practicas microbiologia.2013ok-casa.doc

8/22/2019 practicas microbiologia.2013ok-casa.doc

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SANAGUSTN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOSESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA

QUMICA

GUA DE PRCTICAMICROBIOLOGA INDUSTRIAL

AUTORES:Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara

Ing. Marcia Juana Quequezana BedregalIng. Karina Moran MedinaMg. Jacqueline Zanabria Glvez

AREQUIPA PER

2013


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PROLOGOPROLOGO

El Campo de la Microbiologa en toda su magnitud esindispensable para el desarrollo de las ciencias de la saludhumana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el

ilimitado campo de los bioprocesos.

Los microorganismos han demostrado ser un enormepotencial para la elaboracin de infinidad de productos tiles alhombre, en la generacin de procesos productivos con menorcontaminacin del medio ambiente y con consumos de energamuchos menores.

Los microorganismos son objetos de manipulacionesgenticas para que puedan producir sustancias diversas de grannecesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que a

su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevosbioprocesos.

El conocimiento de la microbiologa se hace imperiosa parasu aplicacin a diversas disciplinas del saber humano. La presenteGua de Prctica se ha desarrollado con el objeto de poner alinteresado en el conocimiento sistematizado sobre las tcnicasbsicas del manejo de Microorganismos en laboratorio paraestudiantes de Ingeniera Qumica.

Los Autores


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NDICENDICE

PROLOGO

NDICEPgs.

RECOMENDACIONESGENERALES........................................................4

PRCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA...........................................5

PRCTICA 2 : MICROSCOPIA; OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS IN

VIVO, COLORACION VITAL.................................................10

PRCTICA 3 : PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL...........................10

PRCTICA 4 : COLORACIONES ESPECIALES: TINCION Y MORFOLOGIA DE

HONGOS............................................................................20

PRCTICA 5 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO,

ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN .......................30

PRCTICA 6 : PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ............................35PRCTICA 7 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS......................................47

PRCTICA 8 : CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE

COLONIAS....................................................................58

PRCTICA 9 : CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO..............................63

PRCTICA 10 : CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS................67

PRCTICA 11 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DEDILUCIN EN PLACA...........................................................49

PRCTICA 12 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM.......................74

PRCTICA 13 : ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS

CONTAMINADAS.................................................77

FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

DIFERENTES PRCTICAS .......................................................................80

BIBLIOGRAFA..........................................................................................83

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Recomendaciones Generales

1. La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia,despus de este tiempo, no se permitir al acceso allaboratorio

2. Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata yabotonarla completamente, slo podr quitrsela al salir deste.

3. Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas,las mochilas debern ser colocadas en los cajones de lasmesas de trabajo.

4. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningnobjeto a la boca.

5. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.6. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de

usarla.7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber

efectuarse sentado y en su equipo de trabajo.8. Hablar slo lo necesario con los compaeros.9. Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es

lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor.10. Si hay necesidad de llevar material biolgico para larealizacin de la prctica, es necesario conseguirlo de locontrario la prctica se suspender para todo el equipo.

11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberesterilizarse en la flama del mechero, antes y despus desu uso.

12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.13. En caso de derramar material que contenga

microorganismos, cbralo con fenol o benzal y deje actuardiez minutos y de aviso al profesor.

14. Todo el material que se va a incubar o desechar, debecolocarse en el sitio indicado por el profesor.

15. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientesdatos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e inicialesdel nombre del alumno.

16. Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin delmaterial para eliminar microorganismos que pudieranhacernos dao a nuestra salud.

17. Lvese las manos con agua y jabn antes de salir dellaboratorio.

18. Es obligacin de cada equipo entregar todo el materiallimpio.

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PRCTICARCTICABIOSEGURIDAD;BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIAMICROSCOPIA

I. OBJETIVOS Aprender las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio. Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio Identificar cada una de las partes del microscopio ptico, conocer su

funcin y el cuidado de cada uno de ellas. Dominar el mecanismo de iluminacin, la observacin de una muestra

con todos los objetivos.

II. MARCO TEORICO2.1 BIOSEGURIDADLa bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido comn quetienen la finalidad de proteger la salud, la integridad fsica, la seguridad de laspersonas en un ambiente determinado, frente a diferentes riesgos biolgicosfsicos, psicolgicos y mecnicos.

2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDADUniversalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamenteen todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o noprevisto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estasprecauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se est dentrodel laboratorioPrecauciones estndar: comprende las medidas a tomar para evitar lacontaminacin de una persona, evitando la exposicin directa a sangre y otrosfluidos orgnicos potencialmente contaminantes, por ejemplo mediante el usode barreras, es decir mediante la utilizacin de materiales adecuados que seinterpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras por ejemploguantes no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, perodisminuyen las consecuencias de dicho accidente

2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR- Barreras de proteccin- Lavado de manos

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- Desinfeccin y esterilizacin.- Manejo de objetos punzo cortantes.- Manejo y eliminacin de desechos- Ventilacin e iluminacin adecuadas- Limpieza y desinfeccin de ambientes

2.1.3 VAS DE CONTAMINACIN1. La boca Comer, beber y fumar en el laboratorio. Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de

proteccin.

2. La piel Cortaduras o rasguos.Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o

utensilios contaminados (lpices, bolgrafos, etc.).

3. Los ojos Salpicaduras de materiales infecciosos.Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos

contaminados.

4. Los pulmones Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION- Lavado de manos (antes y despus)- Guantes- Mascarilla o barbijo- Mandil- Gorro

2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros

objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin. Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe

permanecer completamente cerrado. Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y

al finalizar la sesin prctica. Lavar las manos con agua y jabn: antes de realizar las actividades programadas antes de salir del laboratorio despus de usar materiales contaminantes.

Recoger el cabello largo. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar slo

lo indispensable. No comer, beber, fumar. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de

iniciar las actividades indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna

duda, dirjase al profesor. Usar mascarillas para casos indicados

2.2 MICROSCOPIA

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El microscopio permite la observacin de estructuras muy pequeas que nopueden ser vistas a simple vista. El poder de resolucin de un microscopioest en relacin inversa a la longitud de onda de la luz usada.

2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Parte mecnica:- Pie- Columna (pilar, charnela y brazo)- Tubo: Revlver- Tornillo macromtrico o sistema de movimiento rpido- Tornillo micromtrico o sistema de movimiento lento- Platina: Pinzas sujetadoras de lminas y mandos coaxiales- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo

porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo

2. Parte ptica del Microscopio:

- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra

Los objetivos traen impresas las siguientes caractersticas:o Magnificacin: Ej. x 25o Apertura numrica (A.N.): Ej. 0,45o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo

Planacromticoo Longitud del tubo: Ej. 160 mmo Correccin de espesor de laminilla Ej. 0,17 mmo Aparato de iluminacin. comprende: Espejo, Condensador,

Diafragma2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platinaporque deteriora el tornillo micromtrico.

