pËrdorimi i instrumenteve moderne pËr diagnostikimin … · mero d. (201. 7): përdorimi i...
TRANSCRIPT
REPUBLIKA E SHQIPËRISË
UNIVERSITETI I TIRANËS
FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS
DEPARTAMENTI I BIOTEKNOLOGJISË
PROGRAMI I STUDIMIT BIOTEKNOLOGJI BIMORE
DISERTACION Për marrjen e gradës:
Doktor i Shkencave
PËRDORIMI I INSTRUMENTEVE MODERNE PËR
DIAGNOSTIKIMIN E FITOPLAZMAVE QË
SHKAKTOJNË INFEKSIONE NË BIMËT E MOLLËVE
(AP) DHE LEPTONEKROZËN E KUMBULLËS (PLN)
Kandidati:
Msc. Desareda Mero
Udhëheqës shkencor
Prof. Dr. Ariola Bacu
Prof. Dr. Margarita Hysko
Tiranë 2017
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
ii
REPUBLIKA E SHQIPERISË
UNIVERSITETI I TIRANËS
FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS
DEPARTAMENTI I BIOTEKNOLOGJISË
PROGRAMI I STUDIMIT BIOTEKNOLOGJI BIMORE
DISERTACION
Paraqitur nga
Msc. Desareda MERO
Udhëhequr nga
Prof. Dr. Ariola Bacu
Prof. Dr. Margarita Hysko
Për marrjen e gradës
DOKTOR I SHKENCAVE
Tema: ―Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin
e fitoplazmave që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve
(AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)‖
Mbrohet më; _____/ _____/ _____ para jurisë;
1.______________________________________Kryetar
2.______________________________________Anëtar (Oponent)
3.______________________________________Anëtar (Oponent)
4.______________________________________Anëtar
5.______________________________________Anëtar
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
iii
© 2017 Desareda MERO
Të gjitha të drejtat e rezervuara. Asnjë pjesë e këtij disertacioni nuk lejohet të
riprodhohet, të ruhet në një sistem përsëritës apo të transmetohet në çfarëdo mënyre
(elektronike, mekanike, fotokopje, regjistrim apo ndonjë mënyrë tjetër), pa lejen
paraprake të autorit.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
iv
Dedikuar familjes sime!
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
v
Falenderime
Realizimi i këtij punimi nuk ka qënë aspak i thjeshtë, por pa mbështetjen dhe
kontributin e shumë personave do të ishte i pamundur!
Në rradhë të parë dua të falenderoj udhëheqëset e mia për ndihmën e pakursyer që
më kanë ofruar:
Prof. Dr. Ariola Bacu (Grazhdani) së cilës i jam mirënjohëse për kohën e
gjatë që më ka kushtuar, sqarimet shkencore, ndihmën në laborator, saktësinë
dhe korrektesën me të cilën më ka mësuar të punoj dhe e them me bindje se pa
përkushtimin e saj ky punim nuk do të kishte këtë formë.
Prof. Dr. Margarita Hysko (Nano) së cilës i jam mirënjohëse për mundësinë
që më dha për realizimin e kësaj teme pranë Fakultetit të Shkencave të
Natyrës, për angazhimin, konsultimet, këshillat e çmuara, frymëzimin dhe
motivimin e vazhdueshëm.
Falenderime dhe mirënjohje për gjithë stafin e Departamentit të Bioteknologjisë për
mbështetjen, dashamirësinë dhe pozitivitetin që më kanë përcjellë. Falenderoj Mirën
për ndihmën dhe këshillat e vyera gjatë realizimit të eksperimenteve pranë
Laboratorit të Bioteknologjisë Molekulare, Fakulteti i Shkencave të Natyrës,
Universiteti i Tiranës.
Një falenderim i veçantë për Prof. Asoc. Dr. Gjergji Mero i cili më ka inkurajuar,
mbështetur dhe më ka ndihmuar duke më vënë në dispozicion mjetet dhe duke më
krijuar kushtet e përshtatshme për realizimin e eksperimenteve në laboratorin e
Biologjisë, Fakulteti i Shkencave Natyrore dhe Humane, Universiteti Fan.S.Noli,
Korçë.
Falenderoj kolegët dhe studentët e mi që më janë gjendur pranë në çdo moment
nevoje, gjatë gjithë kohës të realizimit të punimit.
Dhe të fundit por jo më pak të rëndësishmit janë familjarët e mi të cilët meritojnë
gjithë falenderimet e botës.
Falenderoj gjithë të afërmit e mi dhe familjen e bashkëshortit tim për
inkurajimin dhe mbështetjen e vazhdueshme.
Falenderoj bashkëshortin tim të dashur për durimin, mirëkuptimin, kurajon
dhe ndihmën e dhënë gjatë gjithë kohës.
Falenderoj vëllain tim të mrekullueshëm dhe dy prindërit e mi të shtrenjtë që
më kanë ofruar mbështetje dhe dashuri pa kushte në çdo moment. Jam krenare
për ju!
Ju faleminderit!
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
vi
PASQYRA E LËNDËS
Falenderime .................................................................................................................. v
LISTA E SHKURTIMEVE ....................................................................................... ix
LISTA E TABELAVE ................................................................................................. x
PARATHËNIE ......................................................................................................... xvii
KAPITULLI I............................................................................................................... 2
KONSIDERATA TEORIKE ...................................................................................... 2
1.1 Të dhëna të përgjithshme ...................................................................................... 3
1.1.1 Morfologjia .................................................................................................... 3
1.1.2 Përcaktimi i fitoplazmave .............................................................................. 4
1.1.3 Pozicioni filogjenetik i fitoplazmave ............................................................. 4
1.2 Fitoplazmat dhe sëmundjet e lidhura me to .................................................... 6
1.2.1 Transmetimi dhe përhapja e sëmundjeve të fitoplazmave ............................. 7
1.2.2 Aspekte të epidemiologjisë së fitoplazmave ................................................. 8
1.2.3 Sëmundjet fitoplazmatike dhe rëndësia e tyre ekonomike ............................ 9
1.2.4 Disa fitoplazmoza të rëndësishme të drufrutorëve ...................................... 10
1.2.4.1 Apple proliferation ................................................................................ 10
1.2.4.2 Plum Leptonecrosis ............................................................................... 11
1.3. Menaxhimi dhe kontrolli i sëmundjeve fitoplazmatike ............................... 13
1.3.1. Strategjia e parandalimit ............................................................................. 13
1.3.2. Kontrolli i insekteve vektorë ...................................................................... 13
1.3.3. Strategjia e menaxhimit .............................................................................. 14
1.3.4. Perspektivat për kontrollin e sëmundjeve fitoplazmatike ........................... 14
1.4. Gjenomika dhe mekanizmi i patogjenitetit ................................................... 15
1.4.1. Gjenet që përfshihen në ndërveprimet e fitoplazmave me strehuesit e tyre
.............................................................................................................................. 17
1.5. Përhapja e fitoplazmozave në vendin tonë dhe në rajon ............................. 18
1.5.1 Përhapja në Shqipëri .................................................................................... 18
1.5.2 Përhapja në Kosovë ..................................................................................... 19
1.5.3 Përhapja në Greqi ........................................................................................ 19
1.5.4 Përhapja në Bullgari .................................................................................... 19
1.5.5 Përhapja në Rumani ..................................................................................... 20
1.5.6 Përhapja në Serbi ......................................................................................... 20
1.5.7 Përhapja në Itali ........................................................................................... 20
1.5.8 Përhapja në Turqi ......................................................................................... 21
1.6. Metodat për zbulimin dhe identifikimin e fitoplazmave ............................. 21
1.6.1. Metoda e bazuar në simptoma, simptomatologjia ...................................... 21
1.6.2. Izolimi i fitoplazmave në bimët test ........................................................... 24
1.6.3. Mikroskopia ................................................................................................ 25
1.6.3.1 Mikroskopia me dritë (ngjyrimi Diene) ................................................ 25
1.6.3.2 Mikroskopia me fluoreshencë (ngjyrimi DAPI) ................................... 25
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
vii
1.6.3.3 Mikroskopia me imunofluoreshencë..................................................... 27
1.6.3.4 Mikroskopia elektronike ....................................................................... 27
1.6.4. Histokimia .................................................................................................. 27
1.6.5. Imunologjia ................................................................................................. 28
1.6.5.1 Antitrupat monoklonale ........................................................................ 28
1.6.5.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ................................. 29
1.6.5.3 Dot Blot Immunoassay ......................................................................... 29
1.6.6. Biologjia molekulare .................................................................................. 29
1.6.6.1 Hibridizimi i acideve nukleike .............................................................. 30
1.6.6.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) ....................................................... 31
1.6.6.3 Real-Time PCR për zbulim universal të fitoplazmave ......................... 31
1.6.6.4 Restriction Length Fragment Polymorphism (RFLP)........................... 32
1.6.6.5 Nested PCR, RFLP bazuar në gjenin 16S rADN .................................. 32
1.6.6.6 PCR, RFLP bazuar në operonin proteinik ribozomal ........................... 34
1.6.6.7 T-RFLP për zbulim dhe identifikim ..................................................... 35
1.6.6.8 Heteroduplex Mobility Assay (HMA) .................................................. 36
1.6.6.9 Analiza e polimorfizmit të konformacionit një vargor për diferencimin
e shtameve fitoplazmatike (SSCP).................................................................... 37
1.6.6.10 Microarrays për zbulim dhe identifikim universal.............................. 37
KAPITULLI II ........................................................................................................... 39
MATERIALE DHE METODA ................................................................................ 39
2.1 Materiali bimor i analizuar ............................................................................. 39
2.1.1 Llojet e bimëve, plantacionet ....................................................................... 39
2.1.2 Metoda e marrjes së mostrave ..................................................................... 42
2.2 Metodat e diagnostikimit ................................................................................. 45
2.2.1 Vlerësimi i plantacioneve në bazë të simptomave....................................... 45
2.2.2 Metoda e ngjyrimit DAPI ............................................................................ 46
2.2.2.1 Protokolli i metodës së ngjyrimit DAPI................................................ 47
2.2.3 Metoda të bazuara në PCR .......................................................................... 48
2.2.3.1 Protokolli i ekstraktimit të ADN-së të pasuruar në fitoplazma............. 49
2.2.3.2 Shumëfishimi me PCR i rajoneve specifike fitoplazmatike ................. 51
2.2.3.3 Përzgjedhja e mostrave të ADN-së për shumëfishimin e rajoneve
specifike ............................................................................................................ 52
2.2.4 Analizimi i Rezultateve ............................................................................... 53
KAPITULLI III ......................................................................................................... 54
REZULTATE DHE DISKUTIME ........................................................................... 54
3.1 Rezultatet e vlerësimit simptomatologjik ....................................................... 54
3.1.1 Plantacioni Bitinckë ..................................................................................... 54
3.1.2 Plantacioni Korçë.........................................................................................573.1.3 Plantacioni Turan ......................................................................................... 60
3.1.4 Plantacioni Cangonj ..................................................................................... 65
3.1.5 Plantacioni Dvoran ...................................................................................... 68
3.1.6 Plantacioni Zëmblak .................................................................................... 71
3.2 Rezultatet e teknikës së ngjyrimit DAPI ........................................................ 75
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
viii
3.2.1 Plantacioni Bitinckë ..................................................................................... 75
3.2.2 Plantacioni Korçë ........................................................................................ 78
3.2.3 Plantacioni Turan ......................................................................................... 80
3.2.4 Plantacioni Cangonj ..................................................................................... 83
3.2.5 Plantacioni Dvoran ...................................................................................... 86
3.2.6 Plantacioni Zëmblak .................................................................................... 89
3.3 Rezultatet e vlerësimit me anë të PCR-së....................................................... 93
3.3.1 Amplifikimi i ADN-së ribozomale specifike të fitoplazmave ..................... 93
PËRFUNDIME ........................................................................................................ 100
REKOMANDIME ................................................................................................... 102
LITERATURA ......................................................................................................... 103
SHTOJCA ................................................................................................................. 123
LISTA E PUBLIKIMEVE ...................................................................................... 136
PËRMBLEDHJE ..................................................................................................... 138
ABSTRACT .............................................................................................................. 138
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
ix
LISTA E SHKURTIMEVE
ADN Acidi dezoksiribonukleik
AP Apple Proliferation
ARN Acidi ribonukleik
bp Base pairs
BSA Bovine serum albumin
C Citozinë
Ca. Candidatus
CABI Centre for Agriculture and Biosciences International
CP Clover Proliferation
CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
DAS ELISA Double Antibody Sandwich ELISA
dd Double distilled
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
dsADN Double-stranded ADN
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EPPO European and Mediterranean plant protection organization
ESFY European Stone Fruit Yellows
Fig Figura
G Guaninë
HIV Human immunodeficiency virus
HMA Heteroduplex Mobility Assay
ICSB International Committee of Systematic Bacteriology
IRPCM International Research Programme on Comparative Mycoplasmology
kb Kilo base pairs
MLOs Mycoplasmalike organisms
OD Optical density
OY-M Onion yellows phytoplasma
PCR Polymerase chain reaction
PD Pear decline
PLN Plum leptonecrosis
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
x
PVPP Polyvinylpyrrolidone
PWB Potato witches' broom phytoplasma
PYLR Peach yellow leaf roll
rADN ADN ribozomale
rARN ARN ribozomale
RFLP Restriction fragment length polymorphism
RIA Radioimmunoassay
rpm Revolutions per minute
RYD Rice yellow dwarf
ssADN Single-stranded ADN
SSCP Single-strand conformation polymorphism
TAE Tris acetic acid EDTA (buffer)
TBE Tris borate EDTA (buffer)
TRF Terminal restriction fragments
Taq Thermus aquaticus
T-RFLP Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism
U Unit
UV Ultraviolet
32P Fosfor 32
LISTA E TABELAVE
Tabela 1.1 Klasifikimi i fitoplazmave sipas Wei et al., 2007. (*lloji i shtamit në
anglisht) (Dickinson et al., 2013). ................................................................................. 6
Tabela 1.2 Primerat specifikë për amplifikimin e rajonit 16Sr ADN tek fitoplazmat
(Duduk et al., 2013). .................................................................................................... 33
Tabela 1.3 Primerat e bazuar në gjenet rp, gjysëmuniversale, 16Sr grup-specifikë dhe
16Sr nëngrup-specifikë të dizenjuar për amplifikimin e një pjese të operonit rp të
fitoplazmave (Martini and Lee, 2013). ........................................................................ 35
Tabela 2.1 Primerat e përzgjedhur, zona që njohin dhe sekuencat e tyre (Ahrens and
Seemuller, 1992; Lorenz et al., 1995; Duduk et al., 2013). ......................................... 52
Tabela 2.2 Protokolli i ciklimit për shumëfishim duke përdorur primerat fU5/rU3;
fO1/rO1; fCPD/rCPD................................................................................................... 52
Tabela 2.3 Protokolli i ciklimit për shumëfishim duke përdorur primerat fCAP/rCAP.
...................................................................................................................................... 52
Tabela 2.4 Kategoritë e mostrave të zgjedhura për shumëfishimin me anë të PCR të
rajoneve fitoplazmatike. ............................................................................................... 53
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xi
LISTA E FIGURAVE
Figura 1.1 Krahasimi i madhësisë së gjenomës të fitoplazmave dhe baktereve të
ndryshme. Është treguar madhësia e gjenomës të Mesorhizobium loti, Escherichia coli
K-12 MG1655, Staphylococcus aureus subsp. aureus N315, ―Ca. P. asteris‖ OY-M
strain dhe Mycoplasma genitalium G37. Oshima et al. (2013). .................................. 15 Figura 1.2 Mikrografi elektronike (majtas) dhe harta e gjenomës së fitoplazmave
(djathtas). (Majtas) Fitoplazmat (pjesëzat rrethore) janë afërsisht 1 e 10 milionta e
metrit në madhësi, vetëm 1/10 e virusit gjigand të njohur si pandoravirus. (Djathtas)
Gjenoma e fitoplazmave përbëhet afërsisht nga 870,000 çifte bazash, dhe ka rreth 1/3
apo 1/4 e numrit të gjeneve të pandoravirus. © 2016 Laboratory of Plant Pathology,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo. .......... 17 Figura 1.3 Paraqitje diagramatike e operonit rARN të një fitoplazme (Smart et al.,
1996). ........................................................................................................................... 18 Figura 1.4 Fruta të vogla (në të djathtë) me bishta të gjatë, të infektuara me
fitoplazma. Loschi. DBADP, University of Udine, Italy.
http://www.cabi.org/compendia/cpc/ ........................................................................... 22 Figura 1.5 Rozetë e gjetheve, Alberto Loschi http://www.fitoplasmi.it/index1.htm.. 23 Figura 1.6 Lule me numër shumë të madh petalesh. Loschi, University of Udine,
Italy. ............................................................................................................................. 23
Figura 1.7 Gjethe molle e shëndetshme (majtas), gjethe molle (klorotike) e infektuar
nga fitoplazmat (djathtas). Biologische Bundesanstalt für Land-und Forstwirtschaft,
Institut für Pflanzenschutz im Obstbau Archive. ......................................................... 23 Figura 1.8 Gjethe molle e shëndetshme (djathtas), krahasuar me gjethe molle të
prekura nga fitoplazma (majtas). Gjethet e infektuara paraqiten me ndajgjethëza
shumë të mëdha. www.bugwood.org. .......................................................................... 23 Figura 1.9 ―Fshesa e shtrigës‖, Biologische Bundesanstalt für Land-und
Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenschutz im Obstbau Archive. www.bugwood.org.
...................................................................................................................................... 23 Figura 1.10 Ilustrim skematik i hapave të ndryshme të ngjyrimit DAPI, për
diagnostikimin e mostrave të prekura nga fitoplazmat. ©Francisco Beluzan. ............ 26
Figura 2.1 Plantacioni Bitinckë, majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në
terren.............................................................................................................................40
Figura 2.2 Plantacioni Korçë. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga
terreni. .......................................................................................................................... 40 Figura 2.3 Plantacioni Turan. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në
terren. Foto D. Mero. ................................................................................................... 40 Figura 2.4 Plantacioni Cangonj. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në
terren. ........................................................................................................................... 41 Figura 2.5 Plantacioni Dvoran. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga
terreni. Foto nga D.Mero. ............................................................................................ 41 Figura 2.6 Plantacioni Zëmblak. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga
terreni. .......................................................................................................................... 42 Figura 2.7 Ilustrim i mënyrës së shënimit të kampioneve; Druri 2, plantacioni
Zëmblak (majtas), Druri 1 Bitinckë (djathtas). Foto D. Mero. .................................... 42 Figura 2.8 Grumbullimi i mostrave; a. kategoria gjethe, druri 9, plantacioni Zëmblak,
b. kategoria trung, druri 1, plantacioni Korçë, c. kategoria kërcell, druri 10,
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xii
plantacioni Bitinckë, d. kategoria rrënjë, druri 3, plantacioni Zëmblak........... 43Figura 2.9 Gjatë grumbullimit të materialit bimor, kategoria gjethe (Plantacioni
Turan). .......................................................................................................................... 44 Figura 2.10 Mostrat e transportuara në laboratorin e Bioteknologjisë Molekulare,
FSHN, UT, a. kategoria kërcell, b. kategoria trung, c. kategoria rrënjë, d. kategoria
gjethe. ........................................................................................................................... 45 Figura 2.11 Formulari për vlerësimin simptomatologjik të bimëve. .......................... 46 Figura 2.12 a. Mikroskopi me fluoreshencë, b. mostrat e transportuara në laborator c.
mjetet e punës d. momente gjatë punës për realizimin e metodës DAPI. ................... 48 Figura 2.13 Vëzhgimi i imazhit të prerjeve të ngjyrosura me ngjyruesin fluoreshent
DAPI në kompjuter. ..................................................................................................... 48 Figura 2.14 Pamje nga puna për ekstraktimin e ADN. Laboratori i Bioteknologjisë
Molekulare, FSHN, UT................................................................................................ 50 Figura 2.15 Matja e sasisë dhe cilësisë së mostrave të ADN në spektrofotometër. Laboratori i Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT. ................................................ 51 Figura 2.16 Pamje nga puna në laborator për realizimin e PCR-së, elektroforezës së
produkteve të shumëfshimit dhe vizualizimit të produkteve në transiluminator.
Laboratori i Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT. ................................................ 51 Figura 3.1 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2014. ............................................................. 54 Figura 3.2 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2015. ............................................................. 55 Figura 3.3 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2016. ............................................................. 56
Figura 3.4 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Bitinckë. Nga
e majta në të djathtë: a. fruta me përmasa të vogla, përdredhje e gjetheve, b. degë
paralele në formën e fshesës, c. prani e insekteve. Fotot D.Mero. .............................. 56 Figura 3.5 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e
plantacionit Bitinckë për tre vitet (2014, 2015, 2016). ................................................ 57 Figura 3.6 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Korçë gjatë vitit 2014. ................................................................ 58 Figura 3.7 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Korçë gjatë vitit 2015. ................................................................ 58 Figura 3.8 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Korçë gjatë vitit 2016. ................................................................ 59 Figura 3.9 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Korçë. Nga e
majta në të djathtë: a. rritje e çrregullt, gjethe klorotike, b. lule e çrregullt, c. rozeta, d.
përdredhje e gjetheve. Fotot D.Mero. .......................................................................... 59 Figura 3.10 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e
plantacionit Korçë për tre vitet (2014, 2015, 2016). .................................................... 60 Figura 3.11 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Turan gjatë vitit 2014.................................................................. 61 Figura 3.12 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Turan gjatë vitit 2015.................................................................. 61 Figura 3.13 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Turan gjatë vitit 2016.................................................................. 62 Figura 3.14 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Turan. Nga
e majta në të djathtë: a. rritje e çrregullt, gjethe klorotike, b. prani e insekteve, c.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xiii
rozeta, d. përdredhje e gjetheve, gjethe të vogla të pazhvilluara, gjethe klorotike. Fotot
D.Mero. ........................................................................................................................ 62 Figura 3.15 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e
plantacionit Turan për tre vitet (2014, 2015, 2016). .................................................... 63 Figura 3.16 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë,
Korçë, Turan, gjatë vitit 2014. ..................................................................................... 63 Figura 3.17 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë,
Korçë, Turan, gjatë vitit 2015. ..................................................................................... 64 Figura 3.18 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë,
Korçë, Turan, gjatë vitit 2016. ..................................................................................... 65 Figura 3.19 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Cangonj gjatë vitit 2014. ............................................................. 65 Figura 3.20 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Cangonj gjatë vitit 2015. ............................................................. 66 Figura 3.21 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Cangonj gjatë vitit 2016. ............................................................. 66 Figura 3.22 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Cangonj.
Nga e majta në të djathtë: a. gjethe klorotike, b. degë paralele në formën e fshesës, c.
prani e insekteve. Fotot D.Mero. ................................................................................. 67 Figura 3.23 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e
plantacionit Cangonj për tre vitet (2014, 2015, 2016). ................................................ 67 Figura 3.24 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Dvoran gjatë vitit 2014. .............................................................. 68 Figura 3.25 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Dvoran gjatë vitit 2015. .............................................................. 69 Figura 3.26 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Dvoran gjatë vitit 2016. .............................................................. 69 Figura 3.27 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Dvoran.
Nga e majta në të djathtë: a. gjethe klorotike, b. degë paralele në formën e fshesës, c.
përdredhje e gjetheve dhe fruta të pazhvilluar. Fotot D.Mero. .................................... 70 Figura 3.28 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e
plantacionit Dvoran për tre vitet (2014, 2015, 2016)................................................... 70 Figura 3.29 Paraqitja e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2014. ......................................................................... 71 Figura 3.30 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2015. ............................................................ 71 Figura 3.31 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në
drurët e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2016. ............................................................ 72 Figura 3.32 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni
Zëmblak. Nga e majta në të djathtë: a. prani e insekteve, b. rozeta, rritje e çrregullt, c.
zverdhje dhe përdredhje e gjetheve. Fotot D.Mero. ..................................................... 72 Figura 3.33 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e
plantacionit Zëmblak për tre vitet (2014, 2015, 2016). ............................................... 73 Figura 3.34 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj,
Dvoran, Zëmblak gjatë vitit 2014. ............................................................................... 73 Figura 3.35 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj,
Dvoran, Zëmblak gjatë vitit 2015. ............................................................................... 74 Figura 3.36 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj,
Dvoran, Zëmblak gjatë vitit 2016. ............................................................................... 74
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xiv
Figura 3.37 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë
për vitet 2015, 2016. .................................................................................................... 76 Figura 3.38 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me
DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive.
Fotot D. Mero............................................................................................................... 76 Figura 3.39 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 5 e ngjyrosur me
DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 77 Figura 3.40 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë
për vitin 2015. .............................................................................................................. 77 Figura 3.41 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Bitinckë, viti 2015. ....................................................................................................... 77 Figura 3.42 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë
për vitin 2016. .............................................................................................................. 78 Figura 3.43 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Bitinckë, viti 2016. ....................................................................................................... 78 Figura 3.44 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Korçë
për vitet 2015, 2016. .................................................................................................... 78 Figura 3.45 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me
DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive.
Fotot D. Mero............................................................................................................... 79 Figura 3.46 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Korçë
për vitin 2015. .............................................................................................................. 79 Figura 3.47 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit Korçë,
viti 2015. ...................................................................................................................... 79 Figura 3.48 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Korçë
për vitin 2016 ............................................................................................................... 80 Figura 3.49 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit Korçë,
viti 2016. ...................................................................................................................... 80 Figura 3.50 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Turan
për vitet 2015, 2016. .................................................................................................... 81 Figura 3.51 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me
DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive.
Fotot D. Mero............................................................................................................... 81 Figura 3.52 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 9 e ngjyrosur me
DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 82 Figura 3.53 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Turan
për vitin 2015. .............................................................................................................. 82 Figura 3.54 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit Turan,
viti 2015. ...................................................................................................................... 82 Figura 3.55 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Turan
për vitin 2016. ............................................................................................................ 83 Figura 3.56 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit Turan,
viti 2016. ...................................................................................................................... 83 Figura 3.57 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Cangonj
për vitet 2015, 2016. .................................................................................................... 83 Figura 3.58 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur
me DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive.
Fotot D. Mero............................................................................................................... 84
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xv
Figura 3.59 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 6 e ngjyrosur me
DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 85 Figura 3.60 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Cangonj
për vitin 2015. .............................................................................................................. 85 Figura 3.61 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Cangonj, viti 2015. ....................................................................................................... 85 Figura 3.62 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Cangonj
për vitin 2016 ............................................................................................................... 86 Figura 3.63 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Cangonj, viti 2016. ....................................................................................................... 86 Figura 3.64 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran
për vitet 2015, 2016. .................................................................................................... 87 Figura 3.65 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur
me DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive.
Fotot D. Mero............................................................................................................... 87 Figura 3.66 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 5 e ngjyrosur me
DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 88 Figura 3.67 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran
për vitin 2015. .............................................................................................................. 88 Figura 3.68 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Dvoran, viti 2015. ........................................................................................................ 88 Figura 3.69 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran
për vitin 2016. .............................................................................................................. 89 Figura 3.70 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Dvoran, viti 2016. ........................................................................................................ 89 Figura 3.71 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin
Zëmblak për vitet 2015, 2016. ..................................................................................... 90 Figura 3.72 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur
me DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive.
Fotot D. Mero............................................................................................................... 90 Figura 3.73 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 1 e ngjyrosur me
DAPI, parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero. ..... 91 Figura 3.74 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin
Zëmblak për vitin 2015. ............................................................................................... 91 Figura 3.75 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Zëmblak, viti 2015. ...................................................................................................... 91 Figura 3.76 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin
Zëmblak për vitin 2016. ............................................................................................... 92 Figura 3.77 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Zëmblak, viti 2016. ...................................................................................................... 92 Figura 3.78 Amplifikimi i ADN-së ribozomale specifike të fitoplazmave duke
përdorur çiftin e primerave fU5/rU3. ........................................................................... 93 Figura 3.79 Amplifikimi i ADN-së specifike ribozomale të fitoplazmave nga mostrat
e mollës duke përdorur çiftin e primerave fU5/rU3. Fragmenti i pritshëm është 850bp.
...................................................................................................................................... 93 Figura 3.80 Zbulimi i fitoplazmave bazuar në çiftin e primerave fO1/rO1; Fragmenti
i pritshëm 1050bp. ....................................................................................................... 94 Figura 3.81 Zbulimi i fitoplazmave bazuar në çiftin e primerave fO1/rO1; mostrat 16-
18; Fragmenti i pritshëm 1050bp. ................................................................................ 94
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xvi
Figura 3.82 Çifti i primerave fCPD/rCPD amplifikoi mostrat 1-15 nga e djathta në të
majtë duke dhënë fragmentin e pritshëm 1850bp. Mostrat 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14 janë
të infektuara. ................................................................................................................ 94 Figura 3.83 Çifti i primerave fCPD/rCPD amplifikoi mostrat 1-15 nga e djathta në të
majtë duke dhënë fragmentin e pritshëm 1850bp. Mostrat 23/27 janë të infektuara. .. 94 Figura 3.84 Çifti i primerave jo ribozomalë fCAP/rCAP amplifikoi fragmentin e
pritshëm vetëm në dy raste 19/23. Produktet e tjera ishin me dimensione jo specifike
~ 200bp. ....................................................................................................................... 95 Figura 3.85 Çifti i primerave jo ribozomalë fCAP/rCAP nuk amplifikoi fragmentin e
pritshëm në asnjë prej mostrave. Produktet e tjera ishin me dimensione jo specifike ~
200bp............................................................................................................................ 95 Figura 3.86 Paraqitja grafike e rezultateve të katër çifteve të primerave në dedektimin
e fitoplazmave. ............................................................................................................. 96 Figura 3.87 Paraqitja grafike e rezultateve të dy metodave për dedektimin e
fitoplazmave për 28 mostra. ......................................................................................... 96 Figura 3.88 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e
fitoplazmave për mostrat 1-7. ...................................................................................... 97 Figura 3.89 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e
fitoplazmave për mostrat 8-14. .................................................................................... 97 Figura 3.90 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e
fitoplazmave për mostrat 15-21. .................................................................................. 98 Figura 3.91 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e
fitoplazmave për mostrat 22-28. .................................................................................. 98
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xvii
PARATHËNIE
Fitoplazmat janë përgjegjëse për një sërë sëmundjesh të bimëve të përhapura në të
gjithë botën (Lee et al., 2000). Disa prej sëmundjeve, veçanërisht ato të bimëve
drunore, janë letale (Marcone, 2010). Fitoplazmat si parazitë obligativë, janë adaptuar
për të jetuar në floemën e bimëve dhe në insekte. Përhapja e fitoplazmave varet nga
transmetimi me anë të vektorëve Hemipterë që ushqehen në floemë, pasi në
përgjithësi janë të paafta për të kaluar në mënyrë direkte në farat e bimëve apo në
vezët e insekteve (Maixner, 2010). Për mekanizmat me anë të të cilëve fitoplazmat
induktojnë sëmundje tek bimët si edhe mbi arsyet e reagimeve të ndryshme të bimëve
strehuese ndaj infeksioneve fitoplazmatike, dihet pak (Marcone, 2010). Fitoplazmat
dallojnë nga specificiteti për strehuesit, që është zakonisht më i lartë për vektorët sesa
për bimët strehuese (Lee et al., 1998). Arsyet e këtij specificiteti nuk janë të
mirëkuptuara ende, por ekzistenca e llojeve bimore rezistente dhe variacioni i
përqëndrimit të fitoplazmave në bimë të ndryshme strehuese, tregojnë se ndjeshmëria
e bimëve nuk ka të bëjë vetëm me inokulimin specifik nga vektorët, por është e lidhur
me ndërveprime komplekse të fitoplazmave me bimët strehuese (Maixner, 2010).
Kështu, fitoplazmat e grupeve të ndryshme filogjenetike, shfaqin dallime të
konsiderueshme për sa i përket strehuesve bimorë dhe vektorëve (Weintraub and
Beanland, 2006). Zverdhja, zvogëlimi i frutave, përdredhja e gjetheve, vireshenca e
luleve janë simptomat më të zakonshme të lidhura me fitoplazmat, megjithëse në disa
raste infeksionet janë asimptomatike (Lorenz et al., 1995). Të kuptuarit e plotë të
sistemeve epidemiologjike në mjaft raste pengohet nga mungesa e të dhënave mbi
epidemiologjinë e fitoplazmave. Për më tepër duhet treguar kujdes që të shmangen
përfundimet e nxituara mbi etiologjinë e sëmundjeve të caktuara fitoplazmatike, pasi
mund të jenë të përfshirë edhe patogjenë të tjerë (Danet et al., 2003; Streten et al.,
2005). Studimet e etiologjisë dhe epidemiologjisë së sëmundjeve të shkaktuara nga
fitoplazmat varen nga përdorimi i teknikave të besueshme, të ndjeshme për
dedektimin e patogjenëve në bimët dhe insektet strehuese (Firrao et al., 2007;
Maixner, 2010).
Organizmat Mykoplazmatike (MLOs) janë Mollicutes që nuk rriten në kulturë,
dedektimi i të cilave fillimisht kryhej me anë të mikroskopisë elektronike dhe teknikës
së bazuar në fluoreshencë, falë përdorimit të fluorokromit të ADN-së 4'-6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI) (Cieslinska and Kruczynska, 2011). Asnjëra prej metodave
nuk lejonte diferencimin e mikroorganizmave. Për më tepër, përshtatshmëria e
përdorimit të tyre varej nga përqëndrimi i MLO-ve në indin e floemës. Teknika DAPI
është mjaft më e ndjeshme, por e kufizuar në kushtet e sasive të vogla të MLO-ve, çka
zakonisht ndodh në strehuesit drunorë. Sipas Cieslinska and Kruczynska, (2011) është
bërë progres në zbulimin e MLO-ve duke përdorur metoda serologjike dhe
hibridizimet ADN/ADN. Sipas Bonnet et al., 1990; Doyle and Doyle, 1990 për
zbulimin e MLO-ve shkaktarë të Apple Proliferation (AP) në bimët asimptomatike të
mollës, hibridizimet me probe të shënuara rezultuan më të ndjeshme sesa DAPI kur
materiali bimor i analizuar ishte rrënja. Megjithatë, ende nuk dihet nëse kjo metodë
është më e ndjeshme sesa metoda e ngjyrimit DAPI (Cieslinska and Kruczynska,
2011). Metodat molekulare duhen përdorur për diagnozën dhe karakterizimin e
përqëndrimit të fitoplazmave në floemën e bimëve të infektuara, të cilat mund të
variojnë përgjatë sezoneve dhe në bimë të ndryshme, dhe janë mjaft të ulëta në
strehuesit drunorë. (Lorenz et al., 1995). Në mënyrë që të përftohet ADN e
fitoplazmave me cilësi të kënaqshme, janë përdorur një sërë protokollesh ekstraktimi.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xviii
Fitoplazmat e bimëve kanë gjenomë të vogël nga 530 në 1350 kb (Marcone et al.,
1999). Diagnoza rutinë e tyre bazohet në PCR, duke përdorur primera që lidhen me
rajone specifike të operonit ribozomal për grupe filogjenetike të caktuara. Gjithashtu,
janë analizuar lokuse gjenetike me synim diferencimin dhe karakterizimin e shtameve të afërta të fitoplazmave (Arnaud et al., 2007; Marcone et al., 2010). Bimët drunore
shpesh kërkojnë teknika të posaçme për të rritur ndjeshmërinë, si përdorimin e nested-
PCR ose real-time PCR (Maixner, 2010). Fitoplazmat për të cilat janë të
disponueshme rajonet 16S rADN janë klasifikuar tashmë në 20 grupe kryesore
filogjenetike. Bazuar në të dhënat molekulare të marra nga përdorimi i RFLP-së mbi
produktet e shumëfishimit me PCR të ADN-së ribozomike, hibridizimet me probe të
shënuara apo krahasimet serologjike, edhe më tepër fitoplazma u janë bashkuar këtyre
grupeve. Një total prej 75 fitoplazmash janë të dallueshme ndërmjet Mollicuteve
fitopatogjenike të analizuara në nivel molekular (Duska Delic, 2012). Për shkak të
natyrës shumë të ruajtur të 16S rADN, mjaft shtame fitoplazmatike të dallueshme
biologjikisht ose ekologjikisht, që mund të konsideroheshin si përfaqësues të
taksoneve të reja, nuk u klasifikuan si të tilla. Në këtë rast, veçori biologjike unike
shtesë si specificiteti i antitrupave, variacioni i strehuesve, specificiteti i vektorëve
transmetues, si edhe kritere të tjera molekulare (gjene) janë të nevojshme për
specifikime të mëtejshme (Carraro et al., 1998). Për të kaluar vështirësitë në
identifikimin e fitoplazmave për shkak të përqëndrimeve të ulëta, janë zhvilluar
protokolle të bazuara në hibridizime (PCR/dot blot) ose metoda serologjike
(PCR/ELISA) për të rritur ndjeshmërinë dhe specificitetin. Protokollet e Real time-
PCR mund të përmirësojnë gjithashtu ndjeshmërinë e metodave të bazuara në PCR
(Lorenz et al., 1995). Rajoni 16SrADN është shumë i ruajtur dhe vërehet
heterogjenitet i sekuencës së interoperonit 16S-23S rARN që përdoret si mjet
suplementar për të dhënë informacion shtesë mbi karakterizimin e shtameve (Carraro
et al., 1998).
Në këtë studim, për herë të parë është vlerësuar prania e fitoplazmave në kultivarë të
mollës dhe kumbullës në rrethin e Korçës, një nga rajonet kryesore të kultivimit të
dru-frutorëve në vend. Metodat e përdorura ishin vlerësimi bazuar në simptoma
(simptomatologjia), mikroskopia fluoreshente me ngjyrimin DAPI dhe shumëfishimi
specifik i rajoneve gjenomike fitoplazmatike me anë të PCR-së. Rezultatet flasin për
prani të fitoplazmave dhe shpjegojnë avantazhet dhe disavantazhet e përdorimit të
çdonjërës metodë.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
xix
QËLLIMI
Zbulimi i fitoplazmave në mollë dhe kumbulla nëpërmjet mikroskopisë me
fluoreshencë dhe shumëfishimit të fragmenteve gjenike specifike (PCR),
stabilizimi i metodikave të përdorura dhe ngritja e konsideratave mbi efikasitetin e
këtyre metodave në raport me faktorët ndikues në to.
OBJEKTIVAT
Zbulimi i fitoplazmave në bimët e mollëve dhe të kumbullave nëpërmjet
vlerësimit të simptomave, mikroskopisë me fluoreshencë me ngjyrimin DAPI
dhe shumëfishimit të fragmenteve gjenike specifike (PCR).
Krahasimi i rezultateve të verifikimit të pranisë së infeksioneve bazuar në
simptomatologji, mikroskopinë fluoreshente me ngjyrimin DAPI, PCR dhe
ngritja e konsideratave mbi avantazhet dhe disavantazhet e përdorimit të
çdonjërës.
Stabilizimi i metodikës së përdorimit të mikroskopisë me fluoreshencë me
ngjyruesin DAPI për dedektimin e fitoplazmave në mostra biologjike nga
gjethet dhe rrënjët e drurëve të mollës dhe kumbullës.
Stabilizimi i metodikës së shumëfishimit të fragmenteve gjenike specifike
ribozomale për fitoplazmat në mostra biologjike nga gjethet, rrënjët, trungjet,
kërcejtë e drurëve të mollës dhe kumbullës.
Qartësimi i faktorëve që ndikojnë në rezultatet e diagnostikimit të
infeksioneve fitoplazmatike në mollë dhe kumbulla.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
2
KAPITULLI I
KONSIDERATA TEORIKE
HYRJE
Fitoplazmat janë prokariotë pa mur qelizor, të cilët shumohen në floemë dhe
transmetohen nga njëra bimë tek tjetra nëpërmjet insekteve të familjes Cicadellidae
(Sinha and Chiykowski, 1967; Purcell, 1982). Ato rriten në gypin tretës, hemolimfë,
gjendrat e pështymës dhe brënda qelizave në organe të ndryshme të trupit të insekteve
vektorë (Purcell, 1982). Sot, mendohet se fitoplazmat shkaktojnë më shumë se 300
sëmundje në specie të ndryshme të bimëve duke përfshirë pemët frutore, pyjet, pemët
dekorative, barërat, perimet, lulet dhe kulturat bujqësore (McCoy et al., 1989).
Ashpërsia dhe natyra e simptomave të sëmundjes varen nga bima dhe nga agjenti
fitoplazmatik. Disa bimë mund të mos shfaqin simptoma për vite me rradhë, madje
edhe kur përqëndrimi i fitoplazmave në inde është i lartë. Në raste të tjera, bimët
shkatërrohen shumë shpejt dhe vdesin megjithëse përqëndrimi i fitoplazmave në to
është shumë i vogël. Simptomat e sëmundjes variojnë nga bima në bimë dhe
përfshijnë zverdhje, ―xhuxhëri‖, vireshencë, zhvillim jo normal të luleve në struktura
gjethore, proliferim, ―fshesën e shtrigës‖, venitje deri në rënie (Kollar et al., 1990).
Kohët e fundit bazuar tek teknikat e biologjisë molekulare, është bërë progres i
rëndësishëm në zbulimin, identifikimin dhe studimin filogjenetik të fitoplazmave.
Madhësia e gjenomës së fitoplazmave varion nga 450 në 1180 kb (Davis et al., 1990;
Neimark and Kirkpatrick, 1991; Lim and Sears, 1991; Sears and Kirkpatrick, 1994).
Një shumëllojshmëri e teknikave molekulare, duke përfshirë analizën e plotë të
sekuencës 16S rADN, sekuencës specifike 16S-23S rADN dhe reaksionin zinxhir të
polimerizimit (PCR) me primera specifike, janë përdorur për ekzaminimin e shtameve
të ndryshme të fitoplazmave (Deng and Hiruki, 1990a, b, c, 1991a, b; Lee et al.,
1993b; Namba et al., 1993b; Gundersen et al., 1994a, b; Seemuller et al., 1994).
Njëmbëdhjetë grupe të ndryshme të gjenomave 16S rARN të fitoplazmave dhe më
shumë se 25 nëngrupe janë identifikuar në bazë të rezultateve të analizës RFLP të
ADN-së ribozomale (16S rADN) të shumëfishuar nëpërmjet PCR-së (Gundersen et al., 1994b, 1996; Lee et al., 1993b).
Ndërkohë, metodat e kontrollit duket se variojnë në mënyrë të konsiderueshme nga
një sëmundje tek tjetra, në varësi të tipit të patogjenit, bimës strehuese, ndërveprimit
ndërmjet patogjenit dhe bimës dhe shumë faktorëve të tjerë (Agrios, 2004). Studime
më të detajuara pritet të zbulojnë lidhjen midis strukturës së gjeneve dhe funksionit
për të mundësuar kontrollin e sëmundjes.
