práctica 4-6

EQUIPO 1 Mariana Delgado DomínguezSilvana Tapia Cabrera Alejandra Jimenez MolotlaYailín Fernández López

PRÁCTICA 4: “SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA”

INTRODUCCIÓNLa cromatografía fue inventada por el botánico ruso Mikhail Tswett a

principios del siglo XX, empleando esta técnica para separar algunos pigmentos de las plantas, el nombre de este método viene del griego choma (color) y graphein (escritura); el cual es un método de separación, identificación y determinación de los componentes químicos de mezclas complejas ocupando dos fases inmiscibles entre ellas. En la cromatografía en capa fina, se utiliza una placa( generalmente de aluminio) que se recubre con fase estacionaria que puede ser alúmina o silica gel, en la cual se presentara un fenómeno de adsorción selectiva. La fase móvil ascenderá por capilaridad por la placa arrastrando a su paso los componentes de la mezcla (o también llamados solutos) logrando separarlos; las fases involucradas en este tipo de cromatografía son: solido-liquido, las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de migración entre los componentes de la fase móvil, polaridad (generalmente la fase estacionaria será más polar que la fase móvil, de forma que los componentes menos polares se desplazaran con una mayor velocidad) , tamaño de la partícula, temperatura, pureza de los disolventes, entre otros. La cromatografía bidimensional, se basa en desarrollar un cromatograma con dos fases móviles distintas en diferentes direcciones.(Aguilar, 2009)

En la cromatografía, en general se fundamentan en las velocidades de migración de las distintas sustancias que se quieren separar , que están gobernadas por su solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase móvil no polar . En un solo paso de separación cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de partición ( es una constante de equilibrio definido) .Para un sistema de solventes y un tipo de papel determinado , cada sustancia tiene un valor de Rf característico. Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo cromatograma en papel usa la cromatografía bidimensional en papel. Basada en el principio anterior , con la diferencia en la técnica , la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el primer cromatograma la hoja se rota 90º y se realiza una cromatografía paralela al segundo borde utilizando otro sistema desolventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad característica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografía debería incrementar en grado sustancial la separación de la mezcla de componentes.( Braitwaite,1985)


OBJETIVO GENERALIdentificar aminoácidos presentes en jugos de frutas mediante cromatografía

bidimensional en capa fina por comparación de valores Rf con los de soluciones tipo.

OBJETICO ESPECIFICOComparar el grado de resolución de la cromatografía bidimensional con el de la unidimensional para señalar ventajas y desventajas.

Analizar los aminoácidos presentes en el jugo de frutas experimental mente y el encontrado en la literatura

PROCEDIMIENTO

1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PROBLEMA

Se pesaron 20 g del fruto (por ejemplo: limón, naranja, piña, etc), se obtuvp el

jugo, se filtró a través de gasa, medir volumen obtenido y centrifugar 2000

rpm/min.

2. PREPARACIÓN DEL CROMATOFOLIO

Se tomaron tres cromatofolios cortados de la siguiente manera.

* Una en dos mitades de 12.5 cm x 20 cm, para los cromatogramas unidimensionales

(I y II)

* Las otras dos, en cuadrados de 20 cm2 para los cromatogramas bidimensionales (Ill

y IV)

Se marcaron cada una de los cromatofolios de la manera siguiente: en uno de los

extremos del cromatofolio se trazaron con un lápiz la línea de aplicación a 0.5cm.

Esta operación se realizó en los cuatro cromatofolios. En los dos cromatofolios para

cromatrograma unidimensional, sobre la línea de aplicación, se trazaro 11 puntos

equidistantes para la aplicación de las soluciones tipo de aminoácidos y del

problema, indicando en cada punto el nombre del aminoácido ( ver Manual, Figura 1

y 2, pág. 22)


3. APLICACIÓN DE LA MUESTRA

Cromatogramas unidimensionales I y II. En el punto de aplicación correspondiente

a cada aminoácido y solución problema se colocaron 5 µl de muestra.

Cromatogramas bidimensionales, En el punto de intersección, a los 3 cm, se

aplicaron 5 µI de cada solución tipo de aminoácidos, secando inmediatamente

después de la aplicación de cada aminoácido.

En el cromatograma IV se hicieron un mínimo de 10 aplicaciones, de 5 µL cada una,

del jugo del fruto elegido, secando después de cada aplicación.

4. NEUTRALIZACIÓN CON VAPORES DE AMONIACO (HIDRÓXIDO DE

AMONIO)

Después, se expusieron a los vapores de amoniaco 15 segundos.

5. SATURACIÓN CON LA PRIMERA FASE MÓVIL: BUTANOL- AC.

ACÉTICO-AGUA

Se colocaron los cromatogramas I, III y IV en la cámara previamente saturada con los

disolventes de la fase móvil y se saturaron por un mínimo de 10 minutos.

