Pravidla bezpe čnosti a ochrany zdraví p ři práci

1. Do laboratoře mají přístup pouze studenti, kteří jsou rozvrhem hodin vypsáni na příslušná praktika. Jakékoliv návštěvy jsou zakázány.

2. Studenti jsou povinni před nástupem do praktik teoreticky ovládat úlohy, které budou prakticky provádět. Přinesou si laboratorní plášť a pracovní návod. Praktikování bez pláště je nepřípustné. Vlasy musí být upraveny tak, aby nemohlo dojít k úrazu při práci s kahanem. Svrchní oděvy, tašky, batohy a ostatní zavazadla studenti odloží na místě k tomu určeném.

3. Veškeré odchody z praktik jsou povoleny pouze s výslovným svolením asistenta vedoucího praktika. 4. V laboratoři je povoleno provádět pouze ty práce, které jsou náplní praktického cvičení. V laboratoři je

zakázáno jíst, pít a kouřit, dále přechovávat potraviny a používat laboratorní nádobí a zařízení k jiným účelům, než jsou určeny.

5. Pro práce, při nichž může dojít k úniku škodlivých chemických látek do ovzduší, se musí zabezpečit odsávání. Práce s látkami dýmavými, dráždivými, zapáchajícími, jedovatými plyny a parami, stejně jako žíhání a spalování je dovoleno provádět jen v digestořích.

6. Při nasazování balónku na skleněnou pipetu je nutné dbát zvýšené opatrnosti. Střepy a jiné odpadky s ostrými hranami musí být odkládány do zvláštní nádoby s označením „SKLO“.

7. Do výlevek lze vylévat jen rozpouštědla s vodou dokonale mísitelná, dostatečně zředěná (nejméně 1:10), v množství nejvýše 0,5 litru a vodné roztoky kyselin a zásad zředěné nejméně 1:30. S vodou nemísitelná rozpouštědla, jedy, kyseliny a louhy nad uvedenou koncentraci a látky, které uvolňují jedovaté a dráždivé plyny, do výlevek vylévat nelze. Tyto látky se likvidují do zvláštní odpadní nádoby.

8. Při ředění se kyseliny zásadně vlévají do vody, nikoliv naopak. 9. Je zakázáno nasávat roztoky do pipet ústy. Musí být použito příslušných pomůcek (balónek). 10. Rozlité kyseliny je nutno ihned spláchnout vodou, případně neutralizovat práškovou sodou. Rozlité

zásady stačí jen důkladně spláchnout vodou. 11. Při rozlití hořlavých kapalin se musí okamžitě zhasnout všechny kahany, vypnout elektrický proud a

zajistit účinné větrání. Rozlitá kapalina se nechá vsáknout do vhodného porézního materiálu, který se odklidí na bezpečné místo.

12. Při zahřívání kapalin v baňkách se musí zabránit utajenému varu alespoň tak, že se do baňky vloží varný kamínek.

13. Před zahájením práce je nutno zkontrolovat stav všech přístrojů a zařízení, případné závady a nedostatky nahlásit asistentovi nebo laborantce.

14. Posluchačům je zásadně zakázána jakákoliv svévolná manipulace s elektrickou instalací, s přístrojovým vybavením a materiálem. Zapnutí přístroje a zapálení plynových kahanů se děje až po souhlasu asistenta nebo laborantky.

15. Obsluha laboratorní centrifugy musí být prováděna jen v přítomnosti asistenta nebo laborantky. Centrifugační nádobky musí být dokonale vyváženy, víko centrifugy při chodu bezpečně uzavřeno.

16. Při úniku plynných paliv (zemní plyn) musí být uzavřen přívod plynu, vypnut elektrický proud a účinně větráno.

17. Zapálené kahany nelze nechat hořet bez dozoru. Prošlehne-li plamen dovnitř, musí se okamžitě uzavřít přívod plynu a kahan seřídit.

18. Jakékoliv nehody, úrazy, požití chemikálií apod. je nutno ihned nahlásit vedoucímu asistentovi. 19. Hrubé porušení uvedených pravidel, vyplývající z nekázně či neznalosti, má za následek vykázání

posluchače z praktických cvičení se sankcí neomluvené absence. 20. Studenti musí být seznámeni s klasifikací látek toxických, kancerogenních, mutagenních a toxických pro

reprodukci. Bezpečnostní listy jednotlivých látek jsou k dispozici v praktikárnách. 21. Studenti musí být seznámeni s pravidly bezpečnosti práce s látkami vysoce toxickými (označeny T+)

používanými ve studentské laboratoři (např. rtuť, kyanid draselný, ethidium bromid, dusičnan rtuťnatý). V Plzni dne 16. září 2016 Ing. Václav Babuška, Ph.D. zástupce vedoucího ústavu

1

Nácvik pipetování 1) Pipetování destilované vody s kontrolou vážením a) Pipetování větších objemů, pipety s fixním objemem

Na misku vah položte prázdnou malou kádinku, do níž budete pipetovat destilovanou vodu, a stiskněte tlačítko pro tárování (vynulování hmotnosti na vahách položené nádobky, v níž vážíme). Kádinku přeneste z misky vah na pracovní stůl a postupně do ní napipetujte destilovanou vodu v následujících objemech:

3 x 2000 µl 2 x 500 µl

Pro pipetování 2 ml (=2000 µl) použijete pipetu s fixním objemem a příslušnou špičku (velká bílá). Je třeba překontrolovat, že spojení špičky s pipetou těsní. Pipety, které budete používat, se nasazováním a sundáváním špičky snadno v místě připojení špičky povolí, pak netěsní a pipetovaná kapalina ze špičky vytéká! Podobně budete pipetovat 0,5 ml (=500 µl), pipetou s fixním objemem a příslušnou špičku (modrá).

Po dokončení pipetování kádinku položte na misku vah a odečtěte hmotnost napipetované destilované vody. Srovnejte skutečný navážený výsledek s očekávanou hodnotou vypočítanou součtem pipetovaných objemů a přepočtem objemu na hmotnost přes hustotu. Uvažujte hustotu destilované vody při teplotě v laboratoři rovnu ρ=1,000 g/cm3.

Očekávaný objem Očekávaná hmotnost Skutečný výsledek

b) Pipetování menších objemů, pipety s nastavitelným objemem

Na misku vah položte prázdnou malou plastovou zkumavku, tzv. eppendorfku, do níž budete pipetovat destilovanou vodu, a stiskněte tlačítko pro tárování.

Otevřenou eppendorfku si vezměte do ruky a postupně do ní napipetujte destilovanou vodu v následujících objemech:

375 µl 25 µl

Pro pipetování 375 µl použijete pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu 100-1000 µl a příslušnou špičku (modrá). Pro pipetování 25 µl použijete pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu 20-200 µl a příslušnou špičku (žlutá).

Po dokončení pipetování eppendorfku uzavřete a položte na misku vah. Odečtěte hmotnost napipetované destilované vody. Srovnejte skutečný navážený výsledek s očekávanou hodnotou vypočítanou součtem pipetovaných objemů a přepočtem objemu na hmotnost přes hustotu. Uvažujte hustotu destilované vody při teplotě v laboratoři rovnu ρ=1,000 g/cm3.

Očekávaný objem Očekávaná hmotnost Skutečný výsledek

2

2) Zjištění hustoty roztoku Na misku vah položte prázdnou eppendorfku a stiskněte tlačítko pro tárování. Do eppendorfky napipetujte přesně 1 ml (=1000 µl) roztoku, jehož hustotu máte za úkol zjistit.

Pro pipetování 1000 µl použijte pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu 100-1000 µl a příslušnou špičku (modrá).

Eppendorfku uzavřete, položte na misku vah a odečtěte hmotnost napipetovaného roztoku. Ze známého objemu a hmotnosti spočítejte hustotu.

Objem Hmotnost Hustota

3) Příprava roztoku a jeho přesné rozpipetování do více zkumavek

Do eppendorfky napipetujte: 93 µl destilované vody 7 µl barevného roztoku Pro pipetování 93 µl použijte pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu 20-200 µl a příslušnou špičku (žlutá). Pro pipetování 7 µl použijte pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu 0,5-10 µl a příslušnou špičku (malá bílá). Přidáváte velmi malý objem. Ústí špičky je třeba ponořit pod hladinu roztoku, který už je v eppendorfce. Během přidávání těchto 7 µl výsledný roztok i promícháte. Čtěte níže!

