteur d’acyl

Le coenzyme A (CoA) est un cosubstrat, transporteur d’acyle dans un certain nombre de réactions

métaboliques. C’est un élément capital de l’oxydation des aliments. Ce n’est pas une coenzyme intervenant dans

les réactions oxydo-réduction. Il est composé d’une molécule d’ADP unie par une liaison pyrophosphorique à une

molécule d’acide pantothénique qui lui-même est relié à la β-mercaptoéthylamine par une liaison amide. En

outre, il y a un ester phosphorique en 3’ du ribose. Les groupements acyles sont liés par covalence au groupement

thiol réactif (SH-) de la mercaptoéthylamine formant ainsi des thioesters. Le groupement thiol forme par

exemple un thioester avec mercaptoethylamine formant ainsi des thioesters. Le groupement thiol forme par

exemple un thioester avec l’acétate pour former l’acétyl-CoA. L’acide pantothénique est une vitamine B5. On voit

rarement des carences du fait de son abondance dans l’alimentation usuelle.

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III. Glycolyse (=dégradation ANAérobie du glucose)

Cette voie métabolique est la plus ancienne de l’évolution. Nous allons voir comment l’énergie chimique

stockée dans le D-glucose est libérée pour réaliser un travail biologique. Le D-glucose est le principal carburant

de la plupart des organismes et il occupe une position centrale dans le métabolisme.

Il est riche en énergie potentielle et son oxydation complète en CO2 et H2O s’effectue avec une

modification standard d’énergie libre -2840 kJ/mol.

Apports cellulaires en glucose

La majorité des glucides apportés par l’alimentation existent sous la forme de disaccharides (saccharose,

lactose) ou de polysaccharides (amidon), mais seuls les monosaccharides sont capables de rentrer dans la

cellule. La digestion des glucides consiste donc en l’hydrolyse de ces molécules en monosaccharides par des

enzymes salivaires, pancréatiques et intestinales. Puis les monosaccharides traversent les entérocytes pour

rejoindre la circulation sanguine qui va alimenter les cellules de l’organisme. Les glucides dits rapides constitués

par exemple de boissons sucrées riches en glucose et saccharose sont rapidement absorbés et métabolisés tandis

que les glucides « lents » sont libérés progressivement sous l’action de l’amylase et sont donc absorbés de façon

lente et continue au niveau des entérocytes. La membrane cellulaire étant composée d’une bicouche lipidique,

elle est imperméable à ces molécules hydrophiles. Des transporteurs protéiques du glucose sont nécessaires.

On retrouve deux familles de transporteurs du glucose : les GLUT qui permettent une diffusion facilitée du

glucose (ils n’utilisent pas d’énergie) et SGLUT qui ont pour rôle de permettent un transport actif donc

consomme de l’énergie. Les différentes isoformes de ces deux familles de transporteurs permettent la

vectorisation du glucose dans les différents tissus

Devenirs du glucose dans les cellules

Chez les animaux supérieurs le glucose possède 3 principaux destins. Il peut être stocké sous la forme

d’un polysaccharide (glycogène), oxydé en un composé à 3 carbonesou bien oxydé en pentose par

l’intermédiaire de la voie des pentoses phosphates.

Définition de la glycolyse

La glycolyse est la voie métabolique universelle au cours de laquelle 1 molécule de glucose est

transformée en 2 molécules de pyruvate. La glycolyse se produit dans le cytosol. C’est une voie anaérobie qui

ne nécessite pas l’intervention d’oxygène moléculaire. Cette voie métabolique se déroule en 10 étapes dont 3

sont irréversibles. Elle est amphibolique, c’est-à-dire, elle participe au catabolisme et à l’anabolisme. Au cours

de la glycolyse une partie de l’énergie libérée à partir du glucose est conservée sous forme d’ATP. La glycolyse

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réduit du NAD+ en NADH + H+. En aérobiose ce NADH + H+ sera transféré dans la mitochondrie, ou il sera

réoxydé. En Anaérobiose, le NAD+, nécessaire à la glycolyse, sera régénéré par la fermentation lactique.

Si la dégradation s’arrête au pyruvate, c’est une fermentation lactique. La glycolyse est la seule source

d’ATP cellulaire. La fermentation désigne la dégradation anaérobique du glucose (ou autres nutriments) pour

obtenir de l’énergie sous forme d’ATP. Les premiers organismes vivants étant apparus dans une atmosphère

dépourvue d’oxygène, la dégradation anaérobie du glucose est le plus ancien mécanisme biologique d’obtention

de l’énergie à partir de molécules de carburant organiques. La phosphorylation oxydative produit 36-38

molécules d’ATP et la fermentation en produit 2.

Stratégie glycolytique

1. Engager le glucose dans la voie en le phosphorylant (activation) au prix de l’hydrolyse d’un ATP en

ADP (G-->G6P)

2. Dégrader le squelette à 6 carbones pour former 2 dérivés à 3 carbones

3. Utiliser l’énergie libre de l’oxydation de ces dérivés pour les convertir en composés à haut potentiel

d’hydrolyse

4. Coupler l’hydrolyse de tels composés à la formation d’ATP.

La liaison riche n’existe pas à proprement parler sur le glucose

La glycolyse consiste à créer des liaisons à haut potentiel d’hydrolyse, puis l’hydrolyse de cette

liaison va donner de l’ATP.

Equation réactionnelle globale

La glycolyse consiste est la scission oxydative du glucose en 2 molécules de pyruvate, en présence de

phosphate inorganique, d’ADP, et de NAD+. Le glucose est oxydé en pyruvate et le NAD est réduit en NADH2.

Il y a la production de 2 ATP et de deux paires d’atomes d’hydrogènes, sous forme de coenzymes réduits, par

molécules de glucose.

Les deux parties de la glycolyse

Les réactions peuvent être groupées en 2 phases :

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1. Une première phase est dite préparatoire : le glucose est

converti en 2 molécules de glycéraldéhyde-3-phosphate au prix

de l’hydrolyse de 2 ATP. Au cours de cette phase 2 molécules

d’ATP doivent être investies pour activer la molécule de

glucose et permettent son clivage en 2 fragments à 3 carbones.

Cette phase corresponds aux étapes 1 à 5 de la glycolyse.

2. Une seconde phase est dite de remboursement : les 2

molécules de glycéraldhéhyde-3-phosphate sont converties en

pyruvate avec la formation de 4 ATP. Le rendement net est

donc de 2 molécules d’ATP produites par molécule de glucose

utilisée. L’énergie est également conservée dans cette phase par la formation de 2 molécules

NADH + H+ par molécule de glucose. Cette phase constitue les 5 dernières étapes.

Les étapes de la glycolyse

La glycolyse se déroule en 10 étapes dont 7 sont

librement réversibles et se déroulent à l’équilibre. 3 sont des

étapes décisives irréversibles. C’est à leur niveau que s’effectue

la régulation de la glycolyse.

Remarque :Toutes les étapes de la glycolyse, ainsi que leur

enzyme sont à connaître par cœur.

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a) Phase préparatoire

Etape 1 : Phosphorylation du glucose (hexokinase) : G+ ATP → G6P + ADP

L’hexokinase catalyse la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate. L’ATP est le donneur de

phosphate. C’est une réaction Irréversible.

Etape 2 : Conversion du G6P en F6P (phosphoglucose isomérase) : G6P → F6P

Isomérisation du G6P en fructose 6 phosphate (F6P) par la phosphoglucose isomérase. Il s’agit d’un

réarrangement réversible.

Etape 3 : phosphorylation du FP6 en F1,6BP : F6P + ATP → F1,6BP + ADP

La phosphofructokinase catalyse une réaction de phosphorylation couplée à l’hydrolyse d’un second ATP en

ADP. Elle conduit à la formation de fructose-1,6-Biphosphate. Réaction Irréversible. C’est le point majeur de la

régulation de la glycolyse.

Etape 4 : clivage du F1,6BP par l’aldolase. : F1,6BP → DHAP + G3P

Réaction réversible. Elle catalyse une coupure du F1,6BP, générant 2 composés à 3 carbones différents, la

dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Elle se produit entre les atomes

de carbones 3 et 4 de la molécule symétrique de fructose 1-6 diphosphate.