6. DESARROLLO CON LA PRIMERA FASE MÓVIL

Una vez saturados los cromatogramas se agregaron a la cubeta 120 ml de la mezcla

de disolventes, que constituyen la primera fase móvil (ver apéndice I. Preparación de

reactivos). Cuando el frente del disolvente haya alcanzó las 3/4 partes del largo del

cromatofolio se sacaron los cromatogramas, utilizando guantes, y se marcó con lápiz

el frente del disolvente.

7. ELIMINACIÓN DE LA PRIMERA FASE MÓVIL

Se eliminó la primera fase móvil por secado con calor en un horno para

cromatografía. El indicador de temperatura marcó 50 °C.

8. SATURACIÓN CON LA SEGUNDA FASE MÓVIL: METANOL- ETANOL-

UREA-AGUA

Se giraron 90º los dos cromatogramas didimensionales III y IV y se colocaron en la

cámara de cromatografía; se colocaron también el cromatograma unidimensional II,

que se desarrollaron únicamente en este sistema de disolventes. La saturación de los

cromatogramas en la segunda fase móvil, se llevó acabo en un mínimo de 10


minutos.

9. DESARROLLO CON LA SEGUNDA FASE MÓVIL

Se adicionaron a la cubeta 150 ml de la segunda fase móvil (ver apéndice I.

Preparación de reactivos), se dejó desarrollar a lo largo del cromatofolio hasta 3/4

partes del mismo. Se sacaron los cromatogramas de la cámara, usando guantes y

marcar con lápiz el frente del disolvente.

10. ELIMINACIÓN DE LA SEGUNDA FASE MÓVIL

Se repitieron el paso 7 para eliminación de la segunda fase móvil.

11. REVELADO POR ASPERSIÓN

Se colgaron los cromatogramas en la campana de extracción y se rociaron de

manera uniforme con una solución de ninhidrina al 0.2 % en el etanol al 96 %, desde

la línea de aplicación hasta el frente del disolvente. Se dejaron en la oscuridad al

menos, 1 hora antes de obtener los valores de Rf.

RESULTADOS1. Representación esquemática de los cromatogramas

Imagen 1.0 Cromatografía


Figura 1.1 Cromatoplaca de aminoácidos

bidimensional la cual no corrió.

Figura 1.2 En ésta foto se puede mostrar una cromatoplaca, la cual contiene las 6 muestras de los jugos problemas, los cuales como se puede apreciar tuvieron una elución correcta a lo largo de la cromatoplaca. 2° mezcla de solventes


Figura 1.3 En ésta foto se puede mostrar una

cromatoplaca, la cual contiene las 6 muestras de los jugos problemas, los cuales como se puede

apreciar tuvieron una elución correcta a lo largo de la cromatoplaca. 1° mezcla de solventes

Aminoacidos de Zanahoria

Fenilalanina

Triptofan

Aminoacidos de Zanahoria

7.8 cm midiendo del punto de aplicación al final del frente de corrimiento


Figura 1.3.1Representación de la fotografía superior

Las cromatoplacas bidimensionales no tuvieron corrimiento alguno por lo tanto no se representaron esquemáticamente ni en tablas.

1a Fase móvil 2a fase móvil


AminoácidoFrente delDisolvente

Frente delSoluto

Rf Frente delDisolvente

Frente delSoluto

Rf

Glutámico 9cm 2.5cm 0.27 7cm 6.6cm 0.94Prolina 9cm Nada 0 7cm Nada 0Histidina 9cm Nada 0 7cm Nada 0Alanina 9cm 2.5 cm 0.27 7cm Nada 0Lisina 9cm 1, 2.7cm 0.11

0.37cm Nada 0

Triptofano 9cm 5.7cm 0.63 7cm Nada 0Valina 9cm 2.9, 3.7cm 0.32

0.4117cm 6.2cm 0.88

Arginina 9cm 1.3cm 0.144 7cm 6.8cm 0.97Tirosina 9cm 2.7cm 0.3 7cm Nada 0Metionina 9cm Nada 0 7cm Nada 0