Obsah eppendorfky promíchejte. Pro tento účel nejlépe poslouží tzv. propipetování, tj. opakované "nasávání a vypouštění" do špičky pipety, pohyb roztoku ve špičce "nahoru dolů". V našem případě je roztok barevný, měli byste přímo vidět, zda už je dostatečně promíchaný. Dejte pozor, aby špička po jejím vytáhnutí zpod hladiny na konci propipetovávání byla prázdná! Do stojánku si připravte 5 mikrozkumavek a do každé napipetujte přesně 20 µl připraveného roztoku.

5 x 20 µl 100 µl Zhodnoťte, jak přesně jste pipetovali.

1

Spektrofotometrické stanovení koncentrace měďnatých iontů

Hydratované ionty [Cu(H2O)4]2+ jsou modré, ale pro fotometrické stanovení je toto zbarvení málo

intenzivní a musí být zvýrazněno vhodným činidlem. Tím může být roztok amoniaku, který dává sytě modrý tetraamminměďnatý komplex.

[Cu(H2O)4]2+ + 4 NH3 → [Cu(NH3)4]

2+ + 4 H2O

Stanovení koncentrace provedete pomocí kalibrační křivky. Ředěním roztoku o známé koncentraci vytvoříte několik kalibračních roztoků a proměříte jejich absorbance při optimální vlnové délce (maximum absorpčního spektra). Funkci A = f(c) vynesete do grafu, čímž současně prověříte platnost Lambertova-Beerova zákona. Grafickým vyjádřením musí být přímka procházející počátkem. Z křivky odečtete koncentrace zkoumaných vzorků.

Provedení:

• Do stojánku si připravte suché zkumavky a označte čísly: 1 až 10 kalibrační roztoky 0 porovnávací roztok („BLANK“) vz 1, vz 2, vz 3, vz 4 vzorky

• Podle tabulky si připravte kalibrační roztoky ředěním základního roztoku vodou. Základní roztok obsahuje 25 mmol Cu2+/l. Na přesném pipetování velmi záleží.

Číslo roztoku Základní roztok H2O c(Cu2+)

- ml ml mmol/l

0 - 5,0

1 0,5 4,5

2 1,0 4,0

3 1,5 3,5

4 2,0 3,0

5 2,5 2,5

6 3,0 2,0

7 3,5 1,5

8 4,0 1,0

9 4,5 0,5

10 5,0 -

• Nyní přidejte ke všem kalibračním roztokům i porovnávacímu roztoku 5 ml roztoku amoniaku. Použijte automatický dávkovač.

• Současně si připravte také roztoky vzorků (5 ml předloženého vzorku smíchejte s 5 ml amoniaku).

• Všechny roztoky promíchejte opakovaným převracením zkumavek. Nechte 10 minut stát. • Vyhledejte optimální vlnovou délku. Měření proveďte na spektrofotometru proti

porovnávacímu roztoku. Z kalibračního roztoku číslo 5 odlijte potřebné množství do jedné kyvety a druhou naplňte destilovanou vodou. Vložte do spektrofotometru a zjistěte absorbance pro vlnové délky 400, 450, 500, 550, 600, 650 a 700 nm. Maximum

2

absorbance ukazuje na optimální vlnovou délku, při níž provedete měření ostatních kalibračních roztoků a vzorků.

Optimální vlnová délka použitého záření (pro kalibrační roztok č. 5):

vlnová délka [nm] 400 450 500 550 600 650 700

absorbance • Absorbance zadejte do příslušné tabulky v počítači. Soubor označen Cu ionty. Vypočítejte

koncentraci kalibračních roztoků a zapište do tabulky v počítači.

Číslo roztoku koncentrace absorbance - mmol/l -

0 0.0 0.000

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

• Poté dostanete kalibrační křivku. Všechny body by měly ležet na přímce. Odchylky

mohou být způsobeny chybami a nepřesností při přípravě roztoků, neboť podmínky platnosti Lambertova-Beerova zákona nebyly porušeny.

• Z kalibrační křivky odečtěte koncentrace předložených vzorků.

vzorek absorbance koncentrace

č. - mmol/l

1

2

3

4 • Kalibrační křivku a výsledky přiložte k protokolu. Použité roztoky a činidla: 1. Základní roztok Cu2+(c = 25 mmol/l): 6,25 g CuSO4 . 5 H2O rozpustit ve vodě na 1 l roztoku 2. Amoniak (c = 3 mol/l) 3. Destilovaná voda

3

Identifikace acidobazického indikátoru

pomocí absorpčního spektra

Absorpční spektrum je závislost absorbance na vlnové délce (nebo vlnočtu) světelného záření. Obvykle je

to křivka s jedním nebo několika maximy, jejichž poloha je charakteristická pro každou látku. Absorpční spektra slouží k identifikaci látek nebo ke kontrole jejich čistoty. Často se pracuje v ultrafialové nebo v infračervené oblasti, v níž zejména organické sloučeniny dávají velmi bohatá spektra s charakteristickými maximy, která odpovídají jednotlivým vazbám a funkčním skupinám. Spektra se využívají v různých oborech. Např. v organické chemii při studiu struktury složitých molekul, v analytické chemii při studiu stechiometrie komplexů, ve farmacii při kontrole léků a drog, v soudním lékařství k průkazu karbonylhemoglobinu a v mnoha dalších teoretických i aplikovaných oborech. Provedení:

Acidobazické indikátory jsou organická barviva různého složení, která mění svou strukturu (a tím i zbarvení) v závislosti na pH prostředí. Obě formy mají ve viditelné oblasti spektra charakteristické maximum, které může posloužit k identifikaci indikátoru.

• Na pracovním stole máte roztoky acidobazického indikátoru ve vodě (pH = 7). Pomocí roztoku kyseliny sírové převeďte indikátor do kyselé formy. Ve zkumavce označené K smíchejte 1 ml vzorku a 1 ml roztoku H2SO4 (c = 0,05 mol/l). Pomocí tetraboritanu sodného převeďte indikátor do formy zásadité. Ve zkumavce Z smíchejte 1 ml vzorku a 1 ml roztoku Na2B4O7 (c = 0,05 mol/l).

• Měření spektra proveďte na spektrofotometru, jako porovnávací roztok použijte destilovanou vodu. Změřte absorbance v rozsahu vlnových délek 400 až 700 nm. Hodnoty plynule zvyšujte po 10 nm.

vlnová délka

A (kys. prostř.) A (zás.prostř.)

vlnová délka

A (kys. prostř.) A (zás.prostř.)

nm - - nm - -

400 560

410 570 420 580

430 590

440 600

450 610

460 620

470 630

480 640

490 650

500 660

510 670

520 680

530 690

540 700

550

4

• Naměřené hodnoty zadejte do tabulky v počítači. Soubor označen AB indikátor. Získáte absorpční spektrum indikátoru, v němž odečtěte polohu maxima (v nm). V atlasu spekter vyhledejte indikátor, jehož maxima se pro obě formy nacházejí při stejných vlnových délkách jako u vašeho vzorku.

• K protokolu přiložte graf a uveďte název indikátoru. Použité roztoky a činidla: 1. Kyselina sírová (c = 0,05 mol/l), pH = 1 2. Tetraboritan sodný (c = 0,05 mol/l), pH = 9,2 3. Roztoky acidobazických indikátorů ve vodě

5

Polarimetrie

Látky, které se nazývají opticky aktivní , mají schopnost otáčet rovinu polarizovaného světla. Jsou to

většinou organické sloučeniny, které mají ve své molekule asymetrický uhlík, ale patří sem i řada anorganických látek s asymetrickou molekulou a rovněž všechny krystaly s výjimkou krychlové soustavy. V dalších úvahách se budeme zabývat pouze roztoky.

Podle smyslu otáčení se rozdělují opticky aktivní látky na pravotočivé (+) a levotočivé (-). Úhel otočení souvisí se strukturou látky a je závislý na její koncentraci. Konstanta charakterizující každou opticky aktivní látku se nazývá měrná otáčivost. Je to úhel otočení roviny polarizovaného světla při jednotkové tloušťce vrstvy roztoku (1 dm) a při jednotkové koncentraci (1 g/ml). Pro přesná měření je nutný monochromatický zdroj světla, nejčastěji se používá sodíková výbojka (dublet D). Otáčivost je závislá i na teplotě, běžně se uvádí pro 20oC. Hodnoty měrných otáčivostí [α]D

20 se uvádějí v tabulkách. Měření optické otáčivosti se provádí na polarimetrech. Při jejich konstrukci se využívá dvojlomu

islandského vápence vhodně zabroušeného do tzv. nikolu. Na něm dochází k rozštěpení záření na paprsek řádný a mimořádný a současně se oba paprsky polarizují. Řádný paprsek je pohlcen černým obalem nikolu, k měření se využívá pouze paprsek mimořádný. První nikol je pevný a nazývá se polarizátor. Druhý nikol (analyzátor) je otočný a dopadá na něj záření prošlé kyvetou s opticky aktivní látkou. Jeho otáčením se kompenzuje optická aktivita zkoumané látky. Ze zjištěného úhlu otočení roviny polarizovaného světla je možno vypočítat látkovou koncentraci opticky aktivní látky v roztoku.