Etape 5 : interconversion des trioses phosphates par la triose phosphate isomérase : DHAP

→ G3P

Elle catalyse l’isomérisation de la DHAP en G3P. En effet, la DHAP et le G3P sont des isomères et seul le

G3P est utilisé comme substrat dans la réaction suivante de la glycolyse. Le triose phosphate isomérase est une

enzyme extrêmement active, de sorte que la réaction ne soit pas limitante, et que l’oxydation consécutive du G3P

déplace l’équilibre. Tout se passe comme si la coupure du F1,6DP ne produisait que du G3P.

b) Phase de remboursement

Etape 6 : oxydation du G3P en 1,3BPG par G3P déshydrogénase. : G3P + NAD + + Pi → 1,3

BPG

Elle catalyse la formation du premier intermédiaire de « haute énergie ». Le G3P est oxydé par NAD+ et

phosphorylé par le Pi, donnant le 1,3-biphosphoglycérate (1,3BPG). C’est une étape réversible. C’est l’étape où le

phosphate inorganique et le NAD+ sont indispensables. L’énergie produite par l’oxydation de l’aldéhyde en acide

est compensée par la synthèse d’une liaison à très fort potentiel d’hydrolyse du 1,3 bi phosphoglycérate, de sorte

que la réaction se passe à l’équilibre. Le transfert intramoléculaire des atomes d’hydrogène se fait sur une

molécule de NADH + H+. Le NADH + H+ formé doit être réoxydé en NAD+ pour que la glycolyse se poursuive.

Etape 7 : Transfert du phosphate du 1,3 BPG à l’ADP par phosphoglycérate kinase (PGK) :

1,3BPG +ADP →3PG +AT¨P

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Elle catalyse la formation de la première réaction de phosphorylation endergonique de l’ADP en ATP.

Catalysée par la phosphoglycérate kinase en présence de Mg++, elle transfère la liaison riche en énergie de

l’anhydride mixte à l’ATP à l’équilibre. Elle génère du 3-phosphoglycérate (3PG). C’est une réaction de couplage

énergétique chimio-chimique.

Etape 8 : transformation du 3PG en 2PG grâce à la phosphoglycérate mutase (PGM). :

3PG→2PG

Elle catalyse la conversion réversible du 3PG en 2-phosphoglycérate, c’est-à-dire le déplacement du

groupement phosphate entre le C2 et le C3 du glycérate. Le terme de mutase est donné aux enzymes qui

catalysent le transfert d’un groupement fonctionnel d’une position à une autre sur la même molécule.

Etape 9 : Déshydratation du 2PG en PEP grâce à l’énolase. : 2PG →PEP +H2O

Elle catalyse la formation du second intermédiaire de haute énergie, le Phosphoénolpyruvate (PEP).

L'énolase est une enzyme qui, par le départ d'une molécule d'eau, rend la molécule riche en énergie, et prépare

la deuxième synthèse d'ATP. La surveillance de la glycémie est important en médecine. Pour une mesure

correcte, il faut empêcher la consommation du glucose par les globules rouges dans le tube de sang. Pour se faire,

le tube contient du fluorophosphate qui inhibe l'énolase, empêchant ainsi la glycolyse dans les cellules.

Etape 10 : transfert du groupement phosphate du PEP à l’ADP, catalysée par le pyruvate

kinase : PEP + ADP →Pyruvate + ATP

Elle catalyse le couplage chimio chimique irréversible de l’hydrolyse du PEP à la formation de la seconde

molécule d’ATP.

En résumé donc :

3 étapes irréversibles :

o Etape 1 : Entrée et phosphorylation du glucose par l’hexokinase. C’est ce qui marque le point de départ

de cette glycolyse.

o Etape 3 : Rendre la molécule de fructose symétrique avant la scission par la phosphofructokinase qui est

l’enzyme régulatrice principale

o Etape 10 : par le pyruvate kinase

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Devenir du pyruvate

Trois voies cataboliques alternatives sont utilisées par le pyruvate. Dans les organismes ou tissus

aérobies, dans des conditions aérobies, la glycolyse constitue seulement la première étape de la dégradation

complète du glucose.

Première voie catabolique :

➢ Le pyruvate est oxydé dans la mitochondrie par le pyruvate déshydrogénase, avec

perte d’un CO2 pour fournir l’acétyl-coenzyme A

➢ Celui-ci est ensuite complètement oxydé en CO2 par le cycle de Krebs.

➢ Les électrons provenant de ces oxydations passent à travers la chaine des transporteurs

de la mitochondrie pour former H20

➢ L’énergie de ces réactions de transfert d’électrons assure la synthèse d’ATP dans la

mitochondrie

➢ L’oxydation des acétyl-CoA par le cycle de l’acide citrique (2ATP), et celle des coenzymes

réduits par la chaine respiratoire produit 36 à 38 ATP par molécule de glucose, selon le

type de navette empruntée par le NADH2 pour gagner la mitochondrie.

Deuxième voie catabolique : le pyruvate est réduit en

lactate par l’intermédiaire de la fermentation

lactique.

➢ Cette voie catabolique permet la glycolyse de se

poursuivre en l’absence d’oxygène ; la

transformation du pyruvate en lactate est catalysée

par le lactate déshydrogénase qui possède du NAD

comme coenzyme.

➢ La transformation du pyruvate en lactate

s’accompagne d’une oxydation du NADH + H+ en

NAD+ et permet ainsi à la glycolyse (dont l’un des

substrats est le NAD+) de se poursuivre.

➢ Le lactate quitte la cellule par la circulation sanguine

et rejoint le foie ou il est retransformé en pyruvate puis en glucose. L’excès de production d’acide lactique

lors de l’effort musculaire intense (anaérobie) est à l’origine de la crampe musculaire ; le dosage du lactate

sanguin, très utilisé dans les services de réanimation, est un bon marqueur de l’état d’oxygénation

tissulaire

173

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Troisième voie catabolique : le catabolisme du pyruvate conduit à l’éthanol également. Elle se produit

dans certains organismes comme la levure. Le pyruvate est transformé anaérobiquement en éthanol et CO2 par

la fermentation alcoolique.

Régulation

Les enzymes qui catalysent ces réactions (hexokinase, phosphofructokinase et pyruvate kinase) sont

donc soumises à des mécanismes de régulation. Le site de régulation majeur de la glycolyse se situe au niveau de

la phosphofructokinase.

C’est le niveau énergétique de la cellule, et donc les concentrations d’ATP et d’AMP, qui déterminent la

régulation de la glycolyse.

Si le niveau énergétique est bas, l’augmentation de la concentration intracellulaire d’AMP va augmenter

l’activité de la phosphofructokinase (régulateur allostérique). A son tour, l’augmentation du F1,6BP va activer la

pyruvate kinase (régulateur allostérique) et augmenter le flux glycolytique.

Si le niveau énergétique est élevé, l'augmentation de la concentration intracellulaire d'ATP va inhiber la

pyruvate kinase et la phosphofructokinase. A son tour, l'augmentation du glucose-6-phosphate va inhiber

l'hexokinase (régulateur allostérique) et réduire le flux glycolytique. Des niveaux plus complexes de régulations

existent selon les tissus par le biais d’isoformes tissu-spécifiques de ces enzymes régulatrices et grâce à l’actions

d’hormones telles que l’insuline (hormone hypoglycémiante) ou le glucagon (hormone hyperglycémiante)

Régulation allostérique quasiment immédiate

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Aspects bioénergétiques

L’irréversibilité de la glycolyse est assurée par cette diminution importante nette d’énergie libre. Le

rendement de récupération de l’énergie de la glycolyse sous forme d’ATP est supérieur à 60%. Au cours de la

glycolyse, une partie de l’énergie de la molécule de glucose est conservée sous forme d’ATP, une partie sous

forme de NADH2, mais la plus grande partie reste dans le produit : le pyruvate. La glycolyse fournit seulement

5% de l’énergie totale qui peut être libérée par l’oxydation totale du glucose en CO2 + H20.

Importance des intermédiaires phosphoryles

Chacun des 9 intermédiaires de la glycolyse entre le glucose et le pyruvate est phosphorylé. Les

groupements phosphates sont ionisés à Ph7 , donnant chacun des intermédiaires une charge négative nette. La

membrane plasmique étant imperméable aux molécules chargées, ces intermédiaires ne peuvent diffuser à

l’extérieur de la cellule, et la cellule n’a donc pas à dépenser de l’énergie pour contenir ces intermédiaires en dépit

des différences de concentrations de ces molécules de part et d’autre de la membrane plasmique. Les

groupements phosphates sont aussi essentiels pour la conservation de l’énergie métabolique. L’énergie investie

lors de la phase préparatoire est conservée sous la forme de liaisons à haut potentiel d’hydrolyse et sera ainsi

récupérée lors de la phase de remboursement.

Voies d’alimentation de la glycolyse

En plus du glucose de nombreux autres glucides entrent finalement dans la voie de la glycolyse pour subir

des dégradations fournissant de l’énergie :

o Les polysaccharides de stockage : glycogène et amidon

o Les disaccharides : maltose, lactose, saccharose

o Les monosaccharides : fructose, mannose, galactose

Aspects enzymatiques

La glycolyse est la plus ancienne et la plus universelle des voies métaboliques. Les enzymes qui la dirigent

sont des enzymes à fonction domestique, qui présentent des caractéristiques intéressantes :

• Leur concentration est très élevée

• Leur structure est très conservée dans l’évolution, avec des homologies de séquences

remarquables

• Elles sont organisées en complexes supramoléculaires (appelés métabolons).