Me qëllim avancimin në këtë fushë të kërkimit nevojiten njohuri bazë rreth
epidemiologjisë, mekanizmit të patogjenitetit të fitoplazmave, ndikimit të faktorëve të
mjedisit në sëmundje, zhvillimit të simptomave dhe natyrës rezistente/tolerante të
bimëve strehuese. Kontrolli i shpërthimit të epidemive të sëmundjeve fitoplazmatike
teorikisht mund të kryhet me kontrollin e vektorëve, duke eleminuar patogjenin nga
bimët e infektuara të kulturave meristematike ose me përdorimin e antibiotikëve apo
kimikateve të tjera (Bertaccini, 2007).
Zhvillimi i disa teknikave molekulare kohët e fundit ka çuar në lindjen e linjave të
reja të kërkimit në fushën e fitoplazmologjisë. Kështu, është zbuluar se infeksioni
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
3
fitoplazmatik mund të sjellë prodhimin e proteinave mbrojtëse, rritjen e komponimeve
fenolike dhe mbiprodhimin e peroksidit të hidrogjenit në bimët strehuese (Junquera et
al., 2004; Musetti et al., 2000; 2005).
Sëmundjet fitoplazmatike të pemëve frutore në Europë përfshijnë tre çrregullime
ekonomikisht të rëndësishme: Apple Proliferation (AP), Pear Decline (PD) dhe
European Stone Fruit Yellows (ESFY). Raportime të kontrollit ndër vite për praninë e
këtyre infeksioneve në rajone të ndryshme të Europës flasin për prani, por nuk japin statistika të detajuara. Raportimet mbi praninë e fitoplazmave në Shqipëri adresojnë
kontrolle në tetë rrethe të ndryshme të Shqipërisë Juglindore dhe Qëndrore ku u
vërrejtën simptoma të European stone fruit yellows, Apple proliferation, Pear decline
dhe Grapevine yellows (Myrta et al., 2003).
1.1 Të dhëna të përgjithshme
Fitoplazmat, të njohura më parë si ―Mycoplasma-like organisms‖ ose MLOs, janë
baktere të specializuara, parazitë të detyruar të indeve floematike bimore dhe të disa
llojeve të insekteve. Fitoplazmat mendohet se kanë rrjedhur nga bakteret gram
pozitive dhe i përkasin gjinisë ―Candidatus Phytoplasma‖ të klasës Mollicutes
(IRPCM, 2004). Ato nuk mund të shumohen in vitro. Janë pleomorfike duke qënë se
ju mungon muri qelizor, kanë një diameter më të vogël se 1 mikrometër dhe gjenoma
shumë të vogla (680-1,600 kb). Gjenomat e fitoplazmave ndryshojnë shumë në
madhësi kur krahasohen me gjenomat e paraardhësve të tyre (baktere me mur qelizor
në grupin Bacillus/Clostridium). Fitoplazmave u mungojnë disa rrugë biosintetike për
sintezën e komponentëve të rëndësishëm për mbijetesën e tyre dhe ata mund ti
sigurojnë këto substanca nga bimët apo insektet ku parazitojnë (Bai et al., 2006).
1.1.1 Morfologjia
Mollicutes janë prokariotë. Ata janë mikroorganizma njëqelizorë, materiali gjenetik i
të cilëve (ADN) nuk është i rrethuar nga membrana, ndaj nuk është i organizuar në një
bërthamë. Qelizat e këtyre mikroorganizmave kanë citoplazëm ku janë të zhytura
ribozomet (70S) dhe ADN-ja. Citoplazma tek Mollicutes është e rrethuar vetëm nga
membrana plazmatike, ndryshe nga bakteret ku është e rrethuar nga membrana
plazmatike dhe muri qelizor gjithashtu (Agrios, 2004). Fitoplazmat mund të bëhen të
dukshme në materialet e infektuara me anë të mikroskopisë. Morfologjia e tyre shpesh
është përshkruar si pleomorfike (marrin forma të ndryshme; rrethore, filamentoze) me
diametër më pak se 1 µm (Lee et al., 2000). Duke qënë se rritja në kulturë in vitro
akoma nuk është bërë e mundur, kërkohet personel i kualifikuar në përdorimin e
teknikave, të cilat përfshijnë rajonizimin dhe fiksimin e ndjekur nga mikroskopia me
fluoreshencë me ngjyrimin DAPI apo dhe mikroskopia elektronike. Kohët e fundit
janë zhvilluar metoda të marrjes të bioimazheve duke përdorur ngjurues fluoreshentë
vitalë dhe mikroskopinë konfokale me lazer me skanim për të bërë të dukshme
fitoplazmat in situ (Christensen et al., 2004).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
4
1.1.2 Përcaktimi i fitoplazmave
Fitoplazmat (më herët të quajtura organizma të ngjashme me mykoplazmat) i përkasin
klasës Mollicutes. Fitoplazmat rriten dhe riprodhohen vetëm në indet e gjalla të
bimëve strehuese. Ndryshe nga shumica e mykoplazmave humane dhe shtazore,
fitoplazmat nuk mund të rriten në terrene artificiale, duke përfshirë edhe terrenin ku
rriten të gjitha mykoplazmat tipike (Lee and Davis, 1992). Duke qënë së këta
patogjenë nuk rriten in vitro dhe janë të ―pakapshëm‖ tek bimët ku strehoen, njohuritë
në lidhje me karakteristikat e tyre biologjike janë të kufizuara (Christensen et al.,
2005). Kjo pamundësi e ka bërë të vështirë përcaktimin e statusit taksonomik të
fitoplazmave, me metodat tradicionale të aplikuara për prokariotët që rriten në terrene
artificiale. Aktualisht, për shkak të zhvillimit të teknikave molekulare është bërë i
mundur identifikimi i fitoplazmave duke u bazuar tek sekuenca e nukleotideve të
gjenit 16S rARN (Gundersen et al., 1994; Lim and Sears, 1989; Namba et al., 1993;
Sawayanagi et al., 1999; Seemüller et al., 1994). Antitrupat specifikë, probet e ADN-
së, profilet e RFLP-së dhe analizat e gjenit 16S rARN, janë përdorur gjerësisht dhe
kanë qenë shumë të dobishme për zbulimin dhe identifikimin e patogjenëve tek bimët
e dyshuara. Gjithashtu këto teknika kanë dhënë kontribut të rëndësishëm në grupimin,
klasifikimin e patogjenëve si dhe kontrollin e sëmundjeve (Agrios, 2004). Kohët e
fundit, për më tepër, është realizuar sekuencimi i gjenomave të plota të disa
fitoplazmave (Bai et al., 2006; Oshima et al., 2004; Christensen et al., 2005). Metodat
molekulare dhe proçedurat dedektuese të ndjeshme, të cilat u zhvilluan në dekadën e
kaluar, premtuan përparime të mëdha në diagnostikimin e sëmundjeve të shkaktuara
nga fitoplazmat dhe kanë lehtësuar karakterizimin e tyre (Davies and Clark, 1992;
Firrao et al., 1996).
1.1.3 Pozicioni filogjenetik i fitoplazmave
Fitoplazmat kanë diverguar nga eubakteret gram pozitive dhe i përkasin gjinisë
Phytoplasma brenda klasës Mollicutes dhe rendit Acholeplasmatales. Aktualisht
fitoplazmat janë në statusin Candidatus që përdoret për bakteret të cilat nuk mund të
kulturohen in vitro. Kohët e fundit, analizat filogjenetike bazuar në 16S rARN dhe
proteinat ribozomale të sekuencës së gjeneve kanë zbuluar se fitoplazmat formojnë
një grup të madh diskret, monofiletik, brenda klasës Mollicutes (Gundersen et al.,
1994). Grupet taksonomike të fitoplazmave bazohen në ndryshimet e madhësisë së
fragmenteve të prodhuara nga tretja e sekuencës të gjenit 16SrARN (RFLP) ose nga
krahasimi i sekuencave të ADN-së nga rajonet ndarëse 16S/23S (Hodgetts et al.,
2007).
Klasifikimi i fitoplazmave ka qënë i vështirë për një kohë të gjatë sepse për këtë grup
mungojnë karakteristika të qëndrueshme morfologjike (fenomeni i pleomorfisë që
përmendëm më lart) dhe se ato nuk kultivohen in vitro si bakteret. Vështirësitë për të
përdorur karakteristika morfologjike, biokimike dhe fiziologjike si kritere krahasimi
kanë bërë që studiuesit të hezitojnë për t‘i dhënë atyre një taksonomi të qartë dhe
raporte filogjenetike me mikroorganizmat e tjerë të ngjashëm me to.
Në vitet 1972-1973, duke u bazuar në studimet mbi grupin e sëmundjeve të
―zverdhjeve bimore‖, shkaktarët e tyre u klasifikuan në dy grupe: (i) spiroplazma,
organizma në formë spirale ose helike dhe të kultivueshme në kulturë in vitro; (ii)
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
5
mykoplazma, organizma që nuk kishin formë helike dhe që nuk kultivohen në
substrate artificiale, duke bërë të pamundur plotësimin e 4 postulateve të Koch për
identifikimin e patogjenëve bimorë.
Në vitin 1993, Komiteti Ndërkombëtar i Bakteriologjisë Sistematike (ICSB,
International Committee of Systematic Bacteriology) nëpërmjet Nënkomitetit për
Mollicutes vendosi të pranojë propozimin e B.C. Kirkpatrick dhe B.B. Sears, për
zëvendësimin e emrit të mykoplazmave të bimëve nga MLO në fitoplazma. Me këtë
rast u formuluan edhe kriteret specifike që duhet të plotësojnë mikroorganizmat për tu
klasifikuar si fitoplazma:
- mikroskopia elektronike me transmetim duhet të evidentojë formën e tyre
pleomorfike dhe mungesën e murit qelizor;
- të gjenden në tubat kribrozë të floemës dhe të jenë të lidhura me sëmundje me
simptoma si dobësim i përgjithshëm, zverdhje dhe/ose anomali të zhvillimit të
organeve, sidomos të luleve;
- ato transmetohen në natyrë nga cikadet, psillat, etj., që janë insekte që
ushqehen në floemën e bimëve strehuese;
- ato janë rezistente ndaj penicilinës, por janë shumë të ndjeshme ndaj
tetraciklinës;
- gjenoma e tyre është e vogël (530-1350 kb) dhe përbërja e binomit G
(guaninë) + C (citozinë) është e vogël dhe përfaqëson afro 23-29% të bazave
totale;
- analiza e sekuencave duhet të provojë që janë të lidhura filogjenetikisht me
Mollicutes të tjerë.
Vetëm përdorimi i biologjisë molekulare dhe rradhitjes së sekuencave nukleotidike,
nga fillimi i viteve ‗90, arriti të kapërcejë këto vështirësi duke siguruar kritere të reja
shkencore për klasifikimin e fitoplazmave. Analiza PCR/RFLP e fragmenteve të
veçanta të konservuara gjatë evolucionit të këtij grupi (gjenit 16S rARN) mundësoi
ndarjen e fitoplazmave në grupe ribozomike (16Sr) dhe identifikimin e shumë
nëngrupeve të tyre. Njohuritë e fituara në studimet gjenomike të fitoplazmave kanë
evidentuar qartë se taksonomia e bazuar vetëm në analizën e gjenit 16S rRNA nuk
ishte e mjaftueshme për të diferencuar fitoplazmat me ngjashmëri të lartë. Për këtë
qëllim sot përdoren sekuenca të tjera gjenomike që kodifikojnë proteina ribozomike si
rpL22 dhe rpS3, translokazën e membranës SecY dhe faktorin e zgjatjes së
traduksionit Tu, që japin informacione më të thelluara për klasifikimin dhe
taksonominë e fitoplazmave. Dhjetëvjeçari i parë i viteve 2000 u karakterizua nga
interesi në rritje për studimet e fitoplazmave. Për t‘u përmendur është krijimi i grupit
të parë studimor për fitoplazmat (International Phytoplasmologist Working Group), i
cili tani mblidhet rregullisht dhe kontribuon për grumbullimin dhe përhapjen e
njohurive mbi fitoplazmat. Ecuria e shpejtë e kërkimit në fushën e fitoplazmave bën
që klasifikimi i mësipërm të jetë provizor dhe sigurisht që do të pasurohet në të
ardhmen me specie të reja (Susuri L.R., and Myrta A., 2012).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
6
Tabela 1.1 Klasifikimi i fitoplazmave sipas Wei et al., 2007. (*lloji i shtamit në anglisht)
(Dickinson et al., 2013).
Gr.16Sr Specia Candidatus Lloji i shtamit Numri në
bankën gjenetike
Shpërndarja
gjeografike
I-A Ca. Phytoplasma asteris Aster yellows witches‘ broom NC_007716 Amerika e Veriut,
Europë
I-B Ca. Phytoplasma asteris Onion yellows NC_005303 Në të gjithë globin I-C Ca. Phytoplasma asteris Clover phyllody AF222065 Amerike e Veriut,
Europë
I-D Ca. Phytoplasma asteris Paulownia witches‘ broom AY265206 Azi I-E Ca. Phytoplasma asteris Blueberry stunt AY265213 Amerika e Veriut
I-F Ca. Phytoplasma asteris Apricot chlorotic leaf roll AY265211 Spanjë
II-A Peanut witches‘ broom L33765 Azi
II-B Ca. Phytoplasma aurantifolia Lime witches‘ broom U15442 Gadishulli Arabik
II-C Cactus witches‘ broom AJ293216 Azi, Afrikë
II-D Ca. Phytoplasma australasiae* Papaya yellow crinkle YI0097 Australi III-A Ca. Phytoplasma pruni* Western X disease L04682 Amerika e Veriut
III-B Clover yellow edge AF189288 Amerikë, Azi, Europë
IV-A Ca. Phytoplasma palmae* Coconut lethal yellowing AF498307 Karaibe, Florida IV-B Ca. Phytoplasma palmae* Phytoplasma sp. LfY5(PE65) Oaxaca AF500334 Meksikë
IV-D Ca. Phytoplasma palmae* Carludovica palmate leaf yellowing AF237615 Meksikë
V-A Ca. Phytoplasma ulmi Elm yellows AY197655 Amerika e Veriut, Europë
V-B Ca. Phytoplasma zizphi Jujube witches‘ broom AB052876 Azi V-C Ca. Phytoplasma vitis* Alder yellows AY197642 Europë
V-G Jujube witches‘ broom related AB052879 Azi
VI-A Ca. Phytoplasma trifolii Clover proliferation AY390261 Amerika e Veriut, Europë
VII-A Ca. Phytoplasma fraxini Ash yellows AF092209 Amerika e Veriut
VIII-A Ca. Phytoplasma luffae* Loofah witches‘ broom AF353090 Taivan
IX-A Pigeon-pea witches‘ broom AF248957 Amerikë
IX-D Ca. Phytoplasma phoenicium Almond witches‘ broom AF515636 Lindje e Mesme
X-A Ca. Phytoplasma mali Apple proliferation AJ542541 Europë X-C Ca. Phytoplasma pyri Pear decline AJ542543 Europë
X-D Ca. Phytoplasma spartii Spartium witches‘-broom X92869 Europë
X-F Ca. Phytoplasma prunorum European stone fruit yellows AJ542544 Europë
XI-A Ca. Phytoplasma oryzae Rice yellow dwarf AB052873 Azi, Afrikë, Europë
XII-A Ca. Phytoplasma solani* Stolbur AJ964960 Europë
XII-B Ca. Phytoplasma australiense Australian grapevine yellows L76865 Australi
XII-C Strawberry lethal yellows AJ243045 Australi XII-D Ca. Phytoplasma japonicum Japanese hydrangea phyllody AB010425 Japoni
XII-E Ca. Phytoplasma fragariae Strawberry yellows DQ086423 Europë
XIII-A Mexican periwinkle virescence AF248960 Meksikë, Florida
XIV-A Ca. Phytoplasma cynodontis Bermudagrass whiteleaf AJ550984 Azi, Afrikë
XV-A Ca. Phytoplasma brasiliense Hibiscus witches‘ broom AF147708 Brazil XVI-A Ca. Phytoplasma graminis Sugar cane yellow leaf AY725228 Kubë
XVII-A Ca. Phytoplasma caricae Papaya bunchy top AY725234 Kubë
XVIII-A Ca. Phytoplasma americanum Potato purple top wilt DQ174122 Amerika e Veriut
XIX-A Ca. Phytoplasma castanae Chestnut witches‘ broom AB054986 Japoni XX-A Ca. Phytoplasma rhamni Buckthorn witches‘ broom X76431 Gjermani
XXI-A Ca. Phytoplasma pini Pine shoot proliferation AJ632155 Spanjë
XXII-A Ca. Phytoplasma cocosnigeriae* Coconut lethal decline Y14175 Mozambik, Afrikë
XXIII-A Buckli valley grapevine yellows AY083605 Australi
XXIV-A Sorghum bunchy shoot AF509322 Australi
XXV-A Weeping tea witches‘ broom AF521672 Australi XXVI-A Sugar cane Phytoplasma D3T1 AJ539179 Mauritius
XXVII-A Sugar cane Phytoplasma D3T2 AJ539180 Mauritius
XXVIII-A Derbid Phytoplasma AY744945 Kubë XXIX-A* Ca. Phytoplasma allocasuarinae Allocasuarina muelleriana
phytoplasma
AY135523 Australi
XXX-A* Ca. Phytoplasma cocstanzaniae* Tanzanian lethal decline X80117 Tanzani
1.2 Fitoplazmat dhe sëmundjet e lidhura me to
Prania e fitoplazmave është shoqëruar me një numër të gjerë sëmundjesh që prekin
bimët në mbarë botën. Simptomat që shfaqin bimët e infektuara variojnë në bazë të
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
7
bimës bujtëse, shtamit fitoplazmatik dhe faktorëve mjedisorë. Ndër simptomat e
vërrejtura bëjnë pjesë ndryshimi i ngjyrës së gjetheve në të verdhë ose lejla, petalet në
ngjyrë të gjelbër, shndërrimi i organeve lulore në struktura gjethore, Witches‘ broom,
humbje e vitalitetit e deri në vdekje të bimës.
Sëmundjet fitoplazmatike mund të zvogëlojnë në mënyrë të konsiderueshme rritjen
dhe prodhimin ose të reduktojnë dobinë e bimës apo produktit bimor. Bimët e
shëndetshme rriten dhe funksionojnë në maksimumin e potencialit të tyre gjenetik.
Megjithatë, bimët konsiderohen të infektuara kur ato janë të prekura negativisht nga
një agjent shkaktar i sëmundjes i cili pengon zhvillimin e tyre normal dhe funksionet
fiziologjike (Agrios, 2004). Diagnoza korrekte e shkaktarit të sëmundjes është një hap
thelbësor për të ndërtuar një strategji të përshtatshme për menaxhimin e sëmundjes
bimore. Zakonisht hapi i parë përfshin përcaktimin e shkakut të mundshëm të
sëmundjes: nëse sëmundja është shkaktuar nga një agjent infektiv (patogjen) ose nga
një faktor mjedisor. Sëmundjet e bimëve shkaktohen nga faktorë pa jetë (abiotikë, jo
parazitë, jo infektivë, jo patogjenë) dhe agjentë të gjallë (biotikë, parazitë, infektivë,
patogjenë) gjithashtu. Në anën tjetër, sëmundjet bimore grupohen duke u bazuar tek
agjenti shkaktar i përfshirë (sëmundje të defiçencës, sëmundje kërpudhore, sëmundje
bakteriale, sëmundje virale, sëmundje fitoplazmatike, etj), pjesa bimore e prekur ose
lloji i simptomave (Agrios, 2004).
Ndryshimet karakteristike të brendshme ose të jashtme që shfaq bima si reagim ndaj
agjentit që shkakton sëmundje, quhen simptoma. Patologjia bimore është studimi i
patogjenëve; faktorëve të mjedisit që shkaktojnë sëmundje tek bimët, metodave të
parandalimit ose kontrollit të sëmundjeve dhe reduktimit të dëmit që ato shkaktojnë.
Sëmundjet e pakontrolluara të bimëve mund të sjellin prodhim më të vogël ushqimor,
çmime më të larta të ushqimeve ose ushqime me cilësi të ulët (Agrios, 2004). Gjatë
dekadave të fundit, shkencëtarët e patologjisë bimore molekulare gjithashtu kanë
krijuar një seri të re të mjeteve dhe teknikave të cilat përdoren për zbulimin dhe
identifikimin e patogjenëve edhe kur ata janë në numër të vogël ose të përzier me
patogjenë të tjerë me të cilët lidhen ngushtësisht. Mjete të tilla përfshijnë dedektimin
me antitrupa monoklonalë, llogaritjen e përqindjes së hibridizimit të acideve nukleike
të tyre dhe përcaktimin e sekuencave të nukleotideve të acideve nukleike të
patogjenëve. Që nga mesi i viteve 1980, fragmente të ADN-së, të quajtura probe,
komplementare me segmente specifike të acideve nukelike të mikroorganizmave, janë
shënuar me izotope radioaktive ose flurorofore dhe janë përdorur gjerësisht për
zbulimin dhe identifikimin e patogjenëve të bimëve (Agrios, 1997; Soufi Z, 2012).
1.2.1 Transmetimi dhe përhapja e sëmundjeve të fitoplazmave
Në natyrë fitoplazmat transmetohen përmes vektorëve (insekte, etj), dukuri e cila
ndodh në masë. Insektet i mbartin fitoplazmat duke u ushyer me bimët e infektuara
dhe i transmetojnë tek bimët e shëndetshme pas një periudhe latente gjatë së cilës
fitoplazmat lëvizin dhe shumohen në trupin e vektorit. Insektet që i mbartin, mbeten
shpesh burim infeksioni gjatë gjithë ciklit jetësor të tyre. Vektorët e fitoplazmave i
përkasin rendit Hemiptera dhe përbëhen nga tre grupe taksonomike kryesore:
leafhopper (Auchenorrhyncha: Cicadellidae), planthopper (Auchenorrhyncha:
Fulgoromorpha), dhe psillat (Sternorrhyncha: Psyllidae) (Weintraub and Beanland,
2006; Ploaie, 1981). Këto insekte kanë një metabolizëm dhe mënyrë të ushqyeri, e
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
8
cila favorizon transmetimin e fitoplazmave. Ato janë hemimetabolikë, ndaj ashtu si të
rriturit edhe larvat zotërojnë të njëjtën mënyrë të ushqyeri, për rrjedhojë që të dy janë
të aftë ti transmetojnë fitoplazmat. Për më tepër, ata kryesisht ushqehen me lëndët e
gjendura në floemë duke përdorur një mekanizem thithës jo destruktiv, i cili
parandalon dëmtimin e indit përçues dhe eliminon mundësinë e induktimit të një
përgjigjeje mbrojtëse (Dickinson et al., 2013).
Identifikimi i saktë i specieve të insekteve vektorë të përfshira në transmetimin e
fitoplazmave është një kusht kryesor për të menaxhuar në mënyrë sa më të mirë
përhapjen e tyre dhe ngritjen e planeve të veprimit për parandalim. Taksonomia e
vektorëve të fitoplazmave tradicionalisht është bazuar në karakterisikat morfologjike.
Zakonisht morfologjia e jashtme e trupit mundëson identifikimin deri në nivel familje
dhe gjinie, ndërkohë që morfologjia gjenitale përdoret për të përcaktuar speciet.
Fatkeqësisht identifikimi i tipareve dalluese është shpesh i vështirë dhe kërkon
eksperiencë. Një eksperiencë e tillë zotërohet vetëm nga një numër i vogël
specialistësh entomologë të fokusuar në klasa specifike insektesh. Për më tepër
taksonomia në nivel specie është kryesisht e bazuar në morfologjinë gjenitale të
individëve të rritur meshkuj, dukuri e cila vështirëson identifikimin e individëve në
fazë rinore dhe atyre femra (Bosco and Tedeschi, 2013).
1.2.2 Aspekte të epidemiologjisë së fitoplazmave
Fitoplazmat përhapen më së shumti nëpërmjet insekteve të familjes Cicadellidae
(leafhoppers), Fulgoridae (planthoppers) dhe Psyllidae, të cilat ushqehen tek indet e
floemës të bimëve të infektuara duke marrë fitoplazmat dhe duke i transmetuar ato tek
bimët fqinje ku ato ushqehen. Për këtë arsye gama e strehuesve të fitoplazmave varet
nga insektet vektorë. Fitoplazmat përmbajnë një proteinë të madhe antigjenike që
përbën shumicën e proteinave sipërfaqësore të qelizës. Kjo proteinë është zbuluar se
ndërvepron me komplekset e mikrofilamenteve të muskujve të zorrës së hollë të
insekteve dhe mendohet se është e rëndësishme në transmetimin e infeksionit (Suzuki
et al., 2006; Hoshi et al., 2007). Fitoplazmat mund të dimërojnë tek insektet vektorë
ose në bimët shumëvjeçare; ato mund të kenë ndikime të ndryshme tek strehuesit e
tyre specifikë (Christensen et al., 2005). Fitoplazmat gjenden në shumicën e organeve
të insekteve vektorë. Ato hyjnë në trupin e insekteve nëpërmjet rostrumit, lëvizin
përmes zorrës së hollë dhe kalojnë në hemolimfë. Prej aty ato vazhdojnë të
kolonizojnë gjendrat e salivës (pështymës), një proçes i cili mund të zgjatë disa javë.
Koha midis proçesit të thithjes së fitoplazmave nga insektet vektorë dhe arritjes së
përqëndrimit infektiv në gjendrat e pështymës (mundësia për tu transmetuar) quhet
periudha latente. Disa transmetime të fitoplazmave në insekte janë raportuar si
transovariale (transmetimi i patogjenëve nëpërmjet organizmave) të tilla si për
kombinimet Scaphoideus titanus/aster yellows (Danielli et al., 1996; Alma et al.,
1997); Hishimonoides sellatiformis/mulberry dwarf (Kawakita et al., 2000),
Matsumuratettix hiroglyphicus (Matsumura)/sugarcane white leaf (Hanboonsong et
al., 2002) dhe Cacopsylla melanoneura (Tedeschi et al., 2006). Fitoplazmat dhe disa
viruse që infektojnë bimët mund të transmetohen nga bimët e infektuara tek ato të
shëndetshme nëpërmjet kuskutave (Cuscuta sp.). Transmetimi eksperimental i
fitoplazmave nga bimët e infektuara tek ato të shëndetshme të të njëjtës specie ose të
specieve të ndryshme, mund të realizohet në laborator ose në serë. Kohët e fundit
është marrë në studim mundësia e transmetimit të fitoplazmave nëpërmjet farave. Pas
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
9
dyshimeve të para lidhur me përhapjen epidemiologjike të coconut lethal yellowing
(Cordova et al., 2003) studime të tjera mbi kulturat e alfalfa (Medicago sativa L.) të
prekura ashpërsisht nga fitoplazmat, verifikojnë mundësinë e transmetimit të
fitoplazmave nëpërmjet farave (Khan et al., 2002a; Botti and Bertaccini, 2006a).
Fitoplazmat mund të përhapen gjithashtu nëpërmjet shumimit vegjetativ siç është
shartimi i një bime të shëndetshme me një pjesë nga bima e infektuar, mikroshumimi
apo edhe mënyra të tjera që përdoren për shumimin e gjermoplazmës të bimës duke
shmangur shumimin seksual. Fitoplazmat janë në gjendje të lëvizin nëpërmjet gypave
shoshë të floemës nga burimi drejt pjesëve të tjera (Christensen et al., 2004). Disa
studime kanë treguar shpërndarje të pabarabartë të fitoplazmave tek bimët strehuese
(Seemüller et al., 1984) dhe një luhatje sezonale të popullatave të patogjenit tek drurët
strehues. Në përgjithësi, niveli i fitoplazmave është i ulët në rrënjë dhe mesatar në
kërcej. Përqëndrimi më i lartë është gjendur tek organet burimore (gjethe të
maturuara) rreth 40 herë më i lartë së në rrënjë. Përqëndrimi i lartë i fitoplazmave në
rajonet burimore tregon se fitoplazmat shumohen më shpejt aty. Është raportuar një
variacioni në sasinë e ADN-së së fitoplazmave midis bimëve individuale të shartuara
me material nga një bimë prindërore e infektuar (Christensen et al., 2004). Për drurët
gjetherënës, mendohet që fitoplazmat zhduken nga pjesët ajrore të pemës gjatë dimrit
dhe jetojnë në sistemin rrënjor, për të rikolonizuar më pas kërcejtë dhe gjethet në
pranverë (Seemüller et al., 1984, Guthrie et al., 1998). Prania e fitoplazmave në
dimër, në pjesët ajrore të kultivarëve të dardhës dhe specieve të gjinisë Prunus është
raportuar nga Errea et al. (2002) dhe Jarausch et al. (1999b).
1.2.3 Sëmundjet fitoplazmatike dhe rëndësia e tyre ekonomike
Fitoplazmat janë të lidhura me sëmundjet e bimëve në qindra specie bimore të
ndryshme duke përfshirë shumë ushqime të rëndësishme, perime, fruta, bimë
zbukuruese dhe drurë të tjerë (Ahrens et al., 1993; Andersen et al., 1998; Davis et al.,
1998; Errampalli et al., 1991; Zreik et al., 1995). Lista e sëmundjeve që shkaktohen
nga fitoplazmat vazhdon të rritet. Shumë sëmundje të reja janë identifikuar vitet e
fundit, ose sëmundje të njohura janë lidhur me fitoplazmat si shkaktarë të tyre.
Fitoplazma të caktuara kanë përhapje gjeografike të ndryshme si sëmundja Citrus
Huanglongbing e cila lidhet me fitoplazmën aster yellows në Kinë (16SrI) (Chen et
al., 2008) dhe me fitoplazmën pigeon pea witches’ broom (16SrIX) në Brazil
(Teixeira et al., 2009). Shumë nga bimët e kultivuara janë të prekura nga infeksionet
fitoplazmatike jo vetëm në vendet ku bujqësia nuk është ende e zhvilluar, por
gjithashtu edhe në vendet që njihen si të avancuara në këtë drejtim, ku këta patogjenë
janë duke ndikuar ashpërsisht tek bimët barishtore dhe ato drunore gjithashtu
(Bertaccini, 2007). Infeksionet fitoplazmatike janë faktorët kryesorë limitues për
prodhimin e shumë kulturave bimore në gjithë botën. Për shembull, fitoplazma aster
yellows kontribuon në humbjet e mëdha ekonomike të shumë perimeve (p.sh. sallata
jeshile, karota dhe selino) dhe bimëve zbukuruese (p.sh. gladiola, hydrangea, China
aster, dhe purple coneflower) në Amerikën e Veriut dhe disa pjesë të Europës. Peach
yellows dhe X-disease gjatë viteve 90 kanë ndikuar në humbjen e prodhimit të
pjeshkëve dhe qershive në Amerikë. Në disa rajone të Lindjes së Mesme, agrumet
preken nga sëmundjet fitoplazmatike të tilla si lime witches‘ broom, që pothuajse po
eleminon prodhimin tradicional të limonit në Oman dhe në Iran. Rice yellow dwarf
prek kulturat e orizit në rajone të ndryshme të Azisë Juglindore; potato witches‘
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
10
broom dhe maize bushy stunt janë përgjegjës për humbjen e prodhimit të patates dhe
misrit, respektivisht në Amerikën Qëndrore dhe atë të Jugut. Sweet potato witches‘
broom dhe sëmundje të lidhura me të janë përgjegjëse për humbjen e prodhimit të
patates së ëmbël në Azi dhe Australi, cassava witches‘ broom për humbjen e
kulturave të cassava në Amerikën e Jugut; grapevine yellows influencon ashpërsisht
prodhimin e rrushit në Europë dhe Australi. Pear decline, Apple proliferation,
European stone fruit yellows dhe sëmundje të tjera reduktojnë prodhimin dhe cilësinë
e frutave të freskëta në Europë; sëmundjet e bimëve bishtajoreve të tilla si peanut
witches‘ broom, sesame dhe soybean phyllody shkaktojnë humbjen e këtyre kulturave
në Azi. Në anën tjetër, edhe pyjet gjithashtu dëmtohen rëndë nga sëmundjet e lidhura
me fitoplazmat si paulownia witches‘ broom, coconut lethal yellowing, dhe mulberry
dwarf që reduktojnë praninë e këtyre specieve drunore në kontinente të ndryshme.
Elm yellows ose witches‘ broom është një sëmundje, e cila pothuajse ka eleminuar të
gjitha plantacionet e reja dhe ato të vjetra në Europë dhe në Amerikën e Veriut; tek
bimë të veçanta të cilat i mbijetuan epidemisë të rëndë të sëmundjes dutch elm disease
u shkatërruan nga infeksione fitoplazmatike pasuese (Sinclair et al., 1996; Bertaccini,
2007). Për shkak të këtyre sëmundjeve, transporti i shumë specieve bimore të prekura
duhet të ndalohet në nivel ndërkombëtar nga rregullat e karantinës (Lee et al., 2000;
Bertaccini, 2007).
1.2.4 Disa fitoplazmoza të rëndësishme të drufrutorëve
Sëmundjet fitoplazmatike të pemëve frutore në Europë përfshijnë tre çrregullime
ekonomikisht të rëndësishme: Apple Proliferation (AP), Pear Decline (PD) dhe
European Stone Fruit Yellows (ESFY).
1.2.4.1 Apple proliferation
Sëmundja: Fshesa e mollës (Apple proliferation)
Shkaktari: Fitoplazma e fshesës së mollës
Specia: Candidatus Phytoplasma mali
Grupi filogjenetik: Apple proliferation
AP njihet vetëm në Europë dhe për herë të parë është identifikuar në Trentino rreth
viteve 50 (Rui, 1950). Ndikimi më i madh në bujqësi lidhet me faktin se bimët e
infektuara vazhdojnë të vegjetojnë duke prodhuar fruta të vegjël dhe të
papërshtatshëm për shitje. Kultivarët e mollës të cilët preken janë pothuajse të gjithë
ata që gjenden në zonat kryesore të rritjes të mollëve në Europë (Minoiu and Craciun,
1983; Bliefernicht and Krczal, 1995, Marcone et al., 1996a; Seemüller et al., 1998).
Këtu mund të përmendim Golden Delicious dhe Renetta e Kanadasë shartuar mbi
nënshartesa të ndryshme. Kohët e fundit sëmundja është raportuar edhe në Shqipëri
dhe Kosovë por nuk njihet shkalla e përhapjes së saj (Susuri dhe Myrta, 2012).
Apple proliferation është një nga sëmundjet fitoplazmatike më të rëndësishme të
mollës, që prek pothuajse gjithë kultivarët, duke reduktuar madhësinë (rreth 50%),
peshën (nga 63-74%), cilësinë e frutit, si dhe ul energjinë e pemës duke e bërë atë më
të prekshme nga sëmundjet mykotike. Sëmundja u zbulua gjithashtu edhe tek
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
11
gjenotipet rezistente ndaj sëmundjeve kërpudhore të mollës (Loi et al., 1995). Apple
proliferation është raportuar vetëm nga rajoni EPPO. Molla është mbartësi kryesor i
―Ca. P. mali‖. Kultivarët ndryshojnë në reagim por shumica, duke përfshirë fidanët,
janë të ndjeshëm. Sëmundja mund të shihet tek kultivarët ose nënshartesat si edhe tek
Malus i egër apo i kultivuar. Gjithashtu ―Ca. P. mali‖ është gjendur tek lajthia
(Corylus spp.) (Marcone et al., 1996b), qershia (Prunus avium), kajsia (P. armeniaca)
dhe kumbulla (P. domestica) (Mehle et al., 2007). Simptoma më tipike e shkaktuar
nga ―Ca. P. mali‖ është ―fshesa e shtrigës‖ në fund të degëve. Tek pemët e infektuara,
gjethet janë më të vogla dhe më të dhëmbëzuara, zakonisht me ndajgjethëza të mëdha.
Frutat janë më të vegjël, të rrafshuar dhe me bisht të gjatë. Skuqja e herët e gjethes
është një indikacion i saktë për praninë e sëmundjes. Vëzhgimet fushore të realizuara
në plantacionet me mollë në Italinë verilindore dhe veri-perëndimore zbuluan se C.
melanoneura është insekti më i përhapuri (Alma et al., 2000; Tedeschi et al., 2002).
Përhapja e fitoplazmave në pemë nuk është konstante përgjatë vitit. Në dimër numri i
fitoplazmave zvogëlohet për shkak të degjenerimit të gypave shoshë. Ato
përqëndrohen më tepër tek rrënjët dhe gjatë periudhës Prill-Maj, ripushtojnë gjithë
pjesët e tjera të bimës duke arritur pikun në verën e vonë ose vjeshtën e herët
(Seemüller et al., 1984a and b). Modeli i shpërndarjes të fitoplazmave në pemë varet
gjithashtu nga temperatura. Në Francë, fitoplazmat mund të gjenden gjithandej në
temperatura nga 21-25°C, duke shkaktuar simptoma; nga 29-32°C simptomat
frenohen dhe fitoplazmat gjenden vetëm në rrënjë, por ripushtojnë kërcejtë kur
bimëzat rruhen në një temperaturë më të ulët. Kur një pemë inokulohet me një syth të
infektuar, simptomat e para do shfaqen gjatë vitit pasardhës, më së shumti tek degët e
reja. Kur kryhet tek nënshartesat, agjenti shkaktar prodhon simptoma në rritjen e parë
të kalemave. Infeksioni duket se lokalizohet më së shumti tek rrënjët. Edhe pse në
Europë sëmundja AP prek shumicën e varieteteve të pemëve të mollës, ajo shkaktohet
nga një patogjen relativisht homogjen që është i lidhur ngushtësisht me fitoplazmat që
shkaktojnë ESFY (Duduk B, 2009).
1.2.4.2 Plum Leptonecrosis
Sëmundja: Nekroza e kumbullës (Plum leptonecrosis)
Shkaktari: Fitoplazma e zverdhjes evropiane e bërthamorëve
Specia: Candidatus Phytoplasma prunorum
―Candidatus Phytoplasma prunorum‖ është një patogjen prokariot i rëndësishëm që
infekton bërthamorët e Europës. Ai njihet që shkakton disa çrregullime të Prunus spp.
me impakt të fuqishëm në ekonomi, të cilat referohen si European stone fruit yellows
(ESFY) (Lorenz et al., 1994; Seemüller and Foster, 1995; Seemüller et al., 1998a).
Ky organizëm është ngushtësisht i lidhur me patogjenë të rëndësishëm të dru
frutorëve si agjentët shkaktarë të apple proliferation (AP), pear decline (PD) dhe
agjentët e peach yellow leaf roll (PYLR). Së bashku formojnë një grup të ndryshëm
filogjenetik, grupin AP ose 16SrX. Ashtu si fitoplazmat e dru frutorëve të tjerë të
grupit AP, ―Ca. P. prunorum‖ shfaq një specificitet të lartë për strehuesin. Në natyrë,
ky patogjen është raportuar se infekton vetëm specie të gjinisë Prunus dhe
transmetohet nga një specie insekt vektor, Cacopsylla pruni (Psyllidae) (Carraro et
al., 1998a; Weintraub and Beanland, 2006). Gjithashtu ―Ca. P. prunorum‖ përfshin
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
12
shtame të cilat paraqesin ndryshime të mëdha përsa i përket virulencës (Kison and
Seemüller, 2001). ―Candidatus Phytoplasma prunorum‖ është një patogjen prokariot
që infekton bërthamorët në Europë dhe njihet se shkakton apricot chlorotic leaf roll të
kajsisë (Prunus armeniaca), leptonekrozën e kumbullës Japoneze (P. salicina), yellows dhe decline të pjeshkës (P. persica), kumbullës europiane (P. domestica),
bajames (P.dulcis) dhe qershisë (P. serrulata). Humbjet më të mëdha ekonomike janë
rregjistruar tek plantacionet e kajsisë dhe kumbullës Japoneze, ku niveli i infeksionit tek kultivarët e prekur mund të jetë mbi 50% dhe plantacionet bëhen joproduktivë tetë
deri në dhjetë vjet mbas mbjelljes. ESFY është bërë një pengesë e madhe për
prodhimin e suksesshëm të kajsisë në gjithë Europën Qëndrore dhe disa shtete të
Europës Jugore. Për shkak të rëndësisë ekonomike ―Ca. P. prunorum‖ është një prej
fitoplazmave të studiuara më intensivisht. Studimet molekulare duke përdorur
hibridizimin Southern blot, restriction fragment length polymorphism (RFLP) dhe
analizën e sekuencës të ADN-së ribozomale (rADN) dhe jo ribozomale të
shumëfishuar nëpërmjet PCR, treguan se ―Ca. P. prunorum‖ është një organizëm
relativisht homogjen në të gjithë Europën (Ahrens et al., 1993; Lorenz et al., 1994;
Kison et al., 1997; Jarausch et al., 1998a, 2000a; Seemüller et al., 1998b; Seemüller
and Schneider, 2004). Ky patogjen është filogjenetikisht i lidhur me agjentët
shkaktarë të apple proliferation (AP), pear decline (PD), dhe peach yellow leaf roll
(PYLR), shkaktarët e sëmundjeve më të mëdha të drufrutorëve gjetherrënës, të cilët
janë pjesëtarë të një grupi të ndryshëm filogjenetik, grupit AP ose 16SrX, brenda
bashkësisë të fitoplazmave (Seemüller et al., 1998a; IRPCM, 2004; Seemüller and
Schneider, 2004). Agjenti i ESFY është dukshëm i ndryshëm nga X-disease
phytoplasma, një patogjen i rëndësishëm i Amerikës së Veriut dhe nga ―Ca. P.
phoenicium‖ që infekton Prunus spp. në Azi dhe shtetet e Afrikës së Veriut. Agjenti i
ESFY gjithashtu dallon nga disa shtame të ndryshme të fitoplazmave që janë
transmetuar nga pemët e kajsive, qershive dhe kumbullave Japoneze të infektuara tek
strehuesi eksperimental Catharanthus roseus (periwinkle). Këta shtame janë pjesëtarë
edhe të grupit të fitoplazmave aster yellows, the stolbur ose X-disease (Ahrens et al.,
1993; Lorenz et al., 1994; Seemüller et al., 1998a; Marcone et al., 1999a). ―Ca. P.
prunorum‖ njihet se ndodh në shumicën e Europës qëndrore e jugore dhe gjithashtu
në Anglinë e veriut dhe atë juglindore (Seemüller et al., 1998a, 1998b; Davies and
Adams, 2000; Topchiiska et al., 2000; Delic´ et al., 2008; Laimer and Bertaccini,
2008). Ajo gjithashtu është raportuar në Turqi dhe Azerbajxhan (Jarausch et al.,
2000a; Sertkaya et al., 2005; Danet et al., 2007). Ka mundësi që ky patogjen të jetë i
pranishëm kudo ku rriten dru frutorët bërthamorë në Europë si dhe në shtetet jo
Europiane (Seemüller and Foster, 1995).
