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ZENTRUM ANGEWANDTE CHEMIE
INSTITUT FÜR LEBENSMITTELCHEMIE
Prof. Dr. R. G. Berger/ PD Dr. Ulrich Krings
Callinstr. 5
30 167 Hannover
++49-511-762-4583
++49-511-762-4547
Praktikum Bioanalytik im Studiengang Life Science zur Vorlesung Bioanalytik
Das Praktikum findet im Raum 233 statt.
Erarbeitung analytischer Grundbegriffe anhand einer praktischen Einführung
in die Gaschromatographie
Praktikumsleiter: PD Dr. U. Krings
Betreuer: Birgit Fuchs, Johanna Weber, Vida Esparan
Inhalt:
I) Einführung in die Bedienung eines Gaschromatographen und des
zugehörigen Datenverarbeitungssystems [Seminare an den Geräten]
II) GC-Injektionstechniken und GC-Detektoren (s. Vorlesung)
[Kolloquien während der Versuche]
III) Messprinzip In der Gaschromatographie werden verschiedene Gase als Trägergase eingesetzt. Neben
hohen Reinheitsanforderungen stellen insbesondere niedrige Viskosität, chemische Inertheit
und vernachlässigbare Wechselwirkung mit Analyten und stationärer Phase wichtige
Anforderungen an ein Trägergas dar. Aus den genannten, sowie aus Kostengründen, finden
daher hauptsächlich He, N2 und H2 in der Gaschromatographie Verwendung. Helium eignet
sich aufgrund seines hohen Ionisierungspotenzials insbesondere als Trägergas bei der
Kopplung der Gaschromatographie mit einem massenselektiven Detektor (GC-MS).
Der Einfluss des verwendeten Trägergases auf die Trennleistung bei unterschiedlichen
Trägergasgeschwindigkeiten wird anhand der zugehörigen Van-Deemter-Kurven deutlich.
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Abb.: Van-Deemter-Kurven für verschiedene Gase
Aufgabe: Die Trägergasgeschwindigkeit ist nicht nur vom Säulenvordruck und der
Säulendimensionierung, sondern auch von der Temperatur abhängig, nämlich wie?
a) Parameter des Gaschromatographen
Retentionszeit
Die Zeit, die nicht retardierte Substanzen bis zur Detektion benötigen (z.B. Methan) bezeichnet
man als Totzeit (chromatographisch tote Zeit). Um die Totzeit zu messen, injiziert man eine
Substanz, die von der Säule nicht zurückgehalten wird. Aus der gemessenen Totzeit und der
Länge des chromatographischen Systems kann die mittlere Strömungsgeschwindigkeit des
Trägergases oder des Eluenten ermittelt werden.
Tt
Lv ]s [m 1-
Die Gesamtzeit, die von der Injektion bis zur Detektion vergeht, nennt man
Bruttoretentionszeit. Die Differenz zwischen Bruttoretentionszeit und Totzeit bezeichnet man
als Nettoretentionszeit.
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b) Trennleistung: Trennzahl, Theoretische Böden, Auflösung, Retentionsindex
Eine wichtige Kenngröße zweier benachbarter Peaks ist die Auflösung (Resolution, R). R
beschreibt, in wie weit zwei Peaks überlappen. Von zwei benachbarten Peaks wird jeweils die
Peakbreite auf halber Peakhöhe gemessen („Halbwertsbreite“). Nach Ermittlung der
Nettoretentionszeiten von Peak 1 und Peak 2 kann die Auflösung R wie folgt berechnet
werden:
(1) 2
1(2)
2
1
176,1
bb
tR N
Für eine Auflösung von R = 1 überlappen zwei Peaks um 3 %. Etwa mit dem Wert R = 1,3 sind
zwei Peaks bis zur Grundlinie voneinander getrennt („basisliniengetrennt“).