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Aspects de carrefour métabolique

Au centre de la vie de la cellule, cette voie ancestrale est reliée à bon nombre de métabolismes : voie des

pentoses, métabolisme du glycogène, néoglucogenèse, métabolisme du fructose et du mannose. Le glucose

n’est pas seulement un excellent carburant, c’est aussi un précurseur capable de fournir un très grand ensemble

d’intermédiaires métaboliques.

La glycémie

La glycémie est très finement régulée. Des perturbations du système de régulation de la glycémie

peuvent exister, c’est le cas lors du diabète, maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique.

L’hypoglycémie peut conduire à des troubles neurologiques sévères tels que le coma.

Pathologie de la glycolyse

Des mutations dans le gène codant l’hexokinase hépatique (glucokinase) sont observées dans une forme

de diabète monogénique à début précoce. Dans le foie l’altération de l’activité de la glucokinase conduisant à une

altération de la glycolyse et à une augmentation de la néoglucogenèse est responsable de l’hyperglycémie.

IV. Respiration cellulaire

La respiration cellulaire est une oxydation de substances organiques se traduisant par un transfert

exergonique d’électrons et de protons vers l’oxygène très électronégatif, qui subit ainsi une réduction en

H2O. La respiration cellulaire est le processus ultime de dégradation des substrats qui a pour caractéristique :

o D’être aérobie,

o De se dérouler dans la mitochondrie,

o D’être commun aux trois métabolismes, glucidiques, lipidique et protidique,

o Et de produire l’essentiel de l’ATP cellulaire.

La membrane interne de la mitochondrie est imperméable aux électrons.

La respiration cellulaire s’effectue en 3 étapes :

1. Les molécules de carburant organique (glucose, acide gras et quelques acides aminés) sont oxydées en

molécules dicarbonées pour former le groupement acétyl de l’acétyl-CoA.

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176


2. Ces groupements acétyls sont oxydés par le cycle de Krebs en CO2. L’énergie libérée par l’oxydation est

conservée par des transporteurs d’électrons sous leur formes réduites (NADH + H+ et FADH2)

3. Ces cofacteurs réduits sont eux-mêmes oxydés pour donner des protons et des électrons. Les électrons

sont transférés le long de la chaine des transporteurs mitochondriaux vers l’oxygène qu’il réduisent alors

en H2O. Au cours de ce mécanisme de transfert électronique beaucoup d’énergie est libérée et conservée

sous forme d’ATP, par un mécanisme appelé phosphorylation oxydative (OXPHOS)

La production d’énergie chez les eucaryotes est réalisée par deux voies principales. L’une est représentée

par la glycolyse, qui se produit dans le cytoplasme sans l’intervention de l’oxygène moléculaire.

L’autre voie, majoritaire dans la plupart des tissus, est représentée par la phosphorylation oxydative

mitochondriale et nécessite l’oxygène moléculaire. Le couplage entre l’oxydation et la synthèse d’ATP peut être

chimique (comme dans la glycolyse et le cycle de Krebs), ou chimio-osmotique par l’intermédiaire d’un gradient

transmembranaire de protons (comme le système OXPHOS).

Substrats oxydatifs

Le glucose et les acides gras sont les molécules simples qui constituent les substrats énergétiques

préférentiels. D’autres molécules, comme les acides aminés, sont oxydées en composés de même nature. Les

protéines ne représentent pas une réserve énergétique chez les hommes et sont dégradées dans les tissus

pendant le jeûne pour permettre la synthèse de glucose par le foie. Toutes les molécules qu’on veut dégrader

doivent être dégradés par un processus catabolique oxydatif. Quasiment toutes les voies métaboliques passent

par la mitochondrie (juste pour une partie pour les réactions anaboliques ou totalement pour les réactions

cataboliques)

Interdépendance des voies métaboliques

Le partage de différents métabolites par les différentes voies de la respiration cellulaire rend ces

processus interdépendants. Par exemple, la production d’ATP par la chaine respiratoire ne se fera que si les

autres voies cataboliques fournissent des coenzymes réduits. L’absence de quantité suffisante en oxygène

ralentira non seulement la chaine respiratoire mais aussi la vitesse des voies cataboliques situées en amont.

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V. Oxydation des acides gras

L’oxydation des acides gars à longue chaine en acétyl-CoA est la voie principale de fourniture d’énergie

chez les animaux, les triglycérides sont en effet particulièrement adaptés à leur rôle de carburant de stockage.

Les longues chaines des acides gras sont des structures extrêmement réduites avec une énergie d’oxydation plus

importante que celle des glucides ou des protéines. De plus, en raison de leur hydrophobie, les triglycérides

n’augmentent pas l’osmolarité du cytosol et à l’inverse des polysaccharides, ne contiennent pas un poids

supplémentaire d’eau de solvatation. Les électrons retirés au cours de l’oxydation des acides gras passent à

travers la chaine respiratoire, assurant la synthèse d’ATP et l’acétyl-CoA produit est complètement oxydé en CO2

par l’intermédiaire du cycle de l’acide citrique.

La dégradation des acides gras dans les mitochondries consiste en une β-oxydation (=oxydation sur le

3ème carbone qui libère un acétate lié au coenzyme A). Cette oxydation se fait en 2 étapes :

➢ Première étape qui oxyde le groupement alkyle (-CH2) en groupement alcool + H20

➢ La seconde étape oxyde cet alcool en acide

L’énergie libérée est suffisante pour constituer une liaison thioester riche en énergie. On obtient alors un acétyl-

CoA et un acide gras réduit de deux carbones qui pourra à nouveau subir une oxydation. Les acides gras sont

donc progressivement dégradés par prélèvement successifs de fragments dicarbonés.

Par exemple, l’acide palmitique à 16 carbones subit 7 passages à travers cette séquence oxydative et dans

chaque passage il perd 2 carbones sous la forme d’acétyl-CoA. Le résultat global est la conversion de la chaine à

16 carbones en 8 molécules dicarbonées contenues dans les acétyl-CoA.

Avant de pouvoir être oxydés, les acides gras doivent

être activés et transportés dans les mitochondries. L’acétyl-

CoA synthétase est une enzyme qui permet l’initiation de

l’oxydation des acides gras. Elle catalyse l’activation des acides

gras en catalysant la formation d'une liaison thioester entre le

groupe carboxyle de l'acide gras et le groupement thiol du CoA

pour fournir un acyl-CoA, composé riche en énergie. D’ailleurs,

cette activation requiert de l’énergie (ATP). Un transporteur

spécifique nommé la carnitine, ainsi que 2 enzymes qui sont la

carnitine acyl transférase et la translocase assurent le

transport depuis le cytosol des acyl-CoA dans la mitochondrie.

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La β-oxydation des acides gras s’effectue en 4 étapes :

Etape 1 : Déshydrogénation

Cette déshydrogénation produit une double liaison (configuration

trans) entre 2 atomes de carbone α et β (C2 et C3), fournissant un trans∆2-

énoyl-CoA (le symbole ∆2 désigne la position de la double liaison).

L’enzyme qui catalyse cette réaction est l’acyl-CoA déshydrogénase qui

possède un groupement prosthétique FAD. Les électrons retirés à l’acyl-

CoA sont transférés au FAD qui à son tour va transférer ses électrons à un

transporteur d’électrons de la chaine respiratoire : l’ETFP

Etape 2 : Hydratation

Une molécule d’eau est ajoutée à la double liaison du trans-∆2-

énoylCoA pour former le β-hydroxyacyl-CoA. Cette réaction est

catalysée par l’énol-CoA hydratase.

Etape 3 : déshydrogénation

Le β-hydroxyacyl-CoA est déshydrogéné pour former le β-

cétocyl-CoA sous l’action d’une β-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase.

Le NAD+ est l’accepteur d’électrons.

Etape 4 : Thiolyse

Les 3 premières étapes de la β-oxydation ont pour effet de créer

une liaison C-C moins stable facilement clivable au cours de la quatrième étape. L’acyl-CoA acétyltansférase ou

thiolase libère par clivage une molécule d’acétyl-CoA.

L’énergie libérée par le clivage est récupérée pour condenser une CoA et donner un acyl-CoA, maintenant

raccourci de 2 atomes de carbones ; puis cet acyl-CoA subira à son tour une série de 4 réactions pour donner un

nouveau acétyl-CoA.

On peut représenter la β-oxydation par une hélice dont chaque tour de spire correspond à un raccourcissent de

l’acide gras de 2 atomes de carbone libéré sous la forme d’un acétyl-CoA.