[ ] [ ]mol/l1000Mlα

αc

20D

⋅⋅⋅

= ,

kde je α ... nalezený úhel otočení (ve stupních)

[α]D20 ... měrná otáčivost

l ... délka kyvety (v dm) M ... molární hmotnost (v g/mol)

Práce s polarimetrem Zapněte sodíkovou výbojku a nechte ji alespoň 5 minut zářit, aby se ustálil světelný tok.

Plnění kyvety. Kyveta používaná v polarimetrii má tvar na obou koncích uzavíratelné trubice. Pod každým uzávěrem je těsnící kroužek a kruhové sklíčko, které by mělo být čisté a suché. Trubici na jedné straně otevřete, opatrně sejměte sklíčko a naplňte destilovanou vodou ze střičky nebo vzorkem tak, aby se nad horním okrajem vytvořil meniskus, který „seříznete“ suchým sklíčkem. Pak trubici uzavřete a přesvědčte se jejím přetočením, zda se uvnitř nevytvořily vzduchové bubliny. Pokud se objeví, musíte plnění zopakovat a bubliny odstranit. Trubici otřete a suchou vložte do tubusu polarimetru.

Vlastní měření

6

Mírným pootočením nastavovacího kotouče po směru nebo proti směru hodinových ručiček nalezněte jednolité pole bez náznaku pruhů (viz obrázek).

Zorné pole polarimetru

Pokud jste v kyvetě měli destilovanou vodu, tato pozice odpovídá nulové hodnotě úhlu na noniové stupnici. Pokud je hodnota odlišná, kyveta nebyla dostatečně čistá. V tomto případě kyvetu znovu vypláchněte a postup zopakujte. V případě vzorku odečtěte hodnotu úhlu otočení (viz obrázek). Nejdříve se odečítají celé stupně na vnější stupnici, na vnitřní stupnici potom desetiny. Odečítání na stupnici usnadňuje zabudovaná lupa.

Pohled na stupnici polarimetru. V prvním případě znázorněném na obrázku je na stupnici nastavena nulová hodnota, ve druhém případě je výsledná hodnota 1,20o.

Vnější stupnice je rozdělena na jednotlivé stupně. Celá stupnice má 180°. Proti této stupnici leží vnitřní stupnice nonia, která má 20 dílků.

Nejprve nalezněte, mezi které hodnoty na vnější stupnici ukazuje nula vnitřní stupnice nonia. Nižší hodnota je hodnota celých úhlových stupňů. Desetinné hodnoty odečtěte na vnitřní stupnici tak, že naleznete dílek nonia, který se nejlépe kryje s dílkem na vnější stupnici. Tento dílek pak určuje hodnotu desetinných míst, hodnota je 0,05° na jeden dílek.

7

Stanovení koncentrace glukózy polarimetricky

Cukry (monosacharidy, disacharidy a oligosacharidy) mají ve své molekule alespoň jeden asymetrický uhlík, tím ztrácí symetrii a otáčí rovinu polarizovaného světla. Toho se využívá ke stanovení koncentrace.

Polarimetrického stanovení koncentrace cukrů se nejvíce využívá v potravinářské chemii.

Uveďte vzorce a názvy obou α enantiomerů glukózy Který z nich je lidské tělo schopné zpracovat?

Provedení:

• Na pracovním stole máte připraven roztok D-glukózy.

• Změřte optickou otáčivost α ve dvou různě dlouhých kyvetách – 1dm a 2dm

• Vypočítejte koncentraci přítomné glukózy (v mmol/l). Při obsluze polarimetru dbejte na správný směr otáčení šroubem analyzátoru, D-glukóza je pravotočivá, směr otáčení šroubu analyzátoru je ve směru pohybu hodinových ručiček.

M(glukóza) = 180,2 g/mol �α���� = +52,5

Délka kyvety: Nalezený úhel otočení α 1 dm 2 dm

8

Výpočet koncentrace glukózy: Závěr:

9

Rozlišení vzorků cukrů

D-fruktóza vzniká jako štěpný produkt sacharózy a protože stáčí rovinu polarizovaného světla doleva, (byla dříve nazývána levulóza), na rozdíl od D-glukózy, která stáčí rovinu polarizovaného světla doprava. Uveďte strukturní vzorec D-fruktózy: Uveďte strukturní vzorec D-glukózy:

Provedení:

• Na pracovním stole máte připraveny 2 vzorky roztoků o koncentraci 0,3 mol/l, jedná se o fruktózu a glukózu.

• Změřte optickou otáčivost α v kyvetě o délce 2 dm.

• Rozlište jednotlivé cukry. Při obsluze polarimetru dbejte na správný směr otáčení šroubem analyzátoru, glukóza je pravotočivá, směr otáčení šroubu analyzátoru je ve směru pohybu hodinových ručiček, fruktóza je levotočivá, směr otáčení šroubu analyzátoru je proti směru hodinových ručiček!

Hodnoty úhlu otočení se budou pohybovat v rozmezí +10° a -10°. M(fruktóza) = 180,2 g/mol �α�

��� = -93,7 M(glukóza) = 180,2 g/mol �α�

��� = +52,5

Vzorek: Nalezený úhel otočení α Druh cukru Vzorek č. Vzorek č.

Závěr:

1

Potenciometrické měření pH

K určení pH lze použít více jednoduchých metod (indikátorové papírky, kolorimetrické metody), avšak pro exaktní práci je přesnost těchto stanovení nedostatečná. Proto jsou laboratoře vybaveny pH-metry, jimiž lze dosáhnout běžně přesnosti ± 0,01 pH, u dražších přístrojů i vyšší.

Na pracovním stole máte připravený pH-metr s kombinovanou elektrodou.

• Do čisté kádinky přelijte vzorek, ponořte elektrody a na pH-metru odečtěte hodnotu pH. Mezi měřeními jednotlivých vzorků musíte elektrody vždy opláchnout destilovanou vodou. Pro měření jednotlivých vzorků použijte vždy čistou kádinku. Vzorky vracejte vždy zpět do zásobní lahvičky.

• Po změření všech vzorků elektrody důkladně opláchněte destilovanou vodou, otřete a vložte zpět do ochranného krytu s uchovávacím roztokem.

Vzorek číslo Hodnota pH zjištěná

pomocí indikátorového papírku

Hodnota pH zjištěná pomocí pH-metru

2

Demonstrace funkce pufrů Pufry jsou roztoky, které si zachovávají pH i při působení různých vnějších vlivů (přidávání malých množství kyselin nebo zásad). Na pracovním stole máte dvě skleněné lahve s modrým víčkem. V jedné je deionizovaná (ultračistá) voda, ve druhé je fosfátový pufr o pH blízkém 7.

Voda Pomocí odměrného válce odměřte 50 ml deionizované vody, přelijte do čisté kádinky a změřte pH pomocí pH metru. Hodnotu zaznamenejte. Vodu z kádinky vylijte. Stejným odměrným válcem odměřte dalších 50 ml deionizované vody, přelijte do stejné kádinky a znovu změřte pH. Elektrody po druhém měření nechte ponořené v kádince a do kádinky připipetujte 100 µl roztoku kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,1 mol/l. Obsah kádinky opatrně zamíchejte. Chvíli počkejte a zapište, na jakou hodnotu se změnilo pH.

pH deionizované vody pH o přidání HCl

měření 1 měření 2

Vyjádřete se k pH deionizované vody a ke změně v pH způsobené přidáním malého množství HCl:

Pufr Pomocí odměrného válce odměřte 50 ml fosfátového pufru, přelijte do čisté kádinky a změřte pH pomocí pH metru. Hodnotu zaznamenejte. Pufr z kádinky vylijte. Stejným odměrným válcem odměřte dalších 50 ml pufru, přelijte do stejné kádinky a znovu změřte pH. Elektrody po druhém měření nechte ponořené v kádince a do kádinky připipetujte 100 µl roztoku kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,1 mol/l. Obsah kádinky opatrně zamíchejte. Chvíli počkejte a zapište hodnotu, na kterou se změnilo pH.

pH pufru pH o přidání HCl

měření 1 měření 2

3

Vyjádřete se ke stálosti pH pufru a ke změně v pH způsobené přidáním malého množství HCl:

Závěr:

4

Stanovení koncentrace vzorků kyselin potenciometrickou titrací

Pro neutralizační titrace je možno použít elektrody vhodné pro měření pH, např. kombinaci elektrody skleněné a kalomelové. Obecně není třeba pH-metr při potenciometrické titraci kalibrovat, neboť pro určení ekvivalentního bodu je rozhodující změna potenciálu.