Zur Beurteilung der Qualität eines Trennsystems dienen die Trennstufenzahl Nth und die
Bodenhöhe HETP (high equivalent to a theoretical plate). Diese Größen sind der Theorie der
fraktionierten Destillation entnommen. Man kann sich vorstellen, dass die Säule in kleine
Zonen eingeteilt ist, in denen Austausch passiert und die Substanz von Zone zu Zone weiter
transportiert wird. Eine solche Zone nennt man theoretischen Boden. Die Anzahl der Böden
ergibt die theoretische Bodenzahl (Trennstufenzahl). Da die Trennung ein dynamischer
Prozess ist, gibt die Trennstufenzahl letztendlich die Zahl der Gleichgewichtseinstellungen in
der Säule wieder. Die Trennstufenzahl ist unter anderem abhängig von
den Abmessungen der Säule
der Art der stationären Phase
den äußeren Bedingungen (z.B. Fluss der mobilen Phase)
den Prüfsubstanzen
Je mehr theoretische Böden in einer Säule vorhanden sind, umso öfter können Sorptions- und
Desorptionsprozesse erfolgen. Daher wird die Trennstufenzahl als Maß für die
Leistungsfähigkeit eines Systems verwendet. Zur Bestimmung der Trennstufenzahl wird eine
Substanz bei konstanter Ofentemperatur injiziert. Der Peak sollte mit k > 5 im Chromatogramm
aufgezeichnet werden.
k errechnet sich nach:
T
TB
T
N
t
tt
t
tk
Aus der Halbwertsbreite und der Bruttoretentionszeit kann die Bodenzahl ermittelt werden:
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2
2
1
54,5
b
tN B
th
Um die Länge einer Säule mit in die Bewertung einzubeziehen, kann man die Höhe eines
theoretischen Bodens berechnen. Dieser Parameter Bodenhöhe H oder HETP errechnet sich
nach:
thN
LH
Je kleiner die Bodenhöhe H ist, umso besser die theoretische Trennleistung einer Säule.
Eine weitere Größe zur Charakterisierung einer Säule ist die Trennzahl TZ. Sie gibt an, wie
viele Substanzen maximal zwischen zwei aufeinander folgenden n-Alkanen (in diesem Fall
zwischen zwei Carbonsäuremethylestern) mit einer Auflösung von R = 1 eluieren können.
t = Nettoretentionszeit, b0,5 = Peakbreite in halber Höhe
Um geräteunabhängige vergleichbare Retentionsdaten für eine gegebene Trennphase zu
erhalten, wurden Retentionsindices eingeführt. Ein solches System wurde von Kováts
(Kováts-Index) eingeführt. Der Kováts-Index I gibt die relative Lage eines Substanzpeaks zu
zwei aufeinanderfolgenden homologen n-Alkanen in einem Chromatogramm an.
zRzR
zRxR
tt
ttzI
'1'
''
lglg
lglg100100
z = Anzahl der C-Atome des vorher eluierenden Alkans, tR’x = Nettoretentionszeit der Substanz, tR’z =
Nettoretentionszeit des vorher eluierenden Alkans, tR’z+1 = Nettoretentionszeit des nachher eluierenden Alkans
c) Reproduzierbarkeit von manuellen Injektionen: Varianz, Standardabweichung relative
Standardabweichung
Die häufigste Streuungsgröße in Verteilungen ist die Varianz var (x) bzw. (2
xs ) und die
Standardabweichung sx der Einzelwerte. Zur Berechnung der Varianz var werden die
Abweichungen jedes Wertes ix einer Datenreihe vom Mittelwert [( ix - x )] quadriert [( ix - x )]2
1
)2()1(
12
5,05,0
bb
ttTZ
RR
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und aufsummiert [ ( ix - x )2]. Jede „quadrierte Abweichung“ ist ein Maß für die Abweichung
des Messwertes vom Mittelwert. Die Summe der Abweichungsquadrate wird durch den
Freiheitsgrad f dividiert.
2
)var( f
)x - (xx i
Der Freiheitsgrad f ist in Datenreihen die Anzahl N der Daten, vermindert um 1. Vereinfacht
gibt der Freiheitsgrad f die Anzahl der Wiederholungsmessungen an. Beträgt die Gesamtzahl
der Messungen z.B. N = 5, wird eine Messung als „Grundmessung“ betrachtet, die anderen 4
Messungen dienen zur Wiederholung.
