Resumen:La cuantificacin de protenas ya sea de tejido (en este caso de camarn) o de levadura es un proceso ya muy estudiado que conlleva diversas tcnicas ya sea mtodos fsicos mecnicos, mtodos fsicos no mecnicos y mtodos qumicos. En esta prctica se realizaron distintas tcnicas que nos permitieron analizar desde un punto de vista cualitativo y cuantitativo, el contenido proteico de nuestras muestras biolgicas. La cuantificacin de protena se llev acabo en tres pasos, primero se realiz una extraccin de protena por medio de una disrupcin mecnica para que despus se llevara a cabo una cuantificacin de la concentracin proteica utilizando tres mtodos para este caso como lo son: el mtodo Biuret, Bradford y Lowry. Para cada uno de mtodos anteriormente mencionados se les realizo una curva estndar midiendo su absorbancia en un espectrofotmetro. Se realiz la cuantificacin de dos muestras problema (Tejido de camarn y levadura) a las cuales se les hicieron las tres pruebas. Por ltimo se realiz una electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) que sirvi para la purificacin, anlisis y caracterizacin de protenas ya que esta tcnica permite separar molculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la accin de un campo elctrico. Introduccin:Las protenas son polmeros de alfa-aminocidos estas desempean una amplia variedad de funciones esenciales en los mamferos. Entre las funciones dinmicas se encuentra la catlisis de las transformaciones qumica, el transporte, el control metablico y la contraccin. En cuanto a sus funciones estructurales, las protenas proporcionan la matriz para los tejidos seo y conjuntivo que dan estructura y forma al organismo humano (1).La extraccin de protenas es una etapa clave en el estudio de proteomica. Un mtodo de extraccin ideal es aquel que permite obtener el mayor nmero y mayor cantidad de protenas posibles de forma que se puedan detectar y a la vez no genere artefactos de modificacin post-extraccin. No existe un protocolo universal que permita extraer todas y cada una de las protenas, teniendo en cuenta el elevado nmero de especies proteicas (de decenas a cientos de miles) (2).Los organismos de las cueles se obtuvieron las protenas fueron camarn y levadura saccharomyces cerevisiae. En el camarn podemos encontrar la morfologa de s cuerpo se divide en tres partes: cefalotrax, abdomen y telson. La parte en la que se extrajo nuestra muestra fue el musculo este est constituido por protenas las cuales estn distribuidas a lo largo del mismo, y estas pueden ser de 3 tipos: sarcoplasmaticas, estromales, y miofibrilares siendo estas ltimas de mayor inters debido a que son las que se relacionan principalmente con la calidad del pescado y mariscos mediante la congelacin y la conservacin (3).Para la levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado dada su importancia en la industria panadera y vitivincola, as como porsu capacidad de producir etanol.La extraccin de protenas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los mtodos ms utilizados se basan esencialmente en la homogenizacin de los tejidos y la destruccin de los lmites celulares por medio de diferentes procedimientos fsicos y/o qumicos, obtenindose lo que se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberacin de las protenas de inters, evitando la degradacin trmica o las alteraciones secundarias por oxidacin, protelisis, etc. Se han desarrollado una amplia gama de tcnicas de disrupcin celular, que se usan a escala de laboratorio que se pueden clasificar como: a) mtodos fsicos mecnicos: agitacin con abrasivos, homogeneizacin a alta presin o extrusin por presin; b) mtodos fsicos no mecnicos: shock osmtico, ciclos de congelacin descongelacin, sonicaacin o secado; c) mtodos qumicos: tratamiento con lcali, solventes, detergentes, cidos o sustancias caotrpicas. Luego de la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separacin y purificacin de los componentes celulares. Como primera medida, puede realizarse una centrifugacin diferencial para obtener fracciones subcelulares. En este caso, las protenas asociadas a membrana quedarn en el pellet (precipitado que queda en el fondo del tubo luego de una centrifugacin) y las solubles en el sobrenadante (4).Para determinar concentracin de protenas totales se realiza una curva de calibracin utilizando una protena estndar, cuya concentracin es conocida. Los ensayos colorimtricos que ms se utilizan son:Ensayo de biuret (550nm): la reaccin de biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la formacin de un complejo Cu++ en medio alcalino en compuestos que poseen ms de un grupo CO-NH. Ensayo lowry (750nm): se trata de una reaccin en dos fases: en una primera se practica una reaccin parecida a la de biuret y en la segunda se trata el sistema mediante el reactivo de fenoles de folin-Ciocalteu. Esta