Fitoplazmat EFSY prodhojnë sindroma të sëmundjeve komplekse, të tilla si çelja e
hershme e sytheve, përdredhja e gjetheve, kloroza e gjetheve, deformimi i frutave,
nekroza e floemës dhe deri tek rrënia e pemës së kumbullës (Carraro et al., 1998). Në
Iran, kohët e fundit janë zbuluar fitoplazmat që i përkasin grupeve 16SrII dhe
16SrXII, me simptoma të tilla si gjethe të vogla, përdredhje e gjetheve, rozeta dhe
zverdhje (Zirak et al., 2009). Të dhënat tregojnë se Prunus spp. janë tepër të ndjeshme
ndaj një numri linjash fitoplazmash me diversitet gjenetik dhe kanë përhapje
gjeografike të gjerë (Gámez-Jiménez et al., 2009).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
13
1.3. Menaxhimi dhe kontrolli i sëmundjeve fitoplazmatike
Metodat e kontrollit variojnë në mënyrë të konsiderueshme nga një sëmundje tek
tjetra, në varësi të tipit të patogjenit, bimës strehuese, ndërveprimit ndërmjet
patogjenit dhe bimës dhe të shumë faktorëve të tjerë (Agrios, 2004). Shumica e
sëmundjeve serioze të kulturave bimore shfaqen tek disa bimë në një zonë, vit mbas
viti, përhapen shpejt dhe është shumë e vështirë ti luftosh, mbasi ato kanë filluar të
zhvillohen. Prandaj, pothuajse të gjitha metodat e kontrollit kanë për qëllim mbrojtjen
e bimëve më tepër se kurimin e tyre mbasi janë infektuar (Agrios, 2004). Në
kontrollin e sëmundjeve fitoplazmatike, shqetësimi kryesor është më tepër
parandalimi se trajtimi, për arsye se nuk ka kurë të njohur për këto lloj infeksionesh.
Megjithatë, bimët e infektuara ose indet në fazën e fjetjes mund të ―çlirohen‖ nga
fitoplazmat nëpërmjet trajtimit me nxehtësi (Soufi Z, 2012).
1.3.1. Strategjia e parandalimit
Të shumosh nëpërmjet farave ose nëpërmjet bimëve të painfektuara me fitoplazma, do
të thotë të zgjedhësh materialin për shumim nga burime të njohura, pa sëmundje
fitoplazmatike ose të indeksuara si të tilla. Eleminimi i barërave të këqinj dyvjeçarë,
shumëvjeçarë që shërbejnë si strehues dhe çrrënjosja e bimëve të infektuara sa më
herët të jetë e mundur është tepër e rëndësishme. Kështu largimi i bimëve të
infektuara me fitoplazma, eleminon burimin e infeksionit. Prandaj zbulimi dhe
diagnoza e hershme, e shpejtë, e ndjeshme dhe specifike e fitoplazmave është shumë e
rëndësishme për strategjitë parandaluese efektive, në veçanti sepse fitoplazmat mund
të kenë një periudhë latente të gjatë. Gjithësesi, strategjia më premtuese për të
shmangur fitoplazmat është identifikimi ose zhvillimi i varieteteve bimore rezistente
(Welliver, 1999). Me qëllim avancimin në këtë fushë të kërkimit nevojiten njohuri
bazë rreth epidemiologjisë, mekanizmit të patogjenitetit të fitoplazmave, ndikimit të
faktorëve të mjedisit në sëmundje, zhvillimit të simptomave dhe natyrës
rezistente/tolerante të bimëve strehuese.
1.3.2. Kontrolli i insekteve vektorë
Kur patogjeni futet ose përhapet nëpërmjet insektit vektor, kontrolli i vektorit është aq
i rëndësishëm dhe ndonjëherë më i lehtë se kontrolli i vetë patogjenit. Në rastin e
viruseve, fitoplazmave dhe baktereve shumë të vogla, insektet përbëjnë agjentin më të
rëndësishëm të përhapjes. Kontrolli i insekteve ka qënë i dobishëm në kontrollin e
përhapjes së sëmundjeve vetëm kur është kryer brenda zonës dhe tek bimët në të cilat
insektet kanë dimëruar apo janë ushqyer para se të hyjnë në kulturat bimore. Kontrolli
i sëmundjeve të tilla duke vrarë insektet vektorë me insekticide, pasi ata kanë hyrë tek
kulturat bimore, nuk është i mjaftueshëm. Për këtë arsye, në rastet kur njihet insekti
vektor dhe periudha e shfaqjes së tij është e njohur, programet e përdorimit të
insekticideve mund të rezultojnë të vlefshme kur praktikohen drejt insekteve të cilët
nuk janë vendosur ende në bimë. Në mënyrë tipike insekticidet kanë vlerë të limituar
duke qenë se insektet vektorë migrojnë dhe mund të transmetojnë fitoplazmat para se
insekticidet ti vrasin ata (Agrios, 2004).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
14
1.3.3. Strategjia e menaxhimit
Duke qenë se fitoplazmave u mungon muri qelizor, ato janë rezistente ndaj
antibiotikëve të cilët bashkëveprojnë me murin qelizor si penicilina, ndërsa antibiotikë
të tjerë me mënyra alternative veprimi si tetraciklina mund të pengojnë rritjen e tyre
(bakteriostatik ndaj fitoplazmave). Prandaj, lehtësimi i simptomave të sëmundjes
mund të arrihet eksperimentalisht duke injektuar antibiotikun tetraciklinë, por pa
përdorimin e vazhdueshëm të antibiotikut, simptomat e sëmundjes do rishfaqen
përsëri (Davis et al., 1968). Përveç kësaj, trajtimi me antibiotikë është i kushtueshëm
dhe kërkon kohë. Kështu, strategjia më e mirë është aplikimi i një programi eleminimi
efiçient. Si konkluzion, e vetmja mënyrë dinamike për të kontrolluar infeksionin
fitoplazmatik ka qënë përdorimi i materialeve të pastra, të garantuara ose gjetja e
varieteteve bimore rezistente, tolerante ndaj insekteve vektorë të fitoplazmave.
1.3.4. Perspektivat për kontrollin e sëmundjeve fitoplazmatike
Kontrolli i shpërthimit të epidemive të sëmundjeve fitoplazmatike teorikisht mund të
kryhet me kontrollin e vektorëve, duke eleminuar patogjenin nga bimët e infektuara të
kulturave meristematike apo me përdorimin e antibiotikët ose kimikate të tjera
(Bertaccini, 2007). Tani, kontrolli i insekteve vektorë duke përdorur pesticidet është
mjeti i zgjedhur për të limituar shpërthimin e sëmundjeve fitoplazmatike. Përveç
kushteve të mjedisit, efiçienca e kësaj qasjeje është shumë larg nga ajo që ne duam
dhe sëmundjet fitoplazmatike vazhdojnë të jenë epidemike në vende të ndryshme të
botës, pavarësisht nga përdorimi i madh i trajtimeve me insekticide (Firrao et al.,
2007). Nga ana tjetër, heqja e burimeve të inokulimit është e mjaftueshme në rastin e
sëmundjeve të shkaktuara nga Mollicutes, të përhapura nga vektorët monofagë të cilët
ushqehen tek bimët e prekura.
Në mënyrë të ngjashme, është më e lehtë të kontrollosh insektet monofagë që
riprodhohen tek bima e prekur se insektet që realizojnë ciklin e tyre tek bimët e egra.
Gjithashtu, është i mundur kontrolli i bimëve të infektuara nëpërmjet antibiotikëve ose
duke stimuluar prodhimin e antitrupave specifikë. Në njërën anë përdorimi i
antibiotikëve është shumë i kushtueshëm, pak i lejuar ose i ndaluar në disa shtete, jo
gjithmonë efiçient kur aplikohet për një kohë të gjatë dhe në anën tjetër prodhimi i
bimëve transgjenike thjesht për të prodhuar antitrupa kundër këtyre patogjenëve është
ende shumë larg (Le Gall et al., 1998; Chen and Chen, 1998; Bertaccini, 2007).
Hulumtimet e fundit po hedhin dritë mbi disa aspekte të biologjisë së fitoplazmave
dhe marrëdhënieve me strehuesit. Ndërhyrja në kolonizimin e fitoplazmave të trupit të
insektit ose thithja e nutrientëve të tyre në floemën e bimës është objektivi kryesor për
mbrojtjen e bimëve pa përdorimin e përbërjeve toksike.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
15
Figura 1.1 Krahasimi i madhësisë së gjenomës të fitoplazmave dhe baktereve të ndryshme.
Është treguar madhësia e gjenomës të Mesorhizobium loti, Escherichia coli K-12 MG1655,
Staphylococcus aureus subsp. aureus N315, ―Ca. P. asteris‖ OY-M strain dhe Mycoplasma
genitalium G37. Oshima et al. (2013).
Identifikimi i barrierave për kolonizimin e fitoplazmave në trupin e insektit është
parakusht për zhvillimin e strategjive të zhvillimit për reduktimin e infeksionit të
popullatave të vektorëve. Nga ana tjetër, thithja e nutrientëve të fitoplazmave nga
floema e bimës mund të jetë objektivi për reduktimin e shumëfishimit të patogjenit
dhe shprehjen e simptomave tek strehuesit e tyre. Shpresohet se këto risi do të çojnë
në mbrojtjen e bimëve pa përdorimin e përbërësve toksikë (Firrao et al., 2007).
Prandaj një mënyrë e vërtetë për të kontrolluar infeksionet fitoplazmatike është
parandalimi i shpërthimit të epidemive duke prodhuar material të pastër ose duke
gjetur varietete rezistente ndaj fitoplazmave (Dai et al., 1997; Carraro et al., 1998;
Kison and Seemüller, 2001; Jarausch et al., 1999a; 2007; Seemüller et al., 2007).
Njohuritë rreth mekanizmit të rezistencës të strehuesve ndaj fitoplazmave janë
gjithashtu të pakta njësoj si strategjitë efektive të menaxhimit të këtyre sëmundjeve.
Përpjekjet për identifikimin e gjermoplazmës që kodon rezistencën natyrale të
Mollicutes dhe inkorporimin e gjeneve të tilla nëpërmjet programeve të seleksionit
ose rritjes vazhdojnë tek disa bimë dhe pemë përfshirë pemët frutore (Thomas and
Hassan, 1992; Ponnuswami and Irulappan, 1993; Thomas and Mink, 1998; Seemüller
et al., 1992; 1998b; 1998c; Sinclair et al., 1997a; b). Kjo mund të përfshijë
rezistencën ndaj vetë patogjenit ose ndaj insektit vektor. Proteinat e lidhura me
mbrojtjen e bimës, të njohura për gjendjen e tyre aktive në përgjigjen e strehuesit ndaj
invazionit nga tipe të tjerë të patogjenëve, mund të ndodhin ndaj infeksioneve të
Mollicutes. Konfirmimi i kësaj hipoteze do të kërkojë demonstrimin se përbërja është
në vendin e duhur në kohën e duhur dhe është e pranishme në përqëndrime efektive
(Garnier et al., 2001). Çelësi për të mbajtur këto sëmundje nën kontroll është testimi
rigoroz i materialit bimor dhe monitorimi i rregullt i insekteve vektorë.
1.4. Gjenomika dhe mekanizmi i patogjenitetit
Simptomat e shkaktuara nga fitoplazmat në bimë sugjerojnë interferencë të
mekanizmave të sinjalizimit bimor dhe/ose të metabolizmit të hormoneve. Studimet
fiziologjike kanë treguar reduktim të niveleve të niseshtesë në rrënjët e pemëve
frutore të infektuara me fitoplazma, nga gjysëm deri në një të tretën e sasisë normale,
dhe grumbullimin e niseshtesë dhe karbohidrateve të tjera në gjethe. Eksperimentet e
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
16
bazuara në shënimin radioaktiv kanë konfirmuar se transporti i lëndëve të formuara
gjatë fotosintezës nga fidanët drejt rrënjëve dhe nga gjethet e vjetra drejt të rejave
është i pabarabartë në bimët e infektuara nga fitoplazmat. Studimet metabolike në
Madagaskar periwinkle kanë treguar një grumbullim në gjethe të metabolitëve të
lidhur me biosintezën e fenilpropanoideve dhe metabolitëve sekondarë terpenoidikë
së bashku me grumbullimin e sukrozës, glukozës, glicinës, polifenoleve, dhe acidit
suksinik (Choi YH et al., 2004). Niveli i sheqerit njihet gjithashtu si një faktor i
rëndësishëm në rregullimin e tranzicionit lulor dhe studimet mbi shprehjen e gjeneve
në domatet e infektuara me fitoplazmën stolbur (që shkakton simptoma si vireshencë
dhe phyllody), kanë treguar se shprehja e gjeneve që kontrollojnë identitetin e
meristemës së lulesave është shumë e rregulluar, ndërsa gjenet që janë përfshirë në
zhvillimin e meristemës dhe identitetin e luleve janë më pak të rregulluara (Pracos P
et al., 2006). Për të fituar njohuri të mëtejshme në mekanizmat mbi patogjenezën e
fitoplazmave, janë ndërmarrë projekte të sekuencimit të gjenomës dhe janë
identifikuar gjenet që lidhen me patogjenitetin. Këto projekte të sekuencimit kanë
përfshirë izolimin e ADN-së së pastër të fitoplazmave nga bimët e infektuara/insektet
vektorë duke përdorur kolonat e gradientit me CsCl ose xhel elektroforezën në fushë
pulsuese. Analiza e sekuencave të gjenomit ka zbuluar se që të katër gjenomat e
sekuencuara të fitoplazmave nuk kanë gjene për proçese të rëndësishme metabolike.
Këtu përfshihen rrugët për biosintezën e shumë aminoacideve, acideve yndyrore dhe
nukleotideve çka dëshmon se fitoplazmat duhet ti importojnë të gjitha këto nga
bujtësit e tyre (Tran-Nguyen et al., 2008; Kube M et al., 2008). Përmasat e vogla të
gjenomit dhe tendencat e dukshme në drejtim të evolucionit reduktiv tek fitoplazmat
sugjerojnë nivele çuditërisht të larta të përsëritjeve brënda gjenomit të sekuencave të
cilat janë të një rëndësie të lartë.
Përshtatja në mjedise të reja jep një shpjegim se përse një organizëm me një gjenomë
kaq të vogël përmban përsëritje të shumta të gjeneve. Është e njohur se shumë baktere
patogjenë të bimëve përdorin sistemet e sekretimit të tipit III dhe IV për të pompuar
efektorë dhe faktorë të patogjenezës në qelizat bimore. Është konfirmuar se
fitoplazmat sekretojnë peptide të vogla në floemë, të cilat më pas janë në gjendje të
migrojnë në qeliza të tjera bimore për të ndikuar në shprehjen e gjeneve. Një pjesë e
këtyre gjeneve kohët e fundit janë shprehur në bimë transgjenike dhe kanë treguar se
sillen si proteinat efektore, duke ndërvepruar me faktorët e transkriptimit në bimët
strehuese për të rezultuar në simptomat klasike të fitoplazmave të tilla si vireshenca,
phyllodia, njolla kafe etj. Gjithashtu është pohuar se metilimi epigjenetik i ADN-së së
bimëve mund të përfshihet në rregullimin (down-regulation) e gjeneve përgjegjëse për
zhvillimin lulor (Pracos P et al., 2006).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
17
Figura 1.2 Mikrografi elektronike (majtas) dhe harta e gjenomës së fitoplazmave (djathtas).
(Majtas) Fitoplazmat (pjesëzat rrethore) janë afërsisht 1 e 10 milionta e metrit në madhësi,
vetëm 1/10 e virusit gjigand të njohur si pandoravirus. (Djathtas) Gjenoma e fitoplazmave
përbëhet afërsisht nga 870,000 çifte bazash, dhe ka rreth 1/3 apo 1/4 e numrit të gjeneve të
pandoravirus. © 2016 Laboratory of Plant Pathology, Graduate School of Agricultural and
Life Sciences, The University of Tokyo.
1.4.1. Gjenet që përfshihen në ndërveprimet e fitoplazmave me strehuesit
e tyre
Zhvillimi i disa teknikave molekulare kohët e fundit ka çuar në krijimin e linjave të
reja të kërkimit në fushën e fitoplazmologjisë. Teknika të shumëllojshme si p.sh PCR,
që lehtëson zbulimin e shprehjes së gjeneve të ndryshme, po aplikohen në laboratorë
të ndryshëm për investigimin e biologjisë së Mollicuteve, patogjenë në mjedise të
ndryshme, të tilla si bimët apo insektet strehuese. Infeksioni fitoplazmatik mund të
çojë në prodhimin e proteinave mbrojtëse, rritje të komponimeve fenolike dhe
mbiprodhim të peroksidit të hidrogjenit tek bimët strehuese (Junquera et al., 2004;
Musetti et al., 2000; 2005). Duke përdorur metodën ARN differential display, Smart et
al., (1996) kanë njohur gjenet e Arabidopsis të rregulluara si pasojë e infeksionit me
yellows phytoplasma. Gjithashtu, Jagoueix-Eveillard et al., (2001) kanë izoluar gjene
të ndryshëm nga periwinkle të infektuara nga Spiroplasma citri dhe ―Candidatus
Phytoplasma aurantifolia‖. Tetë prej tyre kishin homologji me gjenet që kodojnë
proteinat e përfshira në fotosintezë, transportin e sheqernave, përgjigjen ndaj stresit
ose rrugët e përfshira në sintezën e fitosterolit. Ata kanë treguar se një gjen që
kodonte proteinat e induktuara nga patogjeni, domethënë një kinazë e asociuar me
murin qelizor, aktivizohej nga infeksioni S. citri. Tek Arabidopsis spp., ky gjen
induktohet gjithashtu nga acidi salicilik dhe përfshihet në përgjigjen mbrojtëse të
bimës. Tek A. thaliana, mutacioni i gjenit të transketolazës ndikon në shprehjen e disa
gjeneve fotosintetike dhe në prodhimin e pigmentit. Kështu, inhibimi i gjenit të
transketolazës mund të jetë përgjegjës për shtypjen e gjenit të përfshirë në fotosintezë.
Prania e gjeneve specifike për translokim është raportuar gjithashtu tek disa
fitoplazma (Kakizawa et al., 2001). Një homolog i një transportuesi aminoacidesh
është gjetur se rregullohet mbas infeksionit të Prunus armeniaca me ―Candidatus
Phytoplasma prunorum‖, duke mbështetur efektin e fitoplazmave në transportin e
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
18
aminoacideve. Për më tepër, tre gjene rregullohen tek bimët strehuese të infektuara
me këto fitoplazma; një gjen që kodon një proteinë të shokut nga nxehtësia (HSP70),
një gjen që kodon një metalothioneinë dhe një homolog i sekuencës së shprehur tag
673, klon i P.armeniaca. Metalothioneinat janë proteina që kanë karakteristika
oksido-reduktuese, aftësi të fuqishme për tu lidhur me metalet dhe prodhohen si
pasojë e stresit ndaj metaleve të rënda. Kjo mund të induktojë gjithashtu prodhimin e
HSP70, gjë që ndodh edhe gjatë rritjes nën kushte ekstreme të temperaturës
(Carginale et al., 2004). Fitoplazmat janë zbuluar edhe tek indet e lules gjithashtu.
Infektimi i bimëve të domates nga fitoplazma stolbur indukton anomali tipike të lules
si hipertrofi të nënpetlave, vireshencë, zhvillim jo normal të pjesëve të lules në
struktura gjethore si dhe gonxhe të mëdha. Të dhënat kanë treguar se keqformimet e
lules të domates të infektuar me fitoplazmën stolbur janë të lidhura me çrregullimet e
hershme që ndodhin në shprehjen e gjeneve kyçe për zhvillimin e lules (duke
përfshirë LeDEF, LeWUS dhe TAG1). Duke qënë se fitoplazmat nuk vendosen në
meristema, ato ka mundësi të ndryshojnë zhvillimin e lules nëpërmjet sinjaleve të
distancave të largëta, si bllokimi i translokimit të sheqernave në floemë, ose
hipermetilimi i gjenomës së bimës nëpërmjet aktivizimit të mekanizmave mbrojtës të
bimës (Pracros et al., 2006). Tek bimët dhe kafshët, proçesi i metilimit të citozinës
është i njohur për rregullimin e shprehjes së gjeneve në mënyrë epigjenike. Studimet
kanë treguar se gjenet mund të rregullohen rastësisht kur numri i citozinave të
metiluara është shumë më i madh krahasuar me statusin normal të metilimit të gjenit.
Figura 1.3 Paraqitje diagramatike e operonit rARN të një fitoplazme (Smart et al., 1996).
1.5. Përhapja e fitoplazmozave në vendin tonë dhe në rajon
1.5.1 Përhapja në Shqipëri
Në tetë rrethe të ndryshme të Shqipërisë Juglindore dhe Qëndrore janë studiuar
pemishte dhe vreshta për praninë e sëmundjeve fitoplazmatike. Janë vërrejtur
simptoma të European stone fruit yellows, apple proliferation, pear decline dhe
grapevine yellows. Mostrat e grumbulluara nga bimët e dyshuara janë testuar në
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
19
laborator. Si rezultat 5 pemë frutore (kajsia, myrobalan dhe kumbulla) rezultuan të
infektuara me European stone fruit yellows, 5 pemë të mollëve të infektuara me apple
proliferation dhe 1 pemë dardhe e infektuar me pear decline. Këto janë raportimet e
para të sëmundjeve fitoplazmatike në Shqipëri. Pra për apple proliferation dhe plum
leptonecrosis ka të dhëna që ato ekzistojnë por nuk ka informacion në lidhje me
shkallën e përhapjes së tyre (Myrta, A. et al., 2003).
1.5.2 Përhapja në Kosovë
Në vjeshtën e vitit 2005 është realizuar një studim në lidhje me përhapjen e
fitoplazmave në dru frutorët në Kosovë. Simptomat e vëzhguara ishin të ngjashme me
ato të apple proliferation, pear decline dhe European stone fruit yellows. Prania e
―Candidatus Phytoplasma mali‖ (EPPO A2 list), ―Candidatus Phytoplasma pyri‖
(EPPO A2 list) u zbulua në 6 drurë të mollëve dhe 3 drurë të kumbullave përkatësisht.
―Candidatus Phytoplasma prunorum‖ nuk u zbulua. Ky përbën raportin e parë të
apple proliferation dhe pear decline në Kosovë (Myrta, A. et al., 2006).
1.5.3 Përhapja në Greqi
Studime mbi përhapjen e apple proliferation në Greqi janë bërë kryesisht në zonën e
malit Pelion që dallohet për kultivimin e mollëve. Ky rajon për shumë vite ka pasur
probleme për arsye të përhapjes së apple proliferation. Varieteti i studiuar ka qënë
Starking Delicious. Prania e ―Candidatus phytoplasma mali‖ është provuar duke
përdorur analizat PCR/RFLP dhe sekuencimin gjithashtu. Plantacione të infektuara
me Apple proliferation janë zbuluar edhe në Attiki (Avlona); Ditiki Makedonia
(Kastoria), Peloponnisos (Artemissio Arkadia, Daras Arkadia, Korinthos, Mana
Korinthia, Tripoli Arkadia), Thessalia (Agia Larissa). Studime në Greqi janë bërë
edhe në lidhje me përhapjen e plum leptonecrosis ku sëmundja ka rezultuar e
pranishme në plantacione të kumbullave në Kozan, Imathia dhe prefekturën e
Korinthit. Gjendja e përhapjes të apple proliferation dhe plum leptonecrosis në Greqi
mund të përshkruhet si e pranishme por me përhapje të kufizuar (Rumbou A, et al.,
2011; Holevas, C.D., et al., 2000; Rumbos, I.C.; Bosabalidis, A.M, 1985; Syrgianidis,
G. D. 1989).
1.5.4 Përhapja në Bullgari
Në vitet 1965, 1966 dhe 1968 pemë të kultivarëve Golden Delicious, Starking
Delicious dhe Red Delicious, janë testuar për praninë e sëmundjeve fitoplazmatike.
Situata e vlerësuar sipas EPPO në bazë të informacioneve të vitit 1993 e përshkruan
gjendjen e fitoplazmave si të pranishme në vend, por me përhapje të kufizuar.
Teknika e përdorur për zbulimin e fitoplazmave ka qënë PCR. ―Candidatus
Phytoplasma mali‖ dhe ―Candidatus Phytoplasma prunorum‖ janë zbuluar në mostrat
e marra nga pesë zona të ndryshme. Për arsye të aplikimit të masave fitosanitare, është
vëzhguar se përhapja e apple proliferation në 2009 dhe 2010 ishte reduktuar krahasuar
me 2007, 2008 dhe në 2011 nuk ishte identifikuar asnjë rast pozitiv. Situata lidhur me
praninë e European stone fruit yellows paraqitej ndryshe, pasi infeksioni u zbulua në
2009, 2010, 2011 dhe 2013. Ca. P. mali është raportuar e pranishme tek strehuesit dhe
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
20
vektorët në pesë rajone gjeografikisht të ndryshme, në Bullgari (Etropolska, A. et al.,
2007, 2015).
1.5.5 Përhapja në Rumani
Të dhëna nga CABI Disease map 761 (1998), e përshkruajnë situatën e përhapjes të
Apple proliferation si të pranishme, por pa raportime të detajuara. Të dhënat e marra
nga vlerësimi i EPPO në bazë të informacionit të vitit 2012, e përshkruajnë situatën e
përhapjes të Plum leptonecrosis si të pranishme, por me përhapje të kufizuar.
Phytoplasma prunorum është e përhapur në zonën Bukuresht–Ilfov, Jug-Lindje
(Steffeck R. et al., 2012).
1.5.6 Përhapja në Serbi
Gjendja aktuale e vlerësuar nga EPPO në bazë të informacioneve të vitit 2006 e
përshkruan infeksionin apple proliferation si të pranishëm, por me përhapje të
kufizuar. Gjatë viteve 2003-2005 vëzhgime intensive janë realizuar në zona të
ndryshme të Serbisë për të verifikuar praninë e fitoplazmave në pemët frutore që
shfaqnin simptoma. Për zbulimin dhe përcaktimin e identitetit të fitoplazmave u
përdorën analizat PCR/RFLP. Mostrat me origjinë nga pemët e mollëve, që shfaqnin
simptoma rezultuan të infektuara me apple proliferation (16SrX-A) (Duduk, B. et al.,
2008).
1.5.7 Përhapja në Itali
Gjendja e vlerësuar sipas EPPO bazuar në informacionet e vitit 2013 e përshkruan
infeksionin apple proliferation si të pranishëm dhe me përhapje të gjerë. Apple
proliferation është e përhapur kryesisht në Italinë e Veriut (Emilia-Romagna,
Lombardia, Piemonte, Trentino-Alto Adige, Valle d'Aosta, Veneto), por është gjendur
gjithashtu në Jug (Basilicata).
Sëmundja është shpërndarë në gjithë Valle d‘Aosta. Në pemtoret e vjetra, përhapja e
sëmundjes mund të arrijë 100%. Drurët janë vëzhguar për simptoma tipike ose janë
testuar kur ato nuk shfaqnin simptoma. Drurët e infektuar janë shkatërruar dhe kur
infeksioni është përhapur në 25% të plantacionit i gjithë plantacioni është shkatërruar.
Në rajonin e Friuli-Venezia Giulia, një rajon i Italisë, ku apple proliferation (AP)
njihet që është e përhapur, përdoren gjerësisht varietete të cilat janë rezistente ndaj
sëmundjeve më të zakonshme. Kultivarët më të rëndësishëm janë Florina, Prima dhe
Priscilla. Këto varietet janë kultivuar sipas rregjimeve të bujqësisë organike, duke
mos përdorur insekticide. Rezultatet e fituara në dy plantacione gjatë një periudhe
vëzhgimi 7 vjeçar, tregojnë se të tre varietetet ishin të prekura nga AP. Florina
shfaqte shkallë të lartë infeksioni të AP, ndërkohë Priscilla ishte varieteti më i
ndjeshëm. Identifikimi i sëmundjes u bazua në shprehjen e simptomave, teknikën
fluoreshente DAPI, mikroskopinë elektronike dhe PCR. Modeli i shpërhapjes natyrore
të AP nuk ishte uniform, pemët e prekura ishin në linjë ose të grumbulluara në disa
pika të pemtoreve. Kjo mund të dëshmojë për praninë e një vektori jo shumë të
lëvizshëm (Loi et al., 1995)
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
21
1.5.8 Përhapja në Turqi
Gjendja e vlerësuar nga EPPO në bazë të informacioneve të vitit 2008 e përshkruan
infeksionin apple proliferation si të pranishëm, por pa detaje. EPPO Reporting Service
(2009) raporton praninë e Phytoplasma mali tek mostrat nga pemtoret e Adana
(Rajoni Mesdhetar) dhe Nigde (Anatolia qëndrore). Gjatë verës dhe vjeshtës të viteve
2005 dhe 2006 janë realizuar vëzhgime dhe analiza në Isparta, Yalova dhe Ankara për
të përcaktuar gjendjen e përhapjes së ―Candidatus Phytoplasma mali‖ në Turqi. 201
mostra simptomatike dhe josimptomatike u analizuan me anë të DAS-ELISA,
ngjyrimit fluoreshent DAPI dhe polymerase chain reaction (PCR) e ndjekur nga
analiza RFLP. Mbështetur tek rezultatet, disa drurë të mollëve u identifikuan si të
infektuar me ―Ca. P. mali‖ ndërkohë rezultatet e RFLP treguan se nuk kishte
diferenca ndërmjet izolateve (Canik D., Ertunc F., (2007). Në Turqi, 17 plantacione
me drurë mollësh janë analizuar nga gushti në shtator 2004, për praninë e Apple
proliferation, përkatësisht në Adana (6 plantacione), Mersin (3 plantacione) dhe Nigde
(8 plantacione) (Sertkaya G., 2008).
1.6. Metodat për zbulimin dhe identifikimin e fitoplazmave
Zbulimi, identifikimi i kujdesshëm dhe i saktë është një kusht paraprak i
domosdoshëm për karakterizimin e patogjenit dhe kontrollin e suksesshëm të
sëmundjeve të bimëve. Diagnoza e sëmundjeve të lidhura me fitoplazmat është një
nga aspektet më të vështira në fushën e kërkimit shkencor të sëmundjeve të bimëve, si
rezultat i pamundësisë për të rritur in vitro këta patogjenë. Diagnoza fillestare e
sëmundjeve të bimëve të lidhura me fitoplazmat, është bërë duke u mbështetur
fillimisht në mikroskopinë elektronike, ngjyrosjen e ADN-së të elementëve përçues të
bimëve të infektuara dhe karakteristikat biologjike, duke përfshirë marrëdhëniet e
insekteve vektorë, gamën e bujtësve dhe simptomatologjinë (McCoy et al., 1989).
Megjithatë këto metoda marrin kohë, kërkojnë përkushtim, janë të komplikuara dhe
shpesh çojnë në konkluzione jo të sakta. Zhvillimet e fundit të teknologjisë
molekulare kanë ndihmuar në një zhvillim domethënës, të shpejtë dhe të saktë të
zbulimit, identifikimit dhe klasifikimit të fitoplazmave (Wang, 1997).
1.6.1. Metoda e bazuar në simptoma, simptomatologjia
Para se të zhvilloheshin teknikat molekulare zbulimi i sëmundjeve fitoplazmatike ishe
shumë i vështirë, për faktin se fitoplazmat nuk mund të rriten in vitro. Në atë periudhë
u përdorën gjerësisht teknika diagnostikuese të tilla si vëzhgimi i simptomave,
transmetimi nëpërmjet insekteve apo kuskutave tek bimët strehuese, shartimi si dhe
mikroskopia elektronike nëpërmjet të cilës vëzhgoheshin seksione shumë të holla të
indeve të floemës. Zhdukja e simptomave në disa raste mbas trajtimit me antibiotikë
(p.sh tetraciklinë) siguroi fakte shtesë për të ndihmuar diagnozën e mikroogranizmave
prokariotë si agjentë të disa sëmundjeve bimore (Doi et al., 1967; Lee and Davis,
1992). Shtamet e fitoplazmave u identifikuan dhe diferencuan sipas karakteristikave
biologjike, të tilla si ngjashmëria e simptomave tek bimët e infektuara, bimët
strehuese dhe llojet e insekteve vektorë (Chiykowski, 1991; Errampalli et al., 1991;
Lee and Davis, 1992). Përcaktimi i karakteristikave biologjike është tepër i lodhshëm,
kërkon kohë dhe shpesh rezultatet janë kontradiktore. Një simptomë e zakonshme që
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
22
shkaktohet nga infeksionet fitoplazmatike është phyllodia, prodhimi i strukturave të
ngjashme me gjethet në vend të luleve.
Provat e ndryshme sugjerojnë se fitoplazmat ―nxjerrin nga kontrolli‖ gjenin e
përfshirë në formimin e lules (Pracros et al., 2006). Simptoma të tjera si zverdhja e
gjetheve, mendohet se shkaktohen nga prania e fitoplazmave në floemë, duke ndikuar
në funksionin e tufave përçuese dhe në ndryshimin e transportit të karbohidrateve.
Fotosinteza, në veçanti fotosistemi II, bllokohet në shumë bimë të infektuara me
fitoplazma. Këto bimë të infektuara shpesh shfaqin zverdhje e cila shkaktohet nga
shpërbërja e klorofilit dhe karatenoideve, biosinteza e të cilave bllokohet (Bertamini
and Nedunchezhian, 2001). Shprehja e induktuar e gjeneve të sucrose synthase dhe
alcohol dehydrogenase I tek bimët e infektuara të plantacioneve të rrushit është
demostruar kohët e fundit (Hren et al., 2009). Bimët e infektuara me fitoplazma
shpesh preken nga vireshenca; zhvillimi i luleve të gjelbra si rezultat i humbjes së
pigmentit në qelizat që formojnë petalet (Lee et al., 2000). Një simptomë tjetër e
përshkruar është steriliteti i luleve. Shumë bimë të infektuara nga fitoplazmat marrin
pamjen e shkurres ose të ―fshesës së shtrigës‖ si rezultat i ndryshimeve të rrugëve
normale të rritjes që shkaktohen nga infeksioni.
Shumica e bimëve shfaqin dominancë apikale por infeksioni fitoplazmatik mund të
shkaktojë shumim anësor (sqetullor) të kërcejve (Lee et al., 2000) dhe një zvogëlim të
madhësisë së ndërnyjeve. Fitoplazmat mund të shkaktojnë shumë simptoma të tjera
jospecifike të cilat shfaqen si rezultat i stresit që kalon bima. Simptomat e
infeksioneve fitoplazmatike në disa raste mund të jenë të dobishme për prodhimin
komercial. Infeksionet fitoplazmatike prodhojnë shumë filiza sqetullorë të cilët
mundësojnë prodhimin e luleve poinsettia (lulja e Krishtlindjes) të cilat kanë më
shumë se një lule dhe madhësi të reduktuar, gjë që lejon rritjen e tyre në vazo
(Bertaccini et al., 1996; Lee et al., 1997a).
Figura 1.4 Fruta të vogla (në të djathtë) me bishta të gjatë, të infektuara me fitoplazma.
Loschi. DBADP, University of Udine, Italy. http://www.cabi.org/compendia/cpc/
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
23
Figura 1.9 ―Fshesa e shtrigës‖, Biologische Bundesanstalt für Land-und Forstwirtschaft,
Institut für Pflanzenschutz im Obstbau Archive. www.bugwood.org.
Figura 1.5 Lule me numër shumë të
madh petalesh. Loschi, University of
Udine, Italy.
Figura 1.7 Gjethe molle e shëndetshme
(djathtas), krahasuar me gjethe molle të
prekura nga fitoplazma (majtas). Gjethet e
infektuara paraqiten me ndajgjethëza
shumë të mëdha. www.bugwood.org.
Figura 1.8 Gjethe molle e shëndetshme (majtas), gjethe molle (klorotike) e
infektuar nga fitoplazmat (djathtas).
Biologische Bundesanstalt für Land-und
Forstwirtschaft, Institut für
Pflanzenschutz im Obstbau Archive.
Figura 1.6 Rozetë e gjetheve, Alberto
Loschi
http://www.fitoplasmi.it/index1.htm
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
24
Ky grup patogjenësh, në varësi të karakteristikave të tyre, të bimëve strehuese dhe të
kushteve të mjedisit ku gjendet bima strehuese, mund të shkaktojë një kuadër
simptomatik të gjerë, i cili është shpesh i ngjashëm me atë të shkaktuar nga viruset.
Kuadri simptomatologjik i fitoplazmozave lidhet me mënyrën e dyfishtë me të cilën
fitoplazmat veprojnë mbi bimën strehuese:
- Grumbullimi i madh i tyre në floemë dhe sidomos pranë poreve të pllakave
kribroze, bëhet pengesë për kalimin e sheqernave nga gjethet në pjesët e tjera
të bimës. Ky fenomen bën të grumbullohet amidon në gjethe dhe të shfaqen
simptoma si ndryshimi i ngjyrës së gjethes në të verdhë (simptomë kjo mjaft e
përhapur nga ku marrin emrin disa fitoplazmoza) dhe të kuqe, gjethet janë më
të trasha, të përkulura dhe të rrotulluara nga poshtë. Vërrehen gjithashtu edhe
simptoma të tjera si nekroza të kufizuara në nervurat e gjethes, në fruta dhe në
rrënjë; trashje e lëvores dhe strukturë sfungjerore e saj; zhvillim i dobët i
bimëve që mund të paraqitet edhe me forma xhuxhërie. Shpesh kuadrit të
fitoplazmozave në fushë i bashkangjiten edhe probleme të mungesës së
lëndëve ushqyese dhe simptomat e shkaktuara nga ato.
- Prishja e ekuilibrit hormonal të bimës, që shfaqet me anomali zhvillimi të saj
deri në keqformimin e organeve bimore. Deformimet ose keqformimet prekin
gjethet ose lulet, ka vonesa në çeljen e sythave në drufrutorë (kemi edhe raste
çelje të parakohshme në dimër si në rastin e ―zverdhjes europiane të
bërthamorëve‖) ose në lulëzim. Simptoma tipike të këtij grupi janë ngjyra e
gjelbër e luleve ose ―vireshenca‖ dhe kthimi i petaleve të luleve në gjethe ose
―fillodia‖. Simptoma të tjera janë rritja e parregullt e bimës në formë kaçube
ose fshesë nga shkurtimi i ndërnyjeve. Në pemët frutore të infektuara nga
fitoplazmat mund të vërehen lule jashtë stinës së pranverës (p.sh. gjatë dimrit),
sterilitet i luleve dhe mungesë prodhimi. Në raste të prekjeve të rënda disa
fitoplazma mund të shkaktojnë edhe tharjen e degëve apo të gjithë bimës,
tharje që shpesh përshpejtohet edhe nga kushtet e pafavorshme të mjedisit.
Kohët e fundit në disa fitoplazmoza është vërejtur fenomeni ―recovery‖ ku bimët e
sëmura në natyrë gradualisht humbasin simptomat dhe vazhdojnë të prodhojnë
normalisht në vite.
Simptoma të ngjashme me ato të fitoplazmozave që përshkruhen më sipër shkaktohen
në natyrë shpesh edhe nga viruset, prandaj diagnostikimi i tyre, veç eksperiencës së
gjatë fushore kërkon domosdoshmërisht konfirmim me analiza laboratorike.
Një specie bimore shumë e dobishme në studimin e fitoplazmave dhe
simptomatologjisë së tyre është Catharantus Roseus. Duke qënë shumë e ndjeshme
ndaj infeksionit të fitoplazmave është përdorur si bimë indikatore për zbulimin e
pranisë së tyre në bimë asimptomatike, për aftësinë që ka në diferencimin e
simptomave të shkaktuara nga fitoplazma të ndryshme (Susuri L.R., and Myrta A.G
2012).
1.6.2. Izolimi i fitoplazmave në bimët test
Fitoplazmat mund të transmetohen dhe të konservohen në bime test si p.sh. meneksha
(Catharanthus roseus G. Doni), që nëse infektohet paraqet simptoma zverdhjeje ose
vireshence, fillodi, fshesë, lule të vogla, etj. Transmetimi bëhet me anë të bimës së
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
25
kuskutës, që siguron një urë lidhjeje dhe transmetimi ndërmjet bimës së infektuar dhe
bimës test. Kjo metodë është përdorur në të kaluarën për transmetimin e fitoplazmave
nga drufrutorët në bimë barishtore për të mundësuar studimin e tyre.
Veç izolimit në bimë barishtore, fitoplazmat e drufrutorëve diagnostikohen edhe
nëpërmjet indeksimit (shartimit) në bimë indikatore drunore edhe pse kjo nuk është
një metodë shumë e përdorur, pasi fitoplazmat nuk janë të përhapura rregullisht në
bimët strehuese drunore dhe testet mund të japin rezultate të pasakta (Susuri L.R., and
Myrta A., 2012).
1.6.3. Mikroskopia
1.6.3.1 Mikroskopia me dritë (ngjyrimi Diene)
Teknikat e mikroskopisë me dritë edhe pse jo të dizenjuara drejtpërdrejt për
vizualizimin e fitoplazmave në brendësi të indit mbartës, janë përdorur me sukses si
një metodë paraprake për diagnostikim duke verifikuar praninë e fitoplazmave në
bimët që kanë shfaqur simptoma. Ato përbëjnë hapin e parë drejt të kuptuarit të
ndërlidhjes së simptomave me praninë e fitoplazmave në bimë. Për më tepër metodat
e mikroskopisë me dritë janë të shpejta dhe më pak të kushtueshme krahasuar me
metodat e mikroskopisë elektronike. Duke përdorur mikroskopinë me dritë, janë
përdorur mjaft teknika të ngjyrimit për identifikimin dhe lokalizimin e fitoplazmave
në indet e infektuara, të aplikuara këto në prerje të holla të përgatitura me dorë. Ky tip
dedektimi është efikas vetëm në rastin kur përqëndrimi i patogjenëve është i lartë në
qeliza, p.sh. mund të përdoret me sukses në materiale bimore barishtore.
Ngjyrimi Diene u zhvillua fillimisht si një ngjyrim specifik për vizualizimin e
kolonive të mykoplazmave të kultivuara në siperfaqe agari. Me kalimin e kohës filloi
të përdorej si një ngyrues direkt në gypat shoshë të bimëve mbartëse (Wei W. et al.,
2008), teknikë kjo e aplikuar në prerjet me dorë ose me mikrotom me ngrirje të indeve
bimore të infektuara me fitoplazma ose spiroplazma. Kjo teknikë ngjyrimi përbën një
test paraprak të shpejtë dhe të thjeshtë për analizimin e kampioneve bimore të
mbledhura. Duke ndjekur këtë teknikë ngjyrimi, gypat shoshë të kolonizuara nga
fitoplazmat mund të identifikohen si grupime qelizash të çregullta të ngyrosura
fortësisht, të para këto në mikroskop me dritë. Proçedura është e një rëndësie
diagnostike pasi indet e floemës me prejardhje nga bimët e infektuara me fitoplazma
do të ngjyrosen në blu të errët ndërkohë që ksilema do të ngyroset në bojëqjelli dhe
korteksi në blu të çelët. Ngjyrimi është specifik për sëmundje të caktuara të
shkaktuara nga Mollicutes dhe nuk ngjyros indet e shëndetshme apo mostrat e
infektuara nga patogjenë të tjerë bimorë.