Die Varianz var gibt die Streuung der Messwerte um ihren Mittelwert x an. Dabei geht man
vom Quadrat der charakterisierten Größe aus. Um das Ergebnis auf die ursprüngliche Einheit
zurückzuführen, zieht man aus der Varianz die Quadratwurzel )( var x . Als Ergebnis erhält
man die Standardabweichung s(x) der Einzelmessung vom Mittelwert. Die
Standardabweichung kann also mit Hilfe der folgenden Gleichungen berechnet werden:
(x)var xs
1 - N
)x (x
2
i xs
Vorsicht ist beim Berechnen dieser Kennzahlen mit dem Taschenrechner bzw. mit
Tabellenkalkulationsprogrammen angebracht. Oftmals wird zur Berechnung der
Standardabweichung nicht die „Stichprobenstandardabweichung“ eingesetzt sondern die
Formel:
N
)x (x
2
i xs
Beim Vergleich von Datenreihen mit verschiedenen Größenordnungen ist die
Standardabweichung als Maß für die Präzision (Streuung) alleine noch nicht sehr
aussagekräftig. Daher wird die Standardabweichung auf den Mittelwert bezogen. Diese Größe
wird als Variationskoeffizient V oder „relative Standardabweichung“ (CV coefficient of
variation) bezeichnet (angegeben meistens in %).
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% 100 x
s V
Beim Ausreißertest nach Nalimov müssen mindestens drei Daten (N>2) vorliegen. Die
Kontrolle erfolgt auf den kleinsten und den größten Wert. Anschließend wird eine Prüfgröße
nach Nalimov berechnet und mit einem Tabellenwert verglichen.
Die Prüfgröße nach Nalimov berechnet sich nach
1 - N
N
s
x - x
x
*
PG
mit: *x = ausreißerverdächtiger Wert
x = Mittelwert
xs = Standardabweichung
N = Anzahl der Stichproben
Prüfgrößen zum Ausreißertest nach Nalimov (Ausschnitt):
Freiheitsgrad f Statistische Sicherheit
95 % 99% 99,9%
1 1,409 1,414 1,414
2 1,645 1,715 1,730
3 1,757 1,918 1,982
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d) Detektor: Linearität und Empfindlichkeit (Kalibration, Blindwert, NWG)
Beim Einsatz einer Analysenmethode ist es wichtig zu wissen, bis zu welcher unteren Grenze
die Methode verwertbare Werte liefert. Das kann zum einen derart geschehen, dass Proben
immer geringerer Konzentration gemessen werden, bis kein Signal mehr erkannt werden kann.
Abgeschätzt kann die Nachweisgrenze aus dem Vergleich des Messsignals des Analyten im
Vergleich zum Rauschen. Dabei muss dass Messsignal mindestens das Dreifache des
Rauschens betragen (95% Sicherheit zum Substanznachweis).
Der statistisch sichere Weg geht über die Kalibrierfunktion und den Prognosebereich. Es
existieren verschiedene Vorschläge zur Ermittlung von Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
(z.B. nach DIN 32 634 (Schnellschätzung) oder DFG). Allgemein gilt die Nachweisgrenze als
die geringste Analytmenge in einer Messprobe, die detektiert, aber nicht quantifiziert werden
kann. Die Nachweisgrenze xNG nach DIN 32 645 ist eine Entscheidungsgrenze. Die
Bestimmungsgrenze ist die geringste Analytmenge, die mit der geforderten Präzision und
Richtigkeit quantifiziert wird. Für die Ermittlung der Grenzwerte kann eine Blindprobe
(Leerprobe) notwendig sein. Sie ist eine Probe, die den Analyten nicht enthält, ansonsten aber
mit der Probe identisch ist. Mehrere unabhängig hergestellte Blindproben werden vermessen,
der Mittelwert ist als Blindwert anzusehen. Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung des
Blindwertes ist die Berechnung des Ordinatenabschnitts b in einer linearen Kalibrierfunktion
mit Hilfe der linearen Regression ("Kalibrationkurvenverfahren"). Der Ordinatenabschnitt b ist
die Größe des Signals y bei der Konzentration 0, was definitionsgemäß mit dem Blindwert
identisch ist.