Načrtněte titrační křivku silné kyseliny: Načrtněte titrační křivku slabé kyseliny:

Úkoly 1) Určete graficky koncentraci vzorku silné kyseliny. 2) Určete výpočtem koncentraci vzorku slabé kyseliny. 3) Určete izoelektrický bod aminokyseliny.

1. Určení koncentrace vzorku silné kyseliny graficky:

Potenciometrická titrace:

• Odpipetujte do kádinky přesně 10,0 ml předloženého vzorku silné kyseliny, vložte míchací tělísko a kádinku postavte na elektromagnetickou míchačku.

• Byretu naplňte titračním roztokem NaOH a umístěte ji tak, aby bylo možno přidávat titrační roztok do kádinky se vzorkem.

• Elektrodu vložte do kádinky se vzorkem tak, aby byla měrná plocha zcela ponořena v roztoku. Bude-li to nutné, zvyšte hladinu přidáním destilované vody. Elektroda se nesmí dotýkat dna ani stěn nádobky.

• Zapněte míchání a seřiďte rychlost. Tělísko se musí volně otáčet, nesmí narážet do elektrody ani stěn kádinky.

• Na stupnici odečtěte výchozí hodnotu pH a zahajte titraci. Přidávejte titrační roztok po 0,5 ml a titraci ukončete, až bude docházet po přidání titračního činidla k minimálním změnám pH (spotřeba titračního roztoku 10 ml). Důležité je, abyste zachytili celý průběh titrační křivky a neukončili titraci předčasně. Spotřeby zapisujte do přiložené tabulky.

5

spotřeba ml

pH silné kyseliny

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0

• Po získání potřebných hodnot vypněte míchání, vyjměte elektrodu, pečlivě ji opláchněte a osušte.

Vyhodnocení

• Naměřené hodnoty zadejte do tabulky v počítači. Soubor označen Titrace. Titrační křivku vzorku vytiskněte.

• Metodou podle Kohna a Zítka nebo grafickou metodou určete bod ekvivalence. Odečtěte přibližnou spotřebu titračního činidla a hodnotu pH.

Metoda podle Kohna a Zítka: Titrační křivkou se vede přímka tak, aby ji protla ve třech bodech. Snažíme se, aby vymezené plochy nad i pod přímkou byly stejné.

6

Grafická metoda: Vedou se dvě rovnoběžky, které se dotýkají titrační křivky v její nejzakřivenější části, tj. prakticky prodlužují počáteční a závěrečnou část křivky. Vzdálenost mezi rovnoběžkami se rozpůlí a průsečík půlící rovnoběžky s titrační křivkou udává polohu inflexního bodu. Jeho průmět na osu x (stejně jako v předchozí metodě) udává spotřebu titračního činidla v bodě ekvivalence.

• Pro výpočet látkové a hmotnostní koncentrace vzorku použijte známé vztahy:

cv . Vv = ct . Vt . f µv = cv . Mv

Vzorec a název stanovované silné kyseliny: Napište reakci silné kyseliny s titračním činidlem: Výpočet koncentrace silné kyseliny:

7

2. Určení koncentrace vzorku slabé kyseliny výpočtem:

• Postup uvedený pod bodem Potenciometrická titrace zopakujte se vzorkem slabé kyseliny. Naměřené hodnoty zapište do následující tabulky.

spotřeba ml

pH slabé kyseliny

∆pH ∆2pH

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

8

Vyhodnocení

• Přesnou hodnotu spotřeby, kterou použijete pro výpočet koncentrace vzorku, určíte početně.

• Naměřené hodnoty zadejte do tabulky v počítači. Soubor označen Titrace. Titrační křivku vzorku vytiskněte.

• Do tabulky doplňte vypočítané rozdíly po sobě jdoucích hodnot pH (tzv. první diference, ∆pH) a pak rozdíl těchto diferencí (tzv. druhá diference, ∆2pH ). Spotřeba v ekvivalentním bodě se vypočítá ze vztahu:

∆VpH∆pH∆

pH∆VV

22

2

t ⋅+

+= −+

++ ,

kde Vt je hledaná spotřeba

V+ je objem titračního roztoku odpovídající poslední kladné druhé diferenci

∆2pH+ je poslední kladná druhá diference

∆2pH- je první záporná druhá diference

∆V je rozdíl objemů TR, mezi nimiž se provádí interpolace (tj. rozdíl objemů mezi poslední kladnou a první zápornou druhou diferencí)

• Pro výpočet látkové a hmotnostní koncentrace vzorku použijte známé vztahy:

cv . Vv = ct . Vt . f µv = cv . Mv

Vzorec a název stanovované slabé kyseliny:

Napište reakci slabé kyseliny s titračním činidlem: Výpočet koncentrace slabé kyseliny:

9

3. Určení izoelektrického bodu aminokyseliny:

Aminokyseliny obsahují přinejmenším dvě disociovatelné skupiny, karboxylovou COOH (kyselý charakter) a aminovou NH2 (zásaditý charakter). U aminokyselin dochází ke vnitřní interakci mezi těmito skupinami za vzniku obojetného iontu (amfiontu). Tato interakce se projevuje při hodnotě pH (specifické pro každou aminokyselinu) označované jako izoelektrický bod pI. Molekula se v tomto stavu chová navenek elektricky neutrálně. Jelikož mají aminokyseliny iontovou strukturu, vykazují vlastnosti iontových sloučenin - jsou tuhé, bezbarvé, rozpustné ve vodě, mají vyšší bod tání (resp. rozkladu) a jejich částice se pohybují ve stejnosměrném elektrickém poli (tento děj se nazývá iontoforesa). Isoelektrické pH u aminokyselin, které mají dvě disociovatelné skupiny, leží uprostřed hodnot pK na obou stranách izoiontového uspořádání:

Co je izoelektrický bod? Kolik disociovatelných skupin má aminokyselina lysin? Napište vzorec glycinu zobrazující ionizaci v izoelektrickém bodě:

10

• Postup uvedený pod bodem Potenciometrická titrace zopakujte se vzorkem aminokyseliny. Titrujte do spotřeby titračního činidla 20 ml. Naměřené hodnoty zapište do tabulky v počítači. Soubor označen Aminokyselina. Titrační křivku vzorku vytiskněte.

• Metodou podle Kohna a Zítka nebo grafickou metodou určete bod ekvivalence. Odečtěte hodnotu pH, která odpovídá izoelektrickému bodu (IEB) dané aminokyseliny.

• Do protokolu uveďte všechny naměřené údaje seřazené v přehledné tabulce, graf titrační křivky s ekvivalentním bodem a odpovídající hodnotou pH v IEB.

spotřeba ml

pH -

spotřeba ml

pH -

0,0 - - 0,5 10,5 1,0 11,0 1,5 11,5 2,0 12,0 2,5 12,5 3,0 13,0 3,5 13,5 4,0 14,0 4,5 14,5 5,0 15,0 5,5 15,5 6,0 16,0 6,5 16,5 7,0 17,0 7,5 17,5 8,0 18,0 8,5 18,5 9,0 19,0 9,5 19,5 10,0 20,0

Výpočet pI stanovované aminokyseliny:

11

Závěr: Použité roztoky a činidla: 1. Titrační roztok NaOH (c = 100 mmol/l) 2. Vzorky kyselin: silná kyselina (HCl) slabá kyselina (kys. octová) aminokyselina (hydrochlorid aminokyseliny)

1

Osmóza Jsou-li dva různě koncentrované roztoky od sebe odděleny semipermeabilní membránou propustnou pouze pro molekuly rozpouštědla, dochází k tomu, že část rozpouštědla přejde z místa menší koncentrace do místa vyšší koncentrace tak, aby se rozdíl koncentrací vyrovnal. Tento jev se nazývá osmóza.