2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura convenientepara observar sin fatiga Verificar que los oculares estn limpios y enposicin correcta.

3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo delM.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que noposean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas

oin vivo debe mantenerse la platina horizontal.4. Verificar que los objetivos en el revlver estn en orden progresivo

de aumento.5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje ptico girando el

revlver hasta que haga clik.6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la

platina y abra el diafragma totalmente.7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si

tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o alfluorescente ms cercano.

8. Observe por el ocular la iluminacin del campo y trate de lograr lamxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario bajeligeramente el condensador.

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9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que lalaminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia laderecha del observador y que el preparado se encuentre entre elcondensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz.Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales.

10. Para iniciar la observacin, emplee siempre el objetivo de menor

aumento (panormico 10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mnima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con eltomillo macromtrico y observando por un lado del Microscopio eldescenso del mismo. Luego, observe por el ocular ysimultneamente suba al tubo con el tomillo macromtrico hastaenfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillomicromtrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra lalmina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observacinintegral, siempre utilizando el tomillo micromtrico para no perder lanitidez.Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende alutilizar el tomillo macromtrico, la distancia objeto-objetivo debe serde 1 a 1,5 cm.

11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones decontraste.

12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en elcentro del campo y cambie de objetivo girando el sistema derevlver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento(45X) y NO el de inmersin. Ponga ntida la imagen nicamente conel tomillo micromtrico.Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a

otro no debe manipularse con el tomillo macromtrico porque correel riesgo de romper la lmina o la lente frontal del objetivo.13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersin, coloque el

elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco elobjetivo, de manera tal, que quede libre ste sector de lmina paraque pueda colocarse una gota de aceite de inmersin. Luego,contine girando el revlver hasta que el objetivo de inmersin(100X) contacte con la gota y encaje en el eje ptico; finalmente,observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillomicromtrico.Una vez terminada la observacin limpie el objetivo de inmersin y la

lmina con el campo ligeramente humedecido con alcoholisoproplico o metanol.

2.2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CLCULOAPROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del

objetivo por el del ocular.Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X

40 x 10 = 400 aumentos2. Para el clculo aproximado de dimensiones celulares, se debe

conocer el dimetro del campo microscpico que vara de acuerdo alobjetivo que se usa.

Dimetro del campo microscpico

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Ocular ObjetivoDimetro del

campo en micras10X 10X 150010X 45X 40010X 100X 150

Ejemplo: Si observamos una clula epitelial al Microscopio conobjetivo 10X y ocular 10X, y si sta ocupa la terceraparte del campo microscpico, concluiremos que laclula mide aproximadamente 500 micras; es decir, latercera parte de 1500.

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo la

platina, porque a la larga deteriora el tomillo micromtrico.2. Los objetivos y oculares constituyen la parte ms delicada del

Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. As, elenfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal delobjetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razn debe desmontarselos objetivos.El objetivo de inmersin no debe usarse en seco y debe quedarescrupulosamente limpio despus de su uso, para lo cual use elcampo ligeramente humedecido con alcohol isoproplico o metanol.

3. Al finalizar la observacin microscpica, coloque el objetivo de menoraumento en el eje ptico dejando un espacio de 2 cm. entre ste y lalentilla del condensador, luego apague la luz.

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III.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.

Observe las diferencias en el campo ptico y el acercamiento.

IV. CUESTIONARIO

1. Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?2. A qu se denomina campo ptico?3. Por qu decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal.4. Qu es el poder de resolucin5. qu entiende por bioseguridad6. Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.

7. qu barreras de proteccin debe tener en cuenta antes de empezar atrabajar.

8. Cmo promovera la cultura de bioseguridad.

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PRCTICARCTICAMICROSCOPIA: OBSERVACIN DE MICROORGANISMOSMICROSCOPIA: OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS

IN VIVO, COLORACION VITALIN VIVO, COLORACION VITAL

I. OBJETIVOS

1) Conocer la morfologa de organismos unicelulares.2) Conocer los distintos mtodos de observacin de microorganismos in vivo.

II. OBSERVACIN IN VIVO DE ORGANISMOS

UNICELULARES

Indicaciones:1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina est en

posicin horizontal.2. Coloque la lmina porta objetos en su Microscopio.3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lmina de manera

que la luz del Microscopio la atraviese.4. Proceda a enfocar con menor aumento y observar que tiene exceso de

iluminacin y poca visin de la muestra corrija ste defecto bajando el

condensador y cerrando un poco el diafragma iris.5. Observar elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienencaractersticas especiales y un fondo de partculas de tierra y cristales grisesy oscuros. Pueden distinguirse:- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de

pequeas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.- Diatomeas, de diferentes formas y tamaos, se las distingue porque son

brillantes, amarillentas, poco mviles; van desde la forma de un barrilpequeo hasta cigarros o prismas.

- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo deobservacin. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se

caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interiorobservar el ncleo y vacuolas.- Tambin puede observarse a la stilonichia, ms pequea que el

Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo.

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- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada porpresentar un flagelo largo (Protozoario flagelado).

- La ameba, difcil de visualizar por su transparencia, presenta pocosmovimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudpodos en lasuperficie de su cuerpo.

- Tambin puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cliz, con un

pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficiedel cliz est rodeada de cilios.6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno)

en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares.7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.

Grafique la Observacin y Resultados

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III.EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

1. Examen en FrescoEs la forma ms simple de realizar la preparacin de un espcimen para suexamen microscpico.Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismosvivos.

Hay 2 tipos de tcnicas:a. Preparacin en fresco simple entre porta y cubre.

Consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre unporta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.

b. Gota pendienteConsiste en colocar una gota de lquido con microorganismos en uncubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con unaexcavacin central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparacincon vaselina alrededor de la excavacin.La ventaja de esta preparacin es que no se seca y puede ser observadadurante un tiempo ms largo.

2. Coloraciones VitalesSon los montajes de materia viva teidos. Suelen utilizarse para ello,determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy bajaconcentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observacin,

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mediante el colorante de la morfologa y la estructura bacteriana, pero sinprovocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

IV.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOSEste examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con lafinalidad de observar caracteres de movilidad, morfologa, agrupacin,observacin de huevos y quistes de parsitos.

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EXAMEN EN FRESCO

Material- Microscopio- Lminas cubreobjetos- Lminas portaobjetos

- Agua destilada- Asas de Kolle- Grmenes varios- Muestras fermentadas- Cultivo de microorganismos

Metodologa- Si la muestra proviene de un lquido, con un asa de kolle se coloca

una gota de lquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca uncubreobjeto.