Voraussetzung für die Anwendbarkeit des Kalibrationskurvenverfahrens:
Alle Kalibrationsproben müssen voneinander unabhängig sein, d.h. entweder aus unabhängigen Einwaagen oder zumindest aus unabhängigen Verdünnungen aus ein und derselben Stammlösung stammen,
die Kalibrierfunktion muss linear sein,
die Varianzen müssen im interessierenden Arbeitsbereich konstant sein,
die Konzentrationen der Kalibrierlösungen müssen genau bekannt sein und "richtig" sein,
der gewählte Arbeitsbereich schließt die Bestimmungsgrenze mit ein.
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Ermittlung der Nachweisgrenze aus Kalibrierkenndaten - Graphische Bestimmung der
Nachweisgrenze nach DIN 32645:
Mathematische Bestimmung der Nachweisgrenze Nach DIN 32645:
(t = 1,86, einseitige Fragestellung, f = N – 2, P = 95%)
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IV) Praktischer Teil: Alle zur Verfügung stehende Gaschromatographen sind mit Kapillarsäulen ausgestattet, die
als stationäre Phase Carbowax /DB-5 besitzen. Die Temperatur für den Injektor wird auf
275°C und die für den Detektor wird auf 325 °C gesetzt. Die weiteren Parameter sind der
folgenden Tabelle zu entnehmen:
GC Säulenparameter
Perkin Elmer
AutoSystem XL
Phase Länge Innendurchmesser Filmdicke
PE1 DB-WAX
(polar)
0,25 µm
PE2 DB-5
(unpolar)
0,25 µm
PE3 DB-WAX
(polar)
30 m 0,32 mm 0,25 µm
1.) Bestimmung der mittleren Strömungsgeschwindigkeit, der Totzeit und des
Splitverhältnisses
Mittlere Trägergasströmungsgeschwindigkeit/Splitverhältnis:
Als Trägergas wird Wasserstoff verwendet. Zunächst wird der Durchfluss des geöffneten Splits
(Gesamtfluss) mit einem Blasenzähler für kleine Volumina am Splitausgang bestimmt
(Wiederholung mind. 3x)
Aufgabe: Die mittlere Trägergasströmungsgeschwindigkeit soll bei 100 °C und
geöffnetem Split auf 40 cm sec-1 eingestellt sein: Berechnen Sie hierzu den
Trägergasfluss in mL min-1 aus der Säulendimensionierung für die angestrebte
Trägergasströmungsgeschwindigkeit.
Berechnen sie nun unter Berücksichtigung der berechneten
Trägergasströmungsgeschwindigkeit und des gemessenen Gesamtflusses das
aktuell bestehende Splitverhältnis.
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Anschließend wird das Splitverhältnis auf 10:1/20:1/50:1 gestellt und wiederum der Gasfluss
mit dem Blasenzähler (für große Volumina) bestimmt (Wiederholung 3x).
Überprüfen sie nun unter Berücksichtigung der berechneten
Trägergasströmungsgeschwindigkeit und des gemessenen Gesamtflusses das aktuell
bestehende Splitverhältnis von 10:1/20:1/ 50:1.
Totzeit:
Die Temperatur des Säulenofens wird auf 100 °C gesetzt. Ein 4 mL Probenfläschchen mit
Schraubverschluss wird mit Erdgas gefüllt und verschlossen. Mit Hilfe einer Injektionsspritze
werden bei geöffnetem Split ca. 10 µL Gas in den Split/Splitless-Injektor injiziert und
gleichzeitig die computergestützte Aufzeichnung gestartet. Die Ofentemperatur bleibt isotherm
bei 100 °C. Da diese Alkane bei 100 °C von der stationären Phase nicht retardiert werden, ist
die ermittelte Retentionszeit die Totzeit des chromatographischen Systems unter diesen
Bedingungen. Die Messung ist mindestens dreimal durchzuführen.