1.6.3.2 Mikroskopia me fluoreshencë (ngjyrimi DAPI)
Teknikat e bazuara në shumëfishimin e fragmenteve gjenike specifike janë gjërësisht
të përdorura për zbulimin dhe identifikimin e fitoplazmave, por kostoja e lartë dhe
nevoja e një personeli të mirë trajnuar për të zhvilluar proçedurën, limitojnë aplikimin
e këtyre teknikave pasi në shumë laboratorë (edhe në ato të vëndeve në zhvillim)
mungojnë. Në këtë këndvështrim teknikat e shpejta, të thjeshta dhe jo të kushtueshme
janë tepër të vlerësura për zbulimin e fitoplazmave. Për këto arsye teknika si ngjyrimi
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
26
me 4‘,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) janë përdorur shpesh për diagnostikim të
shpejtë dhe ekonomik të fitoplazmave. Ngjyrimi fluoreshent DAPI është cilësuar si
më specifik krahasuar me ngjyrimin Diene. Gjenomat e sekuencuara të disa
fitoplazmave kanë treguar një përmbajtje të lartë të bazave AT që korenspondon me
një përmbajtje të ulët të GC e cila varion nga 21% (p.sh. ―Candidatus Phytoplasma
mali‖) deri në 28% (p.sh. ―Candidatus Phytoplasma asteris‖) (Hogenhout, 2010).
Figura 1.10 Ilustrim skematik i hapave të ndryshme të ngjyrimit DAPI, për diagnostikimin e
mostrave të prekura nga fitoplazmat. ©Francisco Beluzan.
Kjo veçori krijon mundësinë e aplikimit gjërësisht të teknikave të ngjyrimit si ajo e
DAPI-t (një ngjyrues fluoreshent i cili ka aftësinë të depërtojë lehtësisht membranën
qelizore dhe të lidhet fort me rajonet e ADN-së të pasura me AT). Ndërveprimi i
DAPI-t me ADN-në ka qënë subjekt i shumë studimeve që në momentin që kjo
përbërje aromatike u sintetizua për herë të parë. Fillimisht u sintetizuan një sërë
përbërjesh diamidine më qëllim përdorimin e tyre si agjentë tripanocidë, megjithatë
veçoritë unike spektrale të DAPI-t çuan në përdorimin e tij më tepër si një shënues i
ADN-së sesa si një medikament. Tashmë përdoret gjërësisht në mikroskopinë me
fluoreshencë. Në fitopatologji është përdorur veçanërisht për zbulimin e fitoplazmave
dhe spiroplazmave në specie të ndryshme bimore, të raportuara këto në mjaft studime.
Në qoftë se vëzhgojmë preparatet e ngjyrosura me DAPI, qelizat e floemës në
materialet e infektuara shfaqen më të shndritshme krahasuar me pamjen tipike të
bërthamave në qelizat parenkimatike. Në indet e infektuara zakonisht fitoplazmat
shfaqen si njolla të ndriçuara në gypat shoshë të floemës, dukuri e cila nuk vërehet në
indet e shëndetshme. Ngjyrimi me DAPI është cilësuar si një teknikë e shpejtë dhe e
saktë për lokalizimin e fitoplazmave në gypat shoshë të floemës dhe në pjesë të
ndryshme të bimës (kryesisht gjethe dhe rrënjë) (Andrade and Arsimendi, 2013).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
27
1.6.3.3 Mikroskopia me imunofluoreshencë
Ngjyrimi imunofluoreshent indirekt, i kombinuar zakonisht me teknikën ELISA, është
përdorur gjerësisht për zbulimin e fitoplazmave në inde (Lin and Chen, 1986;
Lherminier et al., 1989; Caudwell et al., 1990; Sinha and Chiykowski, 1990). Edhe
pse antiserumet poliklonalë mund të përdoren si një qasje për zbulimin e fitoplazmave
tek indet e infektuara, për identifikimin dhe diferencimin e tyre ata nuk tregojnë
specificitet të lartë (da Rocha et al., 1986). Në kontrast, antitrupat monoklonalë lidhen
specifikisht me fitoplazmat në seksionet e gypave shoshë të bimëve të infektuara (Lin
and Chen, 1986). Avantazhet e mikroskopisë me imunofluoreshencë janë,
ndjeshmëria, specificiteti dhe thjeshtësia. Mikroskopia me imunofluoreshencë mund
të jetë e dobishme për zbulimin e shpërhapjes brendaqelizore të fitoplazmave në
nivelin e mikroskopisë me dritë (Hiruki, 1988a).
1.6.3.4 Mikroskopia elektronike
Lidhja e fitoplazmave me sëmundjet e bimëve, kohët e fundit është zbuluar nga
vëzhgimi i fitoplazmave në indet bimore nëpërmjet mikroskopisë elektronike me
transmision. Fitoplazmat në seksione shumë të holla, duken si qeliza prokariote me
forma nga ato rrethore deri tek filamentozet, me diameter nga 175 deri në 400 nm dhe
të rrethuara nga një membranë e vetme (Chen and Hiruki, 1977; Waters and Hunt,
1980; McCoy, 1983). Në shumicën e bimëve barishtore, fitoplazmat mund të
vëzhgohen në të gjitha organet si rrënjë, filiza, lule, fruta dhe gjethe. Megjithatë, tek
bimët drunore, është më i vështirë vëzhgimi i fitoplazmave (McCoy et al., 1989). Për
arsye se patogjenë të tjerë bakterialë, me mur qelizor (përfshirë organizmat e
ngjashme me rikeciet dhe organizmat e ngjashme me bakteret) jetojnë në floemën e
bimëve, ndaj nevojitet ekzaminim i kujdesshëm i mikrografive elektronike dhe
njëkohësisht rekomandohen fort seksionet gjysëm të trasha (Chen et al, 1989).
Megjithëse mikroskopia elektronike siguron një metodë direkte për zbulimin e
fitoplazmave, karakteristikat morfologjike ofrojnë një ndihmesë shumë të vogël në
identifikimin e këtyre organizmave, duke qënë se ka numër të lartë të organizmave të
ngjashme në ekstraktet bimore të papërpunuara (Wolanki and Maramorosch, 1970).
1.6.4. Histokimia
Disa fluorokrome si akridina portokalli, bromuri i ethidiumit e të tjera, nuk lidhen në
mënyrë specifike me ADN-në. Ato formojnë një kompleks i cili shfaq fluoreshencë
dhe përdoret në mënyrë rutine për zbulimin e fitoplazmave në kulturat qelizore (Chen,
1977; DelGuidice and Hopps, 1978; Steiner et al., 1982; McGarrity et al., 1983).
Ngjyruesi Hoechst 33258 është përdorur për ekzaminimin e qelizave të infektuara me
fitoplazma dhe spiroplazma (Steiner et al., 1982, 1983) dhe gjithashtu për dedektimin
e fitoplazmave dhe spiroplazmave në gjendrat e salivës të insekteve vektorë
(Markham and Alivizatos, 1983). DAPI (4‘-6‘-diamidion-2-phenylindole) lidhet
specifikisht me rajonet e pasura me adenina dhe timina të ADN-së me origjina të
ndryshme (Russel et al., 1975). Ngjyrimi DAPI është përdorur gjerësisht për zbulimin
e fitoplazmave në indet bimore të infektuara (Seemuller, 1976; Hiruki, 1988a, b, c).
Përdorimi i DAPI-t si një fluorokrom, siguroi një teknikë me ndjeshmëri të lartë për
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
28
dedektimin e fitoplazmave në seksionet e bimëve barishtore (Hiruki and da Rocha,
1984, 1986) dhe ato drunore gjithashtu (Hiruki, 1981). Megjithëse ngjyrimi është një
metodë e thjeshtë, e shpejtë për diagnozën e infeksioneve fitoplazmatike, gjithashtu
edhe për seleksionimin e mostrave të painfektuara nga një numër i madh i mostrave të
dyshuara me infeksion fitoplazmatik, ai nuk bën të mundur diferencimin e
fitoplazmave, duke qënë se nuk është specifik. Megjithatë, kjo është më pak e
rëndësishme kur mostra është marrë nga insekte apo bimë të infektuara për qëllime
eksperimentale, ku aplikohen kontrolle të vazhdueshme, por nuk është shumë e
përshtashme për analizimin e insekteve apo bimëve nga koleksionimi fushor.
1.6.5. Imunologjia
Aplikimi i teknikave imunologjike ka rezultuar i dobishëm për analizimin e
antigjenëve të fitoplazmave dhe për zhvillimin e metodave të shpejta për
diagnostikimin e sëmundjeve (Sinha, 1974; Caudwell et al., 1983; Clark et al., 1983;
Sinha and Benhamou, 1983; Kirkpatrick and Garrott, 1984; Lin and Chen, 1985a, b,
c, 1986; Hobbs et al., 1987; Chen and Jiang, 1988; Clark et al., 1989; Jiang et al.,
1989, Hsu et al., 1990; Shen and Lin, 1993). Preparate pjesërisht të purifikuara
(organizma intakte ose fraksione të membranës) si imunogjenë, antiserume dhe
antitrupa monoklonalë janë përdorur për disa lloje të ndryshme fitoplazmash (Chen
and Jiang, 1988; Boudon-Padieu et al., 1989; Clark et al., 1989; Errampalli et al.,
1989; Jiang et al., 1989; Schwartz et al., 1989; Garnier et al., 1990; Hsu et al., 1990;
Chang and Chen, 1991; Shen and Lin, 1993).
1.6.5.1 Antitrupat monoklonale
Antitrupat poliklonalë shpesh kanë përqëndrim relativisht të ulët dhe reagojnë me
antigjenët nga bimët e shëndetshme ose insektet vektorë edhe pse antiserumet e
përgatitur nga fitoplazmat e purifikuara nga insektet kanë reagim më të vogël me
antigjenët e bimëve të shëndetshme (Chen and Jiang, 1990). Për këtë arsye,
antiserumet poliklonalë nuk janë të dobishëm për diferencimin e fitoplazmave (Lee
and Davis, 1992). Antitrupat monoklonalë të prodhuar nëpërmjet teknikës hibridoma
janë jospecifikë, secili reaksion vetëm me një epitop, të antigjenit të përzgjedhur.
Specificiteti dhe ndjeshmëria e lartë e antitrupave monoklonalë kanë përmirësuar
ndjeshëm besueshmërinë e teknikave imuno-dedektuese. Antitrupat monoklonalë janë
veçanërisht të ndjeshëm për diferencimin e shtameve të fitoplazmave të lidhura
ngushtë (Lin and Chen, 1985a, b, 1986; Chen and Jiang, 1988; Clark et al., 1989;
Jiang et al., 1989; Sears et al., 1989; Garnier et al., 1990; Guo et al., 1991; Shen and
Lin, 1993). Disavantazhi i antitrupave monoklonalë është njëspecificiteti i tyre i
njohjes të një epitopi të vetëm, p.sh: antitrupi homogjen monoklonal njeh vetëm një
sit (epitop) në kompleksin imunogjen. Prandaj, nëse një epitop i veçantë ndahet mes
imunogjenëve të ndryshëm, është e pamundur të dallohen imunogjenët. Kështu, disa
antitrupa monoklonalë në disa raste mund të dështojnë në diagnostikimin e bimëve që
shfaqin simptoma të lidhura me fitoplazmat (Lin and Chen, 1986; Hiruki, 1988b).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
29
1.6.5.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Teknika ELISA, e zhvilluar për zbulimin e antigjenëve viralë në seksionet e indeve,
ka një ndjeshmëri të krahasueshme me atë të teknikës radioimmunoassay (RIA)
(Nakane and Pierce, 1966; Engvall and Perlmann, 1971). ELISA është e dobishme për
shqyrtimin e një numri të madh të mostrave (Clark et al., 1978). Është përdorur
gjerësisht në shqyrtimet në terren të viruseve bimore dhe spiroplazmave. ELISA është
përdorur për analizimin e fitoplazmave (Sinha and Benhamou, 1983; Jiang et al.,
1988). Aplikime të hershme, duke përdorur antiserumet poliklonalë të përgatitur nga
fitoplazma pjesërisht të purifikuara, treguan se antitrupat poliklonalë nuk mund të
dallojnë lehtësisht disa shtame të fitoplazmave (Sinha and Benhamou, 1983; Sinha
and Chiykowski, 1984). Megjithatë, me kontrollet e duhura, të cilat duhet të
përfshihen në teste të tilla si crossabsorbing antiserume me ekstrakte bimore të
shëndetshme, antiserumet poliklonale zbuluan në mënyrë të qartë antigjenë specifikë
të sëmundjes, në bimët e infektuara. Në shumicën e rasteve, diferencuan në mënyrë
efektive fitoplazma të largëta nga njëra-tjetra (Sinha, 1988; Clark et al., 1989;
Errampalli et al., 1989). Kombinimi i ELISA-s dhe mikroskopisë imunofluoreshente
duke përdorur antitrupa monoklonalë ka përmirësuar në masë të madhe specificitetin
dhe ndjeshmërinë e ELISA-s për zbulimin dhe diferencimin e fitoplazmave (Lin and
Chen, 1985b; Clark et al., 1989). ELISA që përdor antitrupat monoklonalë specifikë
për fitoplazmat është aplikuar gjithashtu në dedektimin e fitoplazmave në insektet
vektorë (Boudon-Padieu et al., 1989).
1.6.5.3 Dot Blot Immunoassay
Dot Blot Immunoassay është përdorur për dedektimin e spiroplazmave (Chen et al.,
1989) dhe kohët e fundit përdorimi i saj është shtrirë në diagnostikimin e infeksioneve
fitoplazmatike (Boudon-Padieu et al., 1989; Hsu et al., 1990). Ndjeshmëria e dot blot
immunoassay është e rendit 1.5 herë më e lartë se ajo e ELISA-s indirekte (Hsu et al.,
1990). Një proçedurë më e thjeshtuar blotting, në të cilën një prerje e indeve të freskët
shtypet direkt në membranat e nitrocelulozës, u zhvillua për dedektimin e viruseve
bimore dhe fitoplazmave (Lin et al., 1990). Ekzaminimi i indeve të ngjyrosur (sipas
kësaj teknike imunologjike) të kategorisë gjethe, zbuloi se antigjenët e fitoplazmave
në gjethe ishin të kufizuar në qelizat e floemës të nervurave kryesore dhe të atyre
sekondare. Dot Blot Immunoassay është aplikuar gjithashtu edhe për dedektimin e
fitoplazmave tek insektet vektorë (Garnier, 1990).
1.6.6. Biologjia molekulare
Zhvillimet e fundit të teknikave të ADN-së rekombinante kanë lejuar progresin në
drejtim të zbulimit dhe identifikimit të fitoplazmave. Që nga klonimi i parë i probeve
të ADN-së nga insekti vektor Colladonas montanus, raportuar nga Kirkpatrick et al.,
(1987), fragmente të tjera ADN-je janë klonuar nga të paktën 20 shtame fitoplazmash:
sëmundja Western X (Kirkpatrick et al., 1987; Lee et al., 1991b), Maryland aster
yellows (Lee et al., 1988a), apple proliferation (Kollar et al., 1990), clover
proliferation (Deng and Hiruki, 1990b), zverdhja letale e palmës (Harrison et al., 1992), etj.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
30
Përdorimi i fragmenteve të klonuara të ADN-së të fitoplazmave si probe në
hibridizimin ADN-ADN, siguron një dedektim me ndjeshmëri të lartë dhe specifik të
fitoplazmave në bimët e infektuara ose indet e insekteve (Kirkpatrick et al., 1987,
1900; Davis et al., 1988, 1990b, 1991; Lee and Davis 1988; Lee et al., 1988b, 1990a;
Deng and Hiruki, 1990b, c). Aplikimi i parë i suksesshëm i polymerase chain reaction
(PCR) në studimin e fitoplazmave, siguroi dedektimin më sensitiv të fitoplazmave
(Deng and Hiruki, 1990a). Artikuj të shumtë kanë raportuar zbulimin dhe
identifikimin e fitoplazmave nëpërmjet PCR (Ahren and Seemuller, 1992; Schaff et
al., 1992; Lee et al., 1993a, b, 1994; Davis and Lee, 1993; Schneider et al., 1993;
Gundersen et al., 1994a, b, 1996). Kombinimi i PCR me teknika biologjike,
molekulare si RFLP (restriction length fragment polymorphism) HMA (heteroduplex
mobility assay), sekuencimi i ADN-së etj, lejon klasifikimin gjenetik të fitoplazmave.
Diagnostikimi i fitoplazmave me test molekular mund të kalojë në fazat e mëposhtme:
- ekstraktimi i ADN-së gjenomike totale të mostrës që analizohet;
- shumëfishimi i ADN-së së patogjenit me primera universalë ose specifikë për
fitoplazma (PCR);
- identifikimi i grupit të fitoplazmës me teknikat molekulare si RFLP, nested-
PCR me primera specifikë për grupe të veçantë fitoplazmash, ose dot-blot
hybridization.
1.6.6.1 Hibridizimi i acideve nukleike
ADN-ja e klonuar e fitoplazmave, ose komplementarja e saj ARN-ja (Lee et al.,
1988b) me probe të shënuara, 32
P ose biotinë joradioaktive (Deng and Hiruki, 1990d)
është përdorur gjerësisht në hibridizimin dot-blot dhe Southern-blot, për zbulimin dhe
identifikimin e fitoplazmave tek bimë dhe insektet vektorë (Kirkpatrick et al., 1987,
1990; Davis et al., 1988, 1990a. b, 1991; Lee et al., 1988a, b, 1991a, b; Sears et al.,
1989; Bertaccini et al., 1990a, b; Bonnet et al., 1990; Kollar et al., 1990; Deng and
Hiruki, 1990c, 1991b; Chen and Chang, 1991; Hibben et al., 1991; Nakashima et al.,
1991; Chen et al., 1992; Shaw et al., 1993). Një numër probesh me prejardhje nga
fitoplazma të caktuara, janë përdorur për zbulimin e lidhjeve ndërmjet tyre. Në bazë të
hibridizimit dot-blot dhe Southern-blot, fitoplazmat e clover proliferation dhe potato
witches’ broom janë të lidhura ngushtësisht me njëra-tjetrën, por janë të ndryshme nga
fitoplazmat e aster yellows dhe clover phyllody (Deng and Hiruki, 1990b, c, d, 1991a,
b).
Studimet në lidhje me hibridizimin kanë treguar se fitoplazmat me origjina
gjeografike të ndryshme, ndajnë homologji të lartë të sekuencës të nukleotideve me
njëra-tjetrën. Ndërsa me mykoplazma të tjera të rritura në terrene artificiale kanë
homologji relativisht më të ulët (Davis et al., 1988, 1990a, b; Lee and Davis, 1988,
Lee et al., 1988b, 1990a; Nakashima et al., 1993).
Disa grupime të veçanta të gjenomave të shtameve të ndryshme janë realizuar në bazë
të analizave të hibridizimit dot-blot, Southern-blot dhe RFLP (Lee and Davis, 1988;
Lee et al., 1988a, 1990b, 1991b; Kuske et al., 1991a, b).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
31
1.6.6.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR), fillimisht e parashtruar në një artikull nga Kleppe et
al., (1971) dhe e zhvilluar si një teknikë në mesin e viteve 1990 (Mullis et al., 1986;
Saiki et al., 1985, 1986), siguron një metodë shumë të ndjeshme për dedektimin e
ADN-së. Kjo teknikë mundëson kopjimin e një molekule të vetme të ADN-së, më
shumë se 1 miliard herë për disa orë. Numri i aplikimeve të PCR-së ka erdhur duke u
rritur në mënyrë eksponenciale, ashtu si dhe reaksioni i PCR-së. Kohët e fundit,
teknika e PCR-së është përdorur gjerësisht për dedektimin dhe klasifikimin e
fitoplazmave. Zbulimi i fitoplazmave nëpërmjet PCR-së është të paktën 100 deri në 1
milion herë më i ndjeshëm se zbulimi nëpërmjet metodës së hibridizimit dot-blot
(Deng, 1991; Chen et al., 1993). Testet e PCR-së të cilat përdorin primera universalë
të dizenjuar në bazë të sekuencës së 16S rADN-së, janë përdorur në mënyrë efektive
për zbulimin dhe identifikimin e një koleksioni të gjerë të fitoplazmave, të njohura
dhe të panjohura nga bimë të ndryshme dhe insektet vektorë (Deng and Hiruki, 1991a;
Ahrens and Semuller, 1992, Lee et al., 1993b; Namba et al., 1993; Schneider et al.,
1993; Wang et al., 1994; Pollini et al., 1996). Megjithatë, çiftet e primerave
universalë nuk aplikohen të vetme për studime epidemiologjike, ku një sëmundje e
caktuar është e lidhur me më shumë se një tip fitoplazme (Ceranic-Zagorac and
Hiruki, 1996). Çiftet e primerave specifikë, janë aplikuar për zbulimin e infeksioneve
të shkaktuara nga fitoplazma të ndryshme në një bimë të vetme (Deng and Hiruki
1990a; Lee et al., 1994; Namba et al., 1993b). Një teknikë PCR-je e modifikuar, e
quajtur recycled PCR, u zhvillua gjithashtu për të bërë të mundur dedektimin e
fragmenteve të ADN-së specifike të Mollicutës dhe fragmenteve të grupeve specifike
të fitoplazmave si banda të shumëfishta (Namba et al., 1993b). Për shkak të
përqëndrimit relativisht të ulët (Kollar et al., 1990) dhe shpërndarjes jo të rregullt të
fitoplazmave tek bimët bujtëse, një shumëfishim i vetëm në disa raste dështon të
dedektojë fitoplazmat nga bimët frutore dhe ato dekorative. Nested PCR, siguroi
specificitet më të lartë dhe rriti ndjeshmërinë e dedektimit mbi dhjetë herë, duke lejuar
zbulimin e lehtë të fitoplazmave nga të gjitha bimë e infektuara dhe insektet vektorë
(Gundersen and Lee, 1996). Për më tepër, shumëfishimi i fragmenteve specifike dhe
jospecifike nga bimët e shëndetshme mund të realizohet duke përdorur primera nga
gjeni 16S rARN (Deng and Hiruki, 1991a; Ahrens and Seemuller, 1992; Yoshikawa
et al., 1994; Nakamura et al., 1996). Përdorimi i primerave të dizenjuar në bazë të
sekuencave të nukleotideve të gjeneve të proteinave ribozomale, nuk realizon
shumëfishim të fragmenteve jospecifike dhe siguron dedektim më të besueshëm të
fitoplazmave (Yoshikawa et al., 1994; Nakamura et al., 1996). Përmbledhtas,
ndjeshmëria e dedektimit tregohet nëpërmjet kësaj renditje: nested PCR > direct PCR
> riboprobet e ARN-së > probet e dsADN-së > probet e oligonukleotideve >
antitrupat monoklonalë > antiserumet poliklonalë > ngjyrimi i ADN-së. Është e
dukshme se PCR-ja siguron dedektimin më të ndjeshëm të fitoplazmave.
1.6.6.3 Real-Time PCR për zbulim universal të fitoplazmave
Zbulimi me anë të Real-time PCR-së bazohet në matjen e fluoreshencës së emetuar
gjatë shumëfishimit. Dy lloje kryesore molekulash janë përdorur: agjentët insertues
ose probet fluorogjenike. SYBR e Gjelbër® është një agjent insertues i përdorimit
rutinë; megjithatë, ai lidhet në mënyrë jo specifike tek të gjithë amplikonet dhe në
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
32
këtë mënyrë ndikon fuqishëm në saktësinë e përcaktimit të sasisë dhe mund të çojë në
rezultate false pozitive. Probet fluorogjenike të tilla si probet TaqMan®, sigurojnë një
shkallë më të lartë specificiteti pasi ata kërkojnë jo vetëm hibridizim të probeve, por
edhe të probit TaqMan® në template. Duke qënë se përqëndrimi i fitoplazmave mund
të ndryshojë në mënyrë domethënëse gjatë sezonit dhe në inde të ndryshme të bimëve,
përcaktimi sasior i fitoplazmave mund të jetë i rëndësishëm. Gjithashtu, përcaktimi
sasior është i rëndësishëm në analizimin e bimëve për rezistencën kundër
fitoplazmozave. Nga ana tjetër, përcaktimi i sasisë nuk është gjithmonë esencial në
programet e indeksimit për fitoplazmat ose në testet diagnostikuese. Kur përcaktimi
sasior është i nevojshem, stadet e hollimit të përqëndrimeve të njohura duhet të
aplikohen në mënyrë paralele (Christensen et al., 2013).
1.6.6.4 Restriction Length Fragment Polymorphism (RFLP)
Aplikimet e hershme të RFLP-së për diferencimin dhe klasifikimin e fitoplazmave
ishin të kombinuara me hibridizimin dot ose Southern. Organizimi shumë i ngjashëm
i gjenomave të fitoplazmave PWB dhe CP, u identifikua nga analiza RFLP dhe
hibridizimi dot (Deng and Hiruki, 1991b; Lee et al., 1991a). Një studim krahasues i
grapevine flavescence doree dhe European grapevine yellows nëpërmjet RFLP-së dhe
probeve të biotiniluara të ADN-së, zbuloi se këto dy sëmundje ndanin disa rajone
homologe të sekuencës së ADN-së, por ishin të ndryshme nga njëra-tjetra (Davis et
al., 1992). Pesëmbëdhjetë fitoplazma të izoluara nga Amerika e Veriut dhe Europa u
studiuan gjithashtu nga analiza RFLP dhe u klasifikuan në tre grupe të ndryshme
gjenotipike (Lee et al., 1991a). Që prej përfshirjes së PCR-së në studimet rreth
fitoplazmave, analiza RFLP e 16S rADN-së së shumëfishuar nëpërmjet PCR-së, u
aplikua gjerësisht për identifikimin dhe klasifikimin e një game të gjerë të
fitoplazmave (Lee et al., 1993b; Namba et al., 1993b; Schneider et al., 1993;
Seemuller et al., 1994; Gundersen et al., 1994a, b, 1996; Ceranic-Zagorac and Hiruki,
1996). Njëmbëdhjetë grupe të ndryshme të 16S rADN dhe më shumë se 25 nëngrupe
janë identifikuar duke përdorur këtë metodë (Lee et al., 1993b; Gundersen et al.,
1994b, 1996). Megjithatë, fitoplazmat e lidhura më ngushtësisht nuk mund të
diferencohen nga analiza e fragmentit 16S rADN, për shkak të natyrës së tyre tejet
konservative (Lee et al., 1992b, 1993b; Griffiths et al., 1994a). Gjenet e proteinave
ribozomale, kanë një potencial më të madh për të zbuluar ndryshimet midis shtameve
të lidhura ngushtë (Gundersen et al., 1996). Studime të mëtejshme mbi profilet e
RFLP-së së sekuencave të gjeneve të proteinave ribozomale të fitoplazmave që janë
shumëfishuar nëpërmjet PCR-së, do të zbulojnë në një nivel më të hollësishëm
ndryshimet midis çdo grupi fitoplazmash.
1.6.6.5 Nested PCR, RFLP bazuar në gjenin 16S rADN
Identifikimi i fitoplazmave në nivel grupi aktualisht kryhet me anë të analizimit të
gjenit 16S rADN duke përdorur PCR/RFLP. Skema e parë e klasifikimit të
fitoplazmave është bazuar në analizimin me anë të RFLP-së të produkteve të 16S
rARN të shumëfishuara me anë të PCR-së, duke siguruar një mjet të besueshëm për
diferencimin e një koleksioni të gjerë të fitoplazmave (Lee et al., 1998). Ky sistem
lejoi klasifikimin e fitoplazmave në 19 grupe dhe më shumë se 40 nëngrupe dhe është
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
33
cilësuar si sistemi më i plotë dhe i pranuar më gjerësisht i klasifikimit deri tani.
Zbulimi në nivel ndjeshmërie të lartë dhe të saktë të këtyre mikroorganizmave është
parakusht për menaxhimin e sëmundjeve të shoqëruara me praninë e fitoplazmave.
Pas zbulimit të tyre, fitoplazmat kanë qenë të vështira për tu dedektuar për shkak të
përqëndrimit të tyre të ulët në bimët bujtëse, sidomos tek dru-frutorët, si dhe
shpërndarjes së tyre të çrregullt në gypat shoshë të bimëve të infektuara (Berges et al.,
2000). Janë zhvilluar mjaft primera të projektuar bazuar në sekuencen e 16S rADN-së
që janë universale për fitoplazmat ose specifikë për grupe të veçanta, ato mund të
përdoren në kombinime të ndryshme në sisteme të thjeshta, nested ose semi-nested
për zbulimin rutinë te fitoplazmave, si dhe për identifikimin e fitoplazmave të reja ose
bujtësve të rinj (Duduk et al., 2013). Përpjekjet për të përmirësuar proçedurat
diagnostike kanë për qëllim të zhvillojnë metoda të shpejta, ekonomike dhe efektive.
Ndjeshmëria nuk është një çështje në vetvete, pasi protokollet e tanishme të Nested
PCR-së janë jashtëzakonisht të ndjeshëm. Arritja e niveleve të larta të ndjeshmërisë
pa rrezikun e rezultateve të rreme pozitive që mund të shoqërojnë nested PCR-në
është tepër e rëndësishme. Megjithatë, për shkak të natyrës shumë kompakte të
gjeneve 16S rARN dhe të pranisë jo të pazakontë të sekuencës heterogjene të
interoperonit të 16S rADN-së, janë zhvilluar disa mjete shtesë për analizimin
filogjenetik dhe diferencimin më të mirë të shtameve. Diferencimi i fitoplazmave në
mënyrë rutinë është i bazuar në sekuencat e gjeneve 16S rARN, dhe është kryer me
anë të RFLP-së të sekuencave të shumëfishuara të ADN-së përmes PCR-së duke
përdorur 17 enzima restriksioni (endonukleaza) (Lee et al., 1998). Kjo proçedurë
lejon identifikimin e shumicës së fitoplazmave në nivel grupi/nëngrupi 16Sr, çka e
bën të rëndësishme për qellime të epidemiologjisë dhe karantinave. Duke qenë se
karakteristikat e dokumentuara të profileve të RFLP të çdo fitoplazme ruhen (për të
dy amplikonet R16F2/R16R2 dhe P1/P7), fitoplazmat e panjohura mund të
identifikohen duke krahasuar profilet e tyre me ato të fitoplazmave të njohura, pa
pasur nevojë për të analizuar të gjitha fitoplazmat referencë në të njëjtën kohë. Në
disa raste, mostra mund të përmbajë fitoplazma me prani të sekuencave heterogjene të
interoperonit të 16S rADN-së ose fitoplazma të përziera. Profilet e RFLP-së do të
shfaqen të pazakonta, dhe madhësia në total e gjithë fragmenteve do të jetë më e
madhe se ajo e amplikonit të pritshëm. Në rastin e infeksioneve të përziera është i
rekomanduar përdorimi i primerave specifikë, kur janë të disponueshëm.
Tabela 1.2 Primerat specifikë për amplifikimin e rajonit 16Sr ADN tek fitoplazmat (Duduk et
al., 2013). Primeri Specificiteti 16S Sekuenca 5’-3’ Pozicioni
P1 Universal AAGAATTTGATCCTGGCTCAGGATT 16S rADN
P7 Universal CGTCCTTCATCGGCTCTT 28S rADN
RO Universal GAATACCTTGTTGTTACGACTTAACCCC 16S rADN
P3 Universal GGATGGATTCACCTCCTT 16S rADN
P4 Universal GAAGTCTGCAACTCGACTTC 16S rADN
P5 Universal CGGCAATGGAGGAAACT 16S rADN
R16F2n Universal GAAACGACTGCTAAGACTGG 16S rADN
R16R2 Universal TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 16S rADN
F1 Universal AAGACGAGGATAACAGTTGG 16S rADN
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
34
B6 Universal TAGTGCCAAGGCATCCACTGTG 1S
R16mF2 Universal CATGCAAGTCGAACGGA 16S rADN
R16mR2 Universal CTTAACCCCAATCATCGA 16S rADN
P1A Universal AACGCTGGCGGCGCGCCTAATAC 16S rADN
16Sr-SR Universal GGTCTGTCAAAACTGAAGATG 1S
P7A Universal CCTTCATCGGCTCTTAGTTGC 28S rADN
Pc399 Universal AACGCCGCGTGAACGATGAA 16S rADN
Pc1694 Universal ATCAGGCGTGTGCTCTAACC IS
fU5 Universal CGGCAATGGAGGAAACT 16S rADN
rU3 Universal TTCAGCTACTCTTTGTAACA 16S rADN
PA2f Universal GCCCCGGCTAACTATGTGC 16S rADN
PA2r Universal TTGGTGGGCCTAAATGGACTC 1S
M1(758F) Universal GTCTTTACTGACGC 16S rADN
M2(1232R) Universal CTTCAGCTACCCTTTGTAAC 16S rADN
SN901601 Universal GTTTGATCCTGGCTCAGGATT 16S rADN
SN910502 Universal AACCCCGAGAACGTATTCACC 16S rADN
R16(I)F1 I, II, XII, XV TAAAAGACCTAGCAATAGG 16S rADN
R16(I)R1 I, II, XII, XV CAATCCGAACTAAGACTCT 16S rADN
R16(III)F2 III AAGAGTGGAAAAACTCCC 16S rADN
R16(III)R1 III TTCGAACTGAGATTGA 16S rADN
R16(V)F1 V TTAAAAGACCTTCTTCGG 16S rADN
R16(V)R1 V TTCAATCCGTACTGAGACTACC 16S rADN
R16(X)F1 X GACCCGCAAGTATGCTGAGAGATG 16S rADN
R16(X)R1 X CAATCCGAACTGAGAGTCT 16S rADN
fO1 X CGGAAACTTTTAGTTTCAGT 16S rADN
rO1 X AAGTGCCCAACTAAATGAT 16S rADN
1.6.6.6 PCR, RFLP bazuar në operonin proteinik ribozomal
Deri tani, janë identifikuar 31 grupe 16Sr dhe më shumë se 100 nëngrupe 16Sr.
Megjithatë, për shkak të natyrës së tij të konservuar, gjeni 16s rARN shpesh nuk
mund të përdoret i vetëm për të bërë dallimin mes shtameve të lidhura ngushtë, por
ekologjikisht të veçanta. Kjo nënvizon nevojën për të kërkuar markerë të tjerë që
lejojnë diferencimin më të detajuar të shtameve të lidhur ngushtë. Disa gjene më pak
të konservuar, duke përfshirë edhe gjenet e proteinave ribozomale (rp), janë të
përshtatshëm si markerë molekularë plotësues për diferencim më të detajuar të
shtameve (Lee et al., 2010). Gjenet e proteinave ribozomale (rp) janë më variabël se
gjenet 16S rARN dhe kanë më shumë karaktere informative filogjenetikë, të cilat në
thelb rritin fuqinë diferencuese të klasifikimit të shtameve fitoplazmatike brenda një
grupi të caktuar 16Sr. Studimet e mëparshme për diferencimin e fitoplazmave në
grupet 16SrI dhe 16SrV treguan se analiza e sekuencave gjenike rp jo vetëm që
identifikoi qartë nëngrupet që janë në përputhje me nëngrupet 16Sr por identifikoi
edhe brenda disa nëngrupeve, shtame të tjera të dallueshme që nuk mund të
identifikohen nga analiza e sekuenca gjenike shumë të konservuara 16S rARN.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
35
Përkatësisht dhjetë dhe dymbëdhjetë nëngrupe RFLP-je janë të diferencuara në bazë
të sekuenca gjenike të proteinave ribozomale në shtamet fitoplazmatike 16SrI dhe
16SrV. Shumica e shtameve të tjera të identifikuara kanë veti të veçanta biologjike
dhe ekologjike (Lee et al., 1998).
Tabela 1.3 Primerat e bazuar në gjenet rp, gjysëmuniversale, 16Sr grup-specifikë dhe 16Sr
nëngrup-specifikë të dizenjuar për amplifikimin e një pjese të operonit rp të fitoplazmave
(Martini and Lee, 2013).
1.6.6.7 T-RFLP për zbulim dhe identifikim
Terminal restriction fragment length polymorphism analysis (T-RFLP) është një
teknikë e zhvilluar për herë të parë në vitin 1997 për profilizimin e komuniteteve
mikrobiale bazuar në vendndodhjen e siteve të restriksionit enzimatik brenda një
sekuence ADN-je (Liu et al., 1997). Kjo teknikë kombinon PCR-në me një primer të
shënuar me fluoreshencë, tretjen me enzima restriksioni duke përfshirë një ose më
Çifti i primerave Sekenca (5’ -3’) Vendndodhja Madhësia e
produktit
(bp)
Specificiteti
rpF1/rpR1 GGACATAAGTTAGGTGAATTT
ACGATATTTAGTTCTTTTTGG
rpsS
rplP
1,245-1,389 16SrI, III-V, VII-
IX, XIII
rp(I)F1A/rp(I)R1A TTTTCCCCTACACGTACTTA
GTTCTTTTTGGCATTAACAT
rpsS
rpsC/rplP
1,200 16SrI
rp(I-A)F1/rp(I-A)R1 CAAGAGCTAAAGGTTCTGGC
GAGGGCGCCTGTTAGGGTTA
rplV
rpsC
800 16SrI-A
rp(I-B)F1/rp(I-B)R2 AAGAGCTAAAGGTTCTGGT
GAGGGCGTCTGTTAGGAGTG
rplV
rpsC
800 16SrI-B
rpL2F3/rp(I)R1A TCCTTGGGGYAAAAAAGCTC
GTTCTTTTTGGCATTAACAT
rplB
rpsC/rplP
1,600 16SrI, III-VII, IX,
X, XII, XIII, XVIII
rpF1C/rp(I)R1A ATGGTDGGDCATAARTTAGG
GTTCTTTTTGGCATTAACAT
rpsS
rpsC/rplP
1,212-1,386 16SrI, II-VII, IX,
X, XII, XIII, XVIII
rp(II)F1/rp(II)R1 GCTCTTACTCGTAAAYATGTAGT
TTACTTGATTTTCTGGTTTTGA
rpsS
rpsC
1,200 16SrII
rp(II)F/rp(I)R1A ACTTATTCTCGTGATACTAG
GTTCTTTTTGGCATTAACAT
rpsS
rpsC/rplP
1,390 16SrII
rp(II)F2/rp(I)R1A ATGGTAGGTTATAAATTAGG
GTTCTTTTTGGCATTAACAT
rpsS
rpsC/rplP
1,290 16SrII
rp(III)F1/rp(III)R1 TTAGAGAAGGCATTAAAC
CTCTTTCCCCATCTAGGACG
rpsS
rpsC
1,200 16SrIII
rp(V)F1/rpR1 TCGCGGTCATGCAAAAGGCG
ACGATATTTAGTTCTTTTTGG
rpsS
rplP
1,200 16SrV
rp(V)F2/rpR1 TTGCCTCGTTTATTTCCGAGAGCTA
ACGATATTTAGTTCTTTTTGG
rplV
rplP
950 16SrV
rp(V)F1A/rp(V)R1A AGGCGATAAAAAAGTTTCAAAA
GGCATTAACATAATATATTATG
rpsS
rplP
1,200 16SrV
rp(VI)F2/rp(VI)R2 GGTTGTTGATTTAATTCGTGGTC
CCAGATATTCGTCTAGTATCAGAA
rplV
rpsC
1,000 16SrVI
rp(VIII)F2/rp(VIII)R2 AGTTGTCGATTTAATTCGTGGCA
CAGCAGATATTTGTCTAGTATCTGCG
rplV
rpsC
1,000 16SrVII, VIII
rp(IX)F2/rp(IX)R2 GCACAAGCTATTTTAATGTTTACACCC
CAAAGGGACTAAACCTAAAG
rplV
rpsC
800 16SrIX
rpAP15f2/rp(I)R1A CTCCTAAATCAGCTTCAAGT
TTCTTTTTGGCATTAACAT
rplV
rpsC/rplP
1,036 16SrX-A
rpAP15f/rpAP15r AGTGCTGAAGCTAATTTGG
TGCTTTTTATAGCAAAAGGTT
rplV
rpsC
920 16SrX-A
rpStolF/rpStolR CGTACAAAATAATCGGGAGA
CGAAACAAAAGGTTTACGAG
rplB
rpsC
1,372 16SrXII-A
rpStolF2/rpStolR AAACTTGGTCACGTAGTTCC
CGAAACAAAAGGTTTACGAG
rplP
rpsC
1,253 16SrXII-A
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
36
shumë enzima, dhe ndarjen e fragmenteve me një sekuencator automatik të ADN-së
nëpërmjet elektroforezës me rezolucion të lartë, për të lejuar zbulimin e produkteve
fluoreshente të shënuara me ngjyrues, të quajtura terminal restriction fragments
(TRFs). Vetëm kohët e fundit me përdorimin në masë të Real-time PCR-së është bërë
teknikë rutinë për analizim, çka demonstron se ekstraktimi i ADN-së ka qenë i
suksesshëm dhe se përgatitja e ADN-së mbështet shumëfishimin me anë të PCR-së.
Duke qënë se ky është një hap vital, nga të dy teknikat, si nga ajo konvencionale dhe
Real-time PCR-ja, zakonisht kërkohet që të kryhen dy teste individuale. Një avantazh
kryesor i T-RFLP-së është se në një reaksion të vetëm një sërë primerash
shumëfishojnë si ADN-në bimore dhe atë fitoplazmatike, dhe gjenerohen TRF të cilat
përfaqësojnë si bimën dhe fitoplazmat. Kjo do të thotë konfirmim të lehtë dhe të
shpejtë të mungesës së rezultateve negative të rreme dhe arrihet duke konfirmuar
cilësinë e ADN-së dhe mungesën e inhibitorëve. Mungesa e TRF-ve si të bimëve dhe
të fitoplazmave tregon ose prani të inhibitorëve ose ADN jo të amplifikueshme, dhe
përjashton në këtë mënyrë mostrat me rezultate të rreme negative. Po aq e
rëndësishme sa zbulimi i rezultateve negative të rreme është edhe problemi i
rezultateve false pozitive. Duke përdorur T-RFLP-në, kjo e metë është eliminuar pasi
çdo grup 16Sr prodhon TRFs të cilat janë të veçanta dhe karakteristike me
kombinimin e dy enzimave të restriksionit. Nëse TRF të tjerë do të ishin të pranishëm,
atëherë kjo do të tregonte ose prani të një grupi të ri fitoplazmatik ose një specie të
mundshme jo target, duke identifikuar një mostër të mundshme me rezultat të rremë
pozitiv. Për të krijuar TRF korrekte për një grup të caktuar, duhet të përcaktohet
sekuenca 23S rARN, dhe më pas tretja me enzimat e dhëna mund të kryhet për të
parashikuar përmasat e TRF-ve. Kjo mundëson zhvillim të vazhduar të teknikës
paralel me zbulimin e llojeve të reja të fitoplazmave (Hodgetts J. and M. Dickinson,
2013). Kjo teknikë synon 23S rARN-në, një gjen në shumë kopje. Ky synim siguron
primera që janë universalë për të gjitha fitoplazmat e njohura deri më tani, megjithatë
ka një nivel mesatar të ndjeshmërisë. Ndjeshmëria e T-RFLP-së varion ndërmjet asaj
të PCR-së konvencionale dhe Real-time PCR-së. Kombinimi i gjithë këtyre faktorëve
(ndjeshmërisë, zbulimit universal, zbulimit të rezultateve negative të rreme dhe atyre
false pozitive) e bëjnë T-RFLP-në një mjet i cili është veçanërisht i përshtatshëm për
situata të tilla si p.sh screening, ku për një numër të madh mostrash kërkohet
screening dhe konfirmim i grupit fitoplazmatik 16Sr. Në disa situata kjo mund të jetë
më e përshtatshme se Real-time PCR-ja pasi identifikon fitoplazmat në një hap të
vetëm. T-RFLP ka gjithashtu aftësinë për të zbuluar një sërë infeksionesh që
përfshijnë praninë e fitoplazmave nga grupe të ndryshme filogjenetike pasi ato mund
të dedektohen në të njëjtin analizim. Megjithatë T-RFLP është më pak e përshtatshme
për identifikimin e një grupi të ri fitoplazmatik, ku teknikat të cilat bartin nivelet më të
larta të ndjeshmërisë do të ishin më të përshtatshme (Hodgetts J. and M. Dickinson,
2013).