- Si la muestra proviene de un cultivo slido, se deposita primero una

gota de suero fisiolgico sobre el portaobjetos, para luego con laayuda del asa de kolle realizar una suspensin y colocar uncubreobjetos.

- Observar al microscopio con objetivo 40X.


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COLORACIONES VITALES

Estos tipos de exmenes pueden considerarse como preparaciones enfresco o como tcnicas intermedias entre stas y las preparacionesfijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teidas.

Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, a examinar,Cubreobjetos, Solucin de azul de metileno (1/1000), Asas de platino,Grmenes diferentes

Procedimiento- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno

(l/l000).

- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asade kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o slida).

- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.

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V. CUESTIONARIO

- Qu ventajas y desventajas ofrece una preparacin en fresco?- Qu ventaja presenta una preparacin gota pendiente?- Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?

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PRCTICARCTICAPREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:

COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIALCOLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL

I. OBJETIVOS.Observar clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes

procedimientos de coloracin.

II. MARCO TEORICO

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su

protoplasto posee un ndice de refraccin cercano al agua, se requieregeneralmente tinciones biolgicas para visualizarlos adecuadamente odemostrar el detalle de sus estructuras internas.Los colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo bencnico, ydifieren uno de otro en cuanto al nmero y disposicin de estos anillos y ala sustitucin de los tomos de hidrgeno por otras molculas. Algunos delos grupos cromforos ms comunes hallados en los colorantes son: C=C,C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.La intensidad de coloracin de colorante es proporcional al nmero deradicales cromforos del compuesto.

2.1.-COLORACIONES DIFERENCIALES

PARED CELULAREl espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m deespesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Lasparedes de las clulas jvenes son ms delgadas que las clulas decultivo antiguo.

GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas estconstituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudounidas por puentes peptdicos.Sin embargo estas clulas contienen tambin una gran cantidad decidos teicocos, polmeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato

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y aminocidos como D-alanina o azcares como la glucosa estnunidos a los grupos glicerol y ribitol.

GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas,dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME),con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene el antgeno

o somtico conocido como lipopolisacrido LPS, una capa densaintermedia, y la membrana plasmtica interna. Un espesor de 0.0075m.

2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADASEste tipo de preparaciones son las ms frecuentes, tanto las obtenidasdirectamente a partir de muestras clnicas como las obtenidas a partirde desarrollo de cultivos.

Los pasos a seguir para la realizacin de una preparacin fijada ycoloreada son:

a. Confeccin del Frotis. Puede prepararse a partir de productoslquidos o slidos.Producto lquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre unportaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar yse extiende con ayuda del asa de platino.Cultivo en medio slido. puede prepararse una suspensin delmaterial en una gota de solucin salina colocada previamente en elportaobjetos, extendindola con ayuda del asa de platino.

b. Secado. Se dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

c. Fijacin. La fijacin tiene como objeto la inmovilizacin de lasestructuras del material a estudiar en un estado lo ms prximoposible al estado vivo. Consiste en una muerte rpida de losmicroorganismos, debida a la coagulacin de las albminasprotoplsmicas. Existe un gran nmero de fijadores, tanto en formasimple (etanol, cido pcrico). Las formas ms habituales de fijacinson: por el calor y alcohol en fro.

d. Coloracin. Es el proceso de coloracin de los microorganismos.

e. Lavado. Eliminacin del exceso de colorante.

f. Secado. Se secar la preparacin al aire.

CLASIFICACIN DE LAS COLORACIONESLa clasificacin de los colorantes es algo confusa, pero est basada en loscromforos presentes.

a. Segn su estructura qumica. Pueden clasificarse como cido o

Bsico, trmino que no ndica sus reacciones de pH en solucin, sino, siuna parte de la molcula es aninica o catinica.

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Los colorantes bsicos, tien estructuras de naturalezacida, como la cromatina nuclear de las clulas. Ej: Cristal violeta,Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.

Los colorantes cidos, reaccionan con sustancias bsicas,tales como estructuras citoplsmaticas, y como colorante decontraste. Ej: cido pcrico.

Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorantecido con uno bsico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.

Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en aguay solubles en alcohol. Ej: Sudn III.

CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permitenconocer la morfologa y tipo de agrupacin bacteriana. ejplo. Tincinazul de metileno, Tincin fucsina.

b. Tinciones Diferenciales. Utilizan ms de un colorante y sirven paraponer de manifiesto las caractersticas de afinidad de losmicroorganismos por ciertos colorantes como; Tincin Gram, Tincincido-alcohol resistente.

c. Tinciones Estructurales. Utilizan ms de un colorante y sirven paraponer de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tincin de flagelos,

Tincin de esporas, Tincin de cpsulas, Tincin de corpsculosmetacromticos

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Preparacin del Frotis

- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo.Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porcin azul de laflama. Ponga el asa tan cerca de la posicin vertical como seaposible. Djela enfriar (cuente hasta 20).

- Tome una porcin de la muestra que se va examinar, colocando el

asa en posicin plana en la superficie del lquido.- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplnese ligeramente en elcentro de ste (el portaobjeto deber estar numerado).

- Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjeto muvalatrazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar ciertoespacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos.

- Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruircualesquiera bacterias que se encuentren en ella.

Fijacin- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.

- Pase el portaobjeto tres veces a travs de la llama del mechero deBunsen, con la muestra hacia arriba.

- Djelo enfriar antes de aplicar la tincin.

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3.2. TINCIONES SIMPLES

Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Azul de metileno(solucin acuosa al 1%), Safranina (solucin acuosa 1%), Asas deplatino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin, Xilol

TINCIN DE AZUL DE METILENOLas bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin delcolorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunasestructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad sonas fcilmente diferenciables.

Procedimiento- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua

destilada para hacer un frotis.- Con l esa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y

disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no

necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser nimuy gruesos m muy finos.

- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llamasuavemente para obtener la fijacin del frotis.

- Cubrir la preparacin con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuarde unos 5minutos.

- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caigadirectamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.

- Secar al aire, a temperatura ambiente.- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite

de inmersin.

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TINCIN DE SAFRANINA

Las bacterias aparecen de color rojo.

Procedimiento- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua

destilada para hacer un frotis.- Con el asa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y

disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido nonecesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser nimuy gruesos ni muy finos.

- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llamasuavemente para obtener la fijacin del frotis.

- Cubrir la preparacin con el colorante de safranina (2 3 gotas) yse deja actuar de unos 5 minutos.

- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de aguacaiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso decolorante.

- Secar al aire, a temperatura ambiente.- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con

aceite de inmersin.