2.) Trennleistung: Trennzahl, theoretische Böden, Auflösung; Retentionsindex
Die ausgegebene Testmischung enthält jeweils 100 ng µL-1 folgender Substanzen:
2-Octanon, Tetradecan, 1-Octanol, Decansäuremethylester, Undecansäuremethyl-ester,
Naphthalen, 1-Decanol, Dodecansäuremethylester, 2,6-Dimethylanilin, 2,6-Dimethylphenol in
n-Hexan.
Zur Bestimmung der Trennleistung des vorliegenden GC-Systems (Auflösung, Bodenzahl,
Trennstufenhöhe, Trennzahl) wird 1 µL einer Testmischung bei geöffnetem Split zuerst
isotherm bei 150 °C und anschließend mit nachstehend aufgeführtem
Ofentemperaturprogramm injiziert. Zum Vergleich der Split-Injektion mit einer Splitless/Split-
Injektion wird die Testmischung nochmals bei geschlossenem Split injiziert und mit dem
Gradientenprogramm aufgetrennt.
Die erforderlichen Messdaten zu Berechnung der Trennleistung sind dem
Datenverarbeitungssystem zu entnehmen. Die Trennzahl wird aus den Elutionsdaten für
Decan- und Undecansäuremethylester bestimmt.
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Zur Berechnung der Kováts-Indices der im Säulentest vorhandenen Substanzen wird je 1µL
einer Alkanreihe (C10 bis C 25, c = 100 ng/µL bzw. C8-C20, c = 40 ng/µL) isotherm und mit
dem Gradientenprogramm injiziert.
Nach der Berechnung der einzelnen Parameter ist eine Diskussion/Interpretation der
erhaltenen Werte anzuschließen und das bevorzugte Programm für die beste Trennleistung
zu benennen.
Ofentemperaturprogramm:
Eine Anfangstemperatur von 60 °C wird für 3 min gehalten, anschließend wird mit einer Rate
von 6 °C min-1 auf 220 °C aufgeheizt und die Endtemperatur noch für 10 min gehalten.
Anschließend wird die Temperatur auf die Ausgangsbedingungen zurückgeführt.
3.) Reproduzierbarkeit von manuellen Einspritzungen: Varianz, Standardabweichung,
relative Standardabweichung
Möglichst genau 1µL der obigen Testmischung ist mindestens dreimal manuell zu injizieren.
Die Einspritzung erfolgt isotherm bei 150 °C und geöffneten Split. Es werden der Mittelwert mit
Varianz und Standardabweichung sowie der Median für alle Substanzen berechnet.
Die Peakflächenberechnungen werden dann erneut unter der Annahme, dass
Decansäuremethylester als Normierungsstandard zugesetzt wurde, berechnet (Mittelwert der
3 Areas des Normierungsstandards als Referenzwert zur Normierung). Danach sind erneut
die Mittelwerte mit Varianz und Standardabweichungen sowie der Median für alle Substanzen
zu berechnen. In beiden Messreihen ist für die Substanzen mit der größten relativen
Standardabweichung ein Ausreißertest nach Nalimov durchzuführen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in einer Diskussion/Interpretation zusammenzufassen.
4.) FID: Linearität und Empfindlichkeit (Kalibration, Blindwert, NWG)
Es wird je eine Stammlösung der Testsubstanzen 1-Octanol und des "Internen Standards"
Dodecansäuremethylester hergestellt. Von der 1-Octanol-Lösung sind folgende
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Verdünnungen herzustellen: 10 µg µL-1, 1 µg µL-1, sowie 100, 50, 10, 8, 6, 4, 2, 1 ng µL-1; diese
sind so mit Dodecansäuremethylester zu versetzen, so dass dessen Konzentration in jeder
Kalibrierlösung 200 ng µL-1 beträgt. Beginnend mit der geringsten Konzentration sind jeweils
1 µL dieser Lösungen bei geöffnetem Split einzuspritzen. Die Ofentemperatur bleibt isotherm
bei 150 °C. Für 1-Octanol wird nach Korrektur der Peakflächen eine Kalibrationsgerade
gezeichnet und die zugehörige Kalibrierfunktion mit Hilfe der linearen Regression berechnet.
