UNIVERSIDAD TCNICA DE MANAB FACULTAD DE CIENCIAS MATEMTICAS FSICAS Y QUMICAS

7mo DE INGENIERA QUMICA

FUNDAMENTO DE MICROBIOLOGA Y

LABORATORIO II

ING. VIRGINIA SNCHEZ

PROYECTO DE 2DO PARCIAL

TEMA

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LA

BACTERIA ENTEROBACTER

INTEGRANTES

CEDEO MACAS CARLA

LVAREZ WILLIAM

SABANDO MOLINA CRISTINA

SALTOS GARCA FABIAN

SOLRZANO CHVEZ MARIELA

TOASA VIZUETE EDISSON

TEMA

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LA BACTERIA

ENTEROBACTER

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Aislar la bacteria ENTEROBACTER en muestras especficas utilizando medios

de cultivos para identificar el gnero y especie, aplicando pruebas bioqumicas.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Reconocer las caractersticas de la bacteria Enterobacter para poder realizar las

prcticas respectivas.

Determinar la presencia de bacteria Enterobacter en las muestras escogidas.

Analizar las respectivas pruebas necesarias correctamente para obtener los

resultados requeridos.

INTRODUCCIN

En el presente trabajo investigativo consisti en la implementacin de pruebas

microbiolgicas para el anlisis, afirmacin y confirmacin de la presencia de la bacteria

Enterobacter en muestras una en alimento (queso) y la otra de agua residual.

Los sistemas ms importantes para la identificacin de microrganismos es observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en los laboratorios.

Enterobacter se nombra para el hbitat natural predominante de los organismos, los

intestinos de los animales (del griego enteron, que significa "delgado").

Enterobacter (gnero Enterobacter), cualquiera de un grupo de forma de varilla bacterias

de la familia Enterobacteriaceae.

Enterobacter son bacterias gram-negativas que se clasifican como anaerobios

facultativos, lo que significa que son capaces de prosperar en entornos tanto aerbicas y

anaerbicas. Muchas especies poseen flagelos y por lo tanto son mviles.

Caractersticas tales como la motilidad, as como ciertas propiedades bioqumicas,

incluyendo la capacidad de sintetizar una enzima conocida como la ornitina

descarboxilasa, se utilizan para distinguir Enterobacter desde los muy similares y

estrechamente relacionados Klebsiella bacterias.

El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-

negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa

con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est

conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y

Klebsiella.

Las bacterias Gram-negativas aparecen rosadas o rojas bajo el microscopio. Incluyen E.

coli, Campylobacter, E. aerogenes forma parte del endgeno humano gastrointestinal (GI)

microflora. Tambin reside en el suelo, el agua y en los productos lcteos.

Existe un conjunto de medios de cultivo que son muy usados para la identificacin de

bacterias. La siembra de este conjunto o batera de pruebas bioqumicas debe realizarse a

partir de colonias aisladas.

MATERIALES Y SUSTANCIAS

EQUIPOS Y MATERIALES SUSTANCIAS Y REACTIVOS

Balanza analtica

Autoclave

Incubadora

Calentador- agitador

Cabina de flujo laminar

Mechero

Mortero

Matraz Erlenmeyer

Caja Petri

Cuchara metlica

Tubos de ensayo

Gradilla

Vidrio reloj

Probeta

Pipetas

Peras

Porta objetos

Asas (en punta y redonda)

Pastilla agitadora

Campana de Durham

Algodn

Gasa

Papel kraft

Piola nailn

Cinta adhesiva de papel.

Agua residual (Muestra #1)

Queso macerado (Muestra#2)

Agua destilada

Agua peptonada

Agar verde brillante. (Muestra #1)

Agar Mc Conkey (Muestra #1 y #2 )

Agar EMB (Muestra # 2)

Caldo Billis verde brillante

Agar TSI

Cristal violeta

Reactivo de kovac

Muestra # 1 (Agua Residual)

PROCEDIMIENTO

1. Se esterilizaron todos los materiales y equipos previos a la prctica, esto se lo realiz en la autoclave y en la estufa.

Etapa N1 Obtencin De La Muestra Agua Residual.

2. La Muestra #1 fue obtenida de la poza de oxidacin de Santa Ana, de la cual hemos utilizado 90ml.

Etapa N2 Preparacin de las soluciones.