Osmózu lze kvantifikovat pomocí osmotickéko tlaku (Π), tlaku, který je nutno vyvinout na koncentrovanější roztok, aby se zabránilo osmóze. Mechanismus vzniku osmotického tlaku není zatím zcela jasný, není však vyvolán přímo rozpuštěnou látkou, ale snížením aktivity rozpouštědla přítomností rozpuštěné látky v roztoku. Osmotický tlak závisí především na počtu částic rozpuštěných v roztoku a prakticky nezávisí na jejich druhu, velikosti a náboji. Pro vyjádření osmotických poměrů v roztoku se proto zavádí pojem osmolalita, druh koncentrace nezávislý na teplotě a na vlastnostech rozpuštěných látek (velikosti molekul). Osmolalita vyjadřuje celkové látkové množství všech osmoticky aktivních částic rozpuštěných v jednotkové hmotnosti čistého rozpouštědla. Jednotkou je mol/kg, resp. mmol/kg, pro něž se ve starší literatuře používalo označení Osmol/kg, resp. mOsmol/kg.

1 mol látky v 1 kg vody představuje roztok s osmolalitou: glukosa 1 mol/kg NaCl (při 100% disociaci) 2 mol/kg NaCl (při 86% disociaci v krevní plasmě) 1,86 mol/kg AgCl (nerozpustný ve vodě) 0 mol/kg

Osmolalitě 1 mol/kg odpovídá osmotický tlak 2,7 MPa. Velikost osmotického tlaku jednotlivých součástí biologických systémů a roztoků, které se do nich aplikují, se obvykle posuzuje vzhledem k určitému „standardu“, kterým byla v lidské fyziologii zvolena krevní plasma. K vyjádření rozdílu osmotického tlaku se často používá termín tonicita. Roztok, který má stejný osmotický tlak jako plasma, se nazývá izotonický, roztok s nižším osmotickým tlakem hypotonický a s vyšším osmotickým tlakem hypertonický. Osmóza má nesmírný význam v biologických soustavách, neboť se podílí na transportu vody mezi buňkou a extracelulární tekutinou. Rostliny navíc osmózou přijímají vodu. U živočichů reaguje každá buňka na osmotickou změnu prostředí změnou svého objemu. Nachází-li se buňka v hypertonickém prostředí, dochází k přechodu vody z buňky do okolí, což má za následek její smršťování a současně se obsah buňky koncentruje. Tento jev byl ne zcela vhodně nazván plasmolýza. Nachází-li se buňka naopak v prostředí hypotonickém, dochází k „nasávání“ vody do buňky, plasma se tím zřeďuje a buňka současně zvětšuje svůj objem, může dojít až k destrukci buněčné membrány. V případě erytrocytů se tento jev nazývá hemolýza.

Biologické membrány však nelze považovat za ideální semipermeabilní membrány, ale jsou to složité dvojvrstvy a vícevrstvy, kterými některé látky volně prostupují a jiné jsou přenášeny aktivním transportem.

Osmotické poměry se v medicíně často zkoumají v souvislosti se zachováním stálosti vnitřního prostředí organismu a zjišťují se v krevní plasmě nebo v moči. Osmolalita plasmy je za fyziologických podmínek 285 ± 10 mmol/kg vody, čemuž odpovídá osmotický tlak 0,78 MPa. Osmotický tlak odpovídající bílkovinné složce plasmy má název onkotický tlak a činí cca 0,3 % celkového osmotického tlaku plasmy. Osmolalita moči se nachází v podstatně širším rozmezí (50 – 1400 mmol/kg vody), protože stálost osmotických poměrů v organismu udržují především ledviny.

Praktický význam má i tzv. reverzní osmóza. Při tomto ději se působí tlakem na roztok, který je od čistého rozpouštědla oddělen polopropustnou membránou. Při dostatečném tlaku dochází k opačnému toku rozpouštědla než u osmózy, rozpouštědlo (nejčastěji voda) přechází z prostředí roztoku do prostředí rozpouštědla. Tímto způsoben je možno připravovat tzv. deionizovanou vodu, která nahrazuje vodu destilovanou. Přítomnost osmoticky aktivní látky v roztoku mění i další, tzv. koligativní vlastnosti (vlastnosti prakticky závislé pouze na počtu částic), např. snížení tenze par nad roztokem, zvýšení bodu varu roztoku (ebulioskopický efekt), snížení bodu tuhnutí roztoku (kryoskopický efekt). Toho se využívá při měření osmolality pomocí přístrojů – osmometrů.

2

Úkol 1: Demonstrace osmózy

Pokusíme se realizovat klasický experiment demonstrující osmózu, jehož princip je znázorněný na obrázku. Roztok o větší osmolalitě nasává přes polopropustnou membránu vodu, a dochází tak k vzestupu jeho hladiny. Teoreticky by se měl vzestup hladiny zastavit, až hydrostatický tlak sloupce vyrovná osmotický tlak roztoku.

π = ∆h ρ g

∆h ... výška sloupce

ρ ... hustota kapaliny g ... gravitační konstanta

1. Na širší část trubice upevněte připravený celofán, který bude sloužit jako polopropustná membrána.

2. Trubici ponořte membránou dolů do kádinky s destilovanou vodou tak, aby hladina vody v kádince dosahovala do úrovně značky.

3. Do trubice opatrně pipetou přeneste takové množství nasyceného roztoku sacharózy, aby hladiny kapalin v trubici a v kádince byly ve stejné úrovni. Roztok sacharózy byl pro lepší viditelnost obarven modrým potravinářským barvivem.

4. Na stopkách začněte měřit čas. Zaznamenejte dobu, za kterou vystoupí hladina v kapiláře až na její vrchol přecházející v rozšířenou baňku.

Doba: minut Rozdíl hladin – výška sloupce (mm):

Proč používáme právě sacharózu?

Celofán, který používáme jako membránu, se rozhodně nechová jako ideální teoretická semipermeabilní membrána, nepropouští jen rozpouštědlo (vodu), ale bohužel i další malé částice velikosti Na+ a Cl- iontů, proto pro tento demonstrační pokus nemůžeme použít roztok NaCl případně CaCl2 (běžné soli velice dobře rozpustné ve vodě, vezmeme-li dále v úvahu nízkou molární hmotnost iontů vzniklých disociací, dojdeme k závěru, že jsou to ideální látky pro přípravu roztoků o vysoké osmolalitě). Sacharóza (C12H22O11) už má dost velkou molekulu, aby póry v našem celofánu neprošla. Je to cukr s extrémní rozpustností ve vodě, což umožní také připravit celkem "koncentrovaný" roztok.

3

4

Dialýza Dialýza je dělící metoda, při níž se uplatňuje difúze a současně polopropustnost membrány. Difúze je nevratný děj, při kterém dochází k transportu částic (iontů, molekul) v prostředí tak, aby došlo k vyrovnání složení ve všech místech této soustavy. Difúze je důsledkem neustálého neuspořádaného pohybu částic hmoty a postupuje ve směru koncentračního spádu, tedy i proti zemské tíži. Rychlost difúze je kromě závislosti na povaze částic rozpuštěné látky a rozpouštědla přímo úměrná koncentračnímu gradientu (koncentračnímu spádu, rozdílu koncentrací). Polopropustná (semipermeabilní) membrána je taková membrána, jejímiž póry mohou projít pouze některé ionty nebo molekuly přítomné v daném prostředí. Membrána je tvořena nejčastěji nabobtnalým celofánem nebo podobnými deriváty celulózy. K difúzi dochází i v případě, je-li roztok určité látky oddělen od čistého rozpouštědla polopropustnou membránou, kterou dané rozpuštěné částice mohou procházet. Rychlost a směr pohybu difundujících částic přes membránu závisí na rozdílu koncentrací dané látky na obou stranách membrány. Látky difundují z místa vyšší koncentrace do místa nižší koncentrace. Dojde-li k vyrovnání koncentrací, ustaví se dynamická rovnováha a děj se „zastaví“. Obsahuje-li roztok (tzv. dialyzát) směs rozpuštěných látek, z nichž jen některé membránou procházejí do rozpouštědla (tzv. difuzátu), lze tímto způsobem směsi dělit a metoda se nazývá dialýza. Umožňuje vzájemné dělení malých a velkých molekul, často se tak dělí roztoky solí od velkých polymerních molekul (např. polysacharidů, polypeptidů, bílkovin, apod.). Hlavním praktickým využitím dialýzy v medicíně je hemodialýza pacientů se selháním ledvin. K urychlení dělení elektrolytů od neutrálních molekul může být použito elektrické pole (elektrodialýza). Působí-li na dialyzovaný roztok tlak, hovoříme o ultrafiltraci. Na tomto principu vzniká tzv. glomerulární filtrát (primární moč) v ledvině při glomerulární filtraci.