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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALESMaterial. Microscopio, Lminas portaobjetos, Set para la coloracin deGram, Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin, Xilol

TINCIN GRAMEl cristal violeta acta como un colorante primario, que se une a la

pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucindbil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturalezaqumica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener elcristal violeta, an luego del tratamiento con un decolorante orgnico,tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias sedenominan Grampositivas.Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipdico ensu pared celular, pierden la coloracin primaria del cristal violetacuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o decontraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas quehan perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al

microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a susparedes celulares.Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin delcolorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunasestructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad sonas fcilmente diferenciables.

Reactivos- Solucin de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95 =

20 ml, Agua destilada csp=100 ml)

- Solucin de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0g, Agua destilada= 100 ml)- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) Etanol comercial- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95= 10 ml, Agua destilada

csp=100 ml)

Procedimiento- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de

bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lminaportaobjeto limpia.

- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama

suavemente para obtener la fijacin del frotis, con la finalidad deque el material no sea arrastrado durante el proceso de tincin.- Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la

superficie con solucin de cristal violeta por 1 minuto. Lavar biencon agua de cao.

- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar conagua.

- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar lasuperficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta noarrastrar ms colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos mso menos. Tambin puede utilizar etanol comercial como decolorante, en este caso dar ms tiempo aproximadamente 1 minuto.

- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar conagua de cao.

- Secar al aire, a temperatura ambiente.23


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- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceitede inmersin.


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IV. CUESTIONARIO

1. Qu es un colorante y cules son sus propiedades?2. Por qu se le llama a un colorante cido o bsico?3. A qu se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?4. De qu manera influye el pH en la coloracin?5. Por qu es necesario utiliza mtodos de tincin para visualizar a las

bacterias?6. Escriba la estructura del azul de metileno y safranina7. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos8. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales9. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos

grampositivos y explique la funcin que cumple cada uno de ellos.10. Dibuje los componentes de la pared celular de los

microorganismos gramnegativos y explique la funcin que cumple cadauno de ellos.

11. Explique el fundamento de la coloracin de Gram yesquematice.12. A qu se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?

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13. Mencione tres razones por las que un microorganismogrampositivo se observa gramnegativo.

14. Dibuje la estructura del colorante cristal violeta15. Mencione tres microorganismos (gnero) que sean cocos

grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilosgramnegativos.

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PRCTICARCTICACOLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DECOLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE

HONGOSHONGOS

I. OBJETIVOS

- Distinguir las caractersticas macroscpicas y las estructurasmicroscpicas de losAspergillus, Penicilium y Rhizopus

- Conocer mediante las caractersticas macroscpicas y microscpicas lasespecies deAspergillus, Penicilium y Rhizopus

- Conocer la aplicacin de los gneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopusen la industria.

II. MARCO TERICO

1. ASPERGILLUS

A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS

Caractersticas morfolgicas del hongo: tamao y forma de las cabezasconidiales, Morfologa de los conidiforos, filides y metulas, y en lapresencia de clulas de Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura semuestra las principales estructuras morfolgicas del gnero Aspergillus:

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B. ETIOPATOGENIA

Se origina por hongos omnipresentes y oportunista que vive comosaprofitos en el suelo, vegetales en descomposicin, cualquier tipo demateria orgnica como pintura fresca, alimentos enlatados abiertos, ropavieja, recipientes con agua sin usar, reactivos qumicos, paredes de

refrigeradores, sistemas de ventilacin, cuartos de hospital, lentes decontacto blancos, en las capas altas de la atmosfera.Las especies que actan como patgenos son termotolerantes. Tras laexposicin a grandes cantidades de conidios, penetran por inhalacin o seinstalan de manera saprofitica en una cavidad pulmonar de cualquierorigen, como cavernas por TBC.

C. APLICACIONES INDUSTRIALES

En la produccin de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera:ALFA y BETA-AMILASA.El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunquese usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae decereales.Origen de alfa-amilasa'. Fngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del pncreas.

En la produccin de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados.INVERTASA O SACARASA.Origen y accin'. La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar invertido) puede serrealizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que acta sobre el extremo fructosa de la molcula de

sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmentepor "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras

que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de hongos (ASPERGILLUSORYZAE).RANGODEPH: 4-6.

La aplicacin de enzimas en los detergentesLas enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez quepermiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y perodos ms cortosde lavado.Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actan sobre losmateriales que constituyen las manchas, facilitando la remocin de estosmateriales y de forma ms efectiva que los detergentes convencionales.

Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lpidos para romperlos por hidrlisis, pero las lipasas sonsolubles en agua y los lpidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrlisis slo ocurre en la interfase entrela gota lipdica y la fase acuosa, lo que causa que la reaccin sea relativamente lenta e inefectiva. Se buscadesarrollar lipasas que permitan la remocin de manchas de grasas a bajas temperaturas de lavado. Unacombinacin de bsqueda y manipulacin gentica ha conducido a la introduccin reciente de lipasas en los

jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa Hamicola , QUESELOGRPRODUCIRENAspergillus otyzae y que seconoce como "Lipolasa".

Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivosExtraccin de aceite. El uso de algunos preparados celulolticos en el proceso de extraccin ha tenido un efecto

positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado enzimtico producido porAspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extraccin del aceite de soya. En condiciones ptimas, el contenido de

aceite de soya extrable (24.9 % enbase seca) y el porcentaje de recuperacin del aceite de soya (99 %).

El efecto de una enzima cruda obtenida deAspergillus fumigatus, con actividad mixtaprincipalmente celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en laextraccin de aceite a partir de las semillas de ajonjol, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de

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aceite extrado fueron de 51.4 a 56.7 % PARAELACEITEDEAJONJOL, DE 51.0 a 53.2 % ENELCASODELACEITEDECACAHUATEYDE 55.3 a 57.1 %

Extraccin de colorantes. La extraccin de colorantes es otra aplicacin atribuida a algunospreparados enzimticos.Extraccin de antioxidantes con preparados enzimticos con actividades mixtasmixtasEl preparado enzimtico comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente pectinasa, peroAMBINCELULASAYHEMICELULASA, PRODUCIDOPORAspergillus niger,NOSLOFUEEFECTIVOALAUMENTARLAEXTRACCINDELOSFENOLESDEBIDOALADEGRADACINDELOSPOLISACRIDOS (CELULOSA,.HEMICELULOSAYPECTINA) QUE CONSTITUYEN LA pared celular de la cascara de uva, sino que mejor tambin la actividadantioxidante de los extractos fenlicos

2. PENICILLIUMLas especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como lasestructuras del espora-cojinete.Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos defales en forma de botella.

Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades delos fialides, con la espora ms joven en la base de la cadena, y son casisiempre verdes.La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie delpenicillium. Algunos son no ramificado y llevan simplemente un racimo.defialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cadacojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de unasegunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides.Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llamanmonoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.Colonias de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con unacorona radial ancha y blanca, a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37 C)(Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la colonia.Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin abundante. Oloraromtico, especiado o afrutado (a manzanao a pina).

ECOLOGIAEl Penicillium es gnero grande y difcil encontrado casi por todas partes, ygeneralmente el gnero ms abundante de hongos en suelos. La ocurrenciacomn de la especie del Penicillium en alimento es un problema particular.Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no

comestible o an peligroso. Es una buena prctica desechar los alimentos quedemuestran el desarrollo de cualquier moho.Se le encuentra en el polvo domstico, en los edificios hmedos y mohososdonde deteriora diferentes materiales de construccin, entre los que resaltan elpapel de decoracin (crece bien en la cola empleada para su adhesin a lasparedes). No muestra una notable variacin estacional. Las mximasconcentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera(mayores en las reas urbanas que en las rurales).

APLICACIONES DEL PENICILLLIUMPor otra parte unas ciertas especies DE PENICILLIUMSONBENEFICIOSASALOSSERESHUMANOS. LOSQUESOSTALESCOMO ROQUEFORT, BRIE, CAMEMBERT, STILTON, ETC. SEMADURANCONLAESPECIEDE PENICILLIUMYSONABSOLUTAMENTESEGUROSDECOMER.La CEPA DEPenicillium notatum aisladapor A. Fleming PRODUCA 2 MG DE PENICILINA POR CADA LITRO DECULTIVO, POSTERIORMENTE SE ENCONTR QUE OTROSPenicillium eran mejores productoRES DE PENICILINA Y SE

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ELIGI APenicillium chrysogenum como cepa sper productora de este antibitico. Finalmente, la seleccin desucesivos MUTANTES SPER PRODUCTORES Y LA MEJORA EN LAS TCNICAS DE FERMENTACIN REALIZADAS POR LAINDUSTRIABIOTECNOLGICAHANHECHOQUEACTUALMENTESEOBTENGAN 20 G/L DEPENICILINA SELEEMPLEAENLAPRODUCCINDEALGUNOSALCALOIDESCOMOLAROQUEFORTINA C,meleagrina y chrisogina.

Incluye las siguientes especies: PENICILLIUMBILAIAE

> PenicilliumCAMEMBERTI, QUEESUSADOPARAPRODUCIRLOSQUESOSCAMEMBERTYBRIE.> PenicilliumCANDIDA, DEM.> PenicilliumGLAUCUM, QUEESUSADOPARAPRODUCIRQUESOGORGONZOLA.> Penicillium MARNEFFEI, QUE DESARROLLA UNA MICOSIS SISTMICA EMERGENTE QUE AFECTA A

ROEDORESYHUMANOS, ESPECIALMENTEAPERSONASINMUNODEPRIMIDAS, CONOCIDACOMOPENICILIOISIS> PenicilliumNOTATUM, QUEESUSADOPARAPRODUCIRLAPENICILINA.> PenicilliumPURPUROGENUM> Penicillium ROQUEFORTI, QUE ES USADO para producir los quesos ROQUEFORT, DANISH BLUE Y

RECIENTEMENTETAMBINGORGONZOLA

III. PROCEDIMENTOA.MATERIAL

Asa de kolle KOH al O% Mechero Azul de lactofenol Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos

Microscopio

B. MATERIAL BIOLOGICO

Cultivo de ASPERGILLUSFLAVUS Cultivo de ASPERGILLUSNIGER

Cultivo de ASPERGILLUSFUMIGATUS Cultivo de Penicillium

C. REACTIVOS

C.l. Hidrxido de potasio al 10%KOH 10 GAgua destilada 100 ML

C.2. Azul de lactofenol.Fenol 20 Gcido lctico 20 GGlicerol 40 mlAGUADESTILADA 20 ML

Disolver los componentes antes mencionados y despus se agrega elCOLORANTE.SEPUEDEEMPLEARCUALQUIERADELOSSIGUIENTES:AZULDEALGODN 0.05GAZULDEMETILENO 0.05 GAzul deCOTTONDE PERRIER 0.05 G

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1. EXAMEN DIRECTO CON KOH 10%

Se realiza a partir del esputo, membranas expectoradas o fragmentos de tejidoque se obtienen por broncospia.Se encuentran filamentos hialinos, largos, sinuosos y ramificados de 3 a 4 dedimetro. En los aspergilomas puede observarse masas de filamentos con sus

cabezas aspergilares. Se puede trabajar a partir del cultivo, con la finalidad deobservar sus estructuras que permitan identificar el gnero. Colocar una gota de KOH al 10% en un portaobjeto y mezclar con una

pequea cantidad del material a examinar (micelio areo proveniente delcultivo).

Colocar un cubre objeto (18 x 18 mm) sobre la gota. El hidrxido de potasio acta disolviendo la queratina e intensificando el

contraste de las estructuras fngicas con otros materiales presentes en estepreparado microscpico.

Examinar microscpicamente en busca de hifas u otras estructurasnicticas.

2. CULTIVOSSe realiza en los medios habituales sin cicloheximida, Agar Sabauraud. Lascolonias crecen con rapidez, son de color blanco y por la produccin de esporasse tornan de diferentes colores. La superficie es aterciopelada o pulvurulenta.Estos hongos se diferencian por el aspecto y pigmentacin de la colonia.

2.1. AGAR SABOURAUD

A. FUNDAMENTO

Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos,particularmente a aquellos asociados a infecciones dermatolgicas. Su bajo pHinhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que pueden estarpresentes en la muestra.

B. COMPOSICION

C. PREPARACION

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IV.RESULTADOS

A. ASPEGILLUS NIGER

Caracteres Macroscpicos Caracteres Microscpicos

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B. ASPERGILLUS FUMIGATUS


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C.ASPEGILLUS FLAVUS


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D.PENICILLIUM


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3. RHYZOPUS

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Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontradosen suelo, fruta que se decae y las heces del vehculo, aniMALES, Y EL VIEJO PAN. ENCIERTAS ESPECIES DEL RHIZOPUS SON CAUSAS OCASIONALES DEL ZYGOMYCOSIS (PHYCOMYCOSIS). PUEDEN CAUSARINFECCIONESSERIAS (YAMENUDOFATALES) ENSERESHUMANOSYANIMALESDEBIDOASUTARIFADECRECIMIENTORPIDA. ENCIERTASESPECIESSONPATGENODELAPLANTA, YUNO, OLIGOSPORUSDEL RHIZOPUS, SEUTILIZAENLAPRODUCCINDELTEMPEH, UNALIMENTOFERMENTADODERIVADODELASSOJAS.Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son

el interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son gentico idnticos a supadre, los zygospores se producen despus de que dos mycelia se fundan durante la reproduccinsexual, y dan lugar a las colonias que pueden ser gentico diferentes de sus padres.