Mit Hilfe der Kalibrationsgeraden ist der Blindwert abzuschätzen. Eine statistische Auswertung
der Kalibriergerade ermöglicht die mathematische Bestimmung der Nachweisgrenze (erfolgt
im Rahmen des Praktikums mit dem Programm Valoo®).
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Literatur Cammann K (2001) Instrumentelle analytische Chemie : Verfahren, Anwendungen und
Qualitätssicherung. Spektrum Akad. Verl., Heidelberg u.a. Gey MH (2008) Instrumentelle Analytik und Bioanalytik : Biosubstanzen, Trennmethoden,
Strukturanalytik, Applikationen, Ed 2. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg Kolb B (2006) Gaschromatographie in Bildern : eine Einführung, Ed 2. Wiley-VCH, Weinheim Lohninger H (2003) Teach/Me - instrumentelle Analytik. In Springer-electronic-Media, Ed
Elektronische Ressource. Springer, Berlin u.a., pp 1 CD-ROM Lottspeich F, Engels JW (2006) Bioanalytik. Elsevier (Spektrum Akademischer Verlag), Heidelberg Rücker G, Neugebauer M, Willems GG (2008) Instrumentelle Analytik für Pharmazeuten.
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart Schwedt G, Schreiber J (2007) Taschenatlas der Analytik, Ed 3., überarb. und erw. Aufl. WILEY-
VCH, Weinheim Schwedt G (1995) Analytische Chemie: Grundlagen, Methoden und Praxis. Thieme, Stuttgart u.a. Skoog DA, Leary JJ (1996) Instrumentelle Analytik. Springer, Berlin, Heidelberg
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Allgemeine Angaben zu Versuchsprotokollen – Institut für
Lebensmittelchemie
Prinzip In 2-3 Sätzen darstellen, worum es bei dem Versuch geht und was das Versuchsziel ist
Durchführung Die Durchführung des Versuches ist bereits im Skript angegeben. Stellen Sie hier nur
wesentliche Abweichungen dar. Die Abweichungen sollten nachvollziehbar sein und
begründet werden.
Rohdaten Hier sind sämtlich experimentellen Daten wie Einwaagen, Verbrauch an Maßlösung,
Verdünnungen, Chromatogramme, Spektren etc. anzugeben bzw. darauf zu verweisen
(Chromatogramme können auch in einen Anhang gegeben werden)
Auswertung und Berechnung Hier muss schlüssig aus den Rohdaten das Ergebnis abgeleitet werden (ggf. mit
Strukturformeln und Reaktionsgleichungen). Insbesondere sind sämtliche Berechnungen, die
zum Ergebnis geführt haben, nachvollziehbar darzustellen!
Ergebnis/Schlussfolgerung/Diskussion Was ist das Versuchsergebnis und wie ist diese zu Bewerten? Fallen beim Vergleich mit
literaturbekannten Werten Unterschiede auf? Wie kommen die Unterschiede zustande?
Literatur Angabe der verwendeten Literatur. Bitte verwenden Sie vertrauenswürdige Quellen;
ausschließliches ‚googlen‘, bzw. kopieren von ‚Wikipiedia‘ Artikeln wird nicht akzeptiert!
Verwenden Sie die im Praktikumsskript angegebene Literatur, bzw. Literatur aus der TIB!
Anhang Hier kommen evtl. Chrmoatogramme, Spektren o. ä. rein
Anmerkung Quellen müssen korrekt zitiert werden! Achten Sie beim Protokoll auf eine kurze und
prägnante Darstellung von Sachverhalten (keine ‚Ich‘-form, keine seitenlangen
Diskussionen)