Tabla1. Rf de Aminoácidos tipo en placa unidimensional

No. demancha

1a Fase móvil 2a fase móvilFrente deldisolvente

Frente delSoluto

Rf Frente deldisolvente

Frente delsoluto

Rf

1 9cm 2cm3cm

0.220.33

7.8cm 6.8cm 0.87

2 9cm 2cm2.8cm 5cm

0.220.310.55

7.8cm 7.1cm7.4cm

0.910.94

3 9cm 1.3cm2cm

2.5cm3.3cm3.9cm5cm

0.140.220.270.360.430.55

7.8cm 7cm 0.89


4 9cm 0.6cm1.5cm2.3cm3.3cm

0.0660.160.250.36

7.8cm 6.4cm7cm

7.4cm

0.820.800.94

5 9cm 1.2cm1.9cm3.2cm5cm

0.130.210.350.55

7.8cm 6.3cm7cm

7.4cm

0.800.890.94

6 9cm 1.6cm4,4cm5.3cm

0.170.430.58

7.8cm 6cm6.5cm7.3cm

0.760.830.93

7 9cm 0.7cm1.2cm2.4cm3.3cm4.4cm5cm

0.070.130.260.360.480.55

7.8cm 5.9cm7cm

0.750.89

8 9cm 0.9cm1.6cm2.2cm2.8cm3.3cm4.1cm5cm

0.10.170.240.310.360.450.55

7.8cm 7.4cm 0.94

Tabla 2. Rf de los jugos analizados. Placa unidimensional

PRENGUNTAS ADICIONALES1. Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como

problema.


Jugo Problema: UVA

Aminoácido reportado en literatura Aminoácido encontrado

Alanina Glutámico

Arginina Prolina

Cistina Histidina

Fenilalanina Alanina

Glicina Lisina

Hidroxiprolina Triptofano

Histidina Valina

Metionina Arginina

Prolina Tirosina

Serina Metionina

Tirosina

Treonina

Triptofano

Valina

2. Escriba la reacción completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminoácido.


La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el

grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con

reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez

con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición

doble que presenta una coloración azul-púrpura.

3. ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Explique su respuesta.

No es posible ya que las eluciones llevan un orden y conforme a la metodología no

saldría el rf

4. Mencione 3 aplicaciones de la cromatografía en capa fina, diferentes al utilizado,

explique uno.


Identificación de alguna sustancia conocida en una mezcla por su comparación

con un patrón con una sustancia pura.

Medir el grado de pureza de una muestra, si existen varias manchas en el

cromatograma, es señal de que exisen varios componentes en la muestra.

Obener una medida semi cuantitativa de algún componente, pichando la

misma cantidad en la placa cromatográfica, cuanto mayor sea la mancha

obtenida en el cromatograma, la concentración de esa sustancia será mayor.

5.-Indique las posibles fuentes de error de esta técnica.

Que se aplicara una solución muy cocentrada, no siempre es útil para separar

algunas sustancias por lo que se necesita repetir el experimento.

Utilizar un eluyente con alta polaridad, puede desplazar demasiado a la muestra lo

cual causaria errores en el cociente al momento de sacar el Rf

6. Explique como se podria cuantificar el analito y cuales serían las ventajas y

desventajas de utilizar una curva de calibración o un estándar de concentración

Obteniendo mediante un raspado de la cromatoplaca parte de la muestra y haciendo

una dilución en una celda para obtener sus absorbancias y sacar concentraciones por

método espectofotométrico.

Método Ventajas DesventajasCurva de calibración Se obtienen

concentraciones

exactas

No se sabe que interfiera en

la muestra

Estándar de concentración

DISCUSIÓN


Se utilizó la técnica de cromatografía en capa fina, la cual se basa en la separación de las moléculas absorbidas a la capa de gel de sílice de la cromatoplaca mediante el flujo de la columna de la mezcla de solventes de agua, butanol y ácido acético. La fase estacionaria es la celulosa y la móvil los disolventes. Según la solubilidad que tienen los aminoácidos de la muestra respecto de las dos fases así fue su movilidad Las manchas de los aminoácidos se observaron sobre la placa desarrollada, por la una solución de ninhidrina rociada y al después ponerla en la estufa.

Los aminoácidos aparecieron como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro.

Se utilizó la ninhidrina debido a que sirve para la determinación de aminoácidos con el grupo amino libre .La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura. La ninhidrina reacciona con los aminoácidos formando aductos coloreados según la reacción:

El reparto de los aminoácidos en el papel se debe a su naturaleza química. Las fórmulas de los compuestos usados como patrón son:


El reparto que se obtiene es el siguiente: los aminoácidos apolares son los que mejor interaccionan con el solvente y son arrastrados por él; la lisina presenta la menor movilidad debido a que al pH del solvente, este aminoácido presenta sus dos grupos amino cargados positivamente por lo que interacciona mal con el solvente, mayoritariamente apolar (n-butanol). Los demás aminoácidos se separan entre los aminoácidos apolares y el básico.

Al determinar los factores de retención se puede observar que el triptofano es el que mayor factor de retención obtuvo, esto debido a que es el que tiene mayor afinidad por el disolvente y el de menor factor de retención fue la histidina, es decir, tuvo menor afinidad por el disolvente.