3. Preparamos 250ml de nuestro medio de enriquecimiento que es el agua de

peptona.

4. Cada tubo enroscable se llen con 10 ml de agua peptonada para las disoluciones

en serie de cada muestra con sus respectivas replicas.

5. Para la prctica se utiliz Agar Mc Conkey 12.5 gr en 250ml de agua destilada y

el Agar Verde Brillante 17.4 gr en 300ml de agua destilada.

6. Luego se lo lleva a la autoclave por 15min a una temperatura de 121 C tanto los

tubos enroscables y los agares para el cultivo.

Etapa N 3 Pre-Enriquecimiento

7. Luego se procede a llenar los tubos enroscables que con 10 ml de agua peptonada, esto se lo hace en 2 series de 4

8. Para la primera serie, se procedi a llenar 2 tubos con 10 ml de la muestra lquida de agua residual en 10 de agua peptonada, luego se agita cada muestra y se rotula

el tubo.

9. Para la siguiente serie de 10-1 se procede a llenar 1 ml de la muestra en los tubos que contienen agua peptonada.

10. Para la muestra de 10-2 se toma 1ml de la muestra anterior (la de 10-1) y se la coloca en el siguiente tubo.

11. Para las siguientes series se procede igual que en la muestra anterior de 10-2 con 10-1, hasta llegar a la serie 10-4.

12. Estas muestras se la llevan a la incubadora a una temperatura de 37C por 24h.

Etapa N 4 Siembra En Los Medios De Cultivo

13. Una vez llenado cada tubo se procede a coger inculos del caldo pre-enriquecido (mezcla de agua peptona y el agua residual) con una asa redonda y se siembra

haciendo estras (con el fin de llevar a cabo el aislamiento) en los medios Agar

Verde Brillante y McConkey ya llenos y gelificados dentro de la cabina de flujo

laminar.

14. Estas muestras se la llevan a la incubadora a una temperatura de 37C por 24h. 15. Se observa los resultados a las constantemente, para observar la formacin y

desarrollo de bacterias.

Etapa N 5 Pruebas Bioqumicas

16. Se prepara el Triple Sugar Iron Agar 6.5 gr en 100 ml de agua destilada, el SIM Medium Agar 6.5 gr en 100 ml de agua destilada y Simmons Citrato Agar 2.3

gr en 100 ml de agua destilada. Revuelva para mezclar bien.

17. Calentar hasta ebullicin para disolver completamente. 18. Esterilizar en la autoclave a 121 grados C durante 15 minutos. 19. Enfriar a 45-50 grados C. 20. Una vez que hemos tenido la siembra con nuestros respectivos medios de cultivo

tomamos una muestra de nuestra bacteria procedemos a llevar nuestro medio

identificador como es el agar TSI, SIM Medium y SIM

21. Flamear el asa de platino en el mechero de bunsen. 22. Enfriarlo y pasarlo por encima de la caja Petri. 23. Sacar los tapones de los tubos de TSI y SIM 24. Introducir al fondo del tubo el asa de platino. 25. Llevarlos a la incubadora a una temperatura de 37 C. 26. Observar los resultados a las 18 horas.

El TSI nos permite la diferenciacin de Enterobacteriaceae por su capacidad para

fermentar la glucosa, lactosa y sacarosa, y producir sulfuro de hidrgeno.

El SIM se recomienda para su uso en la diferenciacin de bacilos entricos gram-negativa

basada en la utilizacin de citrato. Nos permite ver una coloracin azul oscuro con su

resultado positivo y si no hay coloracin y hay un desnivel de este tambin significa que

hay presencia de nuestra bacteria enterobacter.

El SIM Medium se recomienda para la diferenciacin de bacilos entricos gram-

negativas, sobre la base de la produccin de sulfuro, formacin de indol, y la motilidad.

CLCULOS

Agua Peptonada Agar

15 gr 1000 ml = 3.75 gr

? 250 ml

Mc Conkey Agar

50 gr 1000 ml = 12.5 gr

? 250 ml

Verde Brillante Agar

58 gr 1000 ml = 17.4 gr

? 300 ml

Triple Sugar Iron Agar

60 gr 1000 ml = 6.5 gr

? 100 ml

Sim Medium Agar

30 gr 1000 ml = 8.75 gr

? 250 ml

Simmons Citrato Agar

23 gr 1000 ml = 2.3 gr

? 100 ml

RESULTADOS

En el Control microbiolgico para observar os siguientes resultados fueron obtenidos a

partir de cepas patrn, despus de incubacin a temperatura de 37C y observados a las

24 horas.