Equation réactionnel globale

L’équation pour un seul passage pour le palmitate par exemple :

Palmitoyl-CoA + CoA + FAD + NAD+ +H20 → Myristoyl-CoA + Acétyl-CoA + FADH2 + NADH + H+

Bilan énergétique

Chaque tour de spire de l’hélice de la β-oxydation produit :

➢ 1 FADH2 dont la réoxydation au niveau de la chaine respiratoire conduira à la formation de 2

molécules d’ATP.

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➢ 1 NADH + H+ dont la réoxydation au niveau de la chaine respiratoire conduira à la formation de

3 molécules d’ATP.

➢ 1 actéyl-CoA

5 ATP sont donc produites à chaque tour de spire. L’acétyl-CoA est ensuite oxydé par le cycle de Krebs

avec la formation de 12 ATP. L’oxydation complète d’un maillon à 2 atomes de carbones fournit donc 17 ATP. Si

nous prenons l’exemple de l’acide stéarique qui a 18 atomes de carbone, on voit que sont oxydation complète

permettra la formation de 148 ATP (= 8*5 +9*12). Si l’on considère que 2 liaisons riches de l’ATP ont été utilisées

pour activer l’acide gras (ce qui correspond sur le plan énergétique à 2 ATP hydrolysés en ADP+Pi), il apparait un

gain net de 146 ATP par molécule d’acide stéarique.

La séquence d’oxydation des acides gras décrite ci-dessus est celle des acides gras saturés (ayant

seulement des simples liaisons dans leur chaines carbonée). Pour les acides gras insaturés les réactions sont plus

complexes et non abordées dans ce cours.

Régulation des acides gras

Pour un acyl-CoA, il existe deux destinées possibles : la béta-oxydation si la cellule a besoin d’énergie

(durant le jeûne) ou la synthèse des triglycérides de réserve si la cellule n’a pas de besoin énergétique (période

post-prandiale, coucou M. LARCHER). C’est finalement le niveau d’énergie qui va déterminer l’entrée dans l’une

ou l’autre voie. Le NADH+H+ inhibe la β-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase. L’acétyl-CoA inhibe la thiolase, c’est

donc une inhibition par le produit.

VI. Oxydation du pyruvate (décarboxylation oxydative du pyruvate)

Le pyruvate produit lors de la glycolyse anaérobie cytoplasmique pénètre dans la mitochondrie grâce à

un transporteur spécifique. Le complexe de la pyruvate déshydrogénase (PDH) est localisé dans les

mitochondries des cellules eucaryotes. Le complexe de la PDH est un exemple d’un complexe multienzymatique

au sein duquel une série de métabolites intermédiaires restent liés à la surface des enzymes avant d’être

transformés en produit final. Les intermédiaires réagissent ainsi rapidement d’une enzyme à l’autre sans diffuser

à distance. Le PDH est situé sur la face interne de la mitochondrie

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C’est une réaction fortement exergonique (-33Kj/mol), ce qui favorise son caractère irréversible. La

réaction globale catalysée par le complexe de la PDH est une décarboxylation oxydative du pyruvate à 3C en

acétyl-CoA à 2C + 1CO2. Le groupement carboxyle est retiré du pyruvate sous forme d’une molécule de CO2

alors que les 2 autres carbones restants deviennent le groupement acétyl de l’acétyl-CoA. Le NADH2 formé dans

cette réaction fournit un ion hydrure (avec ses 2 électrons) à la chaine respiratoire.

Le complexe de la PDH nécessite l’intervention séquentielle de 3 enzymes différentes ainsi que celle de

5 coenzymes différents :

• 3 enzymes :

o La pyruvate déshydrogénase (sous unité E1)

o La dihydrolipoyl transacétylase (E2)

o La dihydrolipoyl déshydrogénase (E3)

• 5 coenzymes dont 4 dérivent d’une vitamine

o La thiamine pyrophosphate ou TPP (vit B1) coenzyme de E1

o La coenzyme A ou CoA (pantothénate ou vitamine B5), coenzyme de E2

o La lipoate coenzyme : ne dérive pas d’une vitamine, coenzyme de E2

o La flavine adénine dinucléotide ou FAD (riboflavine ou vit B2), coenzyme de E3

o La nicotinamide adénine dinucléotide ou NAD (Vit PP), coenzyme de E3.

Cela fait rendre compte de l’importance des facteurs nutritionnels dans le bon fonctionnement de l’enzyme, le

déficit en vitamine B1 au moins étant hautement pathogène (béribéri, alcoolisme)

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Structure du complexe de la PDH

Chaque protéine existe en copies multiples, dans un complexe qui réalise un

édifice supramoléculaire très élaboré, attaché à la membrane mitochondriale interne et

visible au microscope électronique. Les sous-unités ne sont pas en nombre équivalent,

ce qui implique un mode de fonctionnement complexe. On retrouve dans le cœur de

cette agrégat une soixantaine de copie de E2. Liées au cœur, on retrouve une vingtaine

de copies de E1 et une douzaine de copies de E3. Il existe en outre 8 à 12 exemplaires

d’une protéine X qui semble assurer l’attachement au complexe de kinases et

phosphatases (5 copies de chacune de ces protéines régulatrices).

5 étapes réactionnelles

La décarboxylation peut être considérée comme un moyen pour la cellule de se « débarrasser » des

atomes de carbones totalement oxydés. La formation d’acétyl-CoA et de NADH2 permet de récupérer l’énergie

de l’oxydation du pyruvate.

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Étape 1 : Décarboxylation du pyruvate et fixation sur le TPP-E1

Le TPP est un coenzyme fermement attaché

(groupement prosthétique) à la pyruvate déshydrogénase (E1).

Le C1 du pyruvate est libéré sous forme de CO2 et le C2 est

attaché à la TTP de E1 sous la forme d'un groupement

hydroxyéthyle ou acétaldéhyde activé. Le produit de la

réaction reste donc attaché au complexe et ne diffuse pas. La

Vitamine B1ou thiamine est une molécule faite de 2 noyaux substitués, benzénique thiazole. Cette vitamine

permet la synthèse d'un Coenzyme, le pyrophosphate de thiamine, le radical PP estérifiant le groupement alcool

primaire de la thiamine. Ce coenzyme est un activateur de groupements carbonyles.

Étape 2 : Oxydation de l'acétaldéhyde activé par le lipoate

L'acétaldéhyde est oxydé en acétate et transféré de

TPP-E1 au lipoamide-E2. Les 2 électrons retirés par la réaction

d'oxydation réduisent le –S-S- d'un groupement lipoyl en 2

groupements thiol (-SH) ce qui conduit à la formation de

dihydrolipoamide. Puis l'acétate est estérifié sur l'un des

groupements thiols (liaison thioester) du lipoyl de E2. Oxydation du pyruvate (Décarboxylation oxydative du

pyruvate) 31 Le lipoate n'est pas une vitamine car l'organisme peut le synthétiser. Il est lié à un résidu lysine de

l'enzyme E2 par une liaison amide. Le lipoate s'attache aux extrémités des chaînes latérales de lysine de E2 et

forme des groupements lysyl-lipoamide: bras transporteur flexibles de 13 atomes de carbone qui peuvent

transporter des groupements acétyle d'un site actif à un autre au sein de la PDH. Les mouvements des bras lysyl-

lipoamide de E2 font passer 2 électrons et le groupement acétyl provenant du pyruvate de E1 à E3. Dans sa forme

oxydée, le lipoate comporte une liaison disulfure (-SS-), tandis qu'il comporte 2 groupements thiols (-SH) dans sa

forme réduite.

Étape 3 : Transfert de l'acétate sur le Coenzyme A

Puis le bras lysyl-lipoamide de E2 transfère l'acétate

du lipoate-E2 sur le coenzyme A en conservant la liaison

thioester riche en énergie pour former l'acétyl-CoA. C'est

une réaction de transestérification ou le groupement –SH de

CoA remplace le groupement –SH de E2. Ainsi l'énergie

d'oxydation est-elle utilisée pour la formation d'un thioester

de l'acétate à haut potentiel d'hydrolyse.

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Étape 4 : Oxydation du dihydrolipoamide par le FAD

E3 assure le transfert de 2 atomes d'hydrogène des

groupements lipoyls réduits de E2 au FAD de E3, restaurant ainsi

la forme oxydée du groupement lipoyl-lysyle de E2. Le FAD est

un groupement prosthétique fermement attaché à l'enzyme E3.

Etape 5 : Réduction du NAD+

Le groupement FADH2 de E3 transfert un ion hydrure à

NAD+ pour former du NADH + H+ régénération de FAD- → E3

sous forme oxydée. Ainsi, les différents coenzymes vrais sont-ils

régénérés, et les produits de l'oxydation du pyruvate sont le CO

2, le NADH + H+ et l'acétyl CoA. Donc au cours de ces réactions,

les intermédiaires métaboliques restent attachés à la surface de la PDH et ne diffusent pas dans la matrice

mitochondriale. Le NADH + H + quitte le complexe pour être oxydé par la chaîne respiratoire et être remplacé au

sein de E3 par du NAD+ oxydé.