CONCLUSIONESEsta técnica de separación cromatográfica es de las más simples, además de que nos permitió estudiar esta técnica y cualitativamente observar la reacción producida por medio de la ninhidrina que permite identificar aminoácidos ya que la reacción de los aminoácidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo α–NH2 en los

mismos observándose así una coloración morada o magenta. La prolina no tiene dicho grupo libre, sino –NH- ya que forma parte del anillo de pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se forma un color amarillo….El factor de retención depende de la afinidad de los aminoácidos con el disolvente o


eluyente utilizado y esto mismo depende del tipo de aminoácido que se utilice, es decir si son polares, apolares, neutros, etc., por lo cual es importante esta técnica ya que de esta manera se nos facilitaran saber las características del aminoácido que se este utilizando.

REFERENCIAS.Aguilar Zamora Emanuel 2009, Manual del Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Químico Bacteriólogo Parasitólogo, México.

.Braitwaite,L.and F,J .Smith 1985 Cromatographic Methods 43 ed,Chapman and Hall ,N.Y paginas 98-101


PRÁCTICA 5: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y FLUORESCEINA USANDO CROMATOGRAFÍA POR ADSORCIÓN

INTRODUCCIÓN

La cromatografía consiste en una serie de métodos que sirven para la separación de una mezcla de solutos. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. El fundamento de la cromatografía consiste en el reparto o distribución diferencial de dos o más compuestos (solutos) entre dos fases, una de las cuales permanece fija, por lo que se denomina fase fija o estacionaria y otra que fluye a través de ella, por lo que se le denomina fase móvil o eluyente. Como la fase estacionaria debe permanecer fija, su estado físico se limita a sólidos y líquidos, en tanto que la fase móvil requiere ser un líquido o un gas para poder fluir.Las separaciones por cromatografía de reparto, son particularmente interesantes para los compuestos solubles en agua. La cromatografía por adsorción es el fenómeno de adhesión superficial cuyo mecanismo consiste en interacciones bipolares. Esta utiliza una fase líquida móvil y una fase estacionaria sólida. Se puede tener en columnas o en capa fina. En esta cromatografía se sobresalta porque la diferencia principal es la composición de la fase móvil; esta es de tal naturaleza que cuando el material se aplica al adsorbente, el soluto queda inmovilizado. La migración empieza hasta que se añade una fase móvil.(Castellan, 1990)

Existen ciertas sustancias sólidas, químicamente inertes, que tienen la propiedad de adsorber o fijar débilmente en su superficie a una gran cantidad de compuestos. La fortaleza con la que se adsorben las sustancias sobre un adsorbente dado varía de un compuesto a otro. Entre los adsorbentes más usuales: sílica Gel (óxido de silicio), alúmina (óxido de aluminio), celulosa, fluorosil (silicato de magnesio) y sulfato de calcio. La separación se realiza por la diferente tendencia de adsorción de los compuestos orgánicos por la fase estacionaria. La fase móvil desplaza y disuelve a los componentes de la mezcla según sea su afinidad por la fase estacionaria es decir, los componentes más polares estarán adsorbidos con más fuerza y serán más difíciles de separar de la fase estacionaria que los componentes poco polares. Los menos polares no presentan una interacción importante con la fase estacionaria (gel de sílice) y no serán retenidos. En un proceso de adsorción los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad de tal forma que el proceso adsorción. (Carrillo, 2009)


OBJETIVO GENERALAplicar la técnica de cromatografía por adsorción para la separación de dos

colorantes.

OBJETIVO ESPECIFICOComprobará la separación con base en el perfil de elución para señalar las ventajas y

desventajas del método.

PROCEDIMIENTOSe llenó tres cuartas partes de la columna de vidrio, se introdujo un disco de

lana de vidrio previamente humedecido para formar un soporte en la base de la

columna. Se pesaron 15 g de alúmina alcalina y se adicionaron a la columna. Una

vez sedimentada la alúmina, se ajustó la velocidad de elución entre 15 y 20 gotas por

minuto. Cuando el menisco del agua estaba 3 mm por encima de la columna de

alúmina, se aplicó 0.1 ml de la mezcla de colorantes en la parte central de la

superficie del adsorbente, se comenzó a colectar fracciones de 3.0 ml en tubos de

ensaye previamente aforados; se adicionó aproximadamente 1 ml de agua con pipeta

Pasteur, resbalando por las paredes de la columna para introducir toda la mezcla de

colorantes a la alúmina.

Esta operación se repitió unas tres veces, hasta que ya no hubiera colorantes

en la superficie de la fase estacionaria. Se adicionó agua destilada hasta el extremo

superior de la columna de vidrio. Después de que el primer colorante eluyó, se

sustituyó el agua por el etanol ácido y se continuó la colección de fracciones

obtenidas a 493 y 590 nm, Se ajustó a 100 % T a 493 nm con agua y con alcohol

ácido a 590 nm.


DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

1. Elaborar la siguiente tabla

Tabla 1. Valores de absorbencia obtenidos para la separación defluoresceína y azul de metileno

No. de fracción A 493 A590

1 0.023 0.08

2 0.022 0.016

3 0.03 0.009

4 0.034 0.078

5 0.008 0.009

6 0.17 0.003

7 0.026 0.001

8 0.0082 0.078

Fluoresceina Azul de Metileno

PERFIL DE ELUCION

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

0.020.040.060.08

0.10.120.140.160.18

Absorbancia para la separacion de fluoresceina y azul de metileno.

A 493

A 559

Volumen de elución

Ab

sorb

anci

as


Figura 1.0 En este perfil de elución se observan claramente dos picos el primero corresponde a la separación de fluoresceína ya que es el primer componente de la mezcla que se obtuvo, enseguida se observa un lapso en el que no se obtuvo ningún componente, es decir que las absorbancia fueron casi constantes y finalmente se observa otro pico que corresponde al azul de metileno ya que el colorante que se obtuvo al final.

3. Especifique y defina los elementos del sistema cromatográfico para esta

separación

Fase Estacionaria: Silica Alcalina. Puede ser un sólido poroso que funciona de soporte para la elución y poseen alta capacidad de adsorción, interacciona con los compuestos a separar por puentes de hidrogeno e interacciones electrostáticas.Fase Móvil: Agua y Etanol ácido. También conocida como eluyente es una mezcla de solventes que arrastra a los componentes que se encuentran adheridos a la fase estacionaria, son de gran importancia pues determinan con sus interacciones y afinidad el perfil de elución.Columna: Columna de Vidrio: Es el instrumento de soporte de la fase estacionaria, en este caso se utiliza un trozo de lana-cristal para poder retener la silica en la columna.Gradiente: Agua y cambio a Etanol ácido. Consiste en utilizar mezclas variables de dos o mas sustancias de distinta polaridad, la relación de volumen de los disolventes varía según el propósito y permite una elución mejorada.Mezcla: Es un conjunto de 2 o más sustancias que pueden ser separadas por un método físico o químico.

4. Defina el término adsorción y describa, empleando fórmulas, cuales son las

fuerzas intermoleculares que participan en el proceso.

Adsorción: Fenómeno por el cual moléculas de un gas o de un líquido se fijan dentro de una fina capa superficial de determinada sustancia en estado sólido.

Fluoresceína

La fluoresceína es una sustancia muy polar debido a los electrones no compartidos, esta misma característica presenta el agua, sabemos que lo polar disuelve lo polar por lo tanto la fluoresceína se disuelve en el agua, por lo tanto lo que eluye son ambas sustancias.


Fluoresceína sódica agua

Azul de metileno

El azul metileno eluye con el etanol acido (ambas sustancias no polares) por que entre estas dos se da una competencia por el adsorbente, ya que se sabe que adsorbentes con superfiece activa alta adsorben a compuestos no polares

Azul de metileno etanol

DISCUSIÓN:A simple vista se observó que el primer elemento en separarse fue la fluoresceína y posteriormente el azul de metileno.En el perfil de elución se observan dos elevaciones:

La primera se detecto a una longitud de onda de 493 nm que corresponde al agua, como sabemos el agua es una sustancia polar por lo tanto disolverá compuestos semejantes. En la mezcla de colorantes el componente mas polar es la fluoresceína, por lo tanto la elevación en el perfil de elución corresponde a la separación de este compuesto.

Hay algunos volúmenes en los que a diferentes longitudes de onda la absorbancia es mínima lo cual indica que durante este lapso no se separo ningún componente de la mezcla.


La alúmina (fase estacionaria) tiene una superficie activa alta, por lo cual adsorberá mejor a compuestos no polares; al no presenta polaridad, el etanol y azul de metileno competirán por ser adsorbidos, lo cual les permitirá que eluyan juntos, es por esto que se en el cromatograma se observa el segundo pico ya que este fue detectado a 668nm que corresponde a la longitud de onda para el etanol.

CONCLUSIONES:. En esta cromatografía se aplico el principio básico polar disuelve polar, esto es lo que hizo posible que separar a la fluoresceína de acuerdo a su polaridad, finalmente el otro componente se pudo separar ya que la fase estacionaria presentaba una superficie activa alta lo cual le hace tener gran afinidad por los compuestos no polares, al haber dos compuesto no polares en la cromatografía (azul de metileno y etanol) esto competirían por ser adsorbidos lo que ocasiono que eluyeran juntos.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Carillo del Ángel José de Jesús 2009 MANUAL DEL INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA 4IM2 SECCION III 2011500079

.Catellan, G.W.1990 Fisicoquimica .Fondo Educativo Interamericano, S.A, Mexico paginas 818-820.