MacConkey Agar

MICROORGANISMO DESARROLLO COLOR DE

COLONIA

CONFIRMACIN

Enterobacter Bueno Rosa-rojo Positivo

Verde Brillante, Agar

MICROORGANISMO DESARROLLO COLOR DE

COLONIA

CONFIRMACIN

Enterobacter Bueno

Amarillo -

verdoso Positivo

En las Pruebas Bioqumicas se va observar si hay presencia de la bacteria Enterobacter

y si hay fermentacin de lactosa o sacarosa, productora de gas y viraje por cambio de

color.

PRUEBAS BIOQUMICAS TSI

ENTEROBACTER

Aislamiento en MacConkey Agar

1era Muestra Replica

10-1 10-2 10-3 10-4 10-1 10-2 10-3 10-4

Fermentacin de Glucosa - * * - + + * *

Fermentacin de Lactosa + * * + + + * *

Fermentacin de Sacarosa + * * + + + * *

Produccin de SH2 - * * - + - * *

PRUEBAS BIOQUMICAS TSI

ENTEROBACTER

Aislamiento en Verde Brillante, Agar

1era Muestra Replica

10-1 10-2 10-3 10-4 10-1 10-2 10-3 10-4

Fermentacin de Glucosa * + * - + * + *

Fermentacin de Lactosa * + * + + * - *

Fermentacin de Sacarosa * + * + + * - *

Produccin de SH2 * + * - + * + *

Presencia de gas * - * + - * - *

PRUEBAS BIOQUMICAS Sim Medium Agar

ENTEROBACTER

Aislamiento en MacConkey Agar 1era Muestra Replica

10-1 10-2 10-3 10-4 10-1 10-2 10-3 10-4

Fermentacin de Glucosa - - - - - - - -

Fermentacin de Lactosa - - - - - - - -

Fermentacin de Sacarosa - - - - - - - -

Produccin de SH2 + + + + + + + +

PRUEBAS BIOQUMICAS SIM

ENTEROBACTER

Aislamiento en Verde Brillante, Agar

1era Muestra Replica

10-1 10-2 10-3 10-4 10-1 10-2 10-3 10-4

Fermentacin de Glucosa - * - * - - * *

Fermentacin de Lactosa + * + * + + * *

Fermentacin de Sacarosa + * + * + + * *

Produccin de SH2 + * + * + + * *

Muestra # 2 (Queso Macerado)

PROCEDIMIENTO

1. Se esterilizaron todos los materiales y equipos previos a la prctica, esto se lo realiz en la autoclave y en la estufa.

Etapa N1: Obtencin De La Materia Prima

2. Nuestra materia prima fue el queso comprado en un local (tienda), ubicada en la

parroquia primero de mayo en la calle nueva y av. Universitaria.

Etapa N2 Preparacin De La Muestra y Agares

3. Nuestra muestra que es el queso fue cortado en rodajas pequeas, se lo coloca en

el recipiente estril, luego fue llevada a maceracin en temperatura ambiente

durante aproximadamente 3 das esto es para que la flora bacteriana se propague.

4. Para la prctica se utiliz Agar Mc Conkey 12.5 gr en 250ml de agua destilada y

el Agar EMB 11.25 gr en 300ml de agua destilada.

5. Luego se lo lleva a la autoclave por 15min a una temperatura de 121 C tanto los

tubos enroscables y los agares para el cultivo.

Etapa N 3 Pre-Enriquecimiento

6. Se pesan 10g de queso macerado luego se le coloca los 90ml de agua de peptona

esto se lo agito manualmente y luego se lo lleva a incubar por 24h a una

temperatura de 37 C.

Etapa N 4 Siembra En Los Medios De Cultivo

7. Se tomaron inculos del caldo pre-enriquecido (mezcla de agua peptona y queso)

con una asa redonda y se sembr por el mtodo de estras (con el fin de llevar a

cabo el aislamiento) en los medios EMB y McConkey, sometindolos a

incubacin posteriormente a 37C por 24h.