Régulation

Ce complexe est sujet à des régulations complexes, la principale étant une

phosphorylation/déphosphorylation hormono-dépendante. La forme phosphorylée sous l’influence d’une

PDH kinase est inactive. La forme déphosphorylée sous l’influence d’une PDH phosphatase est active. L’insuline

active la PDH en stimulant la déphosphorylation du complexe, ce qui contribue à activer le catabolisme du

glucose. La kinase est aussi stimulée par le NADH + H+, l’ATP et l’acétyl-CoA, ce qui inactive le PDH. L’activité de

la PDH est donc bloquée quand les acides gras sont disponibles pour fournir de l’acétyl-CoA. En revanche, la

kinase est inhibée par le pyruvate, ce qui active le complexe. L’activité PDH est donc accrue par l’administration

d’insuline, de glucose et l’alimentation et abaissé par le jeune.

Mutations de la PDH et carence en thyamine

Les déficits congénitaux de la PDH entraînent des myopathies mitochondriales avec hyperlactacidémies

congénitales et des troubles neurologiques (syndrome de Leigh). La carence en thiamine dans l'alimentation

(viande et germe de blé) a aussi des conséquences neurologiques sévères par l'altération du métabolisme

énergétique du glucose. Elle est responsable du Béribéri qui survient essentiellement dans les populations dont

la plus grande partie de l'alimentation est constituée de riz blanc dépourvu de son enveloppe riche en thiamine.

Elle se voit aussi dans les dénutritions dues à l'alcoolisme. Elle se manifeste par des anomalies neurologiques

(douleur, tremblement, faiblesse musculaire) et cardiaques (insuffisance cardiaque). Les autres vitamines

nécessaires à la PDH sont abondantes dans l'alimentation et sont rarement impliquées dans des carences

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VII. Cycle de l’acide citrique = cycle de Krebs

Le cycle de l’acide citrique aussi appelé

cycle de Krebs est une suite de réactions au cours

desquelles les molécules d’acétyl-CoA

provenant des divers catabolismes oxydatifs

sont totalement dégradées. Il représente

l’aboutissement commun du catabolisme aussi

bien des glucides que des lipides, des acides

aminés et de toutes autres molécules, et ce de

façon quasi universelle chez les êtres vivants.

L’Acétyl-CoA provient en effet à la fois de

l’oxydation du pyruvate, de la β-Oxydation des

acides gras et de la dégradation de beaucoup

d’acides aminés. Certains acides aminés peuvent

également alimenter le cycle de Krebs, mais sans

passer par la voie de l’acétyl-CoA.

Le cycle de Krebs réalise l’oxydation complète de l’acétyl-CoA. Cette voie métabolique cyclique se

déroule dans la matrice mitochondriale et consiste en une série d’oxydations accompagnées de

décarboxylations avec élimination de carbones totalement oxydés. Les énergies ainsi récupérées sont

transférées sur des coenzymes d’oxydoréduction (NAD et FAD) et l’une des étapes permet la constitution d’un

GTP.

Vue d’ensemble

Pour commencer un tour de cycle, l’acétyl-CoA donne son groupement acétyle à un composé à 4

carbones, l’oxaloacétate, pour former le citrate à 6 carbones. Le citrate est ensuite transformé en isocitrate

également à 6 C. L’isocitrate est déshydrogéné avec perte de CO2 pour fournir un composé à 5 carbones, l’α-

cétoglutarate. Ce dernier subit une perte de CO2 et fournit un composé à 4 carbones, le succinate. Le succinate

est ensuite transformé en trois étapes en oxaloacétate avec lequel recommence le cycle. Dans chaque tour de

cycle, un groupement acétyle (2C) entre sous forme d’acétyl-CoA et deux molécules de CO2 quittent le cycle. A

chaque tour de cycle une molécule d’oxaloacétate est utilisée pour former du citrate puis est régénérée. Quatre

des 8 étapes du cycle de Krebs sont des processus d’oxydation dans lesquelles l’énergie d’oxydation est conservée

avec une haute efficacité pour la formation de coenzymes réduits (NADH + H+ et FADH2).

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➢ Etape 1 : Formation du citrate

C’est une réaction de condensation de l’acétyl-CoA avec de

l’oxaloacétate pour former du citrate. Cette réaction est

catalysée par le citrate synthase. L’hydrolyse de la liaison

thioester de haute énergie rend la réaction fortement

exergonique et donc irréversible ce qui oriente le flux du

cycle. Le CoA libéré est recyclé par la PDH pour former une

nouvelle molécule d’acétyl-CoA.

➢ Etape 2 : formation de l’isocitrate

L'aconitase catalyse la transformation réversible du citrate en isocitrate. Cette enzyme contient un centre

fersoufre qui intervient dans la fixation du substrat. L'enzyme assure l'addition et l'élimination d'une molécule

d'eau.

➢ Etape 3 : oxydation de l’isocitrate en α-cétoglutarate et CO2

L’isocitrate déshydrogénase catalyse cette décarboxylation oxydative et la réduction d’une molécule de

NADH + H+. Cette étape est exergonique et irréversible. L’isocitrate déshydrogénase est l’enzyme régulatrice

principale du cycle de Krebs.

➢ Etape 4 : oxydation de l’α-cétoglutarate en succinyl-CoA et Co2

Le complexe de l’α-cétoglutarate déshydrogénase catalyse

cette deuxième décarboxylation oxydative. Le NAD+ sert d’accepteur

d’électrons. L’énergie d’oxydation de l’α-cétoglutarate est conservée

dans la formation de la liaison thioester du succinyl-CoA. A la fois par

sa structure et son fonctionnement, ce complexe enzymatique

ressemble beaucoup au complexe de la PDH. Il comprend aussi 3

enzymes et les mêmes coenzymes. Ces deux complexes partagent

probablement une origine évolutive commune. Cette étape est exergonique et irréversible.

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➢ Etape 5 : transformation du succinyl-CoA en Succinate

Le succinyl-CoA, comme l'acétyl-CoA, possède une énergie libre d'hydrolyse fortement négative pour sa

liaison thioester (ΔG°'= -36 kJ/mol). L'énergie libérée par la destruction de cette liaison est utilisée pour assurer la

synthèse de GTP (couplage chimique). L'enzyme qui catalyse cette réaction réversible est la succinyl-CoA

synthétase. Le GTP est équivalent sur le plan énergétique à l'ATP. Le GTP peut donner son groupement

phosphate à l'ADP pour former de l'ATP par l'action d'une nucléoside diphosphate kinase : GTP + ADP <-> GDP

+ ATP (ΔG°'= 0 kJ/mol)

➢ Etape 6 : oxydation du succinate en fumarate

L’enzyme qui catalyse cette réaction réversible est la

succinate déshydrogénase. Cette enzyme possède la particularité

d’être la seule enzyme du cycle de Krebs à être intégrée dans la

membrane interne de la mitochondrie. Cette enzyme fait partie d’un

des complexes de la chaine respiratoire. Le FAD sert d’accepteur

d’électrons qui seront ainsi directement transmis sur la chaine

respiratoire.

➢ Etape 7 : hydratation du fumarate en malate

Cette étape réversible est catalysée par le fumarase.

➢ Etape 8 : oxydation du malate en oxaloacétate

C’est une étape endergonique. La malate déshydrogénase est une enzyme du NAD. Elle catalyse cette réaction

réversible.

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Le bilan chimique est assez facile à

établir puisque le fonctionnement est cyclique,

les molécules du cycle n’interviennent pas dans

le bilan.

Au total chaque tour de cycle produit :

3 NADH + H+, 1 FADH2, 1 GTP (=ATP) et 2 CO2.

Bilan thermodynamique

La réalisation complète d’un cycle s’accompagne d’une ∆G°’ de -77 kJ/mol. L’ensemble du processus est

donc exergonique et quoique certaines réactions soient réversibles le cycle fonctionne de façon irréversible. Bien

que le cycle génère seulement l’équivalent d’une molécule d’ATP par tour, les 4 étapes d’oxydation fournissent

un grand flux d’électron vers la chaine respiratoire et conduisent donc ainsi indirectement à la formation d’un

grand nombre de molécules d’ATP. L’oxydation des atomes d’hydrogène par la chaine respiratoire produit 11

ATP ( 3 pour chacun des 3 NADH2 et 2 pour le FADH2). Si l’on y ajoute le GTP synthétisé au cours du cycle, c’est

un total de 12 équivalents ATP qui sont récupérés lors de la combustion d’un acétyl- CoA.