1.6.6.8 Heteroduplex Mobility Assay (HMA)
Heteroduplex mobility assay (HMA), u zhvillua fillimisht për zbulimin dhe
vlerësimin e divergjencave gjenetike midis shtameve të virusit të imunodefiçencës
humane (HIV) (Delwart et al., 1993). HMA është një mjet shqyrtimi i ri, i shpejtë, i
thjeshtë dhe është i aftë jo vetëm të bëjë dallimin ndërmjet shtameve të veçanta, por
edhe të sigurojë konkluzione të besueshme në lidhje me marrëdhëniet filogjenetike të
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
37
shtameve të mikroorganizmave. HMA bazohet në vëzhgimin e heteroduplekseve të
ADN-së të formuara midis fijeve teke të nukelotideve të ndryshme, që kanë një
lëvizshmëri të reduktuar në xhelin poliakrilamid nën kushte jodenatyruese.
Lëvizshmëria e tyre është proporcionale me shkallën e divergjencës së tyre.
Heteroduplekset krijohen nga çiftimi i bazave midis fijeve teke komplementare me
prejardhje nga molekula të ndryshme dupleks prindërore gjatë rikombinimit gjenetik.
Sekuencat e panjohura të ADN-së mund të krahasohen me sekuenca standarde
reference. Sekuenca gjenetike e varianteve të zakonshme ose të rralla, mund të
përcaktohet më mirë nga përzgjedhja e bazave sesa nga bazat e rastësishme.
Gjithashtu, analiza heterodupleks mund të përdoret për gjurmimin e sekuencave të
varianteve brenda mostrave individuale, (Delwart et al., 1994) duke ndihmuar në
zbulimin e lidhjeve epidemiologjike midis mostrave individuale. Kohët e fundit,
HMA është përdorur për zbulimin dhe diferencimin e fitoplazmave (Zhong and
Hiruki, 1994; Ceranic-Zagorac and Hiruki, 1996; Cousin et al., 1997). Të gjitha
rezultatet për diferencimin e fitoplazmave nga HMA ishin në përputhje me rezultatet e
fituara nga PCR-ja dhe në veçanti nga analiza RFLP. Hapi i dytë i RFLP-së mbas
shumëfishimit me PCR për klasifikimin e fitoplazmave, mund të shmanget nga HMA.
Është demostruar se HMA siguron diferencim të ndjeshëm të fitoplazmave ndërkohë
që metodat e tjera si RFLP-ja nuk aplikoheshin për diferencimin midis fitoplazmave
të lidhura shumë ngushtë me njëra-tjetrën (Ceranic-Zagorac and Hiruki, 1996; Cousin
et al., 1997). Natyrisht, HMA e kombinuar me PCR-në do të jetë një metodë shumë e
thjeshtë, e shpejtë, e ndjeshme dhe e sigurt për dedektimin dhe klasifikimin e
shtameve dhe grupeve të ndryshme të fitoplazmave (Wang, 1997).
1.6.6.9 Analiza e polimorfizmit të konformacionit një vargor për
diferencimin e shtameve fitoplazmatike (SSCP)
Analiza Single-strand conformation polymorphism (SSCP) është një nga metodat më
të thjeshta teknikisht për zbulimin e shpejtë të ndryshimeve të nukleotideve në çdo
sekuencë të caktuar të ADN-së. Teknika është e bazuar në lëvizshmërinë e
ndryshueshme elektroforetike të fragmenteve një vargore të ADN-së (ssADN) që
kanë struktura të ndryshme primare (Orita et al., 1989). Zakonisht fragmentet e ADN-
së, të shumfishuara me anë të PCR-së, i nënshtrohen denatyrimit kimik dhe/ose me
ngrohje dhe më pas elektroforezës në xhel poliakrilamid jo-denatyrues. Fijet një-
vargore të ADN-së me strukturë parësore të veçantë çojnë në konformacione të
ndryshme si rezultat i vetë-komplementaritetit dhe ndërveprimeve ndërmolekulare.
Në kushte të përshtatshme elektroforetike, ssADN të ndryshme migrojnë me shpejtësi
të ndryshme, dhe mundësojnë zbulimin e pranisë të mutacioneve. Megjithatë, saktësia
e kësaj metode në zbulimin e zëvendësimeve nukleotidike është vlerësuar në
intervalin 80-95% (Ravnik et al., 1994).
1.6.6.10 Microarrays për zbulim dhe identifikim universal
Microarrays janë mjete të fuqishme për identifikimin dhe diferencimin e
mikroorganizmave duke përfshirë edhe patogjenët bimorë. Si test mund të kryhet në
mënyrë paralele për shumë organizma, shembujt përfshijnë microarrays për zbulimin
e nematodëve, kërpudhave, baktereve, fitoplazmave dhe viruseve. Shumica e arrays të
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
38
ADN-së për zbulimin e patogjenëve janë të bazuara në probet oligonukleotidike të
fiksuara në pllaka xhami, duke lejuar analizimin e një mostre në çdo pllakë
(Nicolaisen et al., 2013). Faktor kyç në zhvillimin e mikroarrays është dizenjimi i
probeve. Hartimi i probeve fillon me identifikimin e rajonit më të përshtatshëm të
synuar për dizenjimin e probit. Duke qënë se PCR-ja përdoret më shpesh për
amplifikimin e ADN-së së synuar, rajoni me interes i ADN-së duhet të jetë lehtësisht i
shumëfishueshëm për të gjitha shtamet dhe duhet të përmbajë mjaftueshëm ndryshime
për diferencim në nivelin e dëshiruar.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
39
KAPITULLI II
MATERIALE DHE METODA
2.1 Materiali bimor i analizuar
2.1.1 Llojet e bimëve, plantacionet
Studimi është realizuar në periudhën kohore Prill 2012 - Tetor 2016. Materiali i
përdorur për zbulimin e fitoplazmave është grumbulluar nga dy gjini të ndryshme të
familjes Rosaceae, mollë (Malus domestica) dhe kumbulla (Prunus domestica).
Gjithsej janë përzgjedhur mostra nga gjashtë plantacione, përkatësisht tre me mollë
(plantacionet Bitinckë, Korçë, Turan) (fig 2.1; 2.2; 2.3) dhe tre me kumbulla
(plantacionet Cangonj, Dvoran, Zëmblak) (fig 2.4; 2.5; 2.6).
Plantacioni Bitinckë ka 150 rrënjë mollë, të gjitha kultivarë Idared me moshë 14
vjeçare.
Figura 2.1 Plantacioni Bitinckë, majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në terren.
Foto D. Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
40
Plantacioni Korçë ka 1500 rrënjë mollë të kultivarëve të ndryshëm, me mosha të
ndryshme. Varietetet e zgjedhura për studim janë Gloden Delicious, Rennete dhe
Starking Delicious.
Figura 2.2 Plantacioni Korçë. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga terreni. Foto
nga D.Mero.
Plantacioni Turan ka 375 rrënjë mollë të kultivarëve Golden Delicious dhe Starking
Delicious me moshë 8 vjeçare.
Figura 2.3 Plantacioni Turan. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në terren. Foto
D. Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
41
Plantacioni Cangonj ka 200 rrënjë kumbulla kultivarë Tropojane dhe Iliria, me moshë
7 vjeçare.
Figura 2.4 Plantacioni Cangonj. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje në terren.
Foto D. Mero.
Plantacioni Dvoran ka 420 rrënjë kumbulla, kultivarë Tropojane dhe Iliria me mosha
të ndryshme.
Figura 2.5 Plantacioni Dvoran. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga terreni.
Foto nga D.Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
42
Plantacioni Zëmblak ka 200 rrënjë kumbulla kultivarë Tropojane dhe Iliria, me
moshë 14 vjeçare.
Figura 2.6 Plantacioni Zëmblak. Majtas pamje e marrë nga ajri; Djathtas pamje nga
terreni. Foto nga D.Mero.
2.1.2 Metoda e marrjes së mostrave
Tek secili prej plantacioneve janë përzgjedhur dhjetë bimë në një kuadrat prej 100
bimësh, pra gjithësej 30 drurë të mollëve dhe 30 drurë të kumbullave. Përzgjedhja e
përfaqësuesve është bërë në mënyrë rastësore duke u bazuar tek skemat X, Y, Z, W.
Drurët u identifikuan me numra nga 1-10, të cilët u shënuan në trungun e bimëve me
ngjyrues rezistent (fig 2.7) dhe njëkohësisht në fletore u ruajtën numrat, përbri të
cilëve u vendosen karakteristikat dhe koordinatat për tu siguruar që do të zgjedhim të
njëjtat bimë.
Figura 2.7 Ilustrim i mënyrës së shënimit të kampioneve; Druri 2, plantacioni Zëmblak
(majtas), Druri 1 Bitinckë (djathtas). Foto D. Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
43
Në varësi të llojit të teknikës së përdorur për dedektim, u përcaktua periudha e marrjes
së mostrave dhe lloji i materialit bimor. Për dedektimin e fitoplazmave nëpërmjet
mikroskopisë me fluoreshencë u grumbullua material bimor i kategorisë gjethe gjatë
periudhës së pranverës dhe rrënjë gjatë periudhës së dimrit. Për dedektimin në bazë të
metodave molekulare materiali i grumbulluar është i katër kategorive të ndryshme:
rrënjë dhe trung, grumbulluar në vjeshtën e vonë dhe dimër, kërcell dhe gjethe,
grumbulluar në pranverën e vonë dhe verë (Seemüller et al., 1984, etj) (fig 2.8).
Figura 2.8 Grumbullimi i mostrave; a. kategoria gjethe, druri 9, plantacioni Zëmblak, b.
kategoria trung, druri 1, plantacioni Korçë, c. kategoria kërcell, druri 10, plantacioni Bitinckë,
d. kategoria rrënjë, druri 3, plantacioni Zëmblak.
Gjatë grumbullimit u patën parasysh disa kritere duke ditur se mënyra e grumbullimit
të materialit bimor ndikon drejtpërdrejt në rezultatin e analizave (Scot C. Nelson and
Brian C. Bushe., 2006).
a. Nga e gjithë bima grumbullohen 5 mostra të secilës prej kategorive në 5 vende
të ndryshme (karakteristika kryesore e infeksionit të shkaktuar nga fitoplazmat
është përhapja jo e rregullt në të gjithë bimën; një mostër e vetme mund të
japë rezultat të gabuar).
b. Mos kontaminimi i bimëve nga njëra-tjetra gjatë marrjes së mostrave është
shumë i rëndësishëm (mjetet ndihmëse për grumbullimin e materialit, mbas
marrjes së tij nga njëra bimë tek tjetra, janë dezinfektuar).
c. Pjesët e vdekura të bimës nuk duhet të grumbullohen (fitoplazmat ushqehen
nga indi i floemës dhe nëse qelizat e tij do jenë të vdekura, fitoplazmat nuk do
jenë më të lokalizuara tek ajo pjesë).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
44
d. Mbas grumbullimit shumë e rëndësishme është ruajtja në kushte të caktuara
(mostrat nuk duhet të ekspozohen ndaj diellit pasi ndodh dehidratimi i tyre).
e. Paketimi dhe transporti (mostrat futen në qese plastike ku janë shënuar numri i
drurit, data e grumbullimit, kategoria e materialit bimor, emri i plantacionit
dhe transportohen brenda 24 orësh drejt laboratorit në termobokseve me
temperaturë 4C) (fig 2.9).
Figura 2.9 Gjatë grumbullimit të materialit bimor, kategoria gjethe (Plantacioni Turan).
Materiali bimor i grumbulluar, në varësi të kategorisë plotësoi kushtet e mëposhtme:
1. Gjethe - të plota, me bisht, duke qënë se përdoren nervurat kryesore të tyre.
2. Kërcell - të rinj sepse lehtësojnë proçesin e grirjes dhe mundësia që të ketë
prani fitoplazmash në to është më e madhe.
3. Trung - mostrat e trungut merren në mënyrë vertikale deri në thellësinë e
floemës, me qëllim mos dëmtimin e bimës.
4. Rrënjë - të reja pasi tek ato ka përqëndrim më të madh të fitoplazmave dhe
ofrojnë lehtësi gjatë proçesit të grirjes (fig 2.10).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
45
Figura 2.10. Mostrat e transportuara në laboratorin e Bioteknologjisë Molekulare, FSHN,
UT, a. kategoria kërcell, b. kategoria trung, c. kategoria rrënjë, d. kategoria gjethe.
2.2 Metodat e diagnostikimit
2.2.1 Vlerësimi i plantacioneve në bazë të simptomave
Vlerësimi i plantacioneve në bazë të simptomave u krye sipas Scot C. Nelson and
Brian C. Bushe., 2006. Për vlerësimin simptomatologjik u patën parasysh kushtet si
vijojnë.
a) Para marrjes së materialit e gjithë bima vrojtohet për simptoma (e njëjta bimë
mundet të jetë e prekur nga një ose disa infeksione njëkohësisht).
b) Gjatë vëzhgimit të materialit bimor, fotografimi dhe mbajtja e shënimeve luan
rol thelbësor (një përshkrim sa më i detajuar i karakteristikave të bimës
shërben për kuptuar më mirë problemin).
c) Bimët vëzhgohen në të gjitha stinët (shenjat më karakteristike shfaqen në
verën e vonë ose në mesin e vjeshtës).
d) Bimët vëzhgohen për simptoma të dukshme përgjatë disa viteve (simptomat
shfaqen në mënyrë jo të rregullt, disa bimë mund të shfaqin simptomat tipike
të fitoplazmave vetëm një herë).
e) Gjatë periudhës aktive të bimëve, ato vëzhgohen dhe vlerësohen për praninë e insekteve (insektet janë vektorët kryesorë për përhapjen e infeksioneve fitoplazmatike).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
46
f) Për çdo bimë plotësohet formulari me datën dhe karakteristikat në momentin e
vëzhgimit.
Figura 2.11. Formulari për vlerësimin simptomatologjik të bimëve.
2.2.2 Metoda e ngjyrimit DAPI
Materiali bimor i përdorur është i kategorisë gjethe. U provua zbulimi i fitoplazmave
edhe në materialin bimor me origjinë nga rrënja por teknika rezultoi jo e suksesshme.
Gjethet e grumbulluara u transportuan brenda 60 minutave në laborator. Gjithësej u
analizuan 600 mostra, përkatësisht 5 mostra nga secili prej 10 drurëve të çdo
plantacioni (gjithësej 6 plantacione). Analiza u përsërit për 2 vite njëri mbas tjetrit.
Metoda e mikroskopisë fluoreshente me ngjyruesin DAPI u realizua në laboratorin e
Biologjisë, Fakulteti i Shkencave Natyrore dhe Humane, Universiteti ―Fan. S. Noli‖,
Korçë.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
47
2.2.2.1 Protokolli i metodës së ngjyrimit DAPI
1. Materiali bimor i përdorur ishin gjethe të freskëta me bisht, 5 gjethe për
çdo trung x 10 pemë për plantacion x 6 plantacione.
2. Metodika e realizimit të ngjyrimit DAPI u krye sipas Andrade, 2013 me disa modifikime të vogla.
Metoda:
1. Solucioni stok është holluar në përqëndrimin e punës (1x); është marrë 100 l
e solucionit stok (1,000x) dhe është shtuar 100 ml H2O i distiluar. Solucioni i
punës është ruajtur në 4C.
2. Materiali bimor, është prerë në gjatësi 1 cm dhe është vendosur në ujë të
distiluar.
3. Mostrat janë zhytur në glutaraldehid dhe janë fiksuar për 20 min.
4. Mostrat janë hequr nga solucioni i glutaraldehidit dhe janë shpëlarë me bufer
KH2PO4 0,1M, pH 6,9 për 5 min. Mostrat janë kaluar në bufer të freskët
KH2PO4, 0,1 M, pH 6,9.
5. Janë bërë prerje tërthore me bisturi nga mostrat e fiksuara.
6. Seksionet e mostrave janë vendosur në ngjyruesin DAPI (1x solucioni i punës)
për 25 min.
7. Seksionet janë hequr nga ngjyruesi dhe janë vendosur në ujë të distiluar në
mënyrë që të largohej ngjyruesi i tepërt.
8. Menjëherë seksionet janë vendosur mbi lamë dhe sipër i është vendosur
lamela.
9. Preparatet janë vëzhguar me mikroskop me fluoreshencë me zmadhimet 10x,
40x dhe 100x.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
48
Figura 2.12. a. Mikroskopi me fluoreshencë, b. mostrat e transportuara në laborator c. mjetet
e punës d. momente gjatë punës për realizimin e metodës DAPI.
Figura 2.13. Vëzhgimi i imazhit të prerjeve të ngjyrosura me ngjyruesin fluoreshent DAPI në
kompjuter.
2.2.3 Metoda të bazuara në PCR
Diagnostika molekulare e pranisë së infeksionit fitoplazmatik u bazua në
shumëfishimin specifik të rajoneve ribozomale dhe jo-ribozomale të ADN-së së
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
49
pasuruar fitoplazmatike të ekstraktuar prej mostrave bimore. Kjo kategori analizash u
krye pranë Laboratorit të Bioteknologjisë Molekulare të Departamentit të
Bioteknologjisë, FSHN, UT.
2.2.3.1 Protokolli i ekstraktimit të ADN-së të pasuruar në fitoplazma
ADN u ekstraktua nga kategoritë e mostrave gjethe, kërcell, trung dhe rrënjë, sipas
protokollit të pasurimit me ADN fitoplazmatike të përshkruar nga Seemuller et al.,
1994.
Metoda:
1. 1.5g material bimor (gjethe, kërcell, trung, rrënjë) është coptuar imët në një
havan të ftohtë i cili përmbante 8 ml bufer për grirje (4 ose -20C).
2. Është inkubuar në akull për 10-20 min.
3. Është shtuar edhe 5 ml bufer i freskët dhe është vazhduar përsëri grirja në
havan (shtimi i rërës së kuarcit ndihmon bluarjen) deri sa të jetë bluar i gjithë
materiali.
4. Homogjenati është transferuar në tuba falkon 15 ml të cilët janë mbajtur në
akull deri sa janë bërë gati të gjitha mostrat të cilat janë vendosur më pas për
centrifugim në 4C në 2000 g (1320 rpm).
5. Supernatanti është filtruar dhe është ricentrifuguar në 4C në 14600 g (9727
rpm)
6. Pelleti është tretur në 1.5 ml bufer ekstraktimi të ngrohtë (60C) dhe është
inkubuar në 60C për 30 min.
7. Lizati është ekstraktuar në volum të njëjtë kloroform-izoamilalkool (24:1)
8. Pas centrifugimit shtresa ujore është precipituar me 2/3 e volumit izopropanol
(-20C) dhe është centrifuguar në 14600 g (9727 rpm).
9. Pelleti është shpëlarë në etanol 70%.
10. Tubat janë centrifuguar për 5 min në 14000 rpm.
11. Tubat janë tharë në vakum, dhe pelleti është tretur në 100 µl H2O.
12. Është shtuar RNA-zë 1µl dhe mostrat janë inkubuar për 30 min në 37C.
13. Është shtuar 100 µl kloroform/izoamilalkool (24:1).
14. Tubat janë centrifuguar për 5 min në 14000 rpm.
15. Është marrë shtresa ujore.
16. Është shtuar kloroform/izoamilalkool (24:1) sa shtresa ujore.
17. Tubat janë cenrifuguar për 5 min në 14000 rpm.
18. Është marrë shtresa ujore.
19. Është shtuar 200 µl ETOH 100% (-20C).
20. Tubat janë centrifuguar për 5 min në 14000 rpm.
21. Pelletit i është shtuar 200 µl ETOH 70% (-20C).
22. Tubat janë centrifuguar për 1 min në 14000 rpm.
23. Tubat janë tharë dhe janë tretur në 100 µl TE.
Gjithsej u realizuan 240 ekstraktime, përkatësisht për dhjetë drurë nga çdo plantacion
(gjashtë plantacione), nga katër kategoritë e ndryshme të materialit bimor (rrënjë,
trung, kërcell, gjethe).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
50
Pas ekstraktimit të ADN-së fitoplazmatike u analizua cilësia dhe sasia e saj në
spektrofotometër. Në disa raste mostrat, pas matjeve të sasisë dhe cilësisë, u
riprecipituan dhe ripastruan sipas Sambrook, et al., 1989.
Metoda:
1. Është shtuar 100 µl fenol pH=8.
2. Tubat janë vendosur në vortex për 1 min.
3. Janë centrifuguar për 5 min në 14000 rpm.
4. Është marrë shtresa ujore 100 µl.
5. Është shtuar 50 µl fenol (pH=8)
6. Tubat janë vendosur në vortex për 1 min.
7. Tubat janë centrifuguar për 5 min në 14000 rpm.
8. Është marrë shtresa ujore 100 µl.
9. Është shtuar 250 µl EtOH 100%.
10. Është shtuar 10 µl NaOAc 3M.
11. Tubat janë vendosur në -20C për 1 orë.
12. Tubat janë centrifuguar për 10 min në 4C në 14000 rpm.
13. Pelleti është tretur në 50 µl TE.
Figura 2.14 Pamje nga puna për ekstraktimin e ADN. Laboratori i Bioteknologjisë
Molekulare, FSHN, UT.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
51
Figura 2.15 Matja e sasisë dhe cilësisë së mostrave të ADN në spektrofotometër.
Laboratori i Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT.
Mostrat me cilësinë më të mirë (OD 1.6-2) u përzgjodhën për tju nënshtruar PCR-së me primerat specifikë. Produktet e PCR-së u veçuan në elektroforezë në xhel agarozë
1,5%. Imazhet e fragmenteve të ADN-së u bënë të dukshme në transiluminator UV.
2.2.3.2 Shumëfishimi me PCR i rajoneve specifike fitoplazmatike
PCR u realizua në një volum total prej 40 l që përmbante: 100-200 ng ADN
shabllon, 0,5 M nga secili primer, 100M të katër dNTPs (deoksinukleotid
trifosfateve), 0,2 U Taq polimerazë goldstar dhe 1 X PCR buffer.
Figura 2.16. Pamje nga puna në laborator për realizimin e PCR-së, elektroforezës së
produkteve të shumëfshimit dhe vizualizimit të produkteve në transiluminator. Laboratori i
Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
52
Tabela 2.1 Primerat e përzgjedhur, zona që njohin dhe sekuencat e tyre (Ahrens and
Seemuller, 1992; Lorenz et al., 1995; Duduk et al., 2013).
Primeri Target Sekuenca e primerit (5’-3’)
fU5 16S rADN CGG CAA TGG AGG AAA CT
rU3 16S rADN TTC AGC TAC TCT TTG TAA CA
fO1 16S rADN CGG AAA CTT TTA GTT TCA GT
rO1 16S rADN AAG TGC CCA ACT AAA TGA T
fCAP Insert AT67 GGT TAC TCA CGA TCA AGA AG
rCAP Insert AT67 GTC CCA TCT ATT TTA GAG GC
fCPD Fragmenti PD67 CCA TAG CGA ATG TTT AAA AC
rCPD Fragmenti PD67 CAG TGC GAA AAT TGG TTA AT
Tabela 2.2 Protokolli i ciklimit për shumëfishim duke përdorur primerat fU5/rU3; fO1/rO1;
fCPD/rCPD.
95C 4‘
95C 30‖
35 cikle 51C 75‖
72C 90‖
72C 5‘
4C Infinit
Tabela 2.3 Protokolli i ciklimit për shumëfishim duke përdorur primerat fCAP/rCAP.
95C 4‘
95C 30‖
35 cikle 56C 75‖
72C 90‖
72C 5‘
4C Infinit
2.2.3.3 Përzgjedhja e mostrave të ADN-së për shumëfishimin e rajoneve
specifike
Bazuar në rezultatet e sasisë dhe cilësisë së ADN-së të ekstraktuar u përzgjodhën
mostrat më të mira prej të cilave mund të shumëfishohej me anë të PCR-së rajoni
target.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
53
Meqënëse në kategori të ndryshme të mostrave në plantacione të ndryshme pati
variacion të cilësisë së ADN-së, përveç përzgjedhjes së mostrave më të mira u krye
edhe bashkimi i mostrave të së njëjtës kategori nga e njëjta pemë me synim
zvogëlimin e numrit të reaksioneve fillestare të analizuara.
Tabela 2.4 Kategoritë e mostrave të zgjedhura për shumëfishimin me anë të PCR të rajoneve
fitoplazmatike.
Nr Plantacioni Kategoria Lloji Varieteti
1. Korçë Kërcell Mollë Golden delicious
2. Korçë Kërcell Mollë Starking delicious
3. Korçë Kërcell Mollë Golden delicious
4. Korçë Kërcell Mollë Rennet
5. Korçë Rrënjë Mollë Starking delicious
6. Korçë Trung Mollë Starking delicious
7. Korçë Trung Mollë Rennet
8. Korçë Trung Mollë Golden delicious
9. Korçë Gjethe Mollë Golden delicious
10. Korçë Gjethe Mollë Rennet
11. Korçë Gjethe Mollë Golden delicious
12. Korçë Gjethe Mollë Golden delicious
13. Turan Kërcell Mollë Starking delicious
14. Turan Kërcell Mollë Starking delicious
15. Turan Kërcell Mollë Golden delicious
16. Turan Gjethe Mollë Starking delicious
17. Turan Gjethe Mollë Starking delicious
18. Turan Gjethe Mollë Golden delicious
19. Turan Gjethe Mollë Golden delicious
20. Bitinckë Kërcell Mollë Idared
21. Bitinckë Kërcell Mollë Idared
22. Bitinckë Gjethe Mollë Idared
23. Bitinckë Gjethe Mollë Idared
24. Dvoran Trung Kumbull Tropojane
25. Dvoran Gjethe Kumbull Iliria
26. Cangonj Gjethe Kumbull Tropojane
27. Cangonj Gjethe Kumbull Iliria
28. Cangonj Gjethe Kumbull Tropojane
2.2.4 Analizimi i Rezultateve
Analiza e rezultateve u krye bazuar në të dhënat e marra nga vlerësimi i simptomave,
imazhet e mostrave të ngjyrosura me DAPI dhe ato të elektroforezës në xhel agarozë.
Rezultatet e simptomatologjisë u analizuan me anë të programit Microsoft Office
Excel 2007; Imazhet e ngjyrimit DAPI u përpunuan për të dhënë rezolucion maksimal
me anë të mikroskopit me fluoreshencë L3201LED të pajisur me kamera MOTICAM
352, që mundësoi veçimin e indeve ku fluoreshenca vinte për shkak të fitoplazmave
krahasuar me ato të indeve përreth. Të dhënat e marra nga elektroforeza e
fragmenteve të shumëfishuara të ADN u bënë të dukshme në transiluminatorin UV
dhe u përdorën për të ndërtuar paraqitje grafike me anë të Microsoft Office Excel
2007.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
54
KAPITULLI III
REZULTATE DHE DISKUTIME
3.1 Rezultatet e vlerësimit simptomatologjik
Simptomat e Apple proliferation mund të variojnë në varësi të bimës dhe të periudhës
që kjo sëmundje ka qënë e pranishme në të. Disa degë në një pemë të infektuar mund
të duken normale dhe të prodhojnë fruta normalisht, ndërkohë disa degë të tjera mund
të jenë të prekura dhe të shfaqin simptomat e kësaj sëmundjeje. Përveç kësaj,
simptomat mund të zhduken për një ose disa vite dhe mund të shfaqen sërish pas
ndonjë krasitje ose shartimi të rëndë (Kollar et al., 1990). Temperatura gjithashtu ka
një impakt të dukshëm në zhvillimin e simptomave të sëmundjes, temperaturat më
optimale për zhvillimin e sëmundjes janë nga 21-24ºC.
3.1.1 Plantacioni Bitinckë
Gjatë viteve 2014-2016 në plantacionin Bitinckë janë vërrejtur 9 lloje të simptomave
të shpërndara jo njëtrajtësisht në të gjithë drurët. Llojet e simptomave dhe shpërndarja
e tyre në drurë gjatë 3 viteve është paraqitur tek figurat e mëposhtme.
Gjatë vitit 2014 është vënë re që simptomat më të përhapura tek drurët e plantacionit
Bitinckë ishin unazimi apo përdredhja e gjetheve (në 8 pemë), frutat me përmasa të
vogla (në 7 pemë) dhe prania e insekteve (në 6 pemë). Ndërkohë dy prej simptomave
të përcaktuara në formularin e vlerësimit simptomatologjik mungojnë dhe nuk
shfaqen tek asnjë prej drurëve. Këto dy simptoma janë lule e çrregullt dhe gjethet e
kuqerremta në të gjithë kurorën. Simptoma e parë konsiderohet si një prej
simptomave më të rralla që mund të gjendet tek plantacionet e mollëve të infektuara
me fitoplazma (Susuri and Myrta, 2012; Kunze, 1989).
Figura 3.1 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2014.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
55
Gjatë vitit 2015, ka pasur ndryshime të vogla në lidhje me përhapjen e simptomave në
drurë të ndryshëm. Gjatë këtij viti simptomat më të përhapura kanë qënë prania e
insekteve (në 8 pemë), unazimi apo përdredhja e gjetheve (në 8 pemë) dhe gjethet
klorotike (në 7 pemë).
Figura 3.2 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2015.
Nëse krahasojmë llojet e simptomave që shfaqen më shpesh gjatë dy viteve vihet re që
dy prej simptomave janë të njëjta. Përdredhja e gjetheve dhe prania e insekteve janë
dy simptomat më të përhapura në plantacionin Bitinckë. Ndërkohë 1 nga 3 simptomat
më të përhapura nuk paraqitet e njëjtë gjatë këtyre dy viteve. Në vitin 2014 shfaqeshin
me dendur frutat me përmasa të reduktuara ndërsa në vitin 2015, gjethet klorotike.
Mungesa e simptomave lule e çrregullt dhe gjethe të kuqerremta mbetet e njëjtë edhe
në vitin 2015.
Gjatë vitit 2016 në plantacionin Bitinckë vihen re ndryshime në krahasim me vitet
paraardhëse. Simptomat më të përhapura janë unazimi i gjetheve (në 8 pemë), sytha
sqetullorë paralelë (në 8 pemë) dhe fruta me përmasa të vogla (në 8 pemë). Ajo çfarë
dallohet është rishfaqja si simptomë më e përhapur e frutave me përmasa të vogla.
Gjatë vitit 2016 një simptomë tjetër ka përhapjen më të madhe, sythat sqetullorë
paralelë në formën e fshesës. Kjo përbën simptomën më tipike të Apple proliferation.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
56
Figura 3.3 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Bitinckë gjatë vitit 2016.
Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhguara në
plantacionin Bitinckë gjatë tre viteve (2014, 2015, 2016).
Figura 3.4 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Bitinckë: a. fruta me
përmasa të vogla, përdredhje e gjetheve, b. degë paralele në formën e fshesës, c. prani e
insekteve. Fotot D.Mero.
Figura e mëposhtme paraqet ecurinë e simptomave gjatë tre viteve të studimit të tyre.
Në vite të ndryshme, numri i simptomave që shfaqin drurë të caktuar është i
ndryshëm. Kjo dallohet tek shumica e drurëve me përjashtim të drurëve 2 dhe 7, të
cilët kanë të njëjtin numër simptomash gjatë të tre viteve. Kjo është në përputhje me
karakteristikat e shfaqjes së simptomave të sëmundjeve fitoplazmatike, të cilat mund
të mos shfaqen për një periudhë të caktuar e të rishfaqen sërish mbas një apo dy vitesh
(Kunze, 1989).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
57
Figura 3.5 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Bitinckë për tre vitet (2014, 2015, 2016).
Katër janë format e mënyrës të ndryshimit të numrit të simptomave gjatë 3 viteve.
Rasti i parë është ai i drurëve 1, 3, 4, në të cilët numri i simptomave gjatë viteve 2014,
2015 është i njëjtë dhe në vitin pasardhës (2016) rritet. Rasti i dytë është ai i drurëve 5
dhe 10 në të cilët numri i simptomave në vitin 2014 ka qënë më i lartë se ai në vitin
2015 dhe ky numër rritet përsëri në vitin 2016. Rasti i tretë është ai i drurëve 6 dhe 9,
në të cilët numri i simptomave vjen duke u rritur me kalimin e viteve. Rasti i fundit
është ai i drurit 8 ku numri i simptomave në vitin 2014 ka qënë më i ulët se në vitin
2015 dhe ulet përsëri në vitin 2016.
3.1.2 Plantacioni Korçë
Studimi i plantacionit të Korçës për vitet 2014, 2015, 2016 identifikoi 10 lloje të
simptomave të shpërndara në drurët e marrë në shqyrtim. Figurat e mëposhtme
paraqesin më hollësisht llojet e simptomave për çdo dru, për tre vitet e studimit.
Nga figura 3.6 dallohet që simptomat më të përhapura në Plantacionin Korçë janë
gjethet klorotike (në 8 pemë), unazimi i gjetheve (në 7 pemë), prania e insekteve (në 6
pemë), fruta me përmasa të vogla (në 6 pemë) dhe sytha sqetullorë paralelë (në 6
pemë).
Ndryshe nga plantacioni Bitinckë ku dy simptomat (lule e çrregullt dhe gjethe të
kuqerremta) nuk shfaqeshin, në plantacionin Korçë vetëm në një nga drurët është
gjetur lule e çrregullt, ndërsa simptoma gjethe të kuqerremta vazhdon të mos shfaqet
tek asnjë nga drurët e analizuar.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
58
Figura 3.6 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët
e plantacionit Korçë gjatë vitit 2014.
Në vitin 2015 simptomat më të përhapura janë përsëri gjethe klorotike (në 8 pemë),
unazim i gjetheve (në 7 pemë), frut me përmasa të vogla (në 7 pemë) dhe prani e
insekteve (në 7 pemë). Ndërkohë simptoma sytha sqetullorë paralelë ka përsëri
shkallë të lartë përhapje, të njëjtë me atë të vitit 2014.
Figura 3.7 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Korçë gjatë vitit 2015.
Në plantacionin Korçë gjatë vitit 2016, tre janë llojet e simptomave më të përhapura
madje me të njëjtën denduri. Këto simptoma janë të njëjta me ato të viteve të kaluara
dhe përfshijnë gjethet klorotike (në 7 pemë), unazimin e gjetheve (në 7 pemë) dhe
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
59
praninë e insekteve (në 7 pemë). Ajo çka shihet nga figura 3.8 krahasuar me figurat që
paraqesin llojet e simptomave të viteve paraardhëse (fig 3.6 dhe fig 3.7) është fakti se
disa simptoma shfaqen me të njëjtin intensitet gjatë të tre viteve. Këtu mund të
përmendim zverdhjen e gjetheve, zvogëlimin e gjetheve dhe lulen e çrregullt.
Figura 3.8 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Korçë gjatë vitit 2016.
Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhguara
gjatë 3 viteve në plantacionin Korçë.
Figura 3.9 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Korçë. Nga e majta
në të djathtë: a. rritje e çrregullt, gjethe klorotike, b. lule e çrregullt, c. rozeta, d. përdredhje e
gjetheve. Fotot D.Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
60
Edhe në plantacionin Korçë ka disa modele të përhapjes së simptomave në të njëjtët
drurë gjatë viteve të ndryshme. Modeli i parë është ai i drurëve 1, 2, 9, 10, në të cilët
numri i simptomave paraqitet i njëjtë gjatë dy viteve dhe më pas rritet. Modeli i dytë
është ai i drurëve 6 dhe 8, në të cilët numri i simptomave gjatë vitit 2014 është më i
lartë se numri i simptomave në vitet pasardhëse. Modeli i tretë është ai i drurëve 4 dhe
5 në të cilët numri i simptomave është më i ulët në vitin 2014 dhe vazhdon duke u
rritur në dy vitet pasardhëse. Modeli i katër dhe i pestë janë modele ku bëjnë pjesë
drurët 3 dhe 7 përkatësisht. Numri i simptomave të drurit 3 është më i ulët gjatë vitit
2014, vijon duke u rritur në 2015 dhe në vitin 2016 arrin përsëri në nivelin e vitit
2014. Ndërsa druri 7 ka të njëjtin nivel të numrit të simptomave gjatë të tre viteve.
Figura e mëposhtme paraqet mënyrën e përhapjes së simptomave në drurë të
ndryshëm gjatë tre viteve.
Figura 3.10 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Korçë për tre vitet (2014, 2015, 2016).
3.1.3 Plantacioni Turan
Gjatë tre viteve të vëzhgimit të plantacionit Turan gjithësej janë identifikuar 9 lloje të
simptomave.
Gjatë vitit 2014 plantacioni Turan ka pasur numër më të madh të katër llojeve të
simptomave. Kështu përmendim: praninë e insekteve (në 8 drurë), rozeta (në 6 drurë),
sytha sqetullorë paralelë (në 6 drurë) dhe gjethe klorotike (në 6 drurë). Ajo që bie në
sy është mungesa e dy kategorive të simptomave, përkatësisht lule të çrregullta dhe
gjethe të kuqerremta. E njëjta situatë paraqitej edhe për plantacionin Bitinckë.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
61
Figura 3.11 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët
e plantacionit Turan gjatë vitit 2014.
Gjatë vitit 2015 simptomat më të përhapura kanë qënë: prania e insekteve (në 7
drurë), unazim i gjetheve (në 7 drurë), rozeta (në 6 drurë), sytha sqetullorë paralelë
(në 6 drurë) dhe gjethe klorotike (në 6 drurë).
Figura 3.12 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët
e plantacionit Turan gjatë vitit 2015.
E njëjta situatë për plantacionin Turan vazhdon edhe për vitin 2016, me të njëjtat
kategori të simptomave më të përhapura; rozeta (në 8 drurë), unazim i gjetheve (në 8
drurë), prani e insekteve (në 7 drurë), sytha sqetullorë paralelë (në 7 drurë) dhe gjethe
klorotike (në 7 drurë).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
62
Figura 3.13 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Turan gjatë vitit 2016.
Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhguara
gjatë tre viteve në plantacionin Turan.
Figura 3.14 Foto të drurëve të mollës që shfaqnin simptoma, plantacioni Turan. Nga
e majta në të djathtë: a. rritje e çrregullt, gjethe klorotike, b. prani e insekteve, c.
rozeta, d. përdredhje e gjetheve, gjethe të vogla të pazhvilluara, gjethe klorotike.
Fotot D.Mero.
Figura e mëposhtme paraqet ecurinë e simptomave gjatë 3 viteve për plantacionin
Turan. Me përjashtim të drurit 5 i cili ka të njëjtin numër simptomash gjatë të 3
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
63
viteve, gjithë drurët e tjerë kanë një model të ndryshëm shpërndarje nga viti në vit.
Modeli i parë i përhapjes është ai i drurëve 1, 3, 4, 9, 10, të cilët kanë pasur një numër
të lartë të simptomave gjatë vitit 2014, më pas numri i simptomave është ulur dhe ka
vazhduar me ngritje në vitin 2016. Modeli i dytë është ai i drurëve 2, 6, 8 të cilët gjatë
viteve 2014-2015 kanë numër të njëjtë të simptomave dhe ky numër rritet gjatë vitit
2016. Modeli i tretë është ai i drurit 7 i cili ka numër më të vogël të simptomave vitin
e parë dhe ky numër rritet gjatë dy viteve pasardhëse. Edhe ky rast është në
mbështetje të mënyrës të shfaqjes të simptomave gjatë viteve.
Figura 3.15 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Turan për tre vitet (2014, 2015, 2016).
Figurat e mëposhtme tregojnë krahasimin e simptomatologjisë të tre plantacioneve të
mollëve në secilin prej viteve të vëzhgimit.
Figura 3.16 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë, Korçë,
Turan, gjatë vitit 2014.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
64
Ajo që vihet re nga figura 3.16 është se të tre plantacionet gjatë vitit 2014 kanë patur
pak a shumë të njëjtin numër simptomash. Kështu 3 është numri minimal i
simptomave që ka plantacioni Bitinckë, numër ky që korrespondon me numrin
minimal të simptomave që kanë edhe dy plantacionet e tjera, ai i Korçës dhe i Turanit.
Ndërkohë 6 është numri maksimal i simptomave që shfaqin drurët e plantacionit
Bitinckë dhe Turan. Ndërsa plantacioni Korçë dallohet për numër më të ulët të
simptomave për pemë.
Gjatë vitit 2015 vihet re se ulet numri i simptomave minimale për pemë në
plantacionin Turan ndërsa gjendja për plantacionet e tjera mbetet e njëjtë. Në lidhje
me shfaqjen e numrit më të madh të simptomave për dru vihet re se plantacioni
Bitinckë ka numër më të lartë të simptomave për dru (7 simptoma), numër ky që është
rritur nga viti paraardhës. Për plantacionin Korçë dhe Turan gjendja mbetet e njëjtë.
Figura 3.17 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë, Korçë,
Turan, gjatë vitit 2015.
Ndryshe nga vitet e kaluara, ku plantacioni Turan dallohej për numrin më të ulët të
simptomave për pemë, gjatë vitit 2016 vihet re një rritje e numrit të këtyre
simptomave duke arritur në 7 simptoma për dru.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
65
Figura 3.18 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Bitinckë, Korçë,
Turan, gjatë vitit 2016.
3.1.4 Plantacioni Cangonj
Nga studimi i plantacionit Cangonj gjatë vitit 2014 është vënë re që vazhdon e njëjta
situatë përsa i përket dy kategorive të simptomave; lule e çrregullt dhe gjethe të
kuqerremta në të gjithë kurorën, ato mungojnë.
Simptomat më të përhapura në drurët e këtij plantacioni gjatë vitit 2014 kanë qënë:
gjethet klorotike (në 9 pemë), prania e insekteve (në 6 pemë) dhe frutat me përmasa të
vogla (në 5 pemë).