PRÁCTICA 6: VERIFICACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO CORRECTO DE UN ESPECTROFOTÓMETRO

INTRODUCCIÓN

Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve


para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa y visuales.

Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones:

1. Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra2. Indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos interesa está

presente en la muestra

La espectrofotometría de absorción en las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagnético es, posiblemente, la más utilizada en la práctica del análisis cuantitativo de todas las técnicas espectroscópicas. Asimismo, puede resultar de utilidad como técnica auxiliar para la determinación de estructuras de especies químicas.(Murali,1980)

La química es importante para realizar la lectura de un líquido en cualquier material volumétrico. Para esto deben coincidir la curva (más bien la tangente de ésta)(la parte central)con el aforo o graduación. Siempre teniendo la vista perpendicular a ambas.

El líquido restante del menisco que queda por encima del aforo (en caso de ser cóncavo), generalmente queda en el recipiente una vez vertido el contenido.(Rand,1969)

CONTROL DE LA EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDANO APTO PARA FOTOCOLORÍMETROS NI AUTOANALIZADORES

Frecuencia del control:

El control se podrá realizar en espectrofotómetros con selector continuo de

http://es.wikipedia.org/wiki/Material_volum%C3%A9trico_(qu%C3%ADmica)

http://es.wikipedia.org/wiki/Qu%C3%ADmica

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/cf/Reading_the_meniscus.svg


longitudes de onda, no así en fotocolorímetros de filtro ni en autoanalizadotes, ya que en estos no se pueden realizar espectros de barrido.

Definición: Grado de concordancia entre la longitud de onda que indica el seleccionador y la longitud de onda de referencia requerida. Se expresa en nm.

Fundamento: Se utiliza el método del punto isosbéstico: el rojo Congo tiene la particularidad que los espectros de las formas ácida y básica del colorante en igual concentración presentan la misma absorbancia a una longitud de onda denominada "punto isosbéstico" (PI). Esta longitud de onda es independiente de la concentración del colorante y de la temperatura de trabajo por lo cual resulta un parámetro fijo de referencia. Si el punto isosbéstico hallado experimentalmente difiere del teórico, indica que existe un corrimiento en la longitud de onda .(Frings,1979)

OBJETIVO GENERALRealizar pruebas de control de calidad de un espectofotómetro para determinar la respuesta instrumental del equipo.

OBJETIVO ESPECIFICO

Analizar las siguientes pruebas: proporcionalidad o linealidad fotométrica, exactitud de la escala de longitud de onda, presencia de radiación dispersa, ancho de banda y exactitud para determinar la respuesta de diferentes equipos espectofotométricos.

PROCEDIMIENTO

A) Se determinó el volumen mínimo de lectura y se observó el “Efecto menisco”.

Se ajustó el aparato a cero con aire, a una longitud de onda de 500 nm. Se

colocaron 0.2 ml de la solución dicromato de potasio al 0.08 % y se tomó la

primera lectura. Se agregaron 0.2 ml de la solución nuevamente y se registró la

lectura. Se repitió la adición de la misma cantidad de solución tomando las

lecturas hasta que permaneciera constante. Se determinó el volumen mínimo de

lectura.


A) Exactitud de la escala de longitud de ondaSe colocó el selector de longitud de onda en 380 nm y se ajustó el instrumento al aire

(0 %T) Se ajustó a 100 %T con agua destilada y se insertó el filtro de didimio en el

portacubetas sin quitar la celda con agua y se leyó la transmitancia a las diferentes

longitudes de onda (ver manual, Tabla 2, pág 38)

A.2) Método de solución química colorida. Solución acuosa de NiSO4. 6H20 al 20 %.

Se colocó el selector de longitud de onda en 400 nm y se ajustó a 100 %T con una

solución de HCI al 1 %, empleada como blanco de reactivos. Se colocó la solución

del sulfato de níquel en el portacubetas y se leyó la transmitancia de 380 a 600 nm en

intervalos de l0 nm, ajustando a 100 %T con el blanco de reactivos cada vez que

cambie la longitud de onda, tabla 3.

A.2,1) 1. Se adicionaron 25 µL de la solución de rojo de cresol al 1 % en cada uno

de tres matraces aforados de 25 mL.

2. Se aforaron cada uno de los matraces con las siguientes soluciones

a) Ácido sulfúrico 0.5 M

b) Hidróxido de sodio 0.5 M

c) Regulador de citratos 0.5 M pH 4.7

3. Se leyeron las absorbencias de las tres soluciones en un espectrofotómetro,

desde 360 nm hasta 680 nm con intervalos de 20 nm. Se ajustó a cero con agua

destilada después de cada cambio de longitud de onda.