EL GNERO MUCORSe caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, susespecies invaden lentamente los medios de cultivo.

EL GNERO RHYZOPUSPosee estolones y rizoides, razn por la cual invaden rpidamente los mediosde cultivo. En este Gnero los esporangiforos nacen en los nudos de losestolones, o sea sobre los rizoides.

EL GENERO ABSIDIALos esporangiforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entrerizoides.

APLICACIONES INDUSTRIALES

Importancia econmica, sntESIS DE PRODUCTOS INDUSTRIALES: PRODUCCIN DE CIDOS LCTICO,CTRICO, SUCCNICO, OXLICO, ETC. Y ALIMENTOSPOPULARESORIENTALES: SU-FUYTEM-PE

Mucor racemosus: Se presenta en dos formas segn el medio en que se desarrolle. Una forma tpica ofilamentosa, en medios slidos y otra forma atpica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios lquidos yque es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentacin de mostos azucarados, en cambio, la formatpica se usa para obtener enzimas (amilasas).

Mucor rouxil: Hidroliza el almidn posteriormente y posteriormente fermenta los azcares formados en lahidrlisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una levadura a las 24 horas dedesarrollo de Mucor para facilitar la fermentacin alcohlica. Esto es en sntesis lo que se conoce con el nombre de

proceso amilo. La forma tpica se emplea para la fabricacin de amilasas.

Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amiloltico, puede hidrolizar el almidn y producir etanol,pero en menor proporcin que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de fermentacin alcohlica, encambio, en los ltimos aos se

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A. CULTIVOS

Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente.Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rpidocrecimiento, son vellosas o algodonosas y empujan la tapa de la placa petRI. INICIALMENTE SON BLANCAS PERO CAMBIAN A GRIS, MARRN ONEGRO CON LA MADUREZ A MEDIDA QUE SE

FORMANESPORAS.

B. OBSERVAR

a. RHYZOPUS


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b. MUCOR


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c. ABSIDIA


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V. CUESTIONARIO

1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?2. Mencione las enfermedades producidas por el gnero Aspergillus?3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscpicas y microscpicas) ? Dibuje.4. Cmo diferencia el gnero Aspergillus del Penicilium?5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium?7. Qu es una enzima?8. Dibuje e indique las partes del Penicillium?9. Mencione Ud. Cules son las caractersticas macroscpicas del Penicillium?10. Cul es la estructura bsica de la Penicilina?11. Cules son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?12. Cmo sospecha Ud. Que el hongo que ha desarrollado en su placa de cultivo se trata de un Zygomycete?13. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?14. Indique Ud. Cules son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una Absidia?

15. Qu enfermedades producen estos hongos?16. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?

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PRCTICARCTICAEQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;

ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACINACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN

I. OBJETIVOS

1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento yesterilizacin de materiales y equipos ms empleados en un laboratorio demicrobiologa industrial.

2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales parael anlisis microbiolgico.

3) Justificar la importancia de los mtodos de esterilizacin para el controlmicrobiolgico de los alimentos.

II. MARCO TERICO

El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los mismoses el primer paso en el control microbiolgico de los alimentos, pues de ldepender el xito del anlisis.

2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR

El calor acta desnaturalizando y coagulando las protenas.

2.1.1.- ESTERILIZACIN POR CALOR SECOSe requiere temperaturas elevadas y un periodo ms prolongado decalentamiento que la esterilizacin con vapor. Su uso est limitadoprimariamente a la esterilizacin de material de vidrio y aquellassustancias que sean impermeables al vapor.

El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en losefectos letales del calor seco debido a la desecacin en general, lesin poroxidacin y efectos txicos de los niveles de electrlitos.

En ausencia de agua, disminuye el nmero de grupos polares de la cadenapeptdica y se requiere ms energa para abrir las molculas, de all laaparente mayor estabilidad del organismo.

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Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica unatemperatura de 160-170C durante 1 hora.

a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales aesterilizar (asas y agujas de kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al

contacto de la llama de un mechero para eliminar rpidamente losmicroorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.

b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u hornoPasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170-180Cpor 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material devidrio.

2.1.2 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente

cuando se encuentran hmedas como porque el vapor proporciona unmedio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipientede esterilizacin, el vapor debe conservarse a una presin de 1000g/cm 3

sobre la presin atmosfrica para obtener una temperatura de 121C. Seproduce tambin rupturas de cadena nica en el ADN, y la prdida de laviabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede correlacionarse conla introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica,como resultado de activacin o liberacin de una nucleasa.

El calor produce tambin una prdida de la integridad funcional de lamembrana y filtracin de pequeas molculas y material absorbente de

260 nm. Este material es de origen ribosmico y aparentemente esresultado de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadaspor el tratamiento con calor. Existe tambin degradacin del ARNribosmico y la prdida de viabilidad de las clulas expuestas atemperaturas elevadas.

a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo(100C) por 15-35 minutos.

b)Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a laaccin del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100C; para ello

puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza paramateriales termolbiles como es el caso de algunos medios de cultivo.

c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras depresin y 121C por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar mediosde cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse porcalor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurizacin o tindalizacin.

c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de formacilndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; constade:

Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de unacamisa metlica cilndrica.

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Dispositivos para la instalacin de la fuente calorfica (gas,electricidad o vapor de agua).

Orificios superiores para purga de gases de combustin. Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro. Canastilla para colocar el material a esterilizar.

2.2 ESTERILIZACIN POR FILTRACIN

Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar atravs de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirvepara la esterilizacin de sustancias termolbiles. El material filtrante puedeser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.

II.3 ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA

Poseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando sumayor efectividad como agente bactericida en la regin espectral dealrededor de los 260 nm. de longitud de onda, ste mtodo presentamuchas dificultades tcnicas.

III. MATERIALES Y EQUIPO

- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri

- Erlenmeyer, tubos de ensayo- Papel craff, algodn, gasa, tijeras- Mechero de Bunsen- Horno Pasteur de aire caliente- Autoclave

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a)Preparacin de tubos matraces

- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben llevarsus tapones de algodn respectivamente, los cuales deben cerrarsuavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos,preparados segn el mtodo siguiente:

- De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazoconvenientemente de algodn de fibra, extendida, rectangular

- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta

completar toda la longitud.- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drselela forma de cono truncado, con el dimetro a la medida delrecipiente a taponar, el tapn debe entrar en el recipiente hasta la

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mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los taponesenvueltos en gasa para evitar el hilachamiento.

Tubos de Ensayo- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos

con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel

slo la zona de las bocas.