Figura 3.19 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Cangonj gjatë vitit 2014.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
66
Gjatë vitit 2015 situata në lidhje me shprehjen e simptomave paraqitet e ndryshme në
krahasim me vitin paraardhës. Vihet re se krahas simptomave (lule e çrregullt dhe
gjethe të kuqerremta në të gjithë kurorën) të cilat pothuajse mungojnë në të gjitha
plantacionet e analizuara deri tani, formimi i rozetave nuk gjendet në asnjë nga drurët
e plantacionit Cangonj, gjatë vitit 2015. Ndërkohë kategoritë e simptomave më të
përhapura vazhdojnë të mbeten po ato që shfaqeshin në vitin 2014; gjethet klorotike,
prani e insekteve dhe frutat me përmasa të vogla.
Figura 3.20 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Cangonj gjatë vitit 2015.
Në plantacionin Cangonj, gjatë vitit 2016, dy janë simptomat më të përhapura; gjethe
klorotike (në 8 pemë) dhe prani e insekteve (në 6 pemë). Situata në lidhje me
simptomat të cilat mungojnë paraqitet e njëjtë me atë të vitit 2014.
Figura 3.21 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Cangonj gjatë vitit 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
67
Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhguara në
plantacionin Cangonj gjatë viteve 2014, 2015, 2016.
Figura 3.22 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Cangonj. Nga e
majta në të djathtë: a. gjethe klorotike, b. degë paralele në formën e fshesës, c. prani e
insekteve. Fotot D.Mero.
Nga krahasimi i numrit të simptomave për secilin dru gjatë tre viteve, nëpërmjet
paraqitjes grafike shihet qartë që ky numër pëson luhatje nga viti në vit me përjashtim
të drurëve 1, 2, 4, 6 në të cilët numri i simptomave mbetet i njëjtë në vite. Kjo nuk
nënkupton që domosdoshmërisht edhe kategoritë e simptomave që këta drurë shfaqin
të jenë të njëjta përgjatë tre viteve.
Figura 3.23 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Cangonj për tre vitet (2014, 2015, 2016).
Nga figura 3.23 vihen re edhe disa modele të tjera të përhapjes të simptomave. Kështu
modeli i parë është ai i drurëve 5 dhe 9, të cilët gjatë vitit 2014 kanë pasur numër më
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
68
të vogël të simptomave në krahasim me vitet pasardhëse, të cilët nëse i krahasojmë
me njëri tjetrin kanë të njëjtin numër simptomash. Modeli i dytë është ai i drurëve 3,
8, të cilët dallohen për numër të barabartë të simptomave në vitin 2014 dhe 2015, e
gjatë vitit 2016 ky numër ulet. Ndërkohë drurët e ngelur, druri 7 dhe 10 kanë modele
të kundërta përsa i përket mënyrës të përhapjes së simptomave në vite. Kështu, druri 7
gjatë vitit 2014 ka numër më të lartë të simptomave dhe gjatë viteve pasardhëse ky
numër ulet, ndërsa druri 10 përfaqëson modelin e kundërt, që do të thotë: dy vitet e
para numri i simptomave të shfaqura është i njëjtë dhe gjatë vitit 2016 ky numër është
rritur.
3.1.5 Plantacioni Dvoran
Nga figura 3.24 është i dukshëm fakti që plantacioni Dvoran gjatë vitit 2014, dallohet
për 3 kategori të simptomave më të përhapura. Këto simptoma janë: gjethet klorotike
(në 9 pemë), ndajgjethëzat e mëdha (në 7 pemë) dhe unazim i gjetheve (në 5 pemë).
Në këtë rast simptomat që nuk janë vëzhguar në asnjë pemë janë të njëjta me ato të
shumicës së plantacioneve të tjera ndër vite por në rastin konkret vihet re edhe
mungesa e zverdhjes së gjetheve.
Figura 3.24 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Dvoran gjatë vitit 2014.
Gjatë vitit 2015 simptomat më të përhapura janë po të njëjta me ato të vitit 2014,
madje janë të përhapura me të njëjtën frekuencë. Edhe gjatë vitit 2015 nuk është
vëzhguar lule e çrregullt, gjethe të kuqeremta në të gjithë kurorën dhe zverdhje e
gjetheve.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
69
Figura 3.25 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Dvoran gjatë vitit 2015.
Gjatë vitit 2016, të gjithë drurët e plantacionit Dvoran shfaqin gjethe klorotike, që
përbën edhe një nga simptomat më të përhapura bashkë me ndajgjethëzat e mëdha (në
8 pemë), praninë e insekteve (në 5 pemë) dhe unazimin e gjetheve (në 5 pemë).
Simptomat që nuk shfaqen tek asnjë prej drurëve janë të njëjta edhe për këtë vit.
Figura 3.26 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Dvoran gjatë vitit 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
70
Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhuara gjatë
tre viteve në plantacionin Dvoran.
Figura 3.27 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Dvoran. Nga e
majta në të djathtë: a. gjethe klorotike, b. degë paralele në formën e fshesës, c. përdredhje e
gjetheve dhe fruta të pazhvilluar. Fotot D.Mero.
Nga figura e krahasimit të numrit të simptomave për secilin dru gjatë tre viteve vihet
re se vetëm druri 5 ka të njëjtin numër në vite të ndryshme. Modelet e tjera të
ndryshimit të përhapjes së simptomave janë: modeli i parë ku bëjnë pjesë druri 1, 6, 9
në të cilët numri i simptomave gjatë viteve 2014-2015 është i njëjtë dhe vazhdon të
rritet në vitin 2016. Modeli i dytë është ai i drurëve 3, 8, 10, në të cilët numri i
simptomave gjatë vitit 2014 është më i ulët se dy vitet pasardhëse. Ndërkohë drurët 2,
4, 7 kanë secili modele të veçanta në lidhje me mënyrën e ndryshimit të përhapjes së
simptomave.
Figura 3.28 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Dvoran për tre vitet (2014, 2015, 2016).
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
71
3.1.6 Plantacioni Zëmblak
Gjendja e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2014 është e ngjashme me atë të
plantacionit Dvoran në lidhje me kategoritë e simptomave që nuk shfaqen tek asnjë
pemë. Ndërsa simptomat më të përhapura janë prania e insekteve (në 7 pemë) dhe
unazimi i gjetheve (në 6 pemë).
Figura 3.29 Paraqitja e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët e
plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2014.
Gjatë vitit 2015 në lidhje me simptomat që nuk shfaqen tek asnjë dru dhe simptomat
më të përhapura gjendja është e njëjtë. Ndryshimi i vetëm është ai i frekuencës së
përhapjes së simptomës unazim i gjetheve (në 7 pemë).
Figura 3.30 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët
e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2015.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
72
Në vitin 2016, simptomave të cilat nuk shfaqeshin në vitet paraardhëse, u shtohet një
kategori tjetër që është ajo e zvogëlimit të gjetheve, simptomë kjo që nuk shfaqet tek
asnjë prej drurëve të analizuar të plantacionit Zëmblak.
Figura 3.31 Paraqitja grafike e shpërndarjes të llojeve të ndryshme të simptomave në drurët
e plantacionit Zëmblak gjatë vitit 2016.
Në figurën e mëposhtme janë paraqitur disa nga llojet e simptomave të vëzhguara në
plantacionin Zëmblak për tre vite 2014, 2015, 2016.
Figura 3.32 Foto të drurëve të kumbullës që shfaqnin simptoma, plantacioni Zëmblak. Nga e
majta në të djathtë: a. prani e insekteve, b. rozeta, rritje e çrregullt, c. zverdhje dhe përdredhje
e gjetheve. Fotot D.Mero.
Figura e mëposhtme (fig 3.33) dëshmon për modelet e ndryshme të përhapjes së
simptomave gjatë 3 viteve në drurët e plantacionit Zëmblak. Kështu me përjashtim të
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
73
drurëve 3, 6, të cilët kanë të njëjtin numër simptomash në vite (por jo
domosdoshmërisht të njëjtat kategori të simptomave), drurët e tjerë kanë shpërhapje
sipas modeleve të ndryshme. Modeli i parë është ai i drurëve 8 dhe 9, tek të cilët
numri i simptomave gjatë dy viteve të para të studimit ka qënë i njëjtë dhe gjatë vitit
2016, është rritur. Modeli i dytë është ai i drurëve 5 dhe 10, tek të cilët numri i
simptomave nga viti në vit është në rritje. Ndërkohë katër drurët e tjerë, përkatësisht
druri 1, 2, 4 dhe 7 kanë modele të veçanta të mënyrës së ndryshimit të simptomave në
vite.
Figura 3.33 Paraqitja grafike e ecurisë së numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Zëmblak për tre vitet (2014, 2015, 2016).
Nga figura e paraqitjes grafike të nivelit të simptomave për secilin prej drurëve të
plantacioneve Cangonj, Dvoran, Zëmblak për vitin 2014, ajo që bie në sy është se
plantacioni Cangonj shfaq numrin më të ulët të simptomave (1-4). Plantacionet e tjera
kanë shtrirje më të harmonizuar të simptomave, plantacioni Dvoran ka numrin
minimal të simptomave 2 për çdo dru ndërsa numrin maksimal 5. Plantacioni
Zëmblak ka numrin minimal të simptomave për dru 2 dhe numrin maksimal 4.
Figura 3.34 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj, Dvoran,
Zëmblak gjatë vitit 2014.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
74
Figura e mëposhtme paraqet qartësisht luhatjet e numrit të simptomave nga druri në
dru brenda të njëjtit plantacion për vitin 2015. Plantacioni Cangonj ka numrin
minimal të simptomave për dru 1 dhe numrin maksimal 5. Plantacioni Dvoran ka
numrin minimal të simptomave 1 për secilin dru dhe numrin maksimal 4. Ndërsa
plantacioni Zëmblak numrin minimal të simptomave për dru e ka 1 dhe numrin
maksimal 4.
Figura 3.35 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj, Dvoran,
Zëmblak gjatë vitit 2015.
Gjatë vitit 2016 nga krahasimi i figurave 3.35 dhe 3.36 vihet re që për disa drurë të
plantacioneve të ndryshme, numri i simptomave për dru ka ndryshuar. Kështu
plantacioni Cangonj ka numrin minimal dhe numrin maksimal të simptomave për dru
përkatësisht 1 dhe 5, plantacioni Dvoran 2 dhe 5 dhe plantacioni Zëmblak 3 dhe 4.
Figura 3.36 Krahasimi i numrit të simptomave të drurëve të plantacioneve Cangonj, Dvoran,
Zëmblak gjatë vitit 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
75
Bimët e infektuara me fitoplazma shfaqin simptoma të ndryshme. Problemet e lidhura
me faktorët që kontrollojnë ekuilibrin normal të rritjes çojnë në zverdhje, zhvillimin e
strukturave të ngjashme me gjethet në vend të luleve, sterilitet të luleve dhe
proliferimin e sytheve anësore duke formuar pamje të ngjashme me ato të fshesës,
zgjatjes anormale dhe astenisë (Bertaccini, 2007). Të tjera simptoma të hasura
zakonisht janë zhvillimi i reduktuar i pjesëve të caktuara ose gjithë bimës; deformime
ose keqformime të gjetheve ose luleve; vonesat në çeljen e sytheve ose në lulëzim;
zverdhja dhe skuqja e gjetheve jashtë sezonit. Është fakt se të gjitha këto simptoma
shpesh shkaktohen edhe nga viruset, ndaj diagnoza e tyre pavarësisht eksperiencës
fushore, kërkon analiza laboratorike (Susuri and Myrta, 2012).
Nisur nga sa më sipër, në këtë studim një nga tre metodat e përdorura për evidentimin
e pranisë së infeksioneve fitoplazmatike ishte simptomatologjia. Rezultatet tregojnë se
thuajse të gjithë drurët, në të gjashtë plantacionet, kanë një model të ndryshëm
shpërndarje të simptomave nga viti në vit. Simptoma të caktuara u shfaqën për një
periudhë kohe, u zhdukën për një ose dy vite dhe u rishfaqën sërish. Gjatë viteve
2014-2016 në plantacionin e Bitinckës u vërrejtën 9 lloje të simptomave, në
plantacionin e Korçës 10 lloje të simptomave, dhe në plantacionin e Turanit 9 lloje të
simptomave. Për plantacionet me kumbulla numri i simptomave të vëzhguara ka qënë
përkatësisht 9 lloje të simptomave për plantacionin Cangonj, 8 lloje për plantacionin
Dvoran dhe 8 lloje për plantacionin Zëmblak. Një prej simptomave të përcaktuara në
formularin e vlerësimit të simptomave (gjethe të kuqerremta në të gjithë kurorën)
mungoi dhe nuk u shfaq tek asnjë prej drurëve gjatë tre viteve të marrjes së mostrave.
Bazuar në të dhënat tona, pothuajse të gjithë drurët, në të gjashtë plantacionet, kanë
një model të ndryshëm shpërndarje të simptomave nga viti në vit. Ky fakt përbën një
disavantazh të simptomatologjisë.
Përcaktimi i simptomave është tepër i lodhshëm, kërkon kohë dhe shpesh rezultatet
janë kontradiktore. Pavarësisht vlerësimit tre vjeçar të plantacioneve duke u bazuar
tek simptomatologjia, nuk mund të përcaktojmë gjendjen reale të plantacioneve për
arsye se simptoma të njëjta apo të ngjashme me ato të shkaktuara nga fitoplazmat,
mund të jenë pasojë e karencës nutricionale, apo infeksioneve të tjera kërpudhore,
bakteriale dhe virale.
3.2 Rezultatet e teknikës së ngjyrimit DAPI
3.2.1 Plantacioni Bitinckë
Për ndërtimin e grafikëve të cilët paraqesin rezultatet e teknikës së ngjyrimit DAPI,
janë përdorur matrica me vlerat 0 dhe 1, përkatësisht për mungesën dhe praninë e
infeksionit. Nga figura 3.37 shihet se teknika e ngjyrimit DAPI në vitin 2016 ka
identifikuar 10 nga 10 drurët si pozitivë për infeksionet fitoplazmatike ndërkohë për
vitin 2015 vetëm 7 nga 10 drurët. Kjo mund të shpjegohet me modelin jo të rregullt të
përhapjes së fitoplazmave në kurorë. Kështu mund të ndodhë që asnjë nga mostrat e
grumbulluara nga 5 vënde të ndryshme të kurorës mos ketë qënë e infektuar
pavarësisht se infeksioni mund të ketë ekzistuar në bimë. Mundësia e dytë është që
përqëndrimi i fitoplazmave në inde të ketë qënë i vogël dhe intensiteti i fluoreshencës
ka qënë tepër i ulët. Ky rezultat mund të shpjegohet edhe me hipotezën që gjatë vitit
2015, infeksioni mund të mos ketë qënë i pranishëm në këto drurë dhe është përhapur
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
76
gjatë vitit 2016 nëpërmjet insekteve vektorë duke qënë se numri i tyre ka qënë i lartë
në plantacionin Bitinckë.
Figura 3.37 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë për
vitet 2015, 2016.
Në figurën e mëposhtme (Fig 3.38 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamjet e prerjeve
tërthore të disa prej drurëve të plantacionit Bitinckë që janë identifikuar si pozitivë
ndaj infeksionit fitoplazmatik. Me shigjeta janë treguar grupime të fitoplazmave të
cilat shfaqin fluoreshencë të lartë.
Figura 3.38 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me DAPI,
parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D. Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
77
Në figurën e mëposhtme paraqitet pamja e prerjes tërthore të një mostre negative për
praninë e fitoplazmave.
Figura 3.39 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 5 e ngjyrosur me DAPI, parë
me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero.
Krahasimi i figurave të mëposhtme (fig 3.40 dhe fig 3.41) me njëra tjetrën na
ndihmon të kuptojmë nëse ekziston një lidhje midis dy metodave të përdorura për
zbulimin e fitoplazmave. Vihet re që ka një lidhje midis numrit të simptomave dhe
teknikës DAPI, kjo për arsye se teknika DAPI ka rezultuar negative në zbulimin e
infeksionit fitoplazmatik, përkatësisht tek drurët që kanë pasur numrin më të vogël të
simptomave (druri 1, 4, 5). Kjo mund të jetë një e dhënë që tre llojet e simptomave që
janë vëzhguara tek këta drurë nuk janë specifike të fitoplazmave por mund të
shkaktohen edhe nga infeksione të tjera bakteriale, virale apo karenca nutricionale.
Gjithashtu ky rezultat mund të shpjegohet me përqëndrimin e vogël të fitoplazmave
në indet e gjetheve dhe në këtë mënyrë nuk është shfaqur fluoreshencë.
Figura 3.40 Paraqitja grafike e rezultateve
të teknikës DAPI për plantacionin Bitinckë
për vitin 2015.
Figura 3.41 Paraqitja grafike e numrit të
simptomave për drurët e plantacionit
Bitinckë, viti 2015.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
78
Nga krahasimi i figurës 3.42 me figurën 3.43 evidentohet që fitoplazmat e gjithë
drurëve kanë shfaqur fluoreshencë me teknikën DAPI ndërkohë që numri i
simptomave për secilin dru është mesatar (nga 4 deri në 6).
3.2.2 Plantacioni Korçë
Nga figura 3.44 shihet se metoda e ngjyrimit DAPI ka rezultuar pozitive për të gjithë
drurët e plantacionit Korçë gjatë dy viteve.
Figura 3.44 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Korçë për vitet
2015, 2016.
Në figurën e mëposhtme (fig 3.45 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamje të prerjeve
tërthore të bishtave të gjetheve të mollëve të cilat kanë rezultuar pozitive ndaj
infeksionit fitoplazmatik. Me shigjetë tregohen grupimet e fitoplazmave.
Figura 3.42 Paraqitja grafike e rezultateve
të teknikës DAPI për plantacionin
Bitinckë për vitin 2016.
Figura 3.43 Paraqitja grafike e numrit të
simptomave për drurët e plantacionit
Bitinckë, viti 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
79
Figura 3.45 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me DAPI, parë në
mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D. Mero.
Nga krahasimi i figurës 3.46 me figurën 3.47 vihet re që të gjitha mostrat kanë
rezultuar pozitive me teknikën DAPI dhe në lidhje me simptomatologjinë minimumi i
simptomave që shfaq secili dru është 3, ndërsa numri maksimal i simptomave për dru
është 6.
Nga krahasimi i figurës 3.48 me figurën 3.49 vihet re që metoda DAPI ka rezultuar
pozitive tek të gjithë drurët e plantacionit Korçë gjatë vitit 2016, ndërsa përsa i përket
Figura 3.46 Paraqitja grafike e rezultateve
të teknikës DAPI për plantacionin Korçë
për vitin 2015.
Figura 3.47 Paraqitja grafike e numrit
të simptomave për drurët e plantacionit
Korçë, viti 2015.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
80
simptomave vihet re një nivel mesatar i tyre për çdo dru. Numri minimal i
simptomave për dru është 3 dhe ai maksimal 4.
Nga vlerësimi i gjëndjes së plantacionit Korçë nëpërmjet mikroskopisë fluoreshente
me ngjyrimin DAPI rezulton se në të dy vitet e studimit, situata paraqitet e njëjtë, të
gjitha mostrat e gjetheve kanë rezultuar të infektuara.
3.2.3 Plantacioni Turan
Figura e mëposhtme (fig 3.50) paraqet efektivitetin e teknikës së ngjyrimit DAPI në
zbulimin e mostrave të infektuara me fitoplazma në plantacionin Turan për dy vitet
2015, 2016. Në vitin 2015, 8 nga 10 drurët kanë rezultuar të infektuar ndërsa në vitin
2016, kanë rezultuar të infektuar të gjithë drurët. Ky rezultat mund të shpjegohet me
përhapjen jo sistemike të infeksionit, që do të thotë se mostrat që janë analizuar nuk
kanë qenë të infektuara pavarësisht se infeksioni mund të ketë ekzistuar në bimë.
Gjithashtu ky rezultat mund të shpjegohet me hipotezën se gjatë vitit 2015 këta drurë
nuk kanë qënë të infektuar dhe infeksioni është transmetuar gjatë vitit 2016 nga pemë
të tjera fqinje, nëpërmjet insekteve vektorë. Mundësia e tretë është që teknika e
ngjyrimit DAPI mund të mos ketë arritur të zbulojë infeksionin në mostrat me origjinë
nga drurët 9, 10 edhe për arsye të përqëndrimit të ulët të fitoplazmave në indet e
floemës.
Figura 3.48 Paraqitja grafike e
rezultateve të teknikës DAPI për
plantacionin Korçë për vitin 2016.
Figura 3.49 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Korçë, viti 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
81
Figura 3.50 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Turan për
vitet 2015, 2016.
Në figurën e mëposhtme (fig 3.51 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamje të prerjeve
tërthore të bishtave të gjetheve të mollës të cilat kanë rezultuar pozitive. Intensiteti i
fluoreshencës ndryshon nga një mostër tek tjetra në varësi të përqëndrimit të
fitoplazmave në këto inde.
Figura 3.51 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të mollëve ngjyrosur me DAPI,
parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D. Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
82
Në figurën e mëposhtme (fig. 3.52) është paraqitur pamja e prerjes tërthore të bishtit
të gjethes së drurit 9 në Plantacionin Turan, e cila ka rezultuar negative për praninë e
fitoplazmave.
Figura 3.52 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 9 e ngjyrosur me DAPI,
parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero.
Nga krahasimi i figurës 3.53 me figurën 3.54 vihet re një lidhje ndërmjet
simptomatologjisë dhe metodës DAPI. Kështu drurët 9 dhe 10 që kanë rezultuar
negativë për praninë e infeksionit fitoplazmatik, shfaqin një numër më të vogël të
simptomave krahasuar me drurët e tjerë. Duke qënë se me metodën DAPI drurët 9 dhe
10 kanë rezultuar negativë, mendohet se simptomat që ata shfaqnin mund të jenë
pasojë e infeksioneve të tjera bakteriale, virale apo karencës nutricionale.
Figura 3.53 Paraqitja grafike e rezultateve
të teknikës DAPI për plantacionin Turan
për vitin 2015.
Figura 3.54 Paraqitja grafike e numrit
të simptomave për drurët e plantacionit
Turan, viti 2015.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
83
Nga krahasimi i figurës 3.55 me figurën 3.56 vihet re që të gjitha mostrat kanë
rezultuar pozitive me teknikën DAPI, ndërsa përsa i përket simptomave, drurët
shfaqnin një nivel simptomash relativisht të lartë, nga 4 deri në 7 simptoma për pemë.
3.2.4 Plantacioni Cangonj
Figura e mëposhtme (fig 3.57) paraqet efektivitetin e teknikës DAPI në zbulimin e infeksionit fitoplazmatik në drurët e kumbullave të plantacionit Cangonj. Vihet re që
situata paraqitet e njëjtë për të dy vitet. Vetëm 1 nga 10 drurët ka rezultuar jo i
infektuar si për vitin 2015, ashtu edhe për atë 2016. Duke qënë se është i njëjti dru i
cili rezulton jo i infektuar në të dy vitet mund të themi që mungesa e infeksionit
fitoplazmatik në të konfirmohet.
Figura 3.57 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Cangonj
për vitet 2015, 2016.
Figura 3.55 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për
plantacionin Turan për vitin 2016.
Figura 3.56 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Turan, viti 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
84
Në figurën e mëposhtme (fig 3.58 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamje të prerjeve
tërthore të bishtave të gjetheve me origjinë nga drurë të ndryshëm të kumbullave. Me
shigjeta tregohet prania e fitoplazmave në formën e pikave të cilat fluoreshojnë.
Figura 3.58 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur me
DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D.
Mero.
Në figurën 3.59 është paraqitur pamja e prerjes tërthore të bishtit të gjethes të drurit 6
në plantacionin Cangonj. Të gjitha mostrat e kategorisë gjethe me origjinë nga drurit 6
kanë rezultuar negative për praninë e fitoplazmave.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
85
Figura 3.59 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 6 e ngjyrosur me DAPI,
parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero.
Nga krahasimi i figurës 3.60 me figurën 3.61 vihet re një lidhje midis metodës të
ngjyrimit DAPI dhe simptomatologjisë. Kështu në vitin 2015 vetëm një nga drurët ka
rezultuar jo i infektuar me fitoplazma. Nëse vëzhgojmë me kujdes numrin e
simptomave që manifeston druri që ka rezultuar i painfektuar nëpërmjet metodës
DAPI, vemë re që ka numrin më të vogël të simptomave në krahasim me gjithë drurët
e tjerë të plantacionit Cangonj. Përderisa me metodën e mikroskopisë fluoreshente
druri 6 rezultoi i painfektuar atëherë mendohet se dy simptomat që ai ka shfaqur gjatë
vitit 2015, mund të jenë si pasojë e sëmundjeve të tjera të bimëve.
Figura 3.60 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për
plantacionin Cangonj për vitin 2015.
Figura 3.61 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Cangonj, viti 2015.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
86
I njëjti konkluzion del edhe nga krahasimi i figurave që paraqesin të dhënat e dy
metodave të përdorura për dedektim për vitin 2016. Druri 6 ka numrin më të vogël të
simptomave në krahasim me drurët e tjerë dhe këto simptoma mund të mos
shkaktohen nga prania e fitoplazmave. Mungesa e infeksionit fitoplazmatik tek druri 6
rezulton nga teknika e ngjyrimit DAPI për dy vite njëri mbas tjetrit.
3.2.5 Plantacioni Dvoran
Figura e mëposhtme (fig 3.64) paraqet rezultatet e teknikës së ngjyrimit DAPI për
drurët e plantacionit Dvoran për vitet 2015, 2016. Nga figura vihet re se në vitin 2015, vetëm dy nga 10 drurët (druri 4 dhe 5) kanë rezultuar negativë për praninë e
infeksioneve të shkaktuara nga fitoplazmat. Ndërsa në vitin 2016, vetëm një prej
drurëve rezulton i pa infektuar, përkatësisht druri 5. Për drurin 5 situata mbetet e
njëjtë për të dy vitet ndërsa për drurin 4 ndryshon. Ky ndryshim mund të jetë pasojë e
grumbullimit të mostrave jo të infektuara, ndërkohë që bima ka qënë e infektuar, duke
na çuar në një rezultat fals negativ. Mund të jetë tregues i mungesës së infeksionit në
vitin 2015 dhe shfaqjes së tij në vitin pasardhës si pasojë e përhapjes nëpërmjet
insekteve vektorë nga drurët e tjerë. Hipoteza e tretë që sqaron rezultatet e metodës së
ngjyrimit DAPI për drurin 4 është ajo që shpjegon rezultatin negativ si pasojë e
përqëndrimit të ulët të fitoplazmave në qelizat e floemës.
Figura 3.62 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për
plantacionin Cangonj për vitin 2016
Figura 3.63 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Cangonj, viti 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
87
Figura 3.64 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran
për vitet 2015, 2016.
Në figurën e mëposhtme (fig 3.65 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamje të prerjeve
tërthore të bishtave të gjetheve të drurëve të kumbullave në plantacionin Dvoran, të
cilat kanë rezultuar pozitive për praninë e fitoplazmave. Prania e fitoplazmave
tregohet nëpërmjet shigjetave.
Figura 3.65 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur me
DAPI, parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D.
Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
88
Në figurën e mëposhtme paraqitet pamja e prerjes tërthore të bishtit të gjethes të drurit
5 të kumbullave të plantacionit Dvoran. Mostrat e gjetheve të marra nga ky dru kanë
rezultuar negative për praninë e fitoplazmave.
Figura 3.66 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 5 e ngjyrosur me DAPI,
parë me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero.
Nga krahasimi i rezultateve të metodës të ngjyrimit DAPI dhe simptomatologjisë
(figura 3.67 dhe 3.68) për plantacionin Dvoran vihet re që ekziston një lidhje ndërmjet
tyre. Kështu drurët 4 dhe 5, të cilët kanë numrin më të vogël të simptomave kanë
rezultuar negativë për praninë e fitoplazmave me teknikën e ngjyrimit DAPI.
Rrjedhimisht këto simptoma të cilat shfaqen tek druri 4 dhe 5, ose janë pasojë e
sëmundjeve të tjera të bimëve, ose drurët 4 dhe 5 kanë qënë të infektuar por
përqëndrimi i fitoplazmave tek qelizat e floemës ka qënë tepër i vogël për të shfaqur
fluoreshencë.
Figura 3.67 Paraqitja grafike e rezultateve
të teknikës DAPI për plantacionin Dvoran
për vitin 2015.
Figura 3.68 Paraqitja grafike e numrit
të simptomave për drurët e plantacionit
Dvoran, viti 2015.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
89
Situata e mësipërme sqarohet nga krahasimi i figurës 3.69 dhe figurës 3.70. Vihet re
që në plantacionin Dvoran në vitin 2016, vetëm një nga drurët ka rezultuar negativ me
metodën e ngjyrimit DAPI, druri 5 i cili ka edhe numrin më të vogël të simptomave.
Pra mungesa e infeksionit të shkaktuar nga prania e fitoplazmave konfirmohet për dy
vitet njëri mbas tjetrit. Nuk mund të themi të njëjtën gjë për drurin 4, i cili në vitin
2015 është identifikuar si negativ ndërsa në vitin 2016 pozitiv për praninë e
fitoplazmave. Nëse krahasojmë dy figurat (fig 3.68 dhe fig 3.70) që paraqesin numrin
e simptomave për drurët e plantacionit Dvoran në dy vite ajo që vihet re është se gjatë
vitit 2016 druri 4 shfaq numër më të madh simptomash në krahasim me vitin 2015.
Ky rezultat përputhet edhe me rezultatin e teknikës së ngjyrimit DAPI dhe na shpie në
përfundimin që tek druri 4, në vitin 2015, infeksioni mund të ketë ekzistuar por
përqëndrimi i fitoplazmave ka qënë i vogël ose 5 pikat e kurrorës nga ku është marrë
materiali bimor nuk kanë pasur infeksion (edhe pse ai mund të ketë qënë i panishëm
në bimë) për shkak të natyrës josistemike të përhapjes së infeksionit.
3.2.6 Plantacioni Zëmblak
Figura 3.71 paraqet rezultatet e teknikës DAPI për drurët e plantacionit Zëmblak në
dy vitet; 2015, 2016. Në vitin 2015 vetëm një nga drurët paraqitet negativ për praninë
e fitoplazmave, ndërkohë gjatë vitit 2016 të gjithë drurët kanë rezultuar të infektuar.
Figura 3.69 Paraqitja grafike e
rezultateve të teknikës DAPI për
plantacionin Dvoran për vitin 2016.
Figura 3.70 Paraqitja grafike e numrit
të simptomave për drurët e plantacionit
Dvoran, viti 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
90
Figura 3.71 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Zëmblak
për vitet 2015, 2016.
Në figurën e mëposhtme (fig. 3.72 a, b, c, d, e, f) janë paraqitur pamje të prerjeve
tërthore të bishtave të gjetheve të drurëve të ndryshëm të kumbullave në plantacionin
Zëmblak. Mostrat e mëposhtme kanë rezultuar pozitive për praninë e fitoplazmave,
grupimet e të cilave janë treguar nëpërmjet shigjetave.
Figura 3.72 Foto të prerjeve tërthore të bishtit të gjetheve të kumbullave ngjyrosur me DAPI,
parë në mikroskop me zmadhimin 100x. Të gjitha mostrat në foto pozitive. Fotot D. Mero.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
91
Në figurën e mëposhtme (fig. 3.73) është paraqitur pamja e prerjes tërthore të bishtit
të gjethes të drurit 1 në plantacionin Zëmblak, e cila ka rezultuar negative për praninë
e fitoplazmave.
Figura 3.73 Foto e prerjes tërthore e bishtit të gjethes së drurit 1 e ngjyrosur me DAPI, parë
me mikroskop me zmadhimin 100x. Mostër negative. Foto D. Mero.
Për të kuptuar situatën analizojmë figurat e mëposhtme të cilat paraqesin gjëndjen e
plantacionit Zëmblak sipas dy metodave të vlerësimit, ngyrimit DAPI dhe
simptomatologjisë.
Figura 3.75 Paraqitja grafike e numrit të simptomave për drurët e plantacionit
Zëmblak, viti 2015.
Figura 3.74 Paraqitja grafike e rezultateve të teknikës DAPI për plantacionin Zëmblak
për vitin 2015.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
92
Duket qartësisht që midis figurës 3.74 dhe asaj 3.75 ekziston një lidhje. Kështu druri 1
i identifikuar si negativ për praninë e infeksionit në vitin 2015, paraqet numrin më të
ulët të simptomave (vetëm 1). Edhe në këtë rast (duke marrë parasysh edhe figurat e
mëposhtme) ka dy interpretime; infeksioni mund të ketë qënë i pranishëm por
përqëndrimi i fitoplazmave ka qënë vogël ose mostrat e analizuara nuk kanë qënë të
infektuara pavarësisht se infeksioni mund të ketë ekzistuar në bimë. Kjo e fundit vjen
si pasojë e përhapjes së çrregullt të infeksionit të shkaktuar nga fitoplazmat.
Gjatë vitit 2016 me metodën e ngjyrimit DAPI të gjithë drurët kanë rezultuar të
infektuar. Nëse vemë re edhe figurën që paraqet grafikisht numrin e simptomave, ajo
që bie në sy është se druri 1 gjatë këtij viti manifeston numër më të madh të
simptomave në krahasim me vitin paraardhës. Kjo mbështet edhe njëherë
interpretimet e mësipërme.
Ndërkohë që simptomatologjia ofron informacion mbi praninë e sëmundjeve në faza
të avancuara, ngjyrimi DAPI mund të ndihmojë në identifikimin e tyre në stade më të
hershme. Sidoqoftë, për të qënë një metodë e suksesshme, ka nevojë për një
përqëndrim të caktuar të fitoplazmave në indet e analizuara. Rezultoi se përqëndrimi
më i përshtatshëm për dedektimin me ngjyruesin DAPI ishte ai i gjetheve. Metoda e
ngjyrimit DAPI rezultoi jo e suksesshme në rrënjë. Rezultatet provuan se suksesi i
ngjyrimit DAPI për dedektimin e fitoplazmave tek molla dhe kumbulla varet nga
sezoni i marrjes së mostrave dhe pozicioni i marrjes në çdo pemë, çka shton bindjen
tonë se pavarësisht ndjeshmërisë kjo metodë ka disavantazhe që mund të kalohen
vetëm falë përdorimit të metodave të njëkohshme të dedektimit, të kategorisë
molekulare.
Figura 3.76 Paraqitja grafike e
rezultateve të teknikës DAPI për
plantacionin Zëmblak për vitin 2016.
Figura 3.77 Paraqitja grafike e numrit
të simptomave për drurët e plantacionit
Zëmblak, viti 2016.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
93
3.3 Rezultatet e vlerësimit me anë të PCR-së
3.3.1 Amplifikimi i ADN-së ribozomale specifike të fitoplazmave
Çifti i parë i primerave të përdorur është fU5/rU3, i cili duke u bazuar tek Ahrens dhe
Seemuller 1993; Duduk et al., 2013 është dizenjuar për dedektimin universal të
fitoplazmave. Ashtu sikurse shihet në figurën 3.78 fragmenti i pritur u amplifikua tek
të gjitha mostrat e mollëve, të cilat paraqiten nga e majta në të djathtë: 1-4 Korça
kërcell; 5-Korça rrënjë; 6-8 Korça trung; 9-12 Korça gjethe; 13-15-Turan kërcell.
K 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
850bp
Figura 3.78 Amplifikimi i ADN-së ribozomale specifike të fitoplazmave duke përdorur çiftin e primerave fU5/rU3.
Në figurën e mëposhtme (fig 3.79) janë paraqitur rezultatet e shumëfishimit për
mostrat 16-28, respektivisht 16-19 Korça gjethe (mollë); 20-21 Bitinckë kërcell
(mollë); 22-23 Bitinckë gjethe (mollë); 24 Dvoran trung (kumbull); 25-Dvoran gjethe
(kumbull); 26-28 Cangonj gjethe (kumbull).
K 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16
850bp
Figura 3.79 Amplifikimi i ADN-së specifike ribozomale të fitoplazmave nga mostrat e
mollës duke përdorur çiftin e primerave fU5/rU3. Fragmenti i pritshëm është 850bp.
Duke u mbështetur në figurat 3.78 dhe 3.79, 20 nga 28 mostrat janë të infektuara,
prej të cilave 2 nga 5 mostra të kumbullave.
Në figurën 3.80 tregohen rezultatet e shumëfishimit të rajonit specifik ribozomal duke
përdorur çiftin e primerave fO1/rO1, të dizenjuar për zbulimin e gjithë fitoplazmave
të European fruit tree sipas Lorenz et al., 1995; Duduk et al., 2013. Mostrat janë
emërtuar njësoj si në figurën 3.78.
Ashtu si duket në figurën e mëposhtme (fig 3.80), të gjitha mostrat janë të infektuara
dhe mostrat 4/11 kanë një bandë të dyfishtë të amplifikuar, gjë e cila mund të jetë
tregues i infeksionit nga dy shtame të fitoplazmave njëkohësisht.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
94
M 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Figura 3.80 Zbulimi i fitoplazmave bazuar në çiftin e primerave fO1/rO1; Fragmenti
i pritshëm 1050bp.
Nga figura 3.81 shikojmë se të gjitha mostrat janë të infektuara dhe mostrat 20/22/27
kanë një bandë të dyfishtë të amplifikuar, gjë e cila mund të jetë tregues i infeksionit
nga dy shtame të fitoplazmave njëkohësisht.
28 27 26 25 24 M 23 22 21 20 19 18 17 16 M
Figura 3.81 Zbulimi i fitoplazmave bazuar në çiftin e primerave fO1/rO1; mostrat
16-18; Fragmenti i pritshëm 1050bp.
Në figurat 3.82 dhe 3.83 janë paraqitur rezultatet e amplifikimit të rajonit ribozomal
nëpërmjet çiftit të primerave fCPD/rCPD, të dizenjuar nga Lorenz et al., (1995) për
zbulimin e fitoplazmave të pear decline (PD).
M 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M
Figura 3.82 Çifti i primerave fCPD/rCPD amplifikoi mostrat 1-15 nga e djathta në të
majtë duke dhënë fragmentin e pritshëm 1850bp. Mostrat 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14 janë të
infektuara.
Nga rezultatet duket se jo të gjitha mostrat kanë dhënë rezultat pozitiv; vetëm 7 nga
15 mostrat e gjetheve dhanë fragmentin specifik. Ky rezultat është në përputhje me
autorë të tjerë, të cilët kanë raportuar se në disa raste nuk është marrë produkt nga
pemët e mollëve.
M K 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 M
Figura 3.83 Çifti i primerave fCPD/rCPD amplifikoi mostrat 1-15 nga e djathta në të
majtë duke dhënë fragmentin e pritshëm 1850bp. Mostrat 23/27 janë të infektuara.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
95
Nga figura 3.83 duket se vetëm dy nga 13 mostrat rezultuan të infektuara me
fitoplazma. Përkatësisht mostrat 23 dhe 27.
Çifti i katër i primerave të përdorura në këtë studim ishte çifti jo ribozomal
fCAP/rCAP. Rezultatet e amplifikimit të treguara në figurën 3.84 qartësojnë se ka
amplifikim specifik vetëm tek mostrat 19 dhe 23, mostrat e tjera nuk kanë dhënë
produkt edhe pse fragmenti gjenomik nga i cili primerat janë dizenjuar mund të
hibridizohet me ADN-në e fitoplazmave të PD dhe ESFY (Lorenz et al., 1995).
M 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 M
Figura 3.84 Çifti i primerave jo ribozomalë fCAP/rCAP amplifikoi fragmentin e
pritshëm vetëm në dy raste 19/23. Produktet e tjera ishin me dimensione jo specifike ~
200bp.
Duke konsideruar faktin se të gjitha mostrat janë të infektuara (rezultate nga
përdorimi i primerave fO1/rO1) dalim në konkluzionin se çifti i primerave
fCAP/rCAP zbuloi infeksionin vetëm në dy nga mostrat e analizuara që i përkisnin
mollëve.
15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Figura 3.85 Çifti i primerave jo ribozomalë fCAP/rCAP nuk amplifikoi fragmentin e
pritshëm në asnjë prej mostrave. Produktet e tjera ishin me dimensione jo specifike ~ 200bp.
Rezultatet e amplifikimit specifik të fragmenteve të gjeneve të fitoplazmave treguan
se fU5/rU5 dhe fO1/rO1 rezultuan të suksesshme në mollë dhe kumbulla, fCPD/rCPD
vetëm në një pjesë të mostrave, ndërsa çifti fCAP/rCAP rezultoi i pasuksesshëm
krahasuar me të tjerët.
Rezultatet e mara nga gel elektroforeza janë përdorur për të ndërtuar paraqitjen
grafike që tregohet në figurën 3.86. Nga figura duket qartësisht se një nga çiftet e
primerave përkatësisht fO1/rO1 ka rezultuar i suksesshëm në 100% të mostrave, pra
ka arritur të zbulojë praninë e fitoplazmave në të gjitha mostrat. Çifti i dytë fU5/rU5
identifikoi praninë e fitoplazmave në 71% të mostrave. Çifti i tretë i primerave fCAP/
rCAP ka identifikuar praninë e fitoplazmave në 9 prej mostrave ose 32% të tyre. Çifti
i katër i primerave fCPD/rCPD ka rezultuar efiçient vetëm në 2 prej mostrave ose 7%
të tyre.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
96
Figura 3.86 Paraqitja grafike e rezultateve të katër çifteve të primerave në dedektimin
e fitoplazmave.
Nga figura 3.87 duket qartë se si simptomatologjia ashtu edhe teknika e ngjyrimit
DAPI kanë arritur të dedektojnë infeksionin fitoplazmatik në të gjitha mostrat.
Figura 3.87 Paraqitja grafike e rezultateve të dy metodave për dedektimin e fitoplazmave
për 28 mostra.
Figurat e mëposhtme paraqesin rezultatet e tre teknikave të përdorura për dedektimin
e fitoplazmave për 28 mostrat.
Nga figura 3.88 vihet re se vlerësimi nëpërmjet simptomave, metoda e ngjyrimit
DAPI dhe çiftet e primerave fU5/rU3, fO1/rO1 kanë arritur të zbulojnë infeksionin në
100% të mostrave (1-7). Çifti fCPD/rCPD i primerave nuk ka dedektuar infeksionin
në asnjë prej mostrave dhe çifti fCAP/rCAP në 3 prej 7 mostrave të paraqitura në
figurën e mëposhtme.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
97
Figura 3.88 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e fitoplazmave
për mostrat 1-7.
Nga figura 3.89 vihet re se situata e mostrave 8-14 është e njëjtë me situatën e përshkruar më sipër për mostrat 1-7, me përjashtim të çiftit të primerave fCAP/rCAP i
cili në këtë rast ka arritur të dedektojë infeksionin fitoplazmatik në 4 nga 7 mostra
gjithësej.