B) Proporcionalidad o linealidad fotométricaSe determinó la absorbencia a 460 y 550 nm de la solución de NiSO4. 6H20 al 20 %

ajustando previamente el aparato al aire y a 100 %T al 1 % (tabla 4, pág 39)

C) Luz dispersa, espuria y errática o extrañaSe ajustó el instrumento al aire (0 %T) y a 100 %T con HCI al 1 %. Se leyó la

transmitancia de la solución estándar de sulfato de níquel al 20 % a 400 nm, para

comprobar que no existía luz extraña a ambas longitudes de onda, se comparó con

las lecturas del experimento del inciso A.2. Se considera que existe luz extraña

cuando hay un crecimiento de %T mayor a 3, con respecto a la lectura original a

ambas longitudes de onda, (ver Tabla 5, pág 39)


D) Ancho de la banda (ranura de salida)Se leyó la transmitancia del sulfato de níquel al 20 % a 510 nm, se ajustó

previamente el aparato a 0 y 100 %T con HCI al 1 %. Se considera que hay cambios

en el ancho de banda cuando hay decrementos del 3 %T con respecto a la lectura

original (inciso B) (ver manual, Tabla 6, pág 39)

E) Exactitud fotométricaEn una espectrofotómetro que trabaje en la región ultravioleta, se determinó la

absorbancia de una solución de referencia de dicromato de potasio. Se ajustó el

instrumento al aire y a 100 %T con H2SO4 0.005 M. La lectura se efectuó en una

cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz, (ver Tabla 7, pág 40)

COMPORTAMIENTO INTEGRAL DEL ESPECTROFOTÓMETRO

a) Prepare por duplicado la curva de calibración de acuerdo a la siguiente tabla

Tabla No. 1 Preparación de la curva de calibración del sulfato de níquel, (ver manual, pág 37)

Se determinó la absorbencia de cada tubo de ambas series, a 400 nm ajustando al

100 % T con el tubo 1 y 1 ' respectivamente, (Tabla 8, pág 40)

RESULTADOS Y ANALISISTabla 1. Determinación Del Volumen Mínimo De Lectura Y “Efecto Menisco”

La luz atraviesa de manera uniforme a un volumen mínimo de lectura de 1mL y presenta un efecto menisco a 0.8mL de la sustancia de bicromato (0.08%) a 500nm de longitud de onda.

A) Exactitud de la escala de longitud de onda

Volumen Absorbencia

0.2 0.117

0.4 0.121

0.6 0.379

0.8 0.833

1.0 0.833


Tabla 2. Transmitancias del método de solución química colorida con la solucion de NiSO4. 6H20 al 20 %

Longitud de onda (nm) % T380 34.0

390 24.4

400 24.7

410 32.8

420 51.4

430 75.2

440 89.3

450 96.2

460 99.2

470 102.5

480 106.2

490 107.4

500 108.0

510 107.8

520 106.7

530 103.6

540 104.9

550 103.9

560 102.8

570 100.4

580 97.4

590 93.5

600 88.6


380400

420440

460480

500520

540560

580600

0

20

40

60

80

100

120Espectro de Transmision

Longitud de onda (nm)

%T

Anexo 1 (espectro de transmision).

Se muestra como pico de lectura a 500 nm con un transmitancia del 108%.

% Inexactitud fotométrica = (Abs. hallada – Abs. referencia) x 100 Abs. referencia

Exactitud de la escala de longitud de onda del espectrofotó metro:

%error = 0.3725− ¿❑¿ x 100 =

Tabla 3. Método de solución química colorida

Longitud de onda H2SO4 NaOH Citrato

360 0.523 0.530 0.063

380 0.021 0.296 0

400 0.022 0.018 -

420 0 0 -


350 360 370 380 390 400 410 420 4300

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Metodo de solucion quimica co-lorida

H2SO4CitratoNaOH


Ab

sob

enci

as

Anexo 2

Corrimiento (nm) = p. isosbéstico hallado – p. isosbéstico teórico

El punto isosbéstico teórico del Rojo Congo es 541 nm. Corrimiento (nm) = 420 – 500 = 80 nm Ya que los limites de aceptabilidad se encuentran en un corrimiento de entre +/- 3 nm y un intervalo optimo de entre +/-2 nm, se determino que existe un gran corrimiento en la longitud de onda, mayor a 3 el cual fue de 101.Se debe tomar en cuenta que las mediciones se detuvieron en ese intervalo por lo cual no se llego a las mediciones adecuadas para obtener el punto isosbestico real para las tres disoluciones. Absobancia de color Rojo. 500‐560B) Linealidad o proporcionalidad fotométrica

Tabla 4. Linealidad o proporcionalidad fotométricaSolución de NiSO4. 6H20 al 20 %

Longitud de onda

(nm)

A

460

550 0.092


La proporción de la intensidad de luz que llega al detector, es aproximada a 2:1.