Pourquoi l’oxydation de l’acétate est-elle si compliquée ?

Ce processus cyclique en 8 étapes semble inutilement complexe pour oxyder une molécule à 2 carbones

et ne semble pas être conformes au principe d’économie retenu par les êtres vivants. Il faut bien comprendre que

le rôle du cycle de Krebs, dépasse largement la seule oxydation de l’acétate. Cette voie métabolique est

interconnectée à de nombreuses autres voies métaboliques, c’est une voie amphibolique. En effet, de nombreux

produits terminaux à 4 ou 5 carbones provenant de nombreux processus cataboliques sont apportés au cycle pour

y servir de carburant. Par ailleurs, des intermédiaires du cycle de Krebs quittent le cycle et utilisés comme

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précurseurs pour de nombreux processus de biosynthèse comme les nucléotides , les acides aminés ou encore

l’hème).

Régulation du cycle

Trois étapes puissamment exergoniques sont régulées :

o Celles catalysées par le citrate synthase,

o L’isocitrate déshydrogénase

o l’α-cétoglutarate déshydrogénase.

La vitesse du cycle est étroitement liée à celle de la chaine respiratoire mitochondriale et aux besoins

énergétiques cellulaires. La citrate synthase est activée par l’acétyl-CoA et inhibée par le citrate, le NADH + H+ et

l’ATP. L’α-cétoglutarate déshydrogénase est inhibée par ses produits, succinyl-CoA et NADH+ H+ et l’ATP.

L’isocitrate déshydrogénase est le véritable interrupteur du cycle de Krebs. Elle est activée par l’ADP et le

NAD+ et inhibée par l’ATP et le NADH + H +. Il y a interdépendance entre les divers éléments de la respiration

cellulaire mitochondriale. La baisse du rapport ATP /ADP cellulaire active l’isocitrate déshydrogénase, et le

cycle de Krebs tout entier, en même temps qu’il active la chaine respiratoire, la citrate synthétase et la

pyruvate déshydrogénase. L’élévation du rapport ATP/ADP a l’effet contraire.

VIII. La chaine respiratoire

La réoxydation des coenzymes réduits obtenus lors du cycle de Krebs, de la glycolyse anaérobie, de

l’oxydation du pyruvate et de l’oxydation des acides gras est nécessaire à la poursuite de ces différentes voies

métaboliques. De plus, le pouvoir réducteur de ces coenzymes va être exploité de manière à régénérer de l’ATP.

La phosphorylation oxydative (OXPHOS) est la synthèse d’ATP gouvernée par le transfert d’électrons à

l’oxygène. C’est l’apogée du métabolisme libérant de l’énergie chez les organismes aérobies. Toutes les étapes

enzymatiques de la dégradations oxydatives des nutriments convergent vers ce stade ultime de la respiration

cellulaire.

Rappel sur la mitochondrie

Les mitochondries possèdent 2 membranes. La membrane externe est aisément perméable aux ions et

aux petites molécules. La porine est une protéine qui forme des canaux transmembranaires au sein de cette

membrane externe et qui permet le passage des molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 5000 daltons.

La seule espèce qui traverse la membrane interne contient les composants de la chaine respiratoire responsable

de la synthèse d’ATP. Les crêtes de la membrane interne lui confèrent une surface très importante.

Vue d’ensemble

Le terme de « chaine respiratoire » désigne l’ensemble des transporteurs d’électrons qui transfèrent

les électrons à partir des coenzymes réduits vers l’accepteur final qu’est l’oxygène. Elle assure la

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phosphorylation oxydative, processus par lequel l’ATP est formée. Elle est intra mitochondriale, constituée d’un

ensemble des protéines situées sur la membrane interne de la mitochondrie. L’oxydation et la phosphorylation

sont des phénomènes couplés. Le couplage est réalisé grâce à l’intermédiaire d’un gradient de protons établi de

part et d’autre de la membrane interne. La chaine respiratoire assure la combustion des hydrogènes des

coenzymes réduits en présence d’oxygène moléculaire. Cela donne cette équation bilan : selon l'équation

[4 H] + O2 → 2 H2O. Il existe de nombreuses étapes intermédiaires et l’oxygène moléculaire n’intervient qu’au

tout dernier stade.

Les chaines respiratoires mitochondriale est une série de transporteurs d’électrons dont la plupart sont

des protéines enchâssées dans la membrane interne, et dont les groupements prothétiques sont capables de

donner ou d’accepter les électrons. Ces différents transporteurs sont des flavoprotéines, des cytochromes, des

protéines fer-soufres, des protéines à cuivre et un élément lipidique appelé l’ubiquinone ou coenzyme Q.

Chacun des transporteurs peut accepter des électrons du transporteur précédant et les donner au suivant selon

une séquence bien précise. Ces différents transporteurs sont organisés en plusieurs grands complexes

multienzymatiques. On compte 5 complexes membranaires reliés entre eux par des transporteurs mobiles que

sont l’ubiquinone (coenzymes Q) et le cytochrome C.

Transporteurs d’électrons

Les différents transporteurs fonctionnent dans un ordre de potentiel de réduction croissant, car les

électrons ont tendance à passer spontanément d’un transporteur à bas potentiel vers un autre dont le potentiel

est plus élevé. La marche des électrons se fait donc dans un ordre correspondant à une valeur croissante de

potentiels d’oxydo-réduction de chacun des couples. La partie protéique de ces transporteurs d’électrons assure

le maintien des coenzymes d’oxydo-réduction dans la membrane interne et elle module d’autre part l’activité

enzymatique de ces coenzymes.

➢ Complexe 1 : NADH déshydrogénase

C’est un énorme complexe contenant 47 protéines. Il possède un site liant le NADH + H+ orienté vers la

matrice. C’est à son niveau qu’entrent dans la chaine respiratoire les électrons portés par le NADH + H+. Le

complexe est alimenté par les NADH + H+ provenant de l’oxydation des substrats aussi bien mitochondriaux que

cytosoliques. Ce complexe comporte un groupement FMN (intégré dans une flavoprotéine) et des noyaux fer-

soufre. Le complexe 1 va récupérer les électrons provenant du NADH + H+, puis ses électrons vont transiter à

travers le groupement FMN et les centre fer-souffre. Enfin, ces électrons seront cédés à l’ubiquinone oxydée qui

se trouvera ainsi réduite, et prendra le nom d’ubiquinol. La roténone est un inhibiteur spécifique de ce complexe.

Ce complexe est fixe dans la membrane. L’ubiquinol diffuse librement dans la membrane interne à cause de sa

solubilité dans les membranes lipidiques (molécule hydrophobe). Il va donc diffuser jusqu’au complexe III où il

sera réoxydé cédant ses électrons.

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➢ Complexe 2 : succinate déshydrogénase

Ce complexe est présent dans le cycle de l’acide citrique.

C’est en effet la seule enzyme du cycle de Krebs à être liée à la

membrane interne des mitochondries. Ce complexe comporte 4

sous-unités protéiques dont une flavoprotéine (FAD) et deux

protéines possédant un centre fer-soufre. Les électrons du FADH2

seront donc transférés à ces derniers avant d’être cédés à

l’ubiquinone sera ainsi réduite en ubiquinol. A noter que l’ubiquinone

reçoit aussi des électrons provenant de la β-oxydation des acides gras

par le biais de l’ETFP et provenant de l’oxydation du glycérol-3-

phosphate cytosolique. Le malonate est un inhibiteur spécifique de

ce complexe.

➢ Complexe 3 : l’ubiquinol-cytochrome C oxydoréductase

Ce complexe comprend 11 sous-unités protéiques dont

différents cytochromes, une protéine à centre fer-souffre. Ce complexe oxyde l’ubiquinol et transfère les

électrons le long de ses transporteurs avant de les céder au cytochrome C qui se trouvera ainsi réduit. Ce

complexe est fixe dans la membrane, tandis que le cytochrome C est une protéine qui est mobile. De la même

manière que l’ubiquinone transportant les électrons des complexe 1 et 2 vers le complexe 3, le cytochrome C

transporte les électrons du complexe 3 vers le complexe 4. L’antimycine A est un inhibiteur spécifique de ce

complexe.

➢ Complexe 4 : cytochrome oxydase

Ce complexe contient 13 protéines dont

plusieurs cytochromes et diverses protéines contenant

des ions cuivre qui jouent le rôle de transporteurs

d’électrons. Les électrons sont récupérés sur le

cytochrome C puis cheminent au sein de ce complexe

avant d’être utilisés pour réduire l’oxygène ce qui

conduit à la formation d’H2O. Dans cette chaine de

transporteur, l’oxygène est l’élément qui a la plus forte

affinité pour les électrons et est donc l’accepteur final

de ces électrons. Le cyanure est un inhibiteur spécifique de ce complexe de même que le monoxyde de carbone.