Úkol 2: Sledování dialyzační rychlosti chloridů přes celofánovou membránu

V úloze se sleduje dialyzační rychlost chloridů a současně dělení vysokomolekulární a nízkomolekulární látky (škrob a NaCl). Dialyzační membránu bude tvořit celofán, který vytváří póry o průměru 3 až 4 nm. Jimi snadno projdou ionty, jejichž velikost je i s hydratačním obalem okolo 0,5 nm.

Zdůvodněte, proč molekuly škrobu neprochází dialyzační membránou:

5

Provedení:

Příprava dialyzační nádobky: 1. Na pracovním stole máte ve stojanu upevněnou dialyzační nádobku. Jedná se o

skleněnou trubici s celofánem. Do kádinky (objem 250 ml) odměřte 150 ml destilované vody, vložte míchací tělísko, postavte na elektromagnetickou míchačku a nastavte přiměřenou rychlost míchání.

2. Do dialyzační nádobky napipetujte 5 ml 1% roztoku škrobu a 10 ml roztoku NaCl (c = 1,5 mol/l). Připravte si stopky, zapněte míchání a v okamžiku, kdy ponoříte dialyzační nádobku do kádinky tak, aby byl celofán s roztokem ponořen, začněte měřit čas.

Sledování dialyzační rychlosti: V čase 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 minut a dále pak v desetiminutových intervalech z kádinky odebírejte vzorky o objemu 2,5 ml (použijte automatickou pístovou pipetu), které průběžně merkurimetricky titrujte. Pokus ukončete, jsou-li tři po sobě jdoucí spotřeby stejné (cca po 90 minutách).

Čas (min) 2 4 6 8 10 15 20 Vt (ml) Vdif (ml)

cV (mmol/l) nV (mmol) Čas (min) 30 40 50 60 70 80 90 Vt (ml) Vdif (ml)

cV (mmol/l) nV (mmol)

Stanovení chloridů: Chloridy se stanoví merkurimetrickou titrací. Merkurimetrie patří mezi

komplexotvorné metody. Titrační roztok /Hg(NO3)2/ tvoří se vzorkem (ionty Cl-) rozpustný, ale nedisociovaný komplex [HgCl2]:

Hg2+ + 2 Cl- → [HgCl2] ft = nv/nt = 2/1

K indikaci ekvivalentního bodu se využívá barevné reakce iontů Hg2+ s difenylkarbazidem. Na konci titrace se objeví modrofialové zabarvení. Při titraci dodržujte bezpečnostní opatření, protože roztok Hg(NO3)2 je toxický! Po skončení vaší práce vylejte veškerý odpad do speciální lahve!

6

• K odebranému vzorku přidejte 2,5 ml destilované vody a 0,3 ml indikátoru a ztitrujte roztokem Hg(NO3)2 do vzniku světlefialového zabarvení. Z nalezených spotřeb vypočítejte koncentraci jednotlivých vzorků a látkové množství chloridů prošlých celofánovou membránou (v mmol):

[ ]mmol/lV

.f.Vcc

v

tttv =

[ ]mmol.Vcn difvv = ,

za Vdif se dosazuje objem difuzátu (v litrech), který se průběžně (po odběru vzorků) mění, Vdif = 150 ml, 147,5 ml,… Vv = 2,5 ml Ct = 12,5 mmol/l

Ověření integrity membrány průkazem škrobu:

• Po ukončení dialýzy odeberte do malé aglutinační zkumavky asi 0,3 ml roztoku difuzátu a do druhé zkumavky 0,3 ml roztoku dialyzátu. Do obou zkumavek přidejte 3 kapky Lugolova roztoku (roztok jodu) a porovnejte zbarvení. (Škrob se jodem barví modře.) Výsledek pokusu zhodnoťte.

7

Vyhodnocení rychlosti dialýzy proveďte graficky. Na milimetrový papír naneste na

osu x čas (v minutách), na osu y látkové množství chloridů (mmol). Vynesenými body proložte optimální křivku (dialyzační křivka).

Osu x rozdělte na pětiminutové intervaly (čas t1, t2, t3, ...) a k těmto hodnotám přiřaďte

z dialyzační křivky odpovídající látkové množství chloridů (n1, n2, n3, ...), které odečtěte na ose y. (Pro to = 0 je no = 0).

Čas (min) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 nx (mmol) vx (mmol Cl-/min)

Čas (min) 50 55 60 65 70 75 80 85 90 nx (mmol) vx (mmol Cl-/min)

8

Dialyzační rychlost (v) udává látkové množství Cl- prošlé celofánovou membránou za minutu.

v1 = (n1 - n0) : 5 [mmol Cl-/min] v2 = (n2 - n1) : 5 v3 = (n3 - n2) : 5, atd.

Sestrojte graf dialyzační rychlosti: na osu x naneste čas (min), na osu y vypočítanou rychlost (mmol Cl-/min). V místě, kde křivka protíná osu x odečtěte čas, kdy se vyrovnaly osmotické poměry na obou stranách membrány (dialýza skončila). Dále křivku prodlužte (extrapolujete) tak, aby protla osu y a odečtěte v0 (tzv. počáteční rychlost). Tuto hodnotu nelze přímým měřením zjistit. Může sloužit jako charakteristika daného dialyzačního systému.

Grafy spolu s celkovým zhodnocením a vysvětlením výsledků přiložte k protokolu.

Použité roztoky a činidla 1. 1% roztok škrobu 2. roztok NaCl (c = 1,5 mol/l) 3. titrační roztok Hg(NO3)2 (c = 12,5 mmol/l) 4. difenylkarbazid 5. Lugolův roztok (4 g KI rozpustit ve 100 ml vody a přidat 1,3 g jodu)

9

Stanovení osmolality na principu kryoskopického efektu Pojmenování metody pochází od starořeckých slov krýos, znamenající led, mráz, zima, ale také hrůza a skopeo, které znamená pozoruji. Princip metody je založen na fyzikálním jevu, popsaném francouzským fyzikálním chemikem François-Marie Raoultem (1830 –1901). Ten odvodil zákonitosti, ovlivňující tlakové poměry ve vícesložkových soustavách a vyslovil je v postulátech: 1. tlak syté páry nad roztokem, 2. zvýšení teploty varu roztoku 3. snížení teploty tuhnutí roztoku. Z posledního vyplývá, že teplota tuhnutí roztoku klesá v závislosti na koncentraci, v něm, rozpuštěné látky.

obr. Grafické vyjádření průběhu obr. Iniciace promrznutí vzorku, kapkou teplotních změn při kryoskopii zledovatělou na jehle Osmometr (kryoskop) je v principu velmi citlivý teploměr s rozlišitelností 0,001 °C, což odpovídá rozlišitelnosti měření 1,2 mmol/kg, přičemž 1 mmol/kg tak odpovídá 0,001858 °C. Měřený roztok se rychle podchladí. Potom se, zevním zásahem, přivodí okamžité promrznutí vzorku v celém jeho objemu. Tím se uvolní skupenské teplo tuhnutí, načež se, po následujícím teplotním sedle, měří snížení bodu tuhnutí roztoku odpovídající jeho osmolalitě. Souvislosti: - snížení teploty tuhnutí roztoku, čistému rozpouštědlu, je přímo úměrné koncentraci rozpuštěné látky - vlastnost závisí na počtu částic, nikoli na jejich identitě - rozdíl teplot tání čistého rozpouštědla a roztoku je přímo úměrný osmolalitě a nepřímo úměrný molární hmotnosti rozpuštěné látky

10

Úkol 3: Měření osmolality a) Připrava 250 ml Ringerova roztoku

Fyziologický roztok v podobě 0,9% NaCl obsahuje pouze Na+ a Cl- ionty. V krevní plazmě jsou přítomny ale i jiné ionty. V praxi se používají i infúzní roztoky trochu více odpovídající složení krevní plazmy. Jedním z nich je Ringerův roztok. 1. Postupně navažte pomocí plastové váženky a přeneste navážená množství do téže 250 ml

Erlenmayerovy baňky:

chlorid sodný 2,150 g chlorid draselný 0,075 g chlorid vápenatý 0,083 g

2. Do téže Erlenmayerovy baňky spláchněte i nepozorovatelné zbytky z váženky pomocí střičky s destilovanou vodou.

3. Přidejte destilovanou vodu do objemu asi tak 100 – 150 ml a krouživým mícháním dokonale rozpusťte obsah.

4. Pomocí nálevky přelijte obsah Erlenmayerovy baňky do 250 ml odměrné baňky. Erlenmayerovu baňku alespoň 2x propláchněte malým množstvím vody, vše pořád slejvejte do odměrné baňky.