segunda fase desarrolla un color azul obscuro y se debe a la presencia en la protena de aminocidos aromticos, particularmente tirosina y triptfano.Ensayo de Bradford (595nm): el mtodo de Bradford se fundamenta en la fijacin del colorante azul de coomassie (fast blue B) a las protenas, dando lugar a un cambio en el color que puede ser medido en el espectrofotmetro. (5)Para la separacin de las protenas se puede utilizar el mtodo de ELECTROFORESIS SDS-PAGE: SDS es el detergente anionico dodecil sulfato sodicco; PAGE es el acrnimo de polyacrylamide gel electrophoresis. Se trata de un procedimiento de electroforesis en el cual el desplazamiento de la protena en el medio electrofortico inducido por un campo elctrico es una funcin inversa (no necesariamente lineal) a su peso molecular. Para ello la preparacin de la protena cuyo peso molecular queremos conocer se calienta en presencia de SDS antes de la electroforesis y es as mismo tratada con mercaptoetanol o ditiotenol para romper los enlaces disulfuro. Con este procedimiento la protena se desnaturalizan pero continua en solucin gracias al detergente cuyas molculas se agregan a la protena desnaturalizada y debido a su carga elctrica negativa dotan a esta de una densidad uniforme de carga, ya que la molcula de SDS se fija a la protena desnaturalizada en una relacin de una molcula de SDS por cada dos aminocidos. Todas las protenas presentes en la preparacin adquieren as la misma densidad de carga elctrica (5).Metodologa:Extraccin de protena solublePrimero se realiz la extraccin de levadura: en un tubo eppendorf se coloc 1 mL de extracto de levadura, 200 L de buffer Tris 50 mM pH 8.2 y una tercera parte de su contenido en perlas de vidrio, enseguida el contenido fue homogenizado constantemente durante 8 lapsos de 1 minuto, teniendo cuidando de que la muestra en cada lapso reposara en un recipiente helado, durante otro minuto terminando este tratamiento se le realizo a nuestra muestra una centrifugacin a 13000 RPM durante 5 minutos por dos tiempo esto para que l muestra no se calentara demasiado. Despus se prepar un micro extracto de protena con tejido de camarn, cortando el tejido con un bistur en fragmentos muy pequeos, posteriormente el tejido fue colocado en un tubo eppendorf con 200 L de buffer Tris 50 mM pH 8.2 y un tercera parte de su contenido en perlas de vidrio, enseguida el contenido fue homogenizado constantemente durante 8 lapsos de 1 minuto, teniendo cuidando de que la muestra en cada lapso reposara en un recipiente helado, durante otro minuto terminando este tratamiento se le realizo a nuestra muestra una centrifugacin a 13000 RPM durante 5 minutos por dos tiempo esto para que l muestra no se calentara demasiado.Cuantificacin de protenas:Curva estndar. Mediante el mtodo de Bradford. Primero se prepar una solucin stock de albumina srica bovina (ABS fraccin V) con una concentracin de 1 mg/mL, enseguida se realizaron 10 diluciones con albumina y agua destilada a concentraciones diferentes. La primer dilucin fue de 1000 L de agua destilada con 0 L de solucin stock, la segunda dilucin fue de 980 L de agua destilada con 20 L de solucin stock, la tercera dilucin fue de 960 L de agua destilada con 40 L de solucin stock, la cuarta dilucin fue de 940 L de agua destilada con 60 L de solucin stock, la quinta dilucin fue de 920 L de agua destilada con 80 L de solucin stock, la sexta dilucin fue de 900 L de agua destilada con 100 L de solucin stock, la sptima dilucin fue de 850 L de agua destilada con 150 L de solucin stock, la octava dilucin fue de 800 L de agua destilada con 200 L de solucin stock, la novena dilucin fue de 750 L de agua destilada con 250 L de solucin stock y la dcima dilucin fue de 500 L de agua destilada con 500 L de solucin stock. De estas 10 disoluciones, se tomaron 200 L de cada una y se colocaron por separado en 10 tubos eppendorf, enseguida se les coloco a cada tubo 0.8 mL de reactivo de Bradford y se mezclaron con cuidadosamente, enseguida estas muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos para despus realizar la lectura de las mismas en un espectrofotmetro (Bio-Rad, SmartSpec Plus) a una longitud de onda de 595 nm en celdas de 1 mL, para obtener sus absorbancias. Cuantificacin de protena. Mediante el mtodo de Bradford Con extracto inicial de protena obtenido del tejido camaron, se tomaron 10 L y se colocaron en un tubo eppendorf, despues, se le adicionaron 990 L de agua destilada y se mezcl con cuidado. De los 1000 L de la mezcla anterior se tomaron 200 L y se colocaron en un tubo eppendorf al cual se le agreg 1 mL de reactivo de Bradford. El contenido anterior fue colocado en una celda para posteriormente ser ledo en un espectrofotmetro (Bio-Rad, SmartSpec Plus) a una longitud de onda de 595 nm y obtener su absorbancia. Lo mismo se realiz con el extracto de levadura.