Etapa N 5 pruebas bioqumicas

8. Se prepara el Triple Sugar Iron Agar 6.5 gr en 100 ml de agua destilada, Simmons Citrato Agar 2.3 gr en 100 ml de agua destilada. Revuelva para

mezclar bien.

9. Calentar hasta ebullicin para disolver completamente. 10. Esterilizar en la autoclave a 121 grados C durante 15 minutos. 11. Enfriar a 45-50 grados C. 12. Una vez que hemos tenido la siembra con nuestros respectivos medios de cultivo

tomamos una muestra de nuestra bacteria procedemos a llevar nuestro medio

identificador como es el agar TSI y SIM

13. Flamear el asa de platino en el mechero de bunsen. 14. Enfriarlo y pasarlo por encima de la caja Petri. 15. Sacar los tapones de los tubos de TSI y SIM 16. Introducir al fondo del tubo el asa de platino. 17. Llevarlos a la incubadora a una temperatura de 37 C. 18. Observar los resultados a las 18 horas.

El TSI nos permite Capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa

y lactosa en un nico medio y tambin nos Permite la identificacin de la produccin de

SH2.

El SIM nos permite ver una coloracin azul oscuro con su resultado positivo y si no hay

coloracin y hay un desnivel de este tambin significa que hay presencia de nuestra

bacteria Enterobacter.

CLCULOS

Agua Peptonada Agar

15 gr 1000 ml = 3.75 gr

? 250 ml

Mc Conkey Agar

50 gr 1000 ml = 12.5 gr

? 250 ml

EMB Agar

37.5 gr 1000 ml = 11.25 gr

? 300 ml

Triple Sugar Iron Agar

60 gr 1000 ml = 6.5 gr

? 100 ml

Simmons Citrato Agar

23 gr 1000 ml = 2.3 gr

? 100 ml

RESULTADOS

En el Control microbiolgico para observar os siguientes resultados fueron obtenidos a

partir de cepas patrn, despus de incubacin a temperatura de 37C y observados a las

24 horas.

MacConkey Agar

MICROORGANISMO DESARROLLO COLOR DE

COLONIA

CONFIRMACIN

Enterobacter Bueno Rosa-rojo Positivo

EMB, Agar

MICROORGANISMO DESARROLLO COLOR DE

COLONIA

CONFIRMACIN

Enterobacter Bueno

verde -

brillante Positivo

En las Pruebas Bioqumicas se va observar si hay presencia de la bacteria Enterobacter

y si hay fermentacin de lactosa o sacarosa, productora de gas y viraje por cambio de

color.

PRUEBAS

BIOQUMICAS TSI

ENTEROBACTER

Aislamiento en MacConkey Agar Aislamiento en EMB Agar

2da Muestra Replica 2da Muestra Replica

Fermentacin de

Glucosa - - - -

Fermentacin de

Lactosa + + + +

Fermentacin de

Sacarosa + + + +

Produccin de SH2 - - - -

Presencia de gas - - + +

PRUEBAS

BIOQUMICAS Sim Medium Agar

ENTEROBACTER

Aislamiento en MacConkey Agar Aislamiento en EMB Agar

2da Muestra Replica 2da Muestra Replica

Produccin de SH2 + + + +

Presencia de gas - - - -

Formacin de Idol + + + +

Motilidad + + + +

PRUEBA CONFIRMATIVA DE

MICROORGANISMOS COLIFORMES

TOTALES

1. Llenar los tubos de ensayos enroscable con campanas de Durham dentro de cada

uno.

2. Pesar y disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos

se parte de un preparado comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante

aadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentracin deseada de

los mismos.

3. Llenar los tubos con 10 ml de la sustancia (Caldo de Lactosa).

4. Esterilizar las disoluciones en el autoclave a 121C en un tiempo de 15 minutos,

una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de

contaminantes esto depender de la forma en que vaya a utilizarse el medio.

5. Retirar los materiales del autoclave y los llevamos a la cabina de flujo laminar es

aqu donde se realiza la manipulacin, esperamos que todas las sustancias estn

en la temperatura deseada.

6. Observar que ningunos de los tubos de ensayos tengan gases dentro de la campana

de Durhan.

7. Procedemos a colocar la muestra de agua residual en los tubos que contienen las

sustancia del caldo de Lactosa con una cantidad de 1ml, 0.1 ml y 0.01ml de la

concentracin de la muestra.