5. Destilovanou vodou (ze střičky) doplňte odměrnou baňku přesně po rysku (tj. na objem 250 ml).

6. Odměrnou baňku uzavřete zátkou a důkladně obsah promíchejte.

Jaká je látková koncentrace jednotlivých iontů v připraveném roztoku? M(NaCl) = 58,45 g/mol M(KCl) = 74,56 g/mol M(CaCl2 . 2H2O) = 146,99 g/mol

Výsledek

Na+ mmol/l

K+ mmol/l

Ca2+ mmol/l

Cl- mmol/l

Jakou má tento roztok osmolalitu (osmolaritu)?

11

b) Měření osmolality moderním osmometrem Máme k dispozici moderní osmometr, přístroj pro kryoskopické stanovení celkové osmolality ve vodných roztocích s dotykovým LCD. Používá velmi citlivý teploměr s rozlišitelností 0,001 °C, což odpovídá ve výsledku osmolality rozlišitelnosti 1-2 mmol/kg. Pracuje se s objemy vzorků 50 µl, doba měření je cca 1 min. Měření je snadné a rychlé, proto proměříme více vzorků. Příprava vzorků:

Destilovaná voda – je k dispozici v laboratoři Ringerův roztok – máme připraveno Ringerův roztok + ethanol

Odměrným válcem odměřte co nejpřesněji 50 ml Ringerova roztoku, přelijte do kádinky a připipetujte 0,25 ml 40% alkoholického nápoje.

Spočítejte, jaký vzestup osmolality (osmolarity) by měl tento přídavek ethanolu způsobit:

Ringerův roztok + glukóza

Odměrným válcem odměřte co nejpřesněji 50 ml Ringerova roztoku, přelijte do kádinky. Odvažte pomocí váženky 270 mg glukózy a tu rozpusťte v roztoku v kádince.

Spočítejte, jaký vzestup osmolality (osmolarity) by měl tento přídavek glukózy způsobit:

Vzorek Změřená osmolalita

Destilovaná voda mmol/kg

Ringerův roztok mmol/kg

Ringerův roztok + ethanol mmol/kg

Ringerův roztok + glukóza mmol/kg

12

1

ANTIOXIDANTY

Při metabolických pochodech vznikají reaktivní formy kyslíku, ROS (reactive oxygen species) a reaktivní formy dusíku, RNS (reactive nitrogen species), souhrnně označované RONS (Reactive Oxygen and Nitrogen Species). Tyto vysoce reaktivní látky zahrnují jak volné radikály, tak látky neradikálové podoby.

Reaktivní formy kyslíku (ROS)

Radikály Neradikály

superoxidový aniont (superoxid) O2•- peroxid vodíku H2O2

Hydroperoxylový radikál HO2• kyselina chlorná HClO

hydroxylový radikál HO• ozon O3

peroxylové radikály ROO• singletový kyslík 1O2

alkoxylové radikály RO•

Reaktivní formy dusíku (RNS)

Radikály Neradikály radikál oxidu dusnatého NO• kyselina dusitá HNO2

radikál oxidu dusičitého NO2• oxid dusitý N2O3

peroxynitrit ONOO-

alkylperoxynitrit RONOO-

Volné radikály mohou být definovány jako molekuly, atomy či ionty, schopné samostatné existence mající alespoň jeden volný nepárový elektron ve valenční sféře. Volné radikály vznikají třemi různými způsoby:

1) homolytickým štěpením kovalentní vazby na dvě částice, z nichž každá má jeden elektron, toto štěpení vyžaduje příliš energie, a proto v biologických systémech prakticky nepřichází v úvahu

2) redukcí, tzn. přidáním jednoho elektronu 3) oxidací, tzn. ztrátou jednoho elektronu

Reakce volných radikálů často probíhá formou řetězové reakce. Volný radikál se totiž stabilizuje vytržením elektronu z nejbližší molekuly, ze které se tak stává radikál. Tím dochází k propagaci radikálové reakce. Proces je ukončen až reakcí dvou radikálů. Touto oxidací může být postižena kterákoli biomolekula. Ke vzniku volných radikálů v organismu přispívají nejen exogenní vlivy, jako UV nebo X záření, kouření či intoxikace, ale také je vznik volných radikálů běžnou součástí metabolismu. Jedním z procesů, kde dochází v buňce ke vzniku velkého množství volných radikálů, je dýchací řetězec v mitochondriích.

2

Volné radikály ale nelze vnímat pouze jako zdroj poškození biomolekul, buněčných struktur, buněk a celých tkání. Volné radikály plní i řadu důležitých fyziologických funkcí. Například fagocyty využívají volné radikály k zabíjení mikroorganismů (jsou vybaveny enzymy NADPH oxidázou, která produkuje superoxid, a myeloperoxidázou, katalyzující syntézu kyseliny chlorné). Dále mohou plnit signální funkci, např. oxid dusnatý, který působí jako lokální mediátor. Nebo se uplatňují při biosyntézách (např. cyklooxygenázou produkovaný superoxidový radikál při biosyntéze prostaglandinů, hydroxylace za katalýzy monooxygenázami). Hlavní reaktivní formy kyslíku jsou meziprodukty redukce kyslíku na vodu. Přijetím jednoho elektronu se molekula kyslíku redukuje na superoxid,

O2 + e- → O2-•

který se dalším elektronem redukuje na peroxid vodíku.

O2-• + e- + 2H+ → H2O2

Superoxid podléhá také spontánní dismutaci, při které jedna jeho molekula poskytuje elektron druhé, takže dochází zároveň k oxidaci i redukci, jejímž produktem je kyslík a peroxid vodíku. Přestože ve vodném prostředí probíhá reakce velkou rychlostí, v biologických organismech je ještě urychlována enzymem superoxiddismutázou (SOD).

O2-• + O2

-• + 2H+ O2 + H2O2

Peroxid vodíku je nejstabilnějším meziproduktem. Jeho reakce s biomolekulami jsou poměrně pomalé, avšak v přítomnosti přechodných kovů (Fe2+, Cu+) se ochotně redukuje za vzniku vysoce aktivního, toxického hydroxylového radikálu.

H2O2 + Fe2+ → HO• + OH− + Fe3+

Tuto redukci peroxidu vodíku v přítomnosti tranzitních kovů nazýváme Fentonova reakce. Hydroxylový radikál je nejnebezpečnější ze všech reaktivních forem kyslíku, neboť jako velmi silné oxidační činidlo vytrhuje elektron z nenasycených mastných kyselin, hydroxyluje aminokyseliny a báze nukleových kyselin. Za normálních okolností jsou reaktivní formy kyslíku v rovnováze s aktivitou tzv. antioxidantů. Podle biologické funkce se antioxidanty dělí na enzymové antioxidační systémy (superoxiddismutáza, glutathionperoxidáza, glutathiontransferáza, kataláza) a na nízkomolekulární antioxidanty (kyselina askorbová, tokoferoly, karotenoidy, flavonoidy, glutathion, kyselina lipoová, koenzym Q, bilirubin, kyselina močová, atd.). Tyto látky jsou schopny reagovat s volnými radikály, aniž by se radikálová reakce dále propagovala, tj. ukončí existenci radikálu. Vyčerpání antioxidantů vede k poškození tkáně v důsledku procesů označovaných obecně jako tzv. oxidační stres. Míra schopnosti tkáně vzdorovat oxidačnímu stresu je určena jednak množstvím v ní přítomných antioxidantů, jednak jejich druhem. Parametr, který koreluje se schopností tkáně odolávat oxidačnímu stresu, je označován jako antioxidační kapacita. Obsah antioxidantů se stanovuje nepřímo jako tzv. celková antioxidační kapacita (Total Antioxidant Capacity - TAC), která představuje schopnost systému vzdorovat oxidačnímu stresu.