C) Luz dispersaTabla 5. Transmitancia de la solución estándar de sulfato de níquel al

20 % a 400 nm

Procedimiento % T

A.2 24.7

C 25

No existe una luz extraña o longitud de onda distinta a la seleccionada por el

monocromador, que alcanza el detector, ya que no supera el 3% de transmitancia.

D) Ancho de bandaTabla 6. Ancho de banda.

Longitud de

onda (nm)

% T

510 100.3

550 92%

Existe un cambio mayor al 3% por lo tanto se considera un cambio en el ancho de

banda para el espectrofotometro.

E) Exactitud fotométrica Tabla 7. Exactitud fotométrica. Valores experimentales esperados de la

solución de referencia de dicromato de potasio


235min

257máx

313min

350máx

A esperada 0.748 0.865 0.292 0.640

Tolerancia aceptada 0.740-0.756 0.856-0.874 0.289-0.295 0.634-0.646

E (1%, 1cm) 24.54 144.2 48.62 106.56


A medida 0.792 0.912 0.298 0.667

Tabla 8. Verificación del funcionamiento del espectrofotómetro.

Experimento Datos obtenidosExactitud de la escala de longitud de onda. E = λm- λrefProporcionalidad o linealidad fotométrica.

Luz dispersa, espuria y errática o extraña.

Ancho de la banda (Ranura de salida).

Exactitud fotométrica. %Error = Am – Aref x 100 Aref

El espectrofotometro (Genesis ) utilizado en la practica ---- tiene exactidud-

Causas de erros:

Cambio en el ancho de banda.

Alteración de la respuesta relativa o rendimiento instrumental.

F) Funcionamiento integral del espectrofotómetro.


Tabla 9. Funcionamiento integral del espectrofotómetro

Tubo No. Concentración de

NiSO4. 6H20 (M)

A400 Serie ajustada por

regresión lineala b Serie a Serie b

1 1’ 0 0 0 0

2 2’ 9.50x10-03 0.028 0.034 0.03

3 3’ 0.0285 0.084 0.159 0.095

4 4’ 0.0665 0.202 0.222 0.24

5 5’ 0.1045 0.363 0.357 0.37

6 6’ 0.1425 0.468 0.532 0.51

7 7’ 0.152 0.570 0.562 0.54

8 8’ 0.171 0.607 0.619 0.61

9 9’ 0.1805 0.646 0.658 0.65

10 10’ 0.19 0.670 0.701 0.68

Curava de calibracion

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

f(x) = 3.6025137470542 x + 0.00793731343283571R² = 0.993468371946723

Curva de calibracion del funcionamiento integral

Serie ALinear (Serie A)Serie BLinear (Serie B)

concentracion (M)

Ab

s (4

00

nm

)

Anexo 3 (curva de calibracion)

c) ¿Cómo se interpretan estos valores para esa curva?

d) Concluya respecto a la linealidad en la respuesta del detector


DISCUSIÓN:El efecto menisco que se lee en el espectrofotometro genesis es de 0.8 mL y su volumen

minimo al cual leera de forma correcta sera de 1.0 mL el cual es similar en la mayoria de los

espectrofotometros.

Exactitud de la escala de longitud de ondaLas ventajas del metodo a partir de una solucion colorida, es que la longitud de onda que se

obtienen del colorante es independiente de la concentración del colorante y de la temperatura

de trabajo por lo cual resulta un parámetro fijo de referencia y a partir de un valor ya

establecido se puede obtener una exactitud aproximada de la escala de longitud sin

embargo, si no se llevan a cabo las disoluciones de manera correcta los datos obtenidos

marcaran un grado de inexactitud al que se deberia obtener. Y que el espectro de

transmision solo nos dara un valor maximo, aunque si se obtienen dos puede que exista un

error, por que las celdas estan rayadas.

En este espectrofototmetro no existe una luz extraña o longitud de onda distinta a la

seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector, por lo tanto no existe una luz

que interfiera en las lecturas o que aunmente el grado de error en estas de forma

significativa.

Existe un cambio mayor al 3% por lo tanto se considera un cambio en el ancho de

banda para el espectrofotometro.

CONCLUSIONES: _________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

___________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1:Murali Dharan. Control de calidad de instrumentos y equipamientos de laboratorio. En: Murali Dharan. Control de Calidad en las Laboratorios Clínicos. Madrid: Ed. Reverté S.A; 1980. p. 145-62.


2: Rand RN. Practical spectrophotometric standards. Clin Chem 1969; 15 (9): 839-63.

3: Frings CS, Broussard LA. Calibration and monitoring of spectrometers and spectrophotometers Clin Chem 1979; 25 (6): 1013-7.

práctica 4-6

Documents