Figura 3.89 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e
fitoplazmave për mostrat 8-14.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
98
Nga figura 3.90 vihet re se për mostrat 15-21 vlerësimi nëpërmjet simptomave,
metoda e ngjyrimit DAPI dhe çifti i primerave fO1/rO1 kanë arritur të zbulojnë
infeksionin në 100% të mostrave (15-21). Çifti i primerave fU5/rU3 zbuloi
infeksionin në 4 nga 7 mostra, çifti i primerave fCPD/rCPD zbuloi infeksionin në 1
nga 7 mostra dhe çifti fCAP/rCAP në asnjë prej mostrave.
Figura 3.90 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e fitoplazmave
për mostrat 15-21.
Situata e mostrave 22-28, rezultatet e të cilave janë paraqitur grafikisht në figurën
3.91 është e ngjashme me mostrat 15-21 përsa i përket simptomatologjisë, metodës së
ngjyrimit DAPI dhe çiftit të primerave fO1/rO1, të cilat arritën të zbulojnë infeksionin
në 100% të mostrave. Ndërkohë çifti i primerave fCPD/rCPD zbuloi infeksionin
vetëm në një nga mostrat dhe çiftet e primerave fU5/rU3; fCAP/rCAP, dedektuan
infeksionin në 2 nga 7 mostrat.
Figura 3.91 Paraqitja grafike e rezultateve të 3 metodave për dedektimin e fitoplazmave
për mostrat 22-28.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
99
Për dedektimin e fitoplazmave përdoren një sërë teknikash laboratorike, ndër të cilat
ato të bazuara në PCR janë duke shërbyer gjithnjë e më shumë si metoda rutinë, pasi
në 20 vitet e fundit janë përshtatur për ti dedektuar këta patogjenë si në drurët edhe në insektet vektorë. Suksesi i PCR-së për dedektimin e fitoplazmave në materialin bimor
varet kryesisht nga ekstraktimi i materialit gjenetik cilësor, i pasuruar me ADN
fitoplazmatike, çka përbën një objektiv jo të thjeshtë (Firrao et al., 2007). Sasia e
ADN-së fitoplazmatike përbën më pak se 1% të ADN-së së ekstraktuar nga indet
bimore sipas Bertaccini et al., 2007. Me synim rritjen e këtij përqëndrimi një numër
autorësh kanë përdorur metoda të ndryshme, të cilat janë bazuar në shtimin e një faze
të protokollit standard me synim pasurimin me fitoplazma. Kjo proçedurë u përdor
edhe në studimin tonë duke ndjekur protokollin e pasurimit të Kirkpatrick et al.,
(1987) e të pasuar nga një sërë kërkuesish ndër vite. Rezultatet treguan se pavarësisht
pasurimit, gjethet rezultuan indi më i përshtatshëm krahasuar me rrënjët, kercejtë dhe
trungjet, jo vetëm për shkak të butësisë dhe lehtësisë së ekstraktimit, por kryesisht
pasi përqëndrimi i fitoplazmave në to ishte me i lartë.
Sipas raportimeve, diagnostika e bazuar në PCR mbështetet në përdorimin e
primerave specifikë të tipit me spektër të gjerë (broad-spectrum), të cilët në rastin e
fitoplazmave janë në gjendje të lidhen me rajone të mirëruajtura të gjenomave
fitoplazmatike (Firrao et al., 2007; Lorenz et al., 1995; etj). Ndër rajonet e përdorura
për këtë qëllim janë ato të 16S rADN. Për shkak të natyrës shumë të ruajtur të këtij
fragmenti, dedektimi i shtameve të fitoplazmave të ndryshme nga pikëpamja
biologjike ose ekologjike, të cilat mund të përfaqësojnë taksone të reja, është e
pamundur të realizohet vetëm bazuar në të. Në këto raste, nevojitet përdorimi i
veçorive biologjike si antitrupat specifikë, variacioni i bimëve strehuese, specifika të
transmetimit, apo kritere të tjera molekulare (Luigi Carraro et al., 1998).
Në këtë studim u përdorën katër çifte primerash specifikë (me spektër të gjerë) të
krijuar fillimisht nga Lorenz et al., (1995); Dy prej tyre ribozomalë: fU5/rU3 i hartuar
për detektim universal të fitoplazmave, dhe fO1/rO1 i dizenjuar për dedektimin e
fitoplazmave europiane të dru-frutorëve me sekuencë homologe për gjithë shtamet
fitoplazmatike të kategorisë AP (por që përmbante disa baza të ndryshme nga shtame
të kategorive të tjera të fitoplazmave) (Duduk et al., 2013); dhe dy të tjerë jo-
ribozomalë: fCAP/rCAP të hartuar pas sekuencimit të fragmentit AT67 të
kromozomit të shtamit AT të fitoplazmave; dhe çifti fCPD/rCPD i hartuar për të
dedektuar fitoplazmat e grupit PD.
Çifti fO1/rO1 i primerave të spektrit të gjerë mundën të identifikojnë infeksionin në
100% të mostrave; fU5/rU3 në 71% të mostrave, fCPD/rCPD rezultoi i vlefshëm për
32% të mostrave, ndoshta për shkak të veçorive të shtameve specifikë lokalë, ndërsa
fCAP/rCAP vetëm në 7% të rasteve. Një nga arsyet e mos amplifikimit të pjesës më të
madhe të mostrave mund të jetë prania e shtameve lokale që i përkasin një kategorie
të ndryshme nga AP.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
100
PËRFUNDIME
Për herë të parë u përdorën njëkohësisht tre metoda të bazuara në simptoma,
mikroskopinë me fluoreshencë dhe shumëfishimin e ADN-së ribozomale dhe
jo-ribozomale specifike, për të zbuluar praninë e infeksioneve fitoplazmatike
në mollë e kumbulla në vendin tonë.
Falë këtij punimi u plotësuan formularët e vlerësimit të simptomave për një
periudhë tre vjeçare për gjashtë plantacione të rrethit të Korçës. Gjatë viteve
2014-2016 në plantacionin e Bitinckës u vërrejtën 9 lloje të simptomave, në
plantacionin e Korçës 10 lloje të simptomave, dhe në plantacionin e Turanit 9
lloje të simptomave. Për plantacionet me kumbulla numri i simptomave të
vëzhguara ka qënë përkatësisht 9 lloje të simptomave për plantacionin
Cangonj, 8 lloje për plantacionin Dvoran dhe 8 lloje për plantacionin
Zëmblak.
Një prej simptomave të përcaktuara në formularin e vlerësimit simptomatik
(gjethe të kuqerremta në të gjithë kurorën) nuk shfaqet në asnjë prej drurëve
gjatë tre viteve të marrjes së mostrave. Simptomat më të përhapura në
plantacionet e mollëve ishin përdredhje e gjetheve, degë paralele në formë
fshese në plantacionin Bitinckë, gjethet klorotike në plantacionin Korçë,
përdredhje e gjetheve dhe formim i rozetave në plantacionin Turan. Në
plantacionet me kumbulla, gjethe klorotike në plantacionin Cangonj dhe
plantacionin Dvoran dhe përdredhje e gjetheve dhe prani e madhe e insekteve
në plantacionin Zëmblak.
Simptoma të caktuara u shfaqën për një periudhë kohe, u zhdukën për një ose
dy vite dhe u rishfaqën sërish. Bazuar në të dhënat tona, thuajse të gjithë drurët,
në të gjashtë plantacionet, kanë një model të ndryshëm shpërndarje të
simptomave nga viti në vit. Ky fakt përbën një disavantazh të
simptomatologjisë.
Ndërkohë që simptomatologjia ofron informacion mbi praninë e sëmundjeve
në faza të avancuara, ngjyrimi DAPI mund të ndihmojë në identifikimin e tyre
në stade më të hershme.
600 mostra bimore që përfaqësonin 5 paralele x nga 2 kategori (gjethe, rrënjë)
x 10 drurë x 6 plantacione u analizuan për dy vjet për të zbuluar praninë e
fitoplazmave dhe për të vlerësuar efiçencën e mikroskopisë me fluoreshencë
me ngjyrimin DAPI
Rezultoi se përqëndrimi më i përshtatshëm për detektimin me DAPI ishte ai
i gjetheve. Përdorimi i metodës DAPI tek rrënjët rezultoi jo i suksesshëm.
Numri i drurëve që rezultuan të infektuar me fitoplazma nëpërmjet metodës të
ngjyrimit DAPI për vitin 2015 për çdo plantacion ishte: për plantacioninBitinckë 7 drurë, për plantacionin Korçë 10 drurë, për plantacionin Turan 8
drurë, për plantacionin Cangonj 9 drurë, për plantacionin Dvoran 8 drurë dhe
për plantacionin Zëmblak 9 drurë. Gjatë vitit 2016 situata paraqitet e
ndryshme për disa nga plantacionet. Numri i drurëve që rezultuan të infektuar
me fitoplazma nëpërmjet metodës të ngjyrimit DAPI për vitin 2016 për çdo
plantacion ishte: për plantacionin Bitinckë 10 drurë, për plantacionin Korçë 10
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
101
drurë, për plantacionin Turan 10 drurë, për plantacionin Cangonj 9 drurë, për
plantacionin Dvoran 9 drurë dhe për plantacionin Zëmblak 10 drurë.
Rezultatet provuan se suksesi i simptomatologjisë dhe metodës DAPI për
dedektimin e fitoplazmave tek molla dhe kumbulla varet nga sezoni i marrjes
së mostrave, pozicioni i marrjes në çdo pemë dhe përqëndrimi i fitoplazmave
në indet e analizuara.
1200 mostra bimore që përfaqësonin 5 paralele x nga 4 kategori (rrënjë,
kërcej, trung, gjethe) x 10 drurë x 6 plantacione u analizuan për të zbuluar
praninë e fitoplazmave dhe për të vlerësuar efiçencën e metodës molekulare.
Përdorimi i metodës së shumëfishimit të fragmenteve specifike ribozomale
dhe jo-ribozomale të fitoplazmave bazuar në PCR, rezultoi me vlerë për të
plotësuar të dhënat e marra nga dy kategoritë e tjera të metodave. Në këtë
studim u përdorën katër çifte primerash specifikë (me spektër të gjerë); dy prej
tyre ribozomalë: fU5/rU3 i hartuar për dedektim universal të fitoplazmave, dhe
fO1/rO1 i dizenjuar për dedektimin e fitoplazmave europiane të dru-frutorëve
me sekuencë homologe për gjithë shtamet fitoplazmatike të kategorisë AP (por
që përmbante disa baza të ndryshme nga shtame të kategorive të tjera të
fitoplazmave); dhe dy të tjerë jo-ribozomalë: fCAP/rCAP të hartuar pas
sekuencimit të fragmentit AT67 të kromozomit të shtamit AT të fitoplazmave;
dhe çifti fCPD/rCPD i hartuar për të dedektuar fitoplazmat e grupit PD.
Kategoria e primerave të dizenjuar bazuar në 16SrADN ofroi efiçencën më të
lartë të dedektimit (100%) për çdo kategori materiali biologjik (rrënjë, kërcell,
trung dhe gjethe) të analizuar.
Në disa raste produkti i shumëfishuar rezultoi në dy fragmente të përafërta, që
mund të shpjegohet me praninë e njëkohshme të dy shtameve të fitoplazmave
njëkohësisht.
Në praktikën e këtij studimi evidentuam gjithashtu se suksesi i metodës PCR
ishte i ndërvarur nga cilësia e ADN-së të pasuruar për MLO nga inde të
ndryshme. Rezultatet tona provojnë se falë pasurimit me MLO, u izolua jo
vetëm material gjenetik nga gjethet, por edhe nga indet e tjera dhe u përdor për
të dedektuar infeksionet, ndonëse gjethet dhanë rezultatin më të mirë.
Përdorimi i të tre metodave do të ofronte një rezultat më të besueshëm duke
marrë në konsideratë avantazhet dhe disavantazhet e çdonjërës.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
102
REKOMANDIME
Për shkak të kompleksitetit të patologjive të shkaktuara nga fitoplazmat dhe
mekanizmave ende të pashpjeguar mirë të patogjenitetit të tyre, rekomandojmë
se çelësi për të mbajtur këto sëmundje nën kontroll është testimi rigoroz i
materialit bimor dhe monitorimet e rregullta të insekteve vektorë.
Meqënëse, ka një shpërndarje të pabarabartë të fitoplazmave dhe luhatje
sezonale të popullatave të patogjenit tek drurët strehues, si edhe një nivel më
të ulët të tyre në rrënjë dhe mesatar në kërcej, rekomandojmë se indet më me
vlerë per dedektimin e tyre janë gjethet.
Falë larmisë se metodave serologjke dhe molekulare që janë në zhvillim të
përditshëm, sugjerojmë vijimin e punës tonë për studimin e fitoplazmave në
detaje edhe më të thelluara në mënyrë që të mund të kuptojmë jo vetëm se si
këto organizma interesante mbijetojnë dhe replikohen në bimë dhe insekte, por
edhe të mund të zhvillojmë metodika të përshtatshme dhe me kosto efektive të
kontrollit të sëmundjeve kryesore që ato shkaktojnë në bimë.
Për suksesin e diagnostikimit ka rëndësi edhe mënyra e marrjes së mostrës për
analiza. Zakonisht preferohet të merren mostra në periudhën kur simptomat
shprehen qartë duke marrë pjesët simptomatike të bimës, pasi shpesh bimët e
infektuara nga fitoplazmat nuk janë simptomatike në të gjithë kurorën.
Megjithatë, përdorimi i të tre metodave të trajtuara në këtë studim do të
ofronte një rezultat më të besueshëm, duke marrë në konsideratë avantazhet
dhe disavantazhet e çdonjërës. Një metodë e përshtatshme për vlerësimin në
vijim të këtyre situatave mund të jetë RFLP.
Nëse PCR do të ishte metoda e zgjedhjes për dedektimin e fitoplazmave,
sugjerojmë përdorimin e kombinuar të primerave të dizenjuar në bazë të
16SrADN-së dhe atyre të bazuar në sekuencat e gjeneve koduese të proteinave
ribozomale, të cilët realizojnë shumëfishim vetëm të fragmenteve specifike
dhe ofrojnë dedektim të besueshëm.
Në vijim të punës për stabilizimin e metodikave të dedektimit të fitoplazmave
në mollë dhe kumbulla bazuar në PCR, rekomandojmë mbështetjen financiare
të kërkimit për evidentimin e shtameve lokale të fitoplazmave, të cilat mund të
klasifikohen në përputhje me rregullat ndërkombëtare dhe të kontribuojnë në
skemën e parandalimit të efekteve me pasoja ekonomike të këtyre
infeksioneve.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
103
LITERATURA
1. Agrios, G. N. (1997): Plant pathology (4th ed. Academic Press, San Diego,
USA).
2. Agrios, G. N. (2004): Plant pathology (5th ed. Academic Press, San Diego,
USA).
3. Ahrens, U., and Seemüller, E. (1992): Detection of DNA of plant pathogenic
mycoplasmalike organisms by a polymerase chain reaction that amplifies a
sequence of the 16s rRNA gene. Phytopathology 82, 828-832.
4. Ahrens U., Lorenz K.H., Seemueller E. (1993): Genetic diversity among
mycoplasmalike organisms associated with stone fruit diseases. Molecular
Plant-Microbe Interactions, 6: 686-691.
5. Alma A., Bosco D., Danielli A., Bertaccini A., Vibio M., Arzone A. (1997):
Identification of phytoplasmas in eggs, nymphs and adults of Scaphoideus
titanus Ball reared on healthy plants. Insect Molecular Biology, 6: 115-121.
6. Alma A., Navone P., Visentin C., Arzone A., Bosco D. (2000): Rilevamento
di fitoplasmi di Apple proliferation in Cacopsylla melanoneura (Forster)
(Homoptera Psyllidae). Petria, 10(2):141-142.
7. Andersen M.T., Beever R.E., Gilman A.C., Liefting L.W., Balmori E., Beck
D.L., Sutherland P.W., Bryan G.T., Gardner R.C., Forster R.L.S. (1998):
Detection of phormium yellow leaf phytoplasma in New Zealand flax
(Phormium tenax) using nested PCRs. Plant Pathology, 47:188-196.
8. Andrade Nancy M. and Arismendi Nolberto L. (2013): DAPI Staining and
Fluorescence Microscopy Techniques for Phytoplasmas. In: Dickinson M.,
Hodgetts J., editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols,
phytoplasma methods and protocols. Nottingham, Springer New York
Heidelberg Dordrecht London. p115-117.
9. Arnaud G., Malembic-Maher S., Salar P., Maixner M., Marcone C, Boudon-
Padieu E., Foissac X. (2007): Multilocus sequence typing confirms the close
genetic interrelatedness between three distinct ―Flavescence dorée‖
phytoplasma strain clusters and group 16SrV phytoplasmas infecting
grapevine and alder in Europe. Applied and Environmental Microbiology, 73:
4001-4010.
10. Bai, X., Zhang, J., Ewing, A., Miller, S. A., Radek, A., Schevchenko D.,
Tsukerman, K., Walunas, T., Lapidus, A., Campbell, J. W., Hogenhout, S. A.
(2006): Living with genome instability: the adaptation of phytoplasmas to
diverse environments of their insect and plant hosts. Journal of Bacteriology
188, 3682-3696.
11. Berges R, Rott M, Seemüller E (2000): Range of phytoplasma concentration
in various plant hosts as determined by competitive polymerase chain reaction.
Phytopathology 90: 1145–1152.
12. Bertaccini, A., Davis, R.E., and Lee, 1.-M. (1990a): Distinctions arnong
mycoplasmalike organisrns (MLOs) in Gladiolus, Ranunculus, Brassica, and
Hydrangea through detection with nonradioactive cloned DNA probes.
Phytopathol. Medit. 29, 107-113.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
104
13. Bertaccini, A., Davis, R.E., Lee, LM., Conti, M., Dally, E.L., and Douglas,
S.M. (1990b): Detection of chrysanthemum yellows mycoplasrnalike
organism by dot hybridization and Southem blot analysis. Plant Dis. 74,4043.
14. Bertaccini A., Bellardi M.G., Vibio M. (1996): Virus diseases of ornamental
shrubs. X. Euphorbia pulcherrima Willd. Infected by viruses and
phytoplasmas. Phytopathologia mediterranea, 35: 129-132.
15. Bertaccini A. (2007): Phytoplasmas: diversity, taxonomy, and epidemiology.
Frontieres in Bioscience, 12: 673-689.
16. Bertamini M., Nedunchezhian N. (2001): Effect of phytoplasma, stolbur-
subgroup (Bois noir-BN)] of photosynthetic pigments, saccarides, ribulose-
1,5-bisphosphate carboxylase, nitrate and nitrite reductases and photosynthetic
activities in field-grow grapevine (Vitis vinifera L. cv Chardonnay) leaves.
Photosynthetica, 39(1): 119-122.
17. Bliefernicht K., Krczal G. (1995): Epidemiological studies on apple
proliferation disease in Southern Germany. Acta Horticulturae, 386: 444-447.
18. Bonnet, F., Saillard, C., Kollar, A., Seemüller, E., Dosba, F., Bové J.M. 1990.
Molecular probes for the apple proliferation MLO. Zentralbl. Bactenol. Suppl.
20, 908-909.
19. Bosco D. and R. Tedeschi. (2013): Insect Vector Transmission Assays. In:
Dickinson M., Hodgetts J., editors. Methods in molecular biology 938 springer
protocols, phytoplasma methods and protocols. Nottingham, Springer Neë
York Heidelberg Dordrecht London. P73-74.
20. Botti S., Bertaccini A. (2006a): Phytoplasma infection trough seed
transmission: further observations. 16th International Congress of the IOM,
Cambridge, UK, 9-14 July 76: 113.
21. Boudon-Padieu, E., Lame, J., and Caudweii, A. (1989): ELISA and dot-blot
detection of flavescence doree-ML0 in individual leaniopper vectors during
latency and inoculative state, Curr. Microbiol. 19, 357-364.
22. Canik D, Ertunc F. (2007): Distribution and molecular characterization of
apple proliferation phytoplasma in Turkey. Bulletin of Insectology 60(2), 335-
336.
23. Carginale V., Maria G., Papasso C, Ionata E., La Cara F., Pastore M.,
Bertaccini A., Papasso A. (2004): Identification of genes expressed in
response to phytoplasmal infection in leaves of Prunus armeniaca L. by
messenger RNA differential display. Gene, 12(332): 29-34.
24. Carraro L., Loi N., Ermacora P., Osler R. (1998): High tolerance of European
plum varieties to plum leptonecrosis. European Journal of Plant Pathology,
104: 141-145.
25. Carraro L., Osler R., Loi N., Ermacora P., Refatti E., (1998a): Transmission of
European stone fruit yellows phytoplasma by Cacopsylla pruni. Journal of
Plant Pathology 80: 233-239.
26. Caudwell, A, Meignoz, R, Kuszaia, C., Schneider, C., Lame, J., Fleury, H.,
and Boudon, E. (1983): Serological purification and visualization in electron
microscope of the grapevine flavescence doree (FD) pathogen (MLO) in
diseased plants and infectious vector extracts. Yale J. Biol. Med. 56,936-937.
27. Caudwell, A., Boudon-Padieu, Eo, Lhenninier, JO, Schwartz, Y., and
Meignoz, P. (1990): Current spread of the grapevine yellows and
charactenzation rnethods for the ML0 pathogen. Zentralbl. Bacteriol. Suppl.
20, 916-918.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
105
28. Ceranic-Zagorac, P., and Hiruki, C. (1996): Comparative molecular studies on
aster yellows phytoplasmas. Acta Horticulturae 432, 226-276.
29. Chang, CJ., and Chen, T.A. (1991): Utilization of monoclonal antibodies
against elm yellows mycoplasmalike organisms in detection of elm yellows
disease. Phytopathology 81, 121.
30. Chen, J., and Chang, CJ. (1991): Plasmid-like DNAs with a mycoplasma-like
organism (MLO) and their seasonal occurrence. Phytopathology 81,1169.
31. Chen, J., Chang, CJ.. Jarret, R., and Gawel, N. (1992): Isolation and cloning of
DNA fragments fkom mycoplasmalike organism associated with walnut
witches'-broom disease. Phytopathology 82, 306-309.
32. Chen J., Pu X., Deng X, Liu S., Li H., Civerolo E. (2008): A phytoplasma
closely related to the pigeon pea witches'-broom phytoplasma (16SrIX) is
associated with citrus huanglongbing symptoms in the state of São paulo,
Brazil. Phytopathology, 98(9): 977-984.
33. Chen, K.H., Guo, J.R., Wu, X.Y., Loi, N., Carraro, L., Guo, Y.H., Chen,
YOD., Osler, Re, Pearson, R., and Chen, TA. (1993): Cornparison of
monoclonal antibodies, DNA probes, and PCR for detection of the grapevine
yellows disease agent. Phytopathology 83,9 15-922.
34. Chen, T.A., and Jiang, X.F. (1988): Monoclonal antibodies against the maize
bushy stunt agent. Can. J. Microbiol. 34,6- 11.
35. Chen, T.A., Lei, J.D, and Lin C.P. (1989): Detection and identification of
plant and insect mollicutes. In: The Mycoplasmas, vol. 5. p. 393-424. R.F.
Whitcomb and J.G. Tully (ed.), Acadernic Press, New York.
36. Chen, T.A.9 and Jiang, Y.P. (1990): Progress in the detection of plant
mycoplasmalike organisms by using monoclonal and polyclonal antibodies.
Zentralbl. Baktenol. Suppl. 20,270-275.
37. Chen, T.R. (1977): In situ detection of mycoplasma contamination in ce11
cultures by fluorescent Hoechst 33258 stain. Exp. CeU Res. 104,255-262.
38. Chen Y.D., Chen T.A. (1998): Expression of engineered antibodies in plants: a
possible tool for spiroplasma and phytoplasma disease control.
Phytopathology, 88: 1367-1371.
39. Chen, WH., and Hiruki, Ce (1977): Effect of dark treatment on the
ultrastructure of aster yellows agent in situ. Phytopathology 67, 32 1-324.
40. Cieslinska, M., & Kruczynska, D. (2011): Molecular detection of
phytoplasmas infecting Apple trees in Poland. Bulletin of Insectology,
64(Supplement), S73–S74.
41. Chiykowski L.N. (1991): Vector-pathogen-host plant relationships of clover
phyllody mycoplasmalike organism and the vector leafhopper Paraphlepsius
irroratus. Canadian Journal of Plant Pathology, 13: 11-18.
42. Choi YH et al (2004): Metabolic discrimination of Catharanthus roseus leaves
infected by phytoplasma using 1 H-NMR spectroscopy and multivariate data
analysis. Plant Physiol 135: 2398–2410.
43. Christensen N.M., Nicolaisen M., Hansen M., Schultz A. (2004): Distribution
of phytoplasmas in infected plants as revealed by real time PCR and
bioimaging. Molecular Plant–Microbe Interactions, 17: 1175-1184.
44. Christensen, N. M., Axelsen, K. B., Nicolaisen, M., Schulz, A. (2005):
Phytoplasmas and their interactions with hosts.Trends in Plant Science 10,
526-535.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
106
45. Christensen N. Meyn, H. Nyskjold, and M. Nicolaisen, (2013): Real-Time
PCR for Universal Phytoplasma Detection and Quantification. In: Dickinson
M., Hodgetts J., editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols,
phytoplasma methods and protocols. Nottingham, Springer New York
Heidelberg Dordrecht London. p245-246.
46. Clark, M.F., Flegg, C.L., Bar-Joseph, M., and Rottem, S. (1978): The
detection of ―Spiroplasma citri” by enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA). Phytopathology 92,332-337.
47. Clark, M.F., Barbara, DJ., and Davis, D.L. (1983): Production and
characteristics of antisera of ―Spiroplasma citri” and clover phyllody-
associated antigens derived from plants. Ann. Biol. 103,251-259.
48. Clark, M.F., Morten, A., and Buss, S.L. (1989): Preparation of mycoplasma
immunogens from plants and a cornparison of polyclond and monoclonal
antibodies made against primula yellows MLO-associated antigens. Am. Appl.
Biol. 114, 111- 124.
49. Cordova I., Jones P. Harrison N.A., Oropeza C. (2003): In situ detection of
phytoplasma DNA in embryos from coconut palms with lethal yellowing
disease. Molecular Plant Pathology, 4: 99-108.
50. Cousin, M.T., Roux, J., Boudon-Padieu, E., Berges, R., Seemüller, E., and
Sniki, C. (1997): Use of heteroduplex mobility analysis (HMA) for
differentiating phytoplasma isolates causing witches'-broom disease on
Populus nigra cv Ltalica and stolbur or big bud symptoms on tomato. J.
Phytopathol. (in press).
51. Da Rocha, A., Ohki, S.T., and Hiruki, C. (1986): Detection of mycoplasmalike
organisms in situ by indirect immunofluorescence rnicroscopy.
Phytopathology, 76, 864-868.
52. Dai Q., He F.T., Liu P.Y. (1997): Elimination of phytoplasma by stem culture
from mulberry plants (Morus alba) with dwarf disease. Plant Pathology, 46:
56-61.
53. Danet, J.L.; Foissac, X.; Zreik, L.; Salar, P.; Verdin, E.; Nourrisseau, J.G.;
Garnier, M. (2003): ―Candidatus Phlomobacter fragariae‖ is the prevalent
agent of marginal chlorosis of strawberry in french production fields and is
transmitted by the planthopper Cixius wagneri (China). Phytopathology 93,
644-649.
54. Danet J.-L., Bonnet P., Jarausch W., Carraro L., Skoric D., Labonne G.,
Foissac X. (2007): Imp and secY, two new markers for MLST (multilocus
sequence typing) in the 16SrX phytoplasma taxonomic group. Bulletin of
Insectology 60: 339-340.
55. Danielli A., Bertaccini A., Alma A., Bosco D., Vibio M., Arzone A. (1996):
May evidence of 16SrI-group-related phytoplasmas in eggs, nymphs and
adults of Scaphoideus titanus Ball suggest their transovarial transmission?
IOM Letters, 4: 190-191.
56. Davies, D. L, Clark, M. F. (1992): Production and characterization of
polyclonal and monoclonal antibodies against peach yellow leaf roll MLO-
associated antigens. Acta Horticulturae 309, 275-283
57. Davis, M.J., Tsai, J.H., Cox, R.L., Mcdaniel, L.L., and Harrison, N.A. (1988):
Cloning of chromosomal and extrachromosomal DNA of the mycoplasmalike
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
107
organism that causes maize bushy stunt disease. Mol. Plant-Microbe Interact.
1, 295-302.
58. Davis, M J., Konai, M., and Bak, W.-C. (1990): Electrophoretic separation of
chromosomal DNA of mycoplasmalike organisms. IOM Letters, the 8th IOM
Congress 1,23 1-232.
59. Davis, R.E., Whitcomb, R.F., Steere, R. L. (1968): Remission of aster yellows
disease by antibiotics. Science 161, 793-794.
60. Davis, R.E., Lee, I.-M., Douglas, SaM, and Dally E.L. (1990a): Molecular
cloning and detection of chromosomal and extrachromosomal DNA of the
mycoplasmalike organism (MLO) associated with linle leaf disease in
periwinkle (Catharanthus roseus). Phytopathology 80,789-793.
61. Davis, R.E., Lee, I.-M., Douglas, S.M., Dally, E.L., and DeWitt, ND. (1990b):
Development and use of cloned nucleic acid hybridization probes for disease
diagnosis and detection of sequence homologies among uncultured
mycoplasmalike organisrns (MLOs). Zentralbl. Bakteriol. Suppl. 20,303-307.
62. Davis, R.E., Sinclair, W.A., Lee, LM., and DaUy, E.L. (1991): Cloned DNA
probes specific for detection of a mycoplasmalike organisrn associated with
ash yellows. Mol. Plant-Microbe Interact. 5, 163-169.
63. Davis, R.E., Dally, E.L., Bertaccini, A., Credi, R., Osler, R., Savino, V.,
Refatti, R., DiTerüzzi, B., Barba, M., and Lee, LM. (1992): RFLP analyses
and dot hybridizations of chromosornal DNA distinguish two mycoplasmaiike
organisms (MLOs) associated with grapevine yellows disease. Phytopathology
82, 242.
64. Davis, RE., and Lee, LM. (1993): Cluster-specific polymerase chain reaction
amplification of 16s rDNA sequences for detection and identification of
mycoplasmalike organisms. Phytopathology 83, 1008-1011.
65. Davis R.E., Jomantiene R., Dally E.L., Wolf T.K. (1998): Phytoplasmas
associated with grapevine yellows in Virginia belong to group 16SrI, subgroup
A (tomato big bud phytoplasma subgroup), and group 16SrIII, new subgroup
I. Vitis, 37: 131-137.
66. Davies D.L., Adams A.N. (2000): European stone fruit yellows phytoplasmas
associated with a decline disease of apricot in southern England. Plant
Pathology 49: 635-639.
67. Del Giudice, R-A., and Hopps, H.E. (1978): Microbiological methods and
fluorescent microscopy for direct dernonstration of mycoplasma infection of
cell cultures. In: Mycoplasma Infection of Ceil Cultures, p. 57-59, GJ.
McGarrity, D.G. Murphy and W.W. Nichols (ed.), Academic Press, New
York.
68. Delic´ D., Martini M., Ermacora P., Carraro L., Myrta A. (2008):
Identification of fruit tree phytoplasmas and their vectors in Bosnia and
Herzegovina. Acta Horticulturae 781: 429-434.
69. Delwart, E.L., Shpaer, E.G., Louwagie, J., McCutchan, F.E., Grez, M.,
Rubsamen-Weigrnann, H., and Mullins, J.I. (1993): Genetic relationships
determined by a DNA heteroduplex mobility assay: analysis of Hiv-1 env
genes. Science 262, 1257-1261.
70. Delwart, E.L., Sheppard, H.W., Walker, B.D., Goudsmit, J., and Mullins, J.I.
(1994): Tracking HIV evolution in vivo using a DNA heteroduplex mobility
assay. J. Virol. 68,6672-6683.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
108
71. Deng, S., and Hiruki, C. (1990a): Enhanced detection of a plant pathogenic
mycoplasmalike organism by polymerase chain reaction. Proc. Japan. Acad.
66B,140-144.
72. Deng, S., and Hiruki, C. (1990b): Molecular cloning and detection of DNA of
the mycoplasmalike organisms associated with clover proliferation. Can. J.
Plant Pathol. 12, 383-388.
73. Deng, S., and Hiruki, C. (1990c): The use of cloned DNA probes for diagnosis
of nonculturable plant Mollicutes. Proc. Japan Acad. 66,58-6 1.
74. Deng, S., and Hiruki, C. (1990d): Use of Biotinylated DNA probes for the
detection and differentiation of mycoplasmalike organisms. Can. J. Plant
Pathol. 12,333.
75. Deng, S. (1991): Molecular diagnosis and charactenzation of mycoplasmalike
organisms associated with clover proliferation. Ph.D. Thesis. University of
Alberta. Edmonton, Canada.
76. Deng, S., and Hiruki, C. (1991a): Amplification of 16s rRNA genes from
culturable and non-cdturable mollicutes. J. Microbiol. Methods 14,53-61.
77. Deng, S., and Hiruki, C. (1991b): Genetic relatedness between two
nonculturable mycoplasmalike organisms reveaied by nucleic acid
hybridization and polymerase chain reaction. Phytopathology 8 1, 1475-1479.
78. Dickinson M., Tuffen M., and Hodgetts J. (2013): The Phytoplasmas: An
Introduction. In: Dickinson M., Hodgetts J., editors. Methods in molecular
biology 938 springer protocols, phytoplasma methods and protocols.
Nottingham, Springer New York Heidelberg Dordrecht London. p1-14, p47-
48
79. Doi, Y., Teranaka, M., Yora, K., Asuyama, H. (1967): Mycoplasma- or PLT
group-like microorganisms found in the phloem elements of plants infected
with mulberry dwarf, potato witches‘ broom, aster yellows or paulownias
witches broom. Annuals of the Phytopathologicial Society of Japan 33, 259-
266.
80. Doyle JJ, Doyle JL (1990): Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus
12: 13-15.
81. Duduk, B., Ivanović, M., Paltrinieri, S. and Bertaccini, A. (2008):
Phytoplasmas infecting fruit trees in Serbia. Acta Hort. (ISHS) 781:351-358
82. Duduk, B. (2009): Molecular characterization of phytoplasmas detected in
agronomically relevant crops in Serbia. Ph.D. Thesis. Università di Bologna,
Italy.
83. Duduk B., Paltrinieri S., Lee I., and A. Bertaccini. (2013): Nested PCR and
RFLP Analysis Based on the 16S rRNA Gene. In: Dickinson M., Hodgetts J.,
editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols, phytoplasma
methods and protocols. Nottingham, Springer New York Heidelberg
Dordrecht London.p159-162.
84. Duska Delic (2012): Polymerase Chain Reaction for Phytoplasmas Detection,
Polymerase Chain Reaction, Dr Patricia Hernandez-Rodriguez (Ed.), InTech,
DOI: 10.5772/37728.
85. Engvall, E-, and Perlmann, P. (1971): Enzyme-linked immunosorbent assay,
ELISA. iII. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled anti-
irnrnunogiobulin in antigen-coated tubes. J. Immun01 109, 129-135.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
109
86. Errampalli, D., Fletcher, J., and Sherwood, J.L. (1989): Production of
monospecific polyclonal an tibodies against the aster yellows mycoplasmalike
organisms (AY MLO) of Oklahoma. Phytopathology 79, 1137.
87. Errampalli D., Fletcher J., Claypool P.L. (1991): Incidence of yellows in
carrot and lettuce and characterization of mycoplasmalike organism isolates in
Oklahoma. Plant Disease, 75: 579-584.
88. Errea P., Aguelo V., Hormaza J. (2002): Seasonal variations in detection and
transmission of pear decline phytoplasma. Journal of Phytopathology, 150:
439-443.
89. Etropolska A, Laginova M. (2012): Monitoring distribution of fruit tree
phytoplasmas in Bulgaria from 2007 until 2011. Abstract of a paper presented
at the 22nd International Conference on virus and other graft transmissible
diseases of fruit crops (Rome, 2012-06-03/08), p 108.
90. Etropolska, A., W. Jarausch, B. Jarausch and g. trenchev. (2015): Detection of
European fruit tree phytoplasmas and their insect vectors in important fruit-
growing regions in Bulgaria. Bulg. J. Agric. Sci., 21: 1248–1253.
91. Firrao, G., Smart, C. D., Kirkpatrick, B. C. (1996): Physical map of the
western X disease phytoplasma chromosome. Journal of Bacteriology 178,
3985-3988.
92. Firrao G., Garcia Chapa M., Marzachì C. (2007): Phytoplasmas: genetics,
diagnosis and relationships with the palnt and insect host. Frontiers
Bioscience, 12: 1352-1375.
93. Gámez-Jiménez C, Romero-Romero J L, Santos-Cervantes M E, Leyva-López
N E, Méndez-Lozano J. (2009): Tomatillo (Physalis ixocarpa) as a natural new
host for Tomato yellow leaf curl virus in Sinaloa, Mexico. Plant Disease, 93,
545-545.
94. Garnier, M., Martin-Gros, G., Iskra, M., Zreik, L., Gandar, J., Fos, A., and
Bové, J.M. (1990): Monoclonal antibodies against the MLOs associated with
tomato stolbur and clover phyllody . Zentralbl. Bakteriol. Suppl. 20,263-269.
95. Garnier M., Foissac X., Gaurivaud P., Laigret F., Renaudin J., Saillard C.,
Bové J.M. (2001): Mycoplasmas, plants, insect vectors: a matrimonial
triangle. C.R. Acad. Sci., 324: 923–928.
96. Griffiths, H.M., Gundersen, D.E., Sinclair, W.A., Lee, LM., and Davis, R.E.
(1994a): Mycoplasmalike organisms from milkweed, goldenrod. and spirea
represent two new 16s rRNA subgroups and three new strain subclusters
related to X-disease. Can. J. Plant Pathol. 16,225-260.
97. Gundersen, D. E., Lee, I-M., Rehner, S. A., Davis, R. E., Kingsbury, D. T.
(1994): Phylogeny of mycoplasmalike organisms (phytoplasmas): a basis for
their classification. Journal of Bacteriology 176, 5244-5254.
98. Gundersen, D.E., Lee, LM., Chang, C J., and Davis, R.E. (1994a): RFLP
analysis of ribosomal protein genes reveal strain diversity in ML0 16s rRNA
groups 1 and m. Phytopathology 84, 1128.
99. Gundersen, D.E., Lee, 1.-M., Rehner, S.A., Davis, RE., and Kingsbury, DOT.
(1994b): Phylogeny of mycoplasmalike organisms (phytoplasmas); a bais for
their classification. J. Bacteriol. 176,5244-5254.
100. Gundersen D.E., and Lee, LM. (1996): Ultrasensitive detection of
phytoplasmas by nested-PCR assay using two universal primer pairs.
Phytopathol. Medit. 35, 144-151.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
110
101. Gundersen, D.E., Lee, LM., Schaff, D.A., Harrison, N.A., Chang, CJ.,
Davis, R.E., and Kingsbury, D.T. (1996): Genomic diversity and
differentiation among phytoplasma strains in 16s rRNA groups I (aster
yellows and related phytoplasmas) and DI (X-disease and related
phytoplasmas). Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 64-75.
102. Guo, J.R., Chen, TA., and Loi, N. (1991): Production of monoclonal
antibodies against flavescence doree mycopalsmalike organisrn.
Phytopathology 81, 1210.
103. Guthrie J.N., White D.T., Walsh K.B., Scott P.T. (1998):
Epidemiology of phytoplasmaassociated papaya diseases in Queensland,
Australia. Plant Disease, 82: 1107-1111.
104. Hanboonsong Y, Choosai C, Panyim S, Damak S. (2002): Transovarial
transmission of sugarcane white leaf phytoplasma in the insect vector
Matsumuratettix hiroglyphicus (Matsumura). Insect Molecular Biology, 11:
97-103.
105. Harrison, N.A., Bourne, CM., Cox, R.L., Tsai, JJ., and Richardson,
P.A. (1992): DNA probes for detection of mycoplasmalike organisms
associated with lethal yellowing disease of palms in Horida. Phytopathology
82, 216-224.
106. Hibben, CR,, Sinclair, W.A., Davis, RE., and Alexander, J.H.III.
(1991): Relatedness of mycoplasma-like organisms associated with ash
yellows and lilac witches‘ broom. Plant Dis. 75, 1227-1230.
107. Hiruki, C. (1981): Fluorescence microscopy in diagnosis of tree
diseases associated with mycoplasma-like organisms (MLO). Proc. WIWXO
World Con. Div. 2, 317-322.
108. Hiruki, Ca, and da Rocha, A. (1984): The use of fluorescent DNA
binding agent, 4', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI), for detecting
mycoplasma infections in Vincarosea. Can. J. Plant Pathol. 6,262,
109. Hiruki, C., and da Rocha, A. (1986): Histochemical diagnosis of
mycoplasma infections in Catharanthus roseus by means of fluorescent DNA
binding agent, 4',6'-diamidino-2-phenylindole 2HC1 (DAPI). Can. J. Plant
Pathol. 8, 185-188.
110. Hiruki, C. (1988a): Fluorescence rnicroscopy of yeliows diseases
associated with plant mycoplasrnalike organisms. In: Mycoplasma Diseases of
Crops: Basic and Applied Aspects, p. 51-76, K. Maramorosch and S.P.
Raychaudhuri (ed.), Springer-Verlag, New York.
111. Hiruki, C. (1988b): Rapid and specific detection methods for plant
mycoplasmas. In: Mycoplasma Diseases of Crops: Basic and Applied Aspects,
p. 77-101, K. Mararnorosch and S. P. Raychaudhuri (ed.), Springer-Verlag,
New York Inc.
112. Hiruki, C. (1988c): Immunofluorescence microscopy of yellows
diseases associated with plant mycoplasmalike organisrns. In: Tree
Mycoplasmas and Mycoplasma Diseases, p. 193-203, C. Hiruiki (ed.)
University of Alberta Press, Edmonton, Alberta.
113. Hobbs, H.A., Reddy, D.V.R., and Reddy, A.H. (1987): Detection of a
mycoplasma-like organism in peanut plants with witches ' -broom using
indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Plant Pathol. 36, 164-
167.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
111
114. Hodgetts, J., Ball, T., Boonham, N., Mumford, R., Dickinson, M.
(2007): Use of terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)
for identification of phytoplasmas in plants. Plant Pathology 56, 357-365.
115. Hodgetts J. and M. Dickinson. (2013): T-RFLP for Detection and
Identification of Phytoplasmas in Plants. In: Dickinson M., Hodgetts J.,
editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols, phytoplasma
methods and protocols. Nottingham, Springer New York Heidelberg
Dordrecht London.p233-234.
116. Hogenhout SA, Šeruga MM. (2010): Phytoplasma genomics, from
sequencing to comparative and functional genomics—what have we learnt?
In: Weintraub PG, Jones P (eds) Phytoplasmas: genomes, plant hosts and
vectors. CABI Publishing, Oxfordshire, pp 19–36.