Curva estndar. Mediante el mtodo de Lowry. Primero se prepar una solucin stock de albumina srica bovina (ABS fraccin V) a una concentracin de 1 mg/mL, enseguida se realizaron 10 diluciones con albumina y agua destilada a concentraciones diferentes. La primera dilucin fue de 1000 L de agua destilada con 0 L de solucin stock, la segunda dilucin fue de 980 L de agua destilada con 20 L de solucin stock, la tercera dilucin fue de 960 L de agua destilada con 40 L de solucin stock, la cuarta dilucin fue de 940 L de agua destilada con 60 L de solucin stock, la quinta dilucin fue de 920 L de agua destilada con 80 L de solucin stock, la sexta dilucin fue de 900 L de agua destilada con 100 L de solucin stock, la sptima dilucin fue de 850 L de agua destilada con 150 L de solucin stock, la octava dilucin fue de 800 L de agua destilada con 200 L de solucin stock, la novena dilucin fue de 750 L de agua destilada con 250 L de solucin stock y la dcima dilucin fue de 500 L de agua destilada con 500 L de solucin stock. De estas 10 disoluciones, se tomaron 200 L y se colocaron por separado en 10 tubos eppendorf, enseguida se les coloco a cada uno de los tubos 1 mL de solucin D (de trabajo: carbonato de sodio [Na2CO3] 3% en NaOH 0.2 N, sulfato de cobre [Cu2SO4] 2% y tartato de sodio [Na] y potasio [K] 4%), se mezclaron con cuidado. Las muestras anteriores se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, ensgida se les agreg 100 L de reactivo de Folin a cada una y se les coloco en oscuridad total durante 30 minutos. Despus, se realiz la lectura de las muestras en un espectrofotmetro (Bio-Rad, SmartSpec Plus) a una longitud de onda de 750 nm en cubetas de 1 mL, y as obtener sus absorbancias. Cuantificacin de protena. Mediante el mtodo de Lowry. Con el extracto inicial de protena obtenido del tejido camaron, se tomaron 10 L y se colocaron en un tubo eppendorf, despues, se le adicionaron 990 L de agua destilada y se mezcl con cuidado. De los 1000 L de la mezcla anterior se tomaron 200 L y se colocaron en un tubo eppendorf al cual se le agreg 1 mL de reactivo del reactivo D (carbonato de sodio [Na2CO3] 3% en NaOH 0.2 N, sulfato de cobre [Cu2SO4] 2% y tartato de sodio [Na] y potasio [K] 4%). El contenido anterior fue colocado en una celda para posteriormente ser ledo en un espectrofotmetro (Bio-Rad, SmartSpec Plus) a una longitud de onda de 750 nm y obtener su absorbancia. Lo mismo se realiz con el extracto de levadura.