3

Měření celkové antioxidační kapacity (TAC)

Celková antioxidační kapacita (Total Antioxidant Capacity - TAC) popisuje souhrnnou schopnost systému vzdorovat oxidačnímu stresu. Pro stanovení celkové antioxidační kapacity existuje více různých metod, každá může ale hodnotit trochu něco jiného. V našich praktických cvičeních budeme používat dvě rozdílné metody: A) TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)

Tato metoda vztahuje antioxidační aktivitu vzorku ke standardní látce - Troloxu, což je rozpustný syntetický analog vitaminu E. Principem metody je zhášení uměle připraveného stabilního radikálu ABTS [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)]. Působením peroxodisíranu draselného je ABTS převedeno na svůj stabilní radikál ABTS+. Tento radikál má tyrkysově modrou barvu. Přidáním vzorku s antioxidační aktivitou dochází ke konverzi radikálu zpět na neradikálovou bezbarvou formu, přičemž celková barva přechází na světle zelenou až bezbarvou. Tato změna se měří fotometricky při vlnové délce 734 nm. Trolox (analog vitaminu E)

Vznik radikálu ABTS+ působením peroxodisíranu; reakce radikálu ABTS+ s antioxidantem (AOH) B) FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

Tato metoda popisuje celkovou redukční schopnost vyšetřovaného vzorku. Principem je redukce železitých komplexů Fe3+-TPTZ, které jsou téměř bezbarvé, na intenzivně fialové Fe2+-TPTZ produkty. Tato změna barvy se měří fotometricky při vlnové délce 593 nm. Výsledek se poté vyjádří jako ekvivalentní množství iontů Fe2+.

TPTZ (2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazin)

4

Úloha 1: Vytvoření kalibračních křivek Kalibrační křivka pro metodu TEAC bude v praktikárně k dispozici už hotová (nebudete sami dělat)! Zpracujete jen kalibrační křivku pro metodu FRAP. A) Vytvořte kalibrační křivku pro metodu TEAC (Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity)

1) Do malých očíslovaných zkumavek připravte ředěním kalibrační roztoky syntetického vitaminu E – troloxu ze

zásobního roztoku o koncentraci cTROLOX = 2 mmol/l. Vypočítejte výslednou koncentraci kalibračních roztoků.

2) Do paralelních zkumavek napipetujte po 2 ml činidla ABTS. Z připravených kalibračních roztoků odeberte

50 µl a přidejte je do zkumavek s činidlem. Přesně po 10 minutách změřte absorbanci proti slepému vzorku

(zkumavka č. 0) při 734 nm.

číslo zkumavky 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

zás. roztok TROLOX (µl) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

destilovaná voda ( µl) 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

cTROLOX (mmol/l) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

A734

3) Vytvořte kalibrační graf A734 = funkce cTROLOX => osa y … A734, osa x … cTROLOX

B) Vytvořte kalibrační křivku pro metodu FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

1) Do malých očíslovaných zkumavek připravte ředěním kalibrační roztoky síranu železnatého

ze zásobního roztoku o koncentraci cFeSO4 = 1 mmol/l. Vypočítejte výslednou koncentraci

kalibračních roztoků.

2) Do paralelních zkumavek napipetujte 2 ml činidla FRAP. Z připravených kalibračních

roztoků odeberte 50 µl a přidejte je do zkumavek s činidlem v intervalu 30 sekund tak, že

přesně po 10 minutách změříte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při

593 nm. (Při přidání 50 µl ze zkumavky 0 spustíte stopky, které necháte běžet, po 30

sekundách přidáváte 50 µl z kalibračního roztoku 1 do paralelní zkumavky 1, atd. Přesně po

10 minutách provedete nulování na slepý vzorek, v 10 minut a 30 sekund první měření

absorbance vzorku 1, atd.)

číslo zkumavky 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

zás. roztok FeSO4 (µl) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

destilovaná voda ( µl) 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

cFeSO4 (mmol/l)

A593

3) Vytvořte kalibrační graf A593 = funkce cFeSO4 � osa y … A593, osa x … cFeSO4

5

Úloha 2: Měření celkové antioxidační kapacity různých vzorků Dvěma metodami (TEAC a FRAP) změříte celkovou antioxidační kapacitu třech různých vzorků, nejdřív věnujte čas jejich přípravě:

vzorek 1 – krevní sérum – už je připraveno k použití

vzorek 2 – sliny

Odběr se provádí nejdříve 30 minut po jídle. Vyšetřovaná osoba si vloží do úst sací váleček. Mírným žvýkáním nebo převalováním v ústech po dobu 1 minuty dojde k nasátí slin do válečku. Vatový váleček se vloží zpět do příslušné centrifugační zkumavky Salivette, která se uzavře víčkem. K získání vzorku slin se provede odstředění (2 minuty, 2.500 ot./min.).

vzorek 3 – antioxidační preparát ("tableta")

Ve třecí misce rozetřete tabletu antioxidačního preparátu. Prášek přesypte do malé kádinky a rozpusťte v 5 ml destilované vody. Pro odstranění pevných částí přefiltrujte vzniklou suspenzi přes filtrační papír v nálevce do čisté zkumavky. Z takto vzniklého vzorku přepipetujte 1 ml do kádinky a zřeďte 100 ml destilované vody. Takto zředěný roztok antioxidačního preparátu bude sloužit jako vzorek.

A) Metoda TEAC

Do očíslovaných zkumavek napipetujte po 2 ml činidla ABTS. Ze vzorků přidávejte (s intervalem

přesně 1 minuta) do příslušných zkumavek vždy po 50 µl podle tabulky. Přesně po 10 minutách změřte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 734 nm. Z kalibrační křivky pro TEAC odečtěte odpovídající hodnoty koncentrace troloxu.

číslo zkumavky - vzorek 0 1 - sérum 2 - sliny 3 - tableta

činidlo ABTS ( µl) 2000 2000 2000 2000

vzorek ( µl) - 50 50 50

dest. voda ( µl) 50 - -

A734

cTROLOX (mmol/l)

B) Metoda FRAP

Do očíslovaných zkumavek napipetujte po 2 ml činidla FRAP. Ze vzorků přidávejte (s intervalem

přesně 1 minuta) do příslušných zkumavek vždy po 50 µl. Přesně po 10 minutách změřte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 593 nm. Z kalibrační křivky pro FRAP odečtěte odpovídající hodnoty koncentrace FeSO4.

číslo zkumavky - vzorek 0 1 - sérum 2 - sliny 3 - tableta

činidlo FRAP ( µl) 2000 2000 2000 2000

vzorek ( µl) - 50 50 50

dest. voda ( µl) 50 - -

A593

cFeSO4 (mmol/l)

6

Úloha 3: Měření celkové antioxidační kapacity roztoků vitamínu C Do malých očíslovaných zkumavek připravte ředěním zásobního roztoku (c=1 mmol/l) vitamínu C roztoky vitamínu C o různé koncentraci.

číslo zkumavky 0 1 2 3 4 5

zás. roztok vit. C ( µl) 0 100 200 300 400 500

dest. voda ( µl) 1000 900 800 700 600 500

cvitamín C (mmol/l)

A) Metoda TEAC

Do nových zkumavek napipetujte po 2 ml činidla ABTS. Z připravených vzorků různých

koncentrací vitamínu C odeberte 50 µl a přidejte je s intervalem 1 minuta do zkumavek s činidlem. Přesně po 10 minutách od přidání změřte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 734 nm. Z kalibrační křivky pro TEAC odečtěte hodnoty koncentrace troloxu.

číslo zkumavky 0 1 2 3 4 5

činidlo ABTS ( µl) 2000 2000 2000 2000 2000 2000

vzorek vit. C ( µl) 50 50 50 50 50 50

A734

cTROLOX (mmol/l)

B) Metoda FRAP

Do nových zkumavek napipetujte po 2 ml činidla FRAP. Z připravených vzorků různých

koncentrací vitamínu C odeberte 50 µl a přidejte je s intervalem 1 minuta do zkumavek s činidlem. Přesně po 10 minutách od přidání změřte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 593 nm. Z kalibrační křivky pro FRAP odečtěte hodnoty koncentrace FeSO4.

číslo zkumavky 0 1 2 3 4 5

činidlo FRAP ( µl) 2000 2000 2000 2000 2000 2000

vzorek vit. C ( µl) 50 50 50 50 50 50

A593

cFeSO4 (mmol/l)