Frascos y Matraces- Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel

kraft y se amarra con hilo pabilo.- Colocar el nombre del medio de cultivo- Rotular la fecha de preparacin.

b)Preparacin para proteger las pipetas- En el extremo de succin de cada pipeta introducir una porcin de

algodn con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que

quede muy ajustado.- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar

uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver lapunta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de lapipeta girndose en espiral en forma ajustada y en la parte terminalde la boquilla se remata con una torsin para protegerla y se rompeel resto de papel sobrante.

- Anotar con un lpiz la medida de la pipeta y la fecha de suesterilizacin.

c)Preparacin de las placas Petri- Cortar papel kraft tamao adecuado para cubrir ntegramente las

placas petri completas.- Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa

ponindose esta en el centro, se envuelve la placa tomndose dosextremos opuestos del papel, dndose una vuelta alrededor de ella,los otros dos extremos del papel se doblan en tringulos,rematndose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa,dndosele una apariencia de paquete de regalo.

4.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplearcon utensilios de vidrio o metal.

a)Procedimiento para la esterilizacin en horno- Ponga el termostato a l75C y encienda el horno.- Si hay un ventilador verifique que est funcionando.- Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a l75C. sgase

calentando durante 60 minutos ms.- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta

60C. Abra la puerta del horno.

- El papel empleado para envolver deber de haber tomado un colormarrn oscuro, si el color del papel es amarillo plido indicar que elhorno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecidoindicar que el horno se ha calentado demasiado.

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4.3 ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO

a)Procedimiento para la esterilizacin con autoclave- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la

canasta). Cercirese que el agua no toque la canasta. Elimine elexceso de agua abriendo la espita del drenaje.

- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se vana esterilizar, se pueden aadir indicadores de la esterilizacin, comociertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse latemperatura adecuada.

- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorndose de que la arandela degoma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales lossujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado.

- Abrir la vlvula de salida del aire.- Inicie el calentamiento de la autoclave.- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor.

Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y

continuo, esto indicar que todo el aire ha sido expulsado de laautoclave.

- Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense lossujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperaturaligeramente.

- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deberregular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos.

- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla eltiempo requerido.

- Cuando la temperatura descienda a menos de 80C abra la vlvula

de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera delautoclave.- Deje enfriar la autoclave y a continuacin retire cuidadosamente la

canasta con los utensilios estriles.

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VI.CUESTIONARIO

1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunosejemplos?

2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materialesantes del control microbiolgico, por qu?

3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner enfuncionamiento el autoclave.

4. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporasbacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia.

5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.

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PRCTICARCTICAMEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

I. OBJETIVOS

a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para quepueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano.

b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa.c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms

corrientes.d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de cualquier

medio de cultivo.

II. MARCO TEORICO2.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimientomicrobiano. De acuerdo con esto, siempre se requerir una fuente deenerga y una fuente no energtica como son las sales, factores decrecimiento, etc., que sin proporcionar energa son necesarias para sudesarrollo.

2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGTICOS DE LOSMICROORGANISMOS

A. FUENTES DE CARBONOEn la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde aazcares en forma de mono o disacridos, como glucosa, lactosa,maltosasetc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azcaresms complejas para obtener energa., como es el caso del almidn.Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO2 hechoque es caracterstico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas.Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e,

incluso hidrocarburos como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium.Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar comofuente de energa un gran nmero de componentes hidrocarbonadosdiferentes.

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B. FUENTE DE NITROGENOPueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de lagelatina o incluso protenas an ms complejas, como es el caso de losextractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc.Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que

corresponden a pptidos o polipptidos dependiendo de su complejidadpero en cualquier caso son tambin protenas que estn parcialmentehidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a unapeptona ppsica de carne.La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar laformacin de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido detriptfano que posee este tipo de peptona. Tambin es utilizada paraestudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunosprotozoos.La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmentepara hongos y ciertos grmenes como Neisserias.Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco,sales de amonio, aminocidos, etc.

2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOSMICROROGANISMOS

A. FUENTE DE AZUFRETodos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen

mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos yen otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algn aminocido,ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.

B. FUENTE DE FSFOROEn general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en formade fosfato.

C. IONES METLICOSSon utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones

muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendode su concentracin pueden inhibir el crecimiento de otros, como el casodel sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo demicroorganismo y facilita el crecimiento de otros.- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de

Staphylococous.- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del

Enterococus.

D. FACTORES DE CRECIMIENTOExisten bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si lohacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta adems

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una serie de componentes definidos que no son capaces de fabricar por ssolas.A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van acorresponder a algn tipo de aminocido de bacterias muy exigentes oincluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas, etc.Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:

- Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cidonicotinico para el crecimiento de Xanthomonas.- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y

grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina(factor X) y est enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factorV), que permite el desarrollo de este microorganismo.

- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) paracrecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en gotas demercurio brillantes es fcil de apreciar.

- Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas delcomplejo B para el crecimiento del Flavobacterium.

E. FACTORES INHIBIDORESSon componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo demicroorganismo por bloqueo de sus procesos metablicos.Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propiabacteria.La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimientobacteriano de los Grampositivos.Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.

Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin ytipificacin de pruebas bioqumicas de las bacterias.

Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:

Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben eldesarrollo de las bacterias Gramnegativas.El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes deanilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismosGrarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias.Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales

biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y amuchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.

2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO

Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:- Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese

microorganismo.- Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra

que considerar:A. TEMPERATURA PTIMALos microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categorassiguientes en funcin de los rangos de temperatura de crecimiento.

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- Los psicrfilos crecen bien a 0C y tienen una temperatura ptima oinferior, la mxima es de 20C. Se aslan del rtico y Antrtico. Puedencrecer a 0C, aunque su temperatura ptima sea 20 a 30C y la mximade casi 35C. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefaccinde alimentos refrigerados.

- Los Mesfilos, crecen a una temperatura ptima de 20 a 45C, siendo la

mnima de 15 a 20C y la mxima de casi 45C. La mayora de losmicroorganismos pertenecen a esta categora. Las bacterias patgenaspara el hombre suelen crecer a una temperatura ptima de 37C.

- Los termfilos, pueden crecer a una temperatura de 55C o superiores. Latemperatura mnima es normalmente de 45C y la ptima es de 55 a65C. Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberas de aguacaliente, aguas termales.

- Los Hipertermfilos, temperatura ptima de entre 80C y casi 113C, nocrecen por debajo de 55C. Microorganismos aislados en zonas calientesdel suelo marino.