Electroforesis en geles de poliacrilamida. Protocolo para PAGE-SDS, con geles discontinuos. Pre-Desnaturalizacin de la muestra proteica a analizar Del extracto inicial de protena obtenido del tejido de camarn, se tomaron 37.5 L y 12.5 L de buffer de disociacin y se colocaron en un tubo eppendorf. Esta muestra fue calentada en bao de agua en ebullicin durante 10 minutos). Lo mismo se realiz con extracto de levadura.Preparacin del gel para la fase de corrida, al 12% El gel se prepar realizando una mezcla de diferentes soluciones. La soluciones que se necesitaron para la preparacin de este gel fueron las siguientes en el ordenen indicado fueron las siguientes: 3.5 mL de agua destilada, 2.5 mL de buffer de separacin (1.5 M Tris pH 8.8), 4 mL de acrilamida (CH2CHCONH2), 100 L de solucin SDS al 100%, 50 L de solucin PSA 10% y 5 L de solucin TEMED. Las ltimas dos soluciones se agregaron con mucho cuidado y solo, hasta que el sistema de electroforesis fue montado correctamente.

Preparacin del gel para la fase de empaquetamiento, al 4% El gel se prepar realizando una mezcla de diferentes soluciones. La soluciones que se necesitaron para la preparacin de este gel fueron las siguientes en el ordenen indicado fueron las siguientes: 3.05 mL de agua destilada, 1.25 mL de buffer de empaquetamiento (0.5 M Tris pH 6.8), 0.65 mL de acrilamida (CH2CHCONH2), 50 L de solucin SDS al 100%, 25 L de solucin PSA 10% y 3 L de solucin TEMED. Las ltimas dos soluciones se agregaron con mucho cuidado y solo, hasta que el sistema de electroforesis fue montado correctamente.

Montaje del sistema de electroforesis.