8. Las llevamos a la incubadora por 24 horas pasado ese tiempo se observa los

coliformes totales que se formaron en cada una de las muestras.

RESULTADOS

# SERIE TUBO 1 TUBIO 2 TUBO3 TOTAL

Serie 1 (1 ml) + + + 3 Serie 2 (0.1 ml ) + - + 2 Serie 3 (0.01) + - - 1

NMP de Coliformes Totales 150/100 ml

CONCLUSIONES GENERALES

De acuerdo con nuestras muestras liquida y slida (agua de canal y de

queso macerado) nos damos cuenta con cada uno de sus anlisis y

resultados que hay presencia de Enterobacter.

Se concluye que debido al anlisis adecuado de nuestro proyecto se

pudo poner en prcticas las tcnicas de siembra aprendidas en clase

para la identificacin y clasificacin de la Enterobacterias.

Se comprob los conceptos ya conocidos de dicha bacteria siendo esta

una bacteria Gram negativa, no mvil, siendo fermentadora de lactosa

y causante patognica la cual puede volverse muy grave y hasta mortal

dependiendo en el cuerpo que use para su reproduccion si no es tratada

a tiempo; y su transmisin es va oral-fecal.

Las pruebas bioqumicas indican el metabolismo microbiano de las

bacterias para vivir y reproducirse, as de esta manera se puede

facilitar su identificacin.

Durante el periodo de incubacin de la bacteria se pudo determinar la

presencia de diferentes UFC de otras bacterias entre ellas la ms

visible la Enterobacter entre otras.

El medio de cultivo utilizado nos permiti identificar las UFC ya que

con (McConkey, verde brillante, EMB Agar) nuestra bacteria de

estudio se torna rosada.

RECOMENDACIONES GENERALES

Se recomienda tomar las debidas precauciones de las reglas del laboratorio

mandil, guantes y mascarilla por la atmosfera no tan estril que se presenta durante

la realizacin del proyecto.

Esterilizar muy bien los materiales. Al realizar las disoluciones con la mayor exactitud. Utilizar la debida proteccin y asepsia en los equipos del laboratorio de

Microbiologa.

Emplea los reactivos reveladores en orden y en buen estado. Tenemos que tomar las precauciones adecuadas en cada prctica sin importar el

grado de peligrosidad que se presenten.

En el momento de preparar el agar y todas las soluciones de la prctica leer las

instrucciones que vienen marcadas en el envase del agar. Ya que hubo muchos

problemas al momento de preparar el agar y no dejar que el medio de cultivo

hierva demasiado ya que se puede subir y ensuciar los equipos lo que puede causar

el dao de los mismos.

Para que nuestra siembra sea de mayor eficacia realizarla dentro de la cabina de

flujo laminar as se evita la contaminacin de las muestras como del medio de

cultivo.

Al momento de terminar la prctica se deben dejar todos los materiales y equipos

limpios y en su debido lugar para su posterior uso.

Avisar cuando se desea la entrada al laboratorio, para que haya la debida

supervisin.

BIBLIOGRAFA

Abbot S (1999) Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, and Berratia. En: Murray P,

Baron E, Pfaller M, Tenover F, Yolken (Ed), Manual of Clinical Microbiology.

7th edition. ASM Press, Washington, Estados Unidos de Amrica, p. 475-482.

http://www.britannica.com/EBchecked/topic/685512/Enterobacter

Sanders E, Sanders C (1997) Enterobacter: a pathogen poised to flourish at the

turn of the century. Clin. Microbiol. Rev. 10: 220-

241.http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/pdf/Enterobacterias_Me

dicine2010.pdf

https://books.google.com.ec/books?id=9EIfkks8uxMC&pg=PA37&lpg=PA37&

dq=enterobacter+aerogenes+en+a

http://es.slideshare.net/carolinacartagenad/cultivo-y-aislamiento-de-bacterias

http://scholar.google.com.ec/scholar?q=enterobacterias+en+aguas+residuales&h

l=es&as_sdt=0&as_vis=1&oi=scholart

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-

placa_6527.pdf.

http://www.qo.fcen.uba.ar/quimor/wp-content/uploads/2013/09/GUIA-TP-

CONTROL-2013.pdf.

ANEXOS

MUESTRA # 1

Preparacin del

medio de cultivo