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RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO

MicroorganismoTemperaturas cardinales (C)

Mnima ptimaMxim

aBacillus psichrophilusMicrocococcus cryophilusPseudomona fluorescensStaphylococcus aureusEnterococcus faecalisEscherichia coliNeisseria gonorrhoeae

Thermoplasma acidophilumBacillus stearthermophilusSulfolobus acidocaldarius

Pyrococcus abyssiPyrodictium occultumPvrolobus fumariiCandida scottiSaccharomyces cerevisiaeMucor pusillus

-10-44

6.50

1030453060

6782900

1-321-23

23-2410

25-3030-37

3737

35-3659

60-6580

961051064-1528

45-50

28-30244046444538627585

1021101131540

50-58

B. GRADO DE HUMEDADVa a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria parasu crecimiento.En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin deagua.En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que laliofilizacin y cualquier mtodo de deshidratacin, sea un buen medio deconservacin.

C. pHCada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pHptimo de crecimiento.- Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.- Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0

- Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores depH de 4 a 6.Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismosalterando la membrana plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimasy las protenas transportadoras.El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0.Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.

En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH comoconsecuencia de los metabolitos que se producen por la degradacin de losnutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la fermentacinglucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica

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utilizando la bacteria sales amnicas como fuente de energa se alcalinice elmedio.Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzopara mantener el pH dentro de los lmites fisiolgicos.

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EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

MicroorganismoLmiteinferior

pHptimo

Lmitesuperior

Picrophilus oshimaeThiobacillus thiooxidans

Sulfolobus acidocaldariusLactobacillus acidophilusStaphylococcus aureusProteus vulgarisEscherichia coliClostridium sporogenesPseudomonas aeuriginosaNitrosomonasBacillus pasteuriiBacillus alcalophilus

00.5

1.04.0-4.6

4.24.44.4

5.5-5.85.6

7.0-7.68.58.5

0.72.0-3.5

2.55.8-6.67.0-7.56.0-7.06.0-7.06.0-7.66.6-7.08.0-8.8

SD10.6

SD6.0

4.06.89.38.49.0

8.5-9.08.09.4SD

11.5

D. PRESIN OSMTICASe suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunqueexisten muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algosuperiores.Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos ehipotnicos; este hecho es debido a su pared rgida que permite que el aguano penetre en la bacteria y sta se rompa.En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente aconcentraciones muy altas de cloruro sdico; Ej: Staphylococus.Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados

sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamenteel grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw).

Actividad delAgua

Ambiente Microorganismo

1.00 (agua pura)

0.950.900.850.80

0.75

0.700.60

Sangre

PanJamnSalamiConservas

LagossaladosPescadosaladoCereales,dulcesChocolateLechedeshidratada

Mayora de Gramnegativosno halfilosBacilos Grampositivos,BasidiomycetesCocos, Bacillus, Fusarium, Mucor,Rhizopus

Staphylococus, SaccharomycesPenicillumHalobacterium, AspergillusActinosporaAspergillusSaccharomycesXeromyces

E. CONCENTRACION DE OXGENOUn organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico esAEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.

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Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer,pero lo hacen mejor en su presencia.Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis puedencrecer bien tanto en su presencia como en su ausencia.Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo:Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y

mueren en su presencia.Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energamediante la respiracin aerobia y deben utilizar vas de fermentacin orespiracin anaerobia para este objetivo.Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter,que son MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigenoatmosfrico 20% precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% deOxgeno.

2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentesclasificaciones. De acuerdo con esto y segn criterios se podran dividir en:

2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU PROPORCIN EN AGUA

A. MEDIOS SLIDOSCorresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siemprepor encima del 15%.La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite elaislamiento, purificacin y visualizacin del crecimiento en colonias, as

como su posible identificacin a travs de medios especficos y diferencialesde caracteres, slidos elaboracin de antibiogramas, etc.Ejemplo de medios de cultivo:- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos

Gramnegativos.- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias.

B. MEDIOS LQUIDOS

Tambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad parala realizacin de recuentos bacteriolgicos por turbidimetra, especialmentetil en levaduras, para la realizacin de inculos, para obtener metabolitosprimarios o secundarios, de los microorganismos como: antibiticos, cidoslcticos, etc.Ejemplo de medios de cultivo:- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de

glucosa.- Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol.- Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados

difciles de cultivar.C. MEDIOS SEMISLIDOS

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Son medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin enagar suele ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad quele proporcione consistencia semislida. Son tiles para algunas pruebasbioqumicas:- Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol.- Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina.

2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU USO O UTILIZACIN

A. MEDIOS PARA AISLAMIENTOSon medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos coloniasaisladas. Estos, segn sea su composicin, se pueden a su vez dividir en:A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOSSon medios a los cuales, como su nombre indica, se les aade adems delos componentes bsicos, uno o varios elementos, como por ejemplo casenasoja, triptfano, etc., que facilitan el crecimiento de algn tipo demicroorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar elmicroorganismo que buscamos.

A.2. MEDIOS SELECTIVOSSon medios en cuya composicin presentan componentes que impiden elcrecimiento de algn tipo bacteriano.- Medio Salmonella Shigella, contiene en su composicin sales biliares,

citrato de sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y loshacen con el grupo coliforme.

A.3. MEDIOS DIFERENCIALESCorresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades

que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben elcrecimiento de algunas bacterias y, lo que es ms caracterstico de estemedio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacteriasque van a crecer en dicho medio, dan una informacin suplementaria yespecfica, es decir, diferencial; por ejemplo:- El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composicin eosina y

azul de metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos yalgunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias,que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una coloracincaracterstica para cada tipo de microorganismo.Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con fines

de aislamiento e identificacin.- Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar

la Glucosa, Lactosa y Sacarosa, adems si puede producir H2S.- Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o

desamina el aminocido Lisina.- Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de

utilizar el citrato como nica fuente de carbono.

B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERALSon medios ya sea en forma lquida o slida que sirven para el cultivo de lamayor parte de las bacterias. Su composicin va a corresponder a unafuente de carbono, una fuente de nitrgeno, sales y agua. Dentro de losmedios generales ms empleados tendramos el caldo comn, que est

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compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sdico yagua.

C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPASSon medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a lascepas vivas durante perodos de tiempo relativamente largos

mantenindose tales medios generalmente a temperaturas losuficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento.Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo paramantener cepas durante meses.

2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU COMPOSICINA. MEDIOS NATURALESB. MEDIOS SEMISINTTICOSC. MEDIOS SINTTICOSD. MEDIOS COMPLEJOS

2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACINA. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOSB. MEDIOS YA PREPARADOSC. MEDIOS SLIDOS EN PLACA PETRID. MEDIOS SLIDOS EN TUBOD.1. Con Agar InclinadoD.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de FlautaE. MEDIOS LQUIDOS EN TUBO

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III. MATERIALES Y REACTIVOS

d. MATERIAL REQUERIDO- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml.

Baguetas. Balanza. Esptula. Agua destilada. P

practicas microbiologia.2013ok-casa.doc

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