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Le transfert progressif des électrons à l’oxygène est hautement exergonique

Selon la théorie chimio-osmotique de Mitchell, le transfert d’électrons à travers la chaine respiratoire

conduit au passage de protons de la matrice vers la face externe de la membrane interne, le gradient de pH et le

potentiel membranaire constituent une force promotrice qui est utilisée pour synthétiser l’ATP. Le transfert

d’électrons le long de la chaine respiratoire est couplé à un transfert de protons à travers la membrane

mitochondriale interne. L’énergie libérée par le flux d’électrons transconforme les complexes I, III et IV qui

acquièrent une activité « pompe à protons » et expulsent les protons de la matrice mitochondriale vers l’espace

intermembranaire. Ce transfert de protons aboutit à la création d’un gradient de protons est conservée sous la

forme d’une force promotrice. Cette force promotrice sera enfin exploitée grâce au complexe V pour

phosphoryler l’ADP en ATP.

Complexe 5 : l’ATP synthase

Ce complexe possède 12 protéines et comprend deux principales sous-unités F0 et

F1. F1 est la sous-unité catalytique, F0 est un canal à protons. F1 est constitué de 6

sous-unités contenant plusieurs sites de liaison pour l’ADP et ATP. Cette sous-unité

est intra-matricielle et reliée à la membrane interne par la sous-unité F0. F0 forme

un canal transmembranaire à travers lequel les protons peuvent rentrer dans la

matrice mitochondriale. Lorsque les protons s’écoulent spontanément dans le sens

de leur gradient, de l’énergie libre est libérée pour réaliser un travail. L’ATP synthase

fonctionne un peu comme un moulin, le flux exergonique de protons induit un

mouvement de rotation de la sous-unité F0. Ce mouvement de rotation est transmis

à la sous-unité gamma de F1 qui va ainsi interagir tour à tour avec les sous-unités α

et β. A chaque interaction entre la sous-unité gamma et une sous-unité β, le site actif

apte à phosphoryler l’ADP est activé.

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192


Bilan énergétique de l’oxydation complète d’une molécule de glucose

Le rapport P /O mesure le couplage OXPHOS, c’est – à -dire l’efficacité de la conversion énergétique. P

représente le nombre de molécules d’ATP formées et O le nombre d’atomes d’oxygène consommés. Le gain

d’ATP, mesuré par le rapport des phosphates fixés par atomes d’oxygène consommé ou rapport P/O, est donc de

3 pour l’oxydation du NADH + H+ et de 2 pour celle du FADH2. Le rendement global est de 60% dans les conditions

standard, en fait probablement supérieur à 70 % dans l’environnement cellulaire réel.

Comme nous l’avons fait précédemment avec les acides gars, nous pouvons déterminer le nombre de

molécules d’TAP produites au cours de l’oxydation complète d’une molécule de glucose. La glycolyse anaérobie

cytosolique fournit 2 ATP et 2 NADH + H+. L’oxydation de 2 pyruvates produit 2NADH + H+. L’oxydation de 2

acétyl-CoA fournit 2 ATP, 6 NADH + H+ et de 2 FADH2 au cours du cycle de Krebs. Chaque NADH + H+ fournit 3

ATP et chaque FADH2 fournit 2 ATP au cours de la phosphorylation oxydative. Le bilan global de l’oxydation du

glucose est donc 38 ATP par molécules de glucose. En condition aérobie, le glucose fournit donc beaucoup plus

d’ATP qu’en conditions anaérobies ou la glycolyse anaérobie seule fournit 2 ATP.

Régulation

L’intensité respiratoire des mitochondries, c’est – à -dire la consommation d’oxygène est soumise à une

régulation étroite. Elle est principalement régulée par la concentration en ADP et par le rapport d’action de masse

(ATP/ADP+Pi). En temps normal ce rapport est très élevé de sorte que l’ATP est presque totalement

phosphorylée. Lorsque des besoins énergétiques augmentent, le rapport d’action de masse diminue et la

présence d’une quantité plus importante d’ADP augmente l’intensité respiratoire et entraine une régénération

de l’ATP jusqu’à ce que le rapport d’action de masse revienne à son niveau normal. La vitesse d’oxydation des

combustibles est régulée avec une telle sensibilité et une telle précision que le rapport d’action de masse ne

fluctue que très peu, même au cours de variations de la demande énergétique.

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La qualité du couplage entre phosphorylation de l’ATP et oxydation des composés réduits est

déterminante. Il existe une régulation de ce couplage car des protéines découplantes sont aussi présentes dans

la membrane interne des mitochondries. Ces protéines fournissent aux protons un canal qui permet de dissiper

l’énergie libérée par la force promotrice sous forme de chaleur. La régulation de ces protéines découplantes

permet ainsi d’ajuster le degré de couplage de la chaine respiratoire. Ainsi une énergie apportée en excès peut

être dissipée sous forme de chaleur. Cette production régulée de chaleur est aussi utile à la régulation thermique

des organismes. Des hormones activent ce découplage, telles l’adrénaline ou les hormones thyroïdiennes.

Double origine génétique de la chaine respiratoire

La chaine respiratoire a la particularité d’avoir une double origine génétique. La mitochondrie possède en

effet un petit génome circulaire double brin de 16,5kB. La seule fonction de cet ADN mitochondriale propre à

l’organelle est de coder 13 protéines de la chaine respiratoire. Toutes les autres protéines de la chaine respiratoire

ainsi que toutes les autres protéines mitochondriales sont bien codées par le génome nucléaire, puis sont

importées dans la mitochondrie grâce à des systèmes de transport spécifiques, après avoir été synthétisées dans

le cytoplasme.

Pathologie de la chaine respiratoire

Des anomalies des complexes de la chaine respiratoire peuvent obérer le fonctionnement des cellules. La

carence de production en ATP entraine des pathologies très diverses qui affectent principalement des organes

grand consommateurs d’énergie. Ces pathologies ont pour origine des mutations soit au niveau de l’ADN

mitochondrial, soit au niveau du génome nucléaire. L’ADN mitochondriale a la particularité d’être transmis

uniquement par la mère. En effet, les pathologies liées à des mutations de l’ADN mitochondriale obéissent à une

forme de transmission originale : la transmission maternelle. Les maladies mitochondriales dues à des

mutations de l’ADN nucléaire ont une transmission mendélienne classique.

Théorie endosymbiotique des mitochondries

Le fait que les mitochondries possèdent leur propre génome est en faveur de la théorie

endosymbiotique. Cette théorie suppose que les premiers eucaryotes qui vivaient en conditions anaérobies

(fermentation) ont acquis la capacité de respirer après avoir établi des relations de symbiose avec des bactéries

aérobies vivant dans leur cytoplasme. Après de nombreuses évolutions, ces bactéries endosymbiotiques seraient

progressivement devenues des mitochondries. Ces endosymbiotes auraient été sélectionnés sur leur capacité et

donc à détoxifier l’oxygène apparaissant dans l’atmosphère primitive et sur leur capacité à produire de manière

très efficace de l’ATP.

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POINTS IMPORTANTS

I. METABOLISME ENERGETIQUE

➢ Les voies métaboliques sont partagées entre le catabolisme (dégradation)

et l’anabolisme (biosynthèse). Elles peuvent suivre ces 2 processus =

amphiboliques.

➢ Les voies métaboliques sont irréversibles, exergoniques, limitante, régulée

par des enzymes et localisés dans des sites cellulaires spécifiques.

➢ Ces dernières sont régulées soit à court termes selon l’allostérie simple ou

covalente, soit à long terme.

➢ Elles peuvent être régulée par des hormones qui agit sur l’activité des

enzymes (court terme) ou sur le taux des enzymes (long terme).

II. BIOENERGETIQUE

➢ L’ATP est un vecteur d’énergie, une entité de transfert d’énergie libre. N’est

pas la molécule la plus riche en énergie.

➢ L’hydrolyse de l’ATP en ADP (∆G0’ = - 30,5 kJ/mol) donne des produits qui

sont plus stables que le substrat.

➢ L’intérêt énergétique de l’ATP réside dans l’instabilité des liaisons anhydres.

➢ Les électrons sont transférés d’une molécule à l’autre sous la forme d’un

électron, d’un atome d’hydrogène, d’un ion hydrure ou d’un oxygène fixé.

➢ Le coenzyme Q a pour rôle de transporter des équivalents réducteurs au sein

de la membrane interne de la mitochondrie.

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III. GLYCOLYSE

➢ Est la dégradation anaérobique du glucose : 1 molécule de glucose est

transformé en 2 molécules de pyruvate.

➢ Oxydation complète du glucose : ∆G0’ = -2840 kJ/ mol.

➢ Voie amphibolique, se déroulant en 10 étapes dont 3 irréversibles : 1, 3 et 10.