117. Holevas, C.D.; Chitzanidis, A.; Pappas, A.C.; Tzamos E.C.; Elena, K.;
Psallidas, P.G.; Alivizatos, A.S.; Panagopoulos, P.E.; Kyriakopoulou P.E.;
Bem, F.P.; Lascaris, D.N.; Velissariou, D.E; Vloutoglou, I.; Analytis, S.C.;
Paplomatas, E.J.; Asprogoumos, J.S.; Varveri, C. (2000): Disease agents of
cultivated plants observed in Greece from 1981 to 1990. Annales de l'institut
phytopathologique Benaki 19(1), 1-96.
118. Hoshi A., Ishii Y., Kakizawa S., Oshima K., Namba S. (2007): Host-
parasite interaction of phytoplasmas from a molecular biological perspective.
Bulletin of Insectology, 60(2): 105-107.
119. Hren I.M., Ravnikar M., Brzin J., Ermacora P., Carraro L., Bianco
P.A., Casati P., Borgo M., Angelini E., Rotter A., Gruden K. (2009): Induced
expression of sucrose synthase and alcohol dehydrogenase I genes in
phytoplasma-infected grapevine plants grown in the field. Plant Pathology,
58(1): 170-180.
120. Hsu, H.T., Lee, I.-M., Davis, R.E., and Wang, Y.C. (1990):
Immunization for generation of hybridoma antibodies specifically reacting
with plants infected with a mycoplasrnalike organism (MLO) and their use in
detection of ML0 antigens. Phytopathology 80,946-950.
121. IRPCM PHytoplasma/spiroplasma working team – phytoplasma
taxonomy group. (2004): ―Candidatus Phytoplasma‖, a taxon for the wall-less,
non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects.- International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 1243- 1255.
122. Jagoueix-Eveillard S., Tarendau F., Guolter K., Danet J.L., Bové J.M.,
Garnier M. (2001): Catharanthus roseus genes regulated differentially by
mollicute infections. Molecular Plant-Microbe Interactions, 14: 225-233.
123. Jarausch W., Lansac M., Saillard C., Broquaire J.M., Dosba F.
(1998a): PCR assay for specific detection of European stone fruit yellows
phytoplasmas and its use for epidemiological studies in France. European
Journal of Plant Pathology 104: 17-27.
124. Jarausch W., Lansac M., Bliot C., Dosba F. (1999a): Phytoplasma
transmission by in vitro graft inoculation as a basis for a preliminary screening
method for resistance in fruit trees. Plant Pathology, 48: 283-287.
125. Jarausch W., Lansac M., Dosba F. (1999b): Seasonal colonization
pattern of European stone fruit yellows phytoplasma in different Prunus
species detected by specific PCR. Journal of Phytopathology, 147: 47–54.
126. Jarausch W., Saillard C., Broquaire J.M., Garnier M., Dosba F.
(2000a): PCR-RFLP and sequence analysis of a non-ribosomal fragment for
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
112
genetic characterization of European stone fruit yellows phytoplasmas
infecting various Prunus species. Molecular and Cellular Probes 14: 171-179.
127. Jarausch W., Bisognin C., Schneider B., Grando S., Velasco R.,
Seemüller E. (2007): Breeding of apple rootstocks resistant to ―Candidatus
Phytoplasma mali‖. Bulletin of Insectology, 60(2): 299-300.
128. Jiang, Y.P., Lei, J.D., and Chen, T.A. (1988): Purification of aster
yellows agent from diseased lettuce using afinity chromatography .
Phytopathology 78, 828-831.
129. Jiang, Y.P., Chen, T.A., Chiykowski, L.N., and Sinha, R.C. (1989):
Production of monoclonal antibodies to peach eastem X-disease agent and
their use in disease detection. Cm. J. Plant Pathol. 1 1, 325-33 1.
130. Junquera A. Bedendo I., Pascholati S. (2004): Biochemical changes in
cron plants infected by the maize bushy stunt phytoplasmas. Physiological
Molecular Plant Pathology, 65:181-185.
131. Kakizawa S., Oshima K., Kuboyama T., Nishigawa H., Jung
H.Y.,Sawayanagi T., Tsuchizaki T., Miyata S., Ugaki M., Namba S. (2001):
Cloning and expression analysis of phytoplasma protein translocation genes.
Molecular Plant Microbe Interactions, 14: 1043–1050.
132. Kawakita H., Saiki T., Wei W., Mitsuhasi W., Watanabe K., Sato M.
(2000): Identification of mulberry dwarf phytoplasmas in genital organs and
eggs of the leafhopper Hishimonoides sellatiformis. Phytopathology, 90: 909-
914.
133. Khan A.J., Botti S., Paltrinieri S., Al-Subhi A.M., Bertaccini A.
(2002a): Phytoplasmas in alfalfa seedlings: infected or contaminated seeds?
IOM, Vienna, July 07-12 2002: 6.
134. Kirkpatrick, B.C., and Garrot, D.G. (1984): Detection of western X-
disease mycoplasma-like organisms by enzyme-linked irnmunosorbent assay.
Phytopathology 74.825.
135. Kirkpatrick, B. C., Stenger, D.C., Morris, TJ., and Purcell, A.H.
(1987): Cloning and detection of DNA from a nonculnirable plant pathogenic
mycoplasmalike organisms. Science, 238, 197-200.
136. Kirkpatrick, B.C., Fisher, GA., Fraser, J.D., and Purceli, A.H. (1990):
Epidemiological and phylogenetic studies on westem X-disease
mycoplasmalike organisms. Zentralbl. Baktenol. Suppl. 20,288-297.
137. Kirkpatrick, and B. B. Sears. (1993): Oral verviews on the general
status of the classification of uncultivable phytopathogenic mycoplasmalike
organisms (MLOs). International Journal of Systematic Bacteriology
International Union of Microbiological Societies.p. 394-397.
138. Kison H., Kirkpatrick B.C., Seemüller E. (1997): Genetic comparison
of the peach yellow leaf roll agent with European fruit tree phytoplasmas of
the apple proliferation group. Plant Pathology, 46: 538-544.
139. Kison H, Seemüller E. (2001): Differences in strain virulence of the
European stone fruit yellows phytoplasma and susceptibility of stone fruit
trees on various rootstocks to this pathogen. Journal of Phytopathology, 149:
533-541.
140. Kleppe, K, Ohtsuka, E., Kleppe, R., Moiineux, I., and Khorana, H.G.
(1971): Studies on polynucleotides: repair replication of short synthetic DNAs
as catalyzed by DNA polyrnerases. J. Mol. Biol. 56,341-361.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
113
141. Kollar, A., Seernüller, E., Bonnet, F., Saiilard, Ce, and Bové, J.M.
(1990): Isolation of the DNA of various plant pathogenic mycoplasmalike
organisms from infected plants. Phytopathology 80,233-237.
142. Kube M., et al. (2008): The linear chromosome of the plant-pathogenic
mycoplasma ―Candidatus Phytoplasma mali‖. BMC Genomics 9:306.
143. Kunze, L. (1989): Apple proliferation. Pages 99-113 in: Virus and
Viruslike Diseases of Pome Fruits and Simulating Noninfectious Disorders. P
R. Fridlund, ed. Cooperative Extension College of Agriculture and Horne
Economics, Washington State University, Pullmann, WA, USA.
144. Kuske, CR., Kirkpatrick, B.C., and Seemüller, E. (199la):
Differentiation of virescence MLOs using westem aster yellows mycoplasma-
like organism chromosomal DNA probes and restriction fiagrnent length
polymorphism analysis. J. Gen. Microbiol. 137,153-159.
145. Kuske, CR., Kirkpatrick, B.C., Davis, J.M., and Seemüller, E. (199lb):
DNA hybridization between westem aster yellows mycoplasma-like organisrn
plasmids and extrachromosomal DNA from other plant pathogenic
mycoplasma-like organisms. Mol. Plant-Microbe Interact. 4,75-80.
146. Laimer M., Bertaccini A. (2008): European stone fruit yellows. In:
Harrison N.A, Rao G.P., Marcone C. (eds.). Characterization, Diagnosis and
Management of Phytoplasmas, pp. 73-92. Studium Press, LLC, Houston,
Texas, USA.
147. Le Gall F., Bové J.M., Garnier M. (1998): Engineering of a single-
chain variable-fragment (scFv) antibody specific for the stolbur phytoplasma
(mollicute) and its expression in Escherichia coli and tobacco plants. Applied
and Environmental Microbiology, 64: 4566-4572.
148. Lee, 1.-M., Davis, R.E., and DeWitt, N.D. (1988a): Molecular cloning
and screening by a new method for DNA fragments from elm yellows (EY)
and tomato big bud (BB) mycoplasmalike organisms (MLOs). Phytopathology
78, 1602.
149. Lee, LM., and Davis, R.E. (1988): Detection and investigation of
genetic relatedness among aster yelIows and other rnycoplasmalike organisms
by using cloned DNA and RNA probes. Mol. Plant-Microbe Interact. 1, 303-
310.
150. Lee, 1.-M., Davis, R.E., Hammond, R., and Kirkpatrick, B.C. (1988b):
Cloned riboprobe for detection of a mycoplasmalike organism (MLO).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 155, 443-448.
151. Lee, 1.-M., Davis, RE., and De Witt, N.D. (1990a): Nonradioactive
screening method for isolation of disease-specific probes to diagnose plant
disease caused by mycoplasrnalike organisms. Appl. Environ. Microbiol. 56,
1471-1475.
152. Lee, 1.-M., Davis, R.E., and Hiniki, C. (1990b): Beet leaf-hopper
transmitted virescent and clover proliferation mycoplasmalike organisms
(MLOs): two distinct strain types. Phytopathology 80,958.
153. Lee, 1.-M., Davis, RE., and Eruki, C. (1991a): Genetic relatedness
among clover proliferation mycoplasmalike organisms (MLOs) and other
MLOs investigated by nucleic acid hybridization and restriction fragment
length polymorphism analyses. Appl. Environ. Microbiol. 57, 3565-3569.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
114
154. Lee, 1.-M., Gundersen D.E., Davis, R.E., and Chiykowski, L.N.
(1991b): Peach Xdisease mycoplasmalike organisrn (MLO) genomic strain
cluster. Phytopathology 81, 1169.
155. Lee, I.-M., and Davis, RE. (1992): Mycoplasmas which infect plants
and insects. In: Mycoplasrnas: Molecular Biology and Pathogenesis, p. 379-
390. J. Manilaff, R.N. McElhaney, L.R. Rinch, and J.B. Baseman (ed.),
American Society for Microbiology, Washington, D.C.
156. Lee, LM., Davis, RE., Sinclair, W.A., DeWitt, ND., and Conti, M.
(1993a): Genetic relatedness of mycoplasmalike organisms detected in (IImus
spp. in USA and Italy by means of DNA probes and polymerase chain
reaction. Phytopathology 83, 829-833.
157. Lee, LM., Hammond, R.W., Davis, R.E., and Gundersen, D.E.
(1993b): Universal amplification and analysis of pathogen 16s rDNA for
classification and identification mycoplasmalike organisrns. Phytopathology
83, 834-842.
158. Lee, 1.-M., Gundersen, D.E., Hammond, R.W., and Davis R.E. (1994):
Use of mycoplasmaiike organisrn (MLO) group-specific oligonucleotide
primers for nested-PCR assays to detect mixed-ML0 infections in a single host
plant. Phytopathology 84,559-566.
159. Lee I.-M., Klopmeyer M., Bartoszyk I.M., Gundersen-Rindal D.E.,
Chou T., Thomson K.L., Eisenreich R. (1997a): Phytoplasma induced free-
branching in commercial poinsettia cultivars. Nature Biotechnology, 15: 178-
182.
160. Lee I-M et al., (1998): Revised classification scheme of phytoplasmas
based an RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequences.
Int J Syst Bacteriol 48:1153–1169.
161. Lee, I. M., Gundersen-Rindal, D. E., Davis, R. E. (2000):
Phytoplasma: Phytopathogenic Mollicutes. Annual Review of Microbiology
54, 221-255.
162. Lee I-M, Zhao Y, Davis RE. (2010): Prospects of multiple gene-based
systems for differentiation and classification of phytoplasmas. In: Weintraub
PG, Jones P (eds). Phytoplasmas: genomes, plant hosts and vectors. CAB
International, Wallingford, pp 51–63.
163. Lherminier, J., Terwisscha Van Scheltinga, T., Boudon-Padieu, E., and
Caudwell, A. (1989): Rapid immunofluorescent detection of the grapevine
flavescence doree mycoplasmalike organisrn in the salivary glands of the
leafhopper Euscelidius variegatus KBM. Phytopathol. 2. 125,353-360.
164. Lim, P.O., and Sears, B.B. (1989): 16s rRNA sequence indicates that
plant-pathogenic mycoplasmalike organisrns are evolutionarily distinct fiom
animal mycoplasmas. J. Bacteriol. 17 1,590 1-5906.
165. Lim, P.O., and Sears, BB. (1991): The genome size of a plant-
pathogenic mycoplasmalike organism resembles those of animal
mycoplasmas. J. Bacteriol. 173,2128-2130.
166. Lin, C.P., and Chen, T.A. (1985a): Monoclonal antibodies against corn
stunt spiroplasma. Cm J. Microbiol. 3 1,900-904.
167. Lin, C.P., and Chen, T.A. (1985b): Monoclonal antibodies against the
aster yellows agent. Science 227, 1233- 1235.
168. Lin, C.P., and Chen, T.A. (1985c): Production of monoclonal
antibodies against ―Spiroplasma citri”. Phytopathology 75,848-85 1.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
115
169. Lin, C.P., and Chen, T.A. (1986): Comparison of monoclonal
antibodies and polyclonal antibodies in detection of the aster yellows
mycoplasmalike organism. Phytopathology 76,45-50.
170. Lin, NS., Hsu, Y.E., and Hsu, H.T. (1990): Lmmunological detection
of plant viruses and a mycoplasma-like organism by direct tissue blotting on
nitrocellulose membranes. Phytopathology 80,824-828.
171. Liu W-T et al., (1997): Characterization of microbial diversity by
determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes
encoding 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 63:4516–4522.
172. Loi N., Carraro L., Musetti R., Firrao G., Osler R. (1995): Apple
proliferation epidemics detected in scab-resistant apple trees. Journal of
Phytopathology, 143: 581-584.
173. Lorenz K.-H., Dosba F., Poggi Pollini C., Llácer G., Seemüller E.
(1994): Phytoplasma diseases of Prunus species in Europe are caused by
genetically similar organisms. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und
Pflanzenschutz 101: 567-575.
174. Lorenz, K. H.; Schneider, B.; Ahrens, U.; Seemuller, E. (1995):
Detection of the apple proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR
amplification of ribosomal and non-ribosomal DNA . Phytopathology 85, 771-
776 .
175. Maixner M. (2010): Phytoplasmas epidemiological systems with
multiple plant hosts. In: Phytoplasmas: Genomes, Plant Hosts and Vectors
(P.G. Weintraub, P. Jones, ed.), CABI Publishing, Wallingford, UK, 213‒232.
176. Martini M. and I. Lee. (2013): PCR and RFLP Analyses Based on the
Ribosomal Protein Operon. In: Dickinson M., Hodgetts J., editors. Methods in
molecular biology 938 springer protocols, phytoplasma methods and
protocols. Nottingham, Springer New York Heidelberg Dordrecht
London.p173-175.
177. Marcone C., Ragozzino A., Del Serrone P., Aloj B., Barba M.,
Seemüller E. (1996a): Detection of apple proliferation and pear decline in
Southern Italy. Petria, 6: 149-157.
178. Marcone C., Ragozzino A., Seemüller E. (1996b): Association of
phytoplasmas with the decline of European hazel in southern Italy. Plant
Pathology, 45: 857-863.
179. Marcone C., Hergenhahn F., Ragozzino A., Seemüller E. (1999a):
Dodder transmission of pear decline, European stone fruit yellows, rubus
stunt, picris echioides yellows and cotton phyllody phytoplasmas to
periwinkle. Journal of Phytopathology 147: 187-192.
180. Marcone C., Neimark H., Ragozzino A., Lauer U., Seemüller E.
(1999): Chromosome sizes of phytoplasmas composing major phylogenetic
groups and subgroups. Phytopathology, 89(9): 805-810.
181. Marcone C., Jarausch B., Jarausch W. (2010): ―Candidatus
Phytoplasma prunorum‖, the causal agent of European stone fruit yell.
182. Markham, P.G. and A.S. Alivizatos. (1983): The transmission of corn
stunt spiroplasma by natural and experimental vectors. In Proceedings
international maize virus disease colloq. Workshop, Gordon et al., eds. Ohio
State Univ., OARDC, Wooster, Ohio. Pp. 56-61.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
116
183. McCoy, R.E. (1983): Wall-free prokaryotes of plants and invertebrates.
In: The Prokaryotes, vol. 2, p. 2238-2246. M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Truper,
A. Bolows and HG. Schlegel (ed.), Springer-Verlag, New York Inc.
184. McCoy, R.E., CaudweU, A., Chang, CJ., Chen, T.A., Chiykowski,
L.N., Cousin, M.T., Dale de Leeuw, G.T.N., Golino, D.A., Hackett, KJ.,
Erkpatrick, B.C., Manvitz, R., Petzold, A., Shina, R.H., Sugiura, M.,
Whitcomb, R.F., Yang, I.L., Zhu, B.M., and Seemuller, E. (1989): Plant
diseases associated with mycoplasmaiike organisms. In: The Mycoplasmas,
vol. 5, p. 545-560, R.F. Whitcomb and J.G. TuUy (de.), Academic Press, New
York.
185. McGarrity, GJ., Steiner, T., and Vanaman, V. (1983): Detection of
mycoplasmal infection of ceil cultures by DNA fluorochrome staining. In:
Methods in Mycoplasmology, vol. II Diagnostic Mycoplasmology, p. 183-
190, J.G. Tully and S. Razin (ed.), Academic Press, New York.
186. Mehle N., J. Brzin J., Boben J., Hren M., Frank J., PetrovičN., Gruden
K., Dreo T., Žežlina I., Seljak G., Ravnikar M. (2007): First report of
'Candidatus Phytoplasma mali' in Prunus avium, P. armeniaca and P.
domestica. Plant Pathology, 56(4): 721.
187. Minoiu N., Craciun C. (1983): Electron microscopy detection of apple
rubbery wood pathogens and colbalt-therapy of infected fruit trees. Acta
Horticulturae, 130: 313-315.
188. Mullis, KB., Faioona, F., Scharf, SJ., Saiki, R.K., Horn, G.T.9 and
Erlich, R.A. (1986): Specific enzymatic amplification of DIVA in vitro: the
polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 5 1,263-
273.
189. Musetti R., Favali A., Pressacco L. (2000): Histopathology and
polyphenol content in plants infected by phytoplasmas. Cytobios, 102: 133-
147.
190. Musetti R., Sanita‘ Di Toppi L., Martini M., Ferrini F., Loschi A.,
Favali M.A., Osler R. (2005): Hydrogen peroxide localization and antioxidant
status in the recovery of apricot plants from European Stone Fruit Yellows.
European Journal of Plant Pathology, 112: 53-61.
191. Myrta, A.; Ermacora, P.; Stamo, B.; Osler, R. (2003): First report of
phytoplasma infections in fruit trees and grapevine in Albania. Journal of Plant
Pathology, 85(1), p 64.
192. Myrta A, Martini M, Susuri L, Susuri HS, Carraro L. (2006): First
report of apple proliferation and pear decline phytoplasmas in Kosovo. Journal
of Plant Pathology 88(1), 121-125.
193. Nicolaisen M., Nyskjold H., and A. Bertaccini. (2013): Microarrays for
Universal Detection and Identification of Phytoplasmas. In: Dickinson M.,
Hodgetts J., editors. Methods in molecular biology 938 springer protocols,
phytoplasma methods and protocols. Nottingham, Springer New York
Heidelberg Dordrecht London. p223-224.
194. Nakamura, E., Yoshikawa, N., Takahashi, T, Nahashi, N., Kubono, T.,
and Shoji, T. (1996): Evaluation of primer pairs for the reliable diagnosis of
paulownia witches' -broom disease using a polymerase chain reaction. Plant
Dis. 80, 302-305.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
117
195. Nakane, P.K., and Pierce, G.G. (1966): Enzyme-labeled antibodies:
preparation and application for the localization of antigens. J. Histochem.
Cytochem. 14,929-931.
196. Nakashima, K., Kato, S., Iwanami, S., and Murata, N. (1991): Cloning
and detection of chromosomal and extrachromosomal DNA from
mycoplasmalike organisms that cause yeilow dwarf disease of rice. Appl.
Environ. Microbiol. 57, 3570-3575.
197. Nakashima, K., Kato, S., Iwanami, S., and Murata, N. (1993): DNA
probes reveal relatedness of rice yellow dwarf mycoplasmalike organisms
(MLOs) and distinguish them from other MLOs. Appl. Environ. Microbiol.
59, 1206- 1212.
198. Namba, S., Oyaizu, H., Kato, S., Iwanami, S., and Tsuchizaki, T.
(1993b): Phylogenetic diversity of phytopathogenic mycoplasmalike
organisrns. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 46 1-467.
199. Neimark, H.C., and Kirkpatrick, B.C. (1991): Isolation and
characterization of fulllength chromosomes from non-culhirable plant-
pathogenic mycoplasma-like organisms. Mol. Microbiol. 7,2 1-28.
200. Orita M et al., (1989): Detection of polymorphisms of human DNA by
gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natl
Acad Sci USA 86:2766–2770.
201. Oshima, K., Kakizawa, S., Nishigawa, H., Jung, H. Y., Wei, W.,
Suzuki, S., Arashida, R., Nakata, D., Miyata, S., Ugaki, M., Namba, S. (2004):
Reductive evolution suggested from the complete genome sequence of a plant-
pathogenic phytoplasma. Nature Genetics 36, 27-29.
202. Oshima K, Maejima K, Namba S. (2013): Genomic and evolutionary
aspects of phytoplasmas. Front Microbiol 4:230.
203. Ploaie PG. (1981): Mycoplasmalike organisms and plant diseases in
Europe. In: Maramorosch K, Harris KF, editors. Plant Diseases and Vectors:
Ecology and Epidemiology. Academic Press. pp. 61–104.
204. Pollini, P.C., Bissani, R., Giumchedi, L., and Vindimian, E. (1996):
First report of phytoplasma infection in olive trees (Olea europea L.). J.
Phytopathol. 144, 109-Ill.
205. Ponnuswami V., Irulappan I. (1993): Genetic assessment of resistance
in egg plant inter varietal crosses to little leaf disease. South Indian
Horticulture, 41: 179-181.
206. Pracros P., Renaudin J., Eveillard S., Mouras A., Hernould M. (2006):
Tomato flower abnormalities induced by stolbur phytoplasma infection are
associated with changes of expression of floral development genes. Molecular
Plant-microbe Interactions, 19(1): 62-68.
207. Purcell, A.R. (1982): Insect vector relationships with prokaryotic plant
pathogens. Ann. Rev. Phytopathol. 20,397-4 17.
208. Ravnik-Glavač M, Glavač D, Dean M. (1994): Sensitivity of single-
strand conformation polymorphism and heteroduplex method for mutation
detection in the cystic fibrosis gene. Hum Mol Genet 3:801–807.
209. Rui D. (1950): Una malattia inedita: la virosi a scopazzi del melo.
Humus, 6(11): 7-10.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
118
210. Rumbos, I.C.; Bosabalidis, A.M. (1985): Mycoplasma-like organisms
associated with declined plum trees in Greece. Zeitschrift für
Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz 92, 47-54. As plum decline.
211. Rumbou A, Adamopoulos I, Schneider B, Kube M, Rumbos I. (2011):
Diversity of phytoplasma population causing small fruiting in the apple
orchards of the Pelion mountain (Greece). Phytopathogenic Mollicutes 1(1),
21-25.
212. Russel, W.C., Newman, C., and Willianmson, D.H. (1975): A simple
cytochemical technique for demonstration of DNA in cells infected with
mycoplasrnas and viruses. Nature 253,46 1-462.
213. Saiki, RD., Scharf, S., Saloona, F., Mullis, K., Horn, G., Erlich, HA.,
and Arnheim, N. (1985): Enzymatic amplification of -globin genomic
sequences and restriction site analy sis for diagnosis of sicMe ce11 anemia.
Science 230, 1350-1354.
214. Saiki, R.K., Bugawan, T.L., Horn, G.T., Mullis, KB., and Erlich, H.A.
(1986): Analysis of enzymatically amplified -globin and HLA-DQ DNA
with allelespecific oligonucleotide probes. Nature (Lond.) 324, 163- 166.
215. Sambrook J, Fritschi EF and Maniatis T. (1989): Molecular cloning: a
laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
216. Sawayanagi, T., Horikoshi, N., Kanehira, T., Shinohara, M.,
Bertaccini. A., Cousin, M.-T., Hiruki, C., Namba, S. (1999): ‗Candidatus
Phytoplasma japonicum‘, a new phytoplasma taxon associated with Japanese
Hydrangea phyllody. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 1275-1285.
217. Schaff, D.A., Lee, LM., and Davis, R.E. (1992): Sensitive detection
and identification of mycoplasmalike organisms by polymerase chah reaction.
Biochem. Biophys. Res. Comm 186, 1503-1509.
218. Schneider, B., Ahrens, U, Kirkpatrick, B.C., and Seemüller, E. (1993):
Classification of plant-pathogenic mycoplasmalike organisms using
restriction-site analysis of PCR-amplified 16s rDNA. J. Gen. Microbiol.
137,219-527.
219. Schwartz, Y., Boudon-Padieu, E., Grange, J., Meignoz, R., and
Caudwell, A. (1989): Monoclonal antibodies to the mycoplasmalike organism
(MLO) responsible for grapevine fiavescence doree. Res. Microbiol. 140,3 1
1-324.
220. Scot C. Nelson and Brian C. Bushe. (2006): Soil and Crop
Management. July SCM-14 UH-CTAHR. Collecting Plant and Insect Samples
for Problem Diagnosis SCM-14.
221. Sears, B.B., Lim, P.-O., Holland, N., Kirkpatrick, B.C., and
Klomparens, K.L. (1989): Isolation and characterization of DNA from a
mycoplasmalike organism. Mol. Plant-Microbe Interact. 2, 175- 180.
222. Sears, B.B., and Kirkpatrick, B.C. (1994): Unveiling the evolutionary
relationships of plant pathogenic mycoplasmalike organisrns. Amer. Soc.
Microbiol. News 60, 307- 3 12.
223. Seemüller, E. (1976): Fluoreszenzoptischer direktnachweis von
mycoplasmaahnlichen organism in phloem peu-decline-und triebsuchtkranker
bukme? Phytopathol. 2.85, 368-372.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
119
224. Seemüller E. Kunze L., Schaper U. (1984a): Colonization behavoir of
MLO and symptom expression of proliferation in dieased apple trees and
decline-diseased pear trees over a period of several years. Journal of Plant
Disease Protection, 91: 525-532.
225. Seemüller E., Schaper U., Zimbelmann F. (1984b): Seasonal variations
in the colonization patterns of mycoplasma-like organisms associated with
apple proliferation and pear decline. Z. Pflanzenkrankeiten Pflanzenschutz,
91: 371-382.
226. Seemüller E., Kartte S., Kunze L. (1992): Resistance in established and
experimental apple rootstocks to apple proliferation disease. Acta
Horticulturae, 203: 245-251.
227. Seemüller, E., Schneider, B., Maurer, R, Ahrens, U., Daire, Xe, Kison,
H., Lorenz, K-H. Firrao, G., Avinent, Le, Sears, B.B., and Stackebrandt, E.
(1994): Phylogenetic classification of phytopathogenic mollicutes by sequence
analysis of 16s ribosomal DNA. Int. J. Syst. Bacteriol. 44,440-446.
228. Seemüller E., Foster A. (1995): European stone fruit yellows. In:
Ogawa J.M., Zehr E.I., Bird G.W., Ritchie D.F., Uriu K., Uyemoto J.K. (eds.).
Compendium of Stone Fruit Diseases, pp. 59-60. APS Press, St. Paul, MN,
USA.
229. Seemüller E., Marcone C., Lauer U., Ragozzino A., Göschl M.
(1998a): Current status of molecular classification of the phytoplasmas.
Journal of Plant Pathology, 80(1): 3-26.
230. Seemüller, E., Stolz, E., Kison, H. (1998b): Persistence of European
stone fruit yellows phytoplasma in aerial parts of Prunus taxa during the
dormant season. Journal of Phytopathology, 146: 407–410.
231. Seemüller E., Lorenz K.H., Lauer U. (1998c): Pear decline resistance
in Pyrus communis rootstocks and progenies of wild and ornamental Pyrus
taxa. Acta Horticulturae, 472:681-691.
232. Seemüller E., Schneider B. (2004): “Candidatus Phytoplasma mali‖,
“Candidatus Phytoplasma pyri‖ and ―Candidatus Phytoplasma prunorum‖,
the causal agents of apple proliferation, pear decline and European stone fruit
yellows, respectively. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 54: 1217-1226.
233. Seemüller E., Moll E., Schneider B. (2007): Malus sieboldii-based
rootstocks mediate apple proliferation resistance to grafted trees. Bulletin of
Insectology, 60(2): 301-302.
234. Sertkaya G., Martini M., Ermacora P., Musetti R., Osler R. (2005):
Detection and characterization of phytoplasmas in diseased stone fruits and
pear by PCR-RFLP analysis in Turkey. Phytoparasitica 33: 380-390.
235. Sertkaya G, Martini M, Osler R. (2008): First report of Candidatus
Phytoplasma mali in Turkey. Journal of Plant Pathology 90(1), p 143.
236. Shaw, K.J., P.N. Rather, R.S. Hare, and G.H. Miller. (1993):
Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial
relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbiol. Rev.
57:138-163. Review.
237. Shen, W.C., and Lin, C.P. (1993): Production of monoclonal
antibodies against a mycoplasmalike organism associated with sweetpotato
witchesT-broom. Phytopathology, 83,67 1-675.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
120
238. Sinclair W.A., Griffiths H.M., Davis R.E. (1996): Ash yellows and
lilac witches'-broom: phytoplasmal diseases of concern in forestry and
horticulture. Plant Disease, 80: 468-475.
239. Sinclair W.A., Griffiths H.M., Whitlow T.H. (1997a): Comparisons of
tolerance of ash yellows phytoplasmas in Fraxinus species and rootstock-scion
combinations. Plant Disease, 81:395-398.
240. Sinclair W.A., Whitlow T.H., Griffiths H.M. (1997b): Heritable
tolerance of ash yellows phytoplasmas in green ash. Canadian Journal of
Forest Research, 27: 1928-1935.
241. Sinha, R.C., and Chiykowski, L.N. (1967): Initial and subsequent sites
of aster yellows vhs infection in a leafhopper vector. Virology 33,702-708.
242. Sinha, R.C. (1974): Purification of mycoplasma-like organisms from
China aster plants infected with clover phyllody. Phytopathology 64, 1156-1
158.
243. Sinha, R.C., and Benhamou, N. (1983): Detection of mycoplasrnalike
organisms antigens from aster yellows-diseased plants by two serological
procedures. Phytopathology 73, 1 199-1202.
244. Sinha, R.C., and Chiykowski, L.N. (1984): Purification and serological
detection of mycoplasmalike organism from plants afT'ected by peach eastem
X-disease. Can. J. Plant Pathol. 6,200-205.
245. Sinha, RC. (1988): Serological detection of mycoplasmalike organisas
from plants affected with yellows diseases. In: Tree Mycoplasrnas and
Mycoplasma Diseases, p. 143-156, C. Hiniki (ed), University of Alberta Press,
Edmonton, Alberta, Canada.
246. Sinha, R.C., and Chiykowski, L.N. (1990): Serological detection of
MLOs in plants and vector leafhoppers using polyclonal antibodies. Zentralbl.
Bakteriol. Suppl. 20, 276-279.
247. Smart C.D., Schneider B., Blomquist C.L., Guerra L.J., Harrison N.A.,
Ahrens U., Lorenz K.H., Seemüller E., Kirkpatrick B.C. (1996): Phytoplasma-
specific PCR primers based on sequences of 16S rRNA spacer region. Applied
Environmental Microbiology, 62: 2988-3033.
248. Soufi, Z. (2012): Molecular detection and identification of
phytoplasmas in sugarcane in Hawaii, Thailand, Cuba and Near East. Ph.D.
Thesis. University of Bayreuth, Germany.
249. Steffeck R, Follak S, Sauvion N, Labonne G, MacLeod A. (2012):
Distribution of ‗Candidatus Phytoplasma prunorum‘ and its vector Cacopsylla
pruni in European fruit-growing areas: a review. Bulletin OEPP/EPPO
Bulletin 42(2), 191-202. 250. Steiner, T., McGarrity, GJ.,and Phillips, D.M. (1982): Cultivation and
partial characterization of spiroplasmas in cell cultures. Intect. Immunity 35,
296-304.
251. Steiner, T., McGamty, G.T., Bové, J.M., Phillips, D.M., and Garnier,
M. (1983): Insect cell cultures in the study of attachrnent and pathogenicity of
spiroplasmas and mycoplasmas. Ann. Microbil. (Inst. Pasteur) 135A: 47-53.
252. Streten C, Conde B, Herrington M, Moulden J, Gibb K. (2005a):
Candidatus Phytoplasma australiense is associated with pumpkinyellow leaf
curl disease in Queensland, Western Australia and the Northern Territory.
Australasian Plant Pathology 34, 103–105.doi: 10.1071/AP04077
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
121
253. Susuri L.R., and Myrta A.G. (2012): Diseases of fruit trees and
grapevine. p147-156.
254. Suzuki, S., Oshima, K., Kakizawa, S., Arashida, R., Jung, H. Y.,
Yamaji, Y., Nishigawa, H., Ugaki, M., Namba, S. (2006): Interaction between
the membrane protein of a pathogen and insect microfilament complex
determines insect-vector specificity. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 103, 4252-4257.
255. Syrgianidis, G. D. (1989): Acta Horticulturae No. 235, 21-25.
256. Tedeschi R, Bosco D, Alma A. (2002): Population dynamics of
Cacopsylla melanoneura (Homoptera: Psyllidae), a vector of apple
proliferation phytoplasma in northwestern Italy. Journal of Economic
Entomology, 95: 544-551.
257. Tedeschi R., Alma A. (2006): Fieberiella florii (Homoptera:
Auchenorrhynca) as a vector of ―Candidatus Phytoplasma mali‖. Plant
Disease, 90: 284-290.
258. Teixeira D.C., Wulff N.A., Martins E.C., Kitajima E.W., Bassanezi R.,
Ayres A.J., Eveillard S., Saillard C., Bové J.M. (2009): A phytoplasma related
to ―Candidatus Phytoplasma asteri‖ detected in citrus showing huanglongbing
(yellow shoot disease) symptoms in Guangdong, P. R. China. Phytopathology,
99(3): 236-242.
259. Thomas P.E., Hassan S. (1992): Apparent immunity and tolerance to
tomato big bud disease in Lycopersicon peruvianum and in two of its tomato
hybrids. Plant Disease, 76: 139-141.
260. Thomas P.E., Mink G.I. (1998): Tomato hybrids with nonspecific
immunity to viral and mycoplasma pathogens of potato and tomato.
Hortscience, 33: 764-765.
261. Topchiiska M., Marcone C., Seemüller E. (2000): Detection of pear
decline and European stone fruit yellows in Bulgaria. Zeitschrift für
Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz 107 (6): 658-663.
262. Tran-Nguyen LTT et al., (2008): Comparative genome analysis of ‗
Candidatus Phytoplasma australiense‘ (subgroup tuf Australia I; rp-A) and
―Ca. Phytoplasma asteris‖ strains OY-M and AY-WB. J Bacteriol 190:3979–
3991.
263. Wang, K., Zhong, Q., Khadhair, A.H., and Hiruki, C. (1994): DNA
amplification based on polymerase chah reaction for the sensitive detection of
the mycoplasmalike organism associated with paulownia witches'-broom. Pro.
Japan. Acad. 70B, 87-91.
264. Wang, K. (1997): Molecular Detection and Identification of
Phytoplasmas and Establishment of Phytoplama-free Clonal Plants. Master of
Science Degree. University of Alberta. Edmonton, Canada.
265. Waters, H., and Hunt, P. (1980): The in vivo three-dimensional form of
a plant mycoplasmaiike organism by the analysis of senal uItrathin sections. J.
Gen. Microbiol. 116, 11 1-131.
266. Wei W. et al., (2007): Computer-simulated RFLP analysis of 16S
rRNA genes: identification of ten new phytoplasma groups. Int J Syst Evol
Microbiol 57:1855–1867.
267. Wei W. et al., (2008): Automated RFLP pattern comparison and
similarity coefficient calculation for rapid delineation of new and distinct
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
122
phytoplasma 16Sr subgroup lineages. Int J Syst Evol Microbiol 58:2368–
2377.
268. Weintraub PG, Beanland LeA. (2006): Insect vectors of phytoplasmas.
Annu Rev Entomol 51:91–111.
269. Welliver, R. (1999): Diseases caused by phytoplasmas. Plant
Pathology Circular No. 82
270. Wolanki, B., and Maramoroseh, IC. (1970): Negatively stained
rnycoplasmas: fact or artifact? Virology 42, 319-327.
271. Yoshikawa, N., Nakamura, H., Sahashi, N., Kubono, T., Katsube, K,
Shoji, T., and Takahashi, T. (1994): Amplification and nucleotide sequences
of ribosomal protein and 16s rRNA genes of mycoplasma-like organism
associated with paulownia witches‘-broom. Ann. Phytopathol. Soc. Japan 60,
569-575.
272. Zhong, Q., and Hiruki, C. (1994): Genetic differentiation of
phytoplasma isolates determined by a DNA heteroduplex mobility assay. Proc.
Japan. Acad. 70B, 127- 131.
273. Zirak L, Bahar M, Ahoonmanesh A. (2009): Characterization of
phytoplasmas associated with almond diseases in Iran. Journal of
Phytopathology 157(11-12), 736-741.
274. Zreik L., Carle P., Bové J.M., Garnier M. (1995): Characterization of
the mycoplasmalike organism associated with witches'-broom disease of lime
and proposition of a Candidatus taxon for the organism, ―Candidatus
Phytoplasma aurantifolia‖. International Journal of Systematic Bacterology.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
123
SHTOJCA
I. Metoda e ngjyrimit DAPI
Materialet:
1. Material bimor (p.sh gjethe me bisht).
2. Buferi KH2PO4, 0,1 M, pH 6,8; Shtojmë 6,8 g KH2PO4 në 500 ml H2O të
distiluar. E përziejmë me 7 rpm për 10 min. Shtojmë 1,16 g NaOH në 200 ml
H2O të distiluar dhe e përziejmë me 7 rpm për 10 min. Rregullojmë pH e
solucionit në pH=6,8 duke shtuar solucion NaOH.
3. Buferi KH2PO4, 0,1 M, pH 6,9; Shtojmë 6,8 g KH2PO4 në 500 ml H2O të
distiluar. E përziejmë me 7 rpm për 10 min. Shtojmë 1,16 g NaOH në 200 ml
ujë të distiluar dhe e rrotullojmë me 7 rpm për 10 min. Rregullojmë pH e
solucionit në pH=6,9 duke shtuar solucion NaOH.
4. Glutaraldehid (solucion 5%): 5 ml glutaraldehid, 95 ml 0,1 M bufer KH2PO4
pH 6,8.
5. Ngjyrues DAPI (4‘,6-diamidino-2fenilindole dihidroklorid) (1,000x solucioni
stok); shtojmë 1 mg në 1 ml H2O të distiluar. E rruajmë në 4C nëse nuk
përdoret menjëherë.
6. Ujë i distiluar steril
7. Mikrotom ose bisturi
8. Mikroskop me fluoreshencë
9. Peshore elektronike
10. Balona konike (1,000 ml)
11. Qese plastike
12. Pipeta të shkallëzuara (5 dhe 10 ml)
13. Mikropipeta (100 ml)
14. Lama dhe lamela
15. Piskatore
II. Metoda e ekstraktimit të ADN-së
Materialet:
1. Materiali bimor i freskët
2. Peshore e thjeshtë
3. Peshore elektronike
4. Havan
5. Rërë kuarci
6. Bufer ekstraktimi MLO
7. Bufer CTAB
8. Kloroform/izoamilalkool (24:1)
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
124
9. ETOH 100% (-20C)
10. ETOH 70% (-20C)
11. Tuba falkon 15 ml
12. Tuba 1,5 dhe 2ml
13. Mikropipeta
14. Ujë i bidistiluar (ddH2O)
15. Izpropanol (-20C)
16. RNA-zë
17. TE
18. Mikrocentrifugë
19. Centrifugë me ftohje
20. Banjomari
21. Termostat
22. Vorteks
23. pH metër
24. Erlenmayer
25. Gota kimike
Tabela 1 Protokolli i përgatitjes së buferit MLO.
(Buferi në formë stoku (pa PVPP) mund të ruhet ne 4 ose -20C. Përpara përdorimit
shtohet PVPP dhe rregullohet pH në 7.6 me NaOH 1M)
Tabela 2 Protokolli i përgatitjes së buferit CTAB
Bufer CTAB 2% 1L
NaCl 1.4M
MkaptoEtOH 0.2 %
EDTA 20mM
Tris-Hcl 100mM
dH2O steril Deri në 1L
pH 8
Bufer MLO 1L
K2HPO4 3H2O 28.5 g
Ac.Ascorbik 5.28 g
Sukrozë 100 g
BSA 1.5 g
PVPP* 20 g
dH2O steril Deri në 1l
pH 7.6
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
125
Tabela 3 Protokolli i PCR
Mastermix 1x 40 µl Mastermix 31x 1180 µl
Buffer 10x 4 µl Buffer 10x 124 µl
dNTPs 0.4 µl dNTPs 12.4 µl
P1 2 µl P1 62 µl
P2 2 µl P2 62 µl
Taq pol 0.5 µl Taq pol 15.5 µl
MgCl2 4 µl MgCl2 124 µl
ADN 2 µl ADN 2λ *për çdo tub
ddH2O 25.1 µl ddH2O 778.1 µl
Tabela 4 Kategoritë e mostrave të përdorura për shumëfishimin nëpërmjet PCR, cilësia dhe
sasia e secilës prej tyre.
Nr Plantacioni Kategoria Druri Cilësia
OD 260/ OD 268
Sasia
(µg)
1. Korçë Kërcell 1 2 130
2. Korçë Kërcell 4 1.8 90
3. Korçë Kërcell 7 1.7 170
4. Korçë Kërcell 9 1.62 130
5. Korçë Rrënjë 6 1.8 160
6. Korçë Trung 6 2 100
7. Korçë Trung 8 1.7 220
8. Korçë Trung 10 2 120
9. Korçë Gjethe 1 2 200
10. Korçë Gjethe 2 1.8 90
11. Korçë Gjethe 7 1.8 110
12. Korçë Gjethe 10 2 400
13. Turan Kërcell 2 1.75 70
14. Turan Kërcell 3 1.69 220
15. Turan Kërcell 6 1.66 100
16. Turan Gjethe 4 1.7 410
17. Turan Gjethe 4‘ 1.67 150
18. Turan Gjethe 