Para armar el sistema de electroforesis este consisti en montar dos placas de vidrio en un soporte que los sujetaba hermticamente con una separacin de 1 mm entre las cara de los vidrios y formaba una cmara pequea entre los vidrios donde posteriormente se colocaran los geles. Una vez listo el sistema, se comprob que este no tuviera fugas agregando agua destilada en esta separacin, despus de comprobar que no hubiese fugas se prosigui a colocar el gel de fase de corrida; con mucho cuidado para evitar la formacin de burbujas de oxgeno, hasta llegar a un lmite indicado. Enseguida se agreg a la cmara una pequea capa de butanol para identificar la polimerizacin del gel de corrida mediante la observacin de una interface con el mismo. Una vez que la interface se form y el gel polimerizo de forma satisfactoria, se retir el butanol con mucho cuidado y se sec con ayuda de un pequeo pedazo de papel filtro. Enseguida y rpidamente se coloc el gel de empaquetamiento previamente preparado hasta que este desbordara superficialmente los cristales del sistema; se limpi con papel filtro el excedente, y se coloc en el borde del sistema un peine que sell al sistema y form espacios vacos o pocillos entre sus dientes donde colocamos nuestra muestra proteica posteriormente. Se esper una hora a que el gel polimerizara, y se retir el peine enseguida los cristales con el gel polimerizado fueron retirados de su soporte inicial y se colocaron con cuidado en el aparato de electroforesis donde las cmaras de electroforesis fueron llenadas hasta la lnea indicada, con un buffer de reservorios diluidos (1X). Enseguida; dentro de los pocillos formados en los geles, se colocaron las muestras (extracto de camarn y levadura) en el primer pocillo se coloc la muestra indicadora. Finalizado este proceso se coloc rpidamente la tapa en la cmara de electroforesis y se conect a una fuente de poder con un voltaje de 100. Terminado el proceso anterior, se retiraron de la cmara de electroforesis los geles, con mucho cuidado se colocaron los geles en un recipiente plstico con solucin de teido durante varias horas a temperatura ambiente. Para finalizar los geles fueron desteidos, sumergindolos en solucin de desteido (contiene cido actico, metanol y agua destilada) hasta lograr visualizar bandas de las protenas.Resultados.1.-Las curvas estndar de Bradford, Lowry y biuret y la electroforesis por geles de poliacrilamida PAGE-SDS se realizaron siguiendo el protocolo que propone el manual de prcticas de laboratorio de bioqumica del Instituto Tecnolgico de la paz; obteniendo los siguientes resultados, en la tabla 1 se muestran los datos de la curva estndar de Bradford y en la figura 1 se reporta la grfica con los datos de la tabla 1. De la misma forma en la tabla 2 se muestran los datos de la curva estndar de lowry y en la figura 2 se reporta la grfica con los datos de la tabla 2.En la imagen 1 se muestran los resultados obtenidos de la electroforesis PAGE-SDS.Tabla 1. Se muestra los datos obtenidos (concentracin y absorbancia) de la curva estndar que se realiz de Bradford a diferentes concentraciones con una longitud de onda de 595nm, con mtodos espectrofotomtricos (espectrofotmetro, SmartSpec, Biorad).

Longitud de ondaAbsorbanciaconcentracin

5950.30920

5950.58540

5950.97660

5950.79180

5951.082100

5951.371150

5951.614200

5951.728250

5952.164500

Figura 1. Se muestra los valores graficados de la tabla 1, absorbancia vs la concentracin, los puntos azules representa los valores dados por el espectrofotmetro, la lnea delgada muestra los datos ajustado por el mtodo estadstico de los mnimos cuadrados.

Tabla 2. Se muestra los datos obtenidos (concentracin y absorbancia) de la curva estndar que se realiz de Lowry a diferentes concentraciones con una longitud de onda de 750nm, con mtodos espectrofotomtricos (espectrofotmetro, SmartSpec, Biorad).Longitud de onda Concentracin microg/mLAbsorbancia

750200.057

750400.104

750600.207

750800.219

7501000.283

7501500.42

7502000.472

7502500.562

7505000.947

Figura 2. Se muestra los valores graficados de la tabla 2, absorbancia vs la concentracin, los puntos azules representa los valores dados por el espectrofotmetro, la lnea delgada muestra los datos ajustado por el mtodo estadstico de los mnimos cuadrados.

Clculos de la concentracin:Para estos clculos se recurri a la ecuacin de la recta obtenida de la curva estndar de lowry mediante la siguiente forma:Y= 0.0018X + 0.0804.Donde X es la concentracin que se busca y Y es la longitud de onda obtenida del espectrofotmetro, (en camarn 0.367 y en levadura 0.102) teniendo esto despejamos y obtenemos: X= (Y-0.0804)/0.0018.Para camarn tenemos: x = (0.376-0.804)/0.0018 = 164.22 este valor se multiplica por 100 debido a la concentracin 1:100 y despus se divide entre 1000 ya que el valor se representara en mg/ml dndonos una concentracin de 16.422.Para levadura se realiza la misma forma dando un resultado de 1.2 mg/ml

Imagen 1. Se muestran los resultados obtenidos en la ELECTROFORESIS SDS-PAGES. Donde a la izquierda podemos observar las bandas obtenidas con los extractos y a la derecha se muestra los datos del marcador utilizado (6).

Discusin.En la primera parte de la prctica no hubo mayor problema debido a que solo se hiso disrupcin mecnica y centrifugacin de nuestras muestras de protenas. Para la siguiente parte en las pruebas de Bradford,biuret y lowry los resultados obtenidos quedaron dentro del rango aceptable de las curvas realizadas. Cabe destacar que nicamente se utilizaron las curvas estndar de Bradford y lowry debido a que en la curva de biuret no se obtuvieron los resultados esperados debido a problemas con las disoluciones por lo cual de esta cuerva no se reportan resultados. Para los clculos de la concentracin estos se realizaron con los datos de la curva estndar de lowry utilizando la ecuacin de la recta proporcionada por esta curva. En la tabla 1 se muestran los resultados de la curva de Bradford pudindose observar que solo se tiene un valor raro y es cuando la absorbancia pasa de 0.976 a 0.791 debido a que entre mayor sea la concentracin se debera obtenerse una longitud de onda mayor ya que las molculas interrumpiran el paso de la luz dando una longitud de onda ms alta, esto pudo deberse a una mala disolucin en las muestras. En la tabla 2 se pueden observar los valores de la curva estndar de lowry aqu los valores parecen ser acorde en relacin a concentracin-longitud de onda por lo cual aqu no queda mucho que discutir.Con respecto a los resultados obtenidos en la electroforesis PAGE-SDS estos se muestran en la imagen 1, se puede observar que las bandas obtenidas no se encuentran muy definidas. Estos resultados pudieran deberse errores experimentales tales como la velocidad de la polimerizacin; que si es muy rpida puede deformar las bandas de los geles, pureza de los reactivos, preparacin de las muestras, las concentraciones de las muestras ya que esta es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por todos estos factores.Tambin podemos destacar que en extracto de tejido de camarn las bandas grandes que se alcanzan a apreciar nos pueden indicar una alta concentracin de protenas o protena. En el caso del extracto de levadura se observa bandas ms delgadas lo que nos puede indicar una poca concentracin de protenas..

Conclusin.En esta prctica se pudo comprobar que para la extraccin, determinacin y cuantificacin de protenas hay diversa tcnicas las cuales nos ayudan a cumplir con estos objetivos. Varios de estos mtodos ya se conocan como lo son la disrupcin mecnica por medio de perlas y un pistilo en la etapa de extraccin o los mtodos de determinacin de la concentracin de protenas como lo son: Bradford, Lowry y Biuret (mtodos usados en esta prctica), pero haba otros que no se conoca o no se avan realizado como lo es la electroforesis PAGE-SDS mtodo por el cual se separaron nuestras protenas. En general en todos los procesos que se realizaron en esta prctica desde la extraccin hasta la elaboracin de la electroforesis GE-SDS, es de vital importante tener mucho cuidado en todo el procedimiento y en cada detalle pues son prcticas en las que cualquier error o descuido puede arruinar toda la prctica.

Bibliografa:1.-Thomas M. Devlin.2008/Bioqumica Libro de texto con aplicaciones clnicas/ Editorial reverte/cuarta edicin/ paginas 94,95.2.- Vicente pallas, carolina escobar.2007/Herramientas biotecnolgicas en fitopatologa/ Editorial Aedos, s.a/ primera edicin/ pgina 80.3.- http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/10626/Capitulo5.pdf/ consultada el da 13 de octubre del 2013.4.- http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf/ Introduccin a la Biologa Celular y Molecular/ consultada el da 13 de octubre del 2013.5.- Enrique Battaner Arias.2000/Biomoleculas/Ediciones universal salamanca/primera edicion/Paginas 262,264,2656.- http://www.bio-rad.com/ consultada el da 13 de octubre del 2013.