➢ La phosphofructokinase est l’enzyme régulatrice principale de la glycolyse.

IV. RESPIRATION CELLULAIRE

➢ Est une oxydation de substances organiques se traduisant par un transfert

exergonique d’électrons et de protons vers l’oxygène qui sera réduit en H2O.

➢ Se déroule en aérobie, dans la mitochondrie.

➢ Elle synthétise de l’ATP, qui sera conservé grâce à la phosphorylation

oxydative.

V. OXYDATION DES ACIDES GRAS

➢ Est la dégradation des acides gras dans les mitochondries qui libère un

acétate lié au CoA : β-oxydation.

➢ L’acyl-CoA synthétase est l’enzyme qui initie l’oxydation des acides gras.

➢ Se déroule en 4 étapes : déshydrogénation, hydratation, déshydrogénation

et thiolyse.

➢ Bilan : 1 FADH2, 1 NADH2, 1 acétyl-CoA par tour de spires.

VI. OXYDATION DU PYRUVATE

➢ Le pyruvate pénètre dans la mitochondrie grâce au complexe de la pyruvate

déshydrogénase (PDH).

➢ Le PDH nécessite 3 enzymes et 5 coenzymes. Il est situé sur la face interne

de la mitochondrie.

➢ 1 pyruvate + 1 acyl-CoA + 1 NAD+ → 1 acétyl-CoA + 1 CO2 + 1 NADH2

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➢ Complexe qui est régulé sous forme de phosphorylation/déphosphorylation.

VII. CYCLE DE KREBS

➢ Correspond à l’oxydation complète de l’Acétyl-CoA.

➢ Voie métabolique amphibolique, se déroulant dans la matrice

mitochondriale.

➢ Le cycle de l’acide citrique se déroule en 8 étapes dont 3 sont irréversibles

➢ Chaque tour de cycle produit : 3 NADH + H+, 1 FADH2, 1GTP (équivalent ATP)

et 2 CO2.

➢ Trois étapes irréversibles exergoniques sont régulées par le citrate synthase,

l’isocitrate déshydrogénase (=interrupteur du cycle de Krebs) et l’α-

cétoglutarate déshydrogénase.

VIII. CHAINE RESPIRATOIRE

Complexe 1 Complexe 2 Complexe 3 Complexe 4 Complexe 5

Nom

NADH

déshydrogénase

Succinate

déshydrogénase

Ubiquinol-Cytochrome C

oydoréductase Cytochrome oxydase ATP Synthase

Nombre de

protéines

nucléaires 40 4 10 10 12

Nombre de

protéines

mitochondriales 7 0 1 3 0

Principe de

fonctionnement

récupère e- de

NADH+H+, cède à

ubiquinone ->

complexe III

Récupère e- de FADH2,

cède à ubiquinone ->

complexe III

Récupère e- de l'Ubiquinol, cède au

cytochrome C -> complexe IV

Récupère e- de

cytochrome C, réduit

O2 -> formation H2O

Gradient de H+

entraine rotation

de F0, active F1 -

>

phosphorylation

ADP -> ATP

Inhibiteur Roténone Malonate Antimycine A CN-, CO, N3- olygomycine

Remarque

Ubiquinone se

retrouve oxydée en

ubiquinol. Plus gros

complexe

En commun avec le cycle

de Krebs. Ubiquinol

diffuse librement. N'est

pas transmembranaire

Récupère tous les e- des complexes I

et II

1/2 O2 + 2H+ + 2e- ->

H2O

F1 : 6 SU

catalytique

F0 : canal à

protons. Ne

consomme pas

d'énergie

Pompe à protons Oui Non Oui Oui

Métaux centre Fer-soufre Centre fer - soufre Centre Fer-soufre Cu

Coenzyme FMN FAD

Rôle

oxyde le NADH2,

réduit l'ubiquinone

oxyde FADH2, Réduit

l'Ubiquinone en

Ubiquinol

oxyde l'ubiquinol en ubiquinone,

réduit le cytochrome C

oxyde le cytochome

c réduit. Réduit O2

en H2O.

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QCM1 CONCERNANT LES VOIES METABOLIQUES – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS, LAQUELLE

(LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) Elles sont localisées dans des sites cellulaires spécifiques et réversibles B) Elles sont principalement régulées par des enzymes qui catalysent des étapes limitantes C) Elles font l’objet d’une régulation allostérique et /ou hormonale D) Les voies cataboliques sont réductrices tandis que les voies anaboliques sont oxydatives E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 2 CONCERNANT LA GLYCOLYSE – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS, LAQUELLE (LESQUELLES)


A) Elle se déroule en 8 étapes dont 3 sont irréversibles B) Elle réalise l’oxydation complète de l’acétyl-CoA C) Les 3 enzymes régulatrices sont la citrate synthase, l’isocitrate déshydrogénase, l’α-cétoglutarate

déshydrogénase D) La succinate déshydrogénase est en enzyme agissant dans la catalyse de la glycolyse et fait aussi partie de

l’un des complexes de la chaine respiratoire E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte

QCM 3 QUEL(S) EST (SONT) LE (LES) REGULATEUR(S) ALLOSTERIQUE(S) DE LA GLYCOLYSE

A) GTP B) AMP C) G6P D) ATP E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte

Exercice 1 :

VRAI/FAUX

A) Le PDH fonctionne en anaérobie B) Le PDH est situé sur la face externe de la mitochondrie C) L’hydrolyse de l’ATP est de 30,5 kJ/mol D) Les étapes irréversibles de la glycolyse sont régulées par l’hexokinase, la phosphofructose kinase et la

pyruvate kinase E) Le bilan de la β-oxydation est 1 FADH2, 1NADH2, 1 acétyl-CoA par tour de spires F) La chaine respiratoire est un transporteur d’électrons qui fonctionne selon un ordre décroissant de potentiel

de réduction G) La sous-unité de F0 du complexe V permet de canaliser le flux de protons tandis que le F1 phosphoryle l’ADP

en ATP H) Les liaisons les plus stables sont celles dont la formation requiert le plus d’énergie et dont l’hydrolyse en

libère le plus

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Exercice 2 :


Complexe 1 Complexe 2 Complexe 3 Complexe 4

Nom NADH Déshydrogénase

Activités Transfert

d’électrons de

l’Ubiquinol puis au

cytochrome C

Pompes à protons Oui

Métaux Centre fer-soufre

Coenzymes FMN

Inhibiteurs Malonate

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QCM 1 CONCERNANT LES VOIES METABOLIQUES – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSOUS, LAQUELLE

(LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) FAUX, elles sont irréversibles et bien localisées dans des sites cellulaires spécifique B) VRAI C) VRAI D) FAUX, c’est l’inverse E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte.

QCM 2 CONCERNANT LA GLYCOLYSE – PARMI LES PROPOSITIONS CI-DESSUS, LAQUELLE (LESQUELLES)


A) FAUX, c’est le cycle de Krebs qui se déroule en 8 étapes. La glycolyse se déroule en 10 étapes

B) FAUX, c’est le cycle de l’acide citrique qui réalise l’oxydation complète de l’Acétyl-CoA C) FAUX, ces enzymes régulatrices font parties du cycle de Krebs D) FAUX, la succinate déshydrogénase est une enzyme agissant dans la catalyse du cycle de

Krebs E) VRAI

QCM 3 QUEL(S) EST (SONT) LE (LES) REGULATEUR(S) ALLOSTERIQUE(S) DE LA GLYCOLYSE – PARMI LES

PROPOSITIONS CI-DESSUS, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

A) GTP B) AMP C) G6P D) ATP E) Aucune des réponses ci-dessus n’est exacte

Exercice 1:

VRAI/FAUX

A) FAUX, en aérobie B) FAUX, face interne de la mitochondrie C) FAUX, attention au signe ! l’hydrolyse de l’ATP est de -30,5kJ/mol D) VRAI, E) VRAI, F) FAUX, ordre CROISSANT G) VRAI H) FAUX : Ce sont les liaisons INstables

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202


Exercice 2 :


Complexe 1 Complexe 2 Complexe 3 Complexe 4

Nom NADH Déshydrogénase Succinate

déshydrogénase

Ubiquinol –

cytochrome C

oxydoréductase

Cytochrome C

oxydase

Activités Transfert e- de NADH à

l’ubiquinone

Transfert e- de

succinate à Coenzyme

Q

Transfert électrons

de l’ubiquinol puis au

cytochrome C

Transfert e- de

cytochrome C à O2

Pompe à protons Oui Non Oui Oui

Métaux Centre Fer-Soufre Centre Fer-soufre Centre Fer-soufre Cu

Coenzyme FMN FAD

Inhibiteurs Roténone Malonate Antimycine A CN-, N-3, CO

pr. g. larcher pr. d. prunier pr. s. khiati pr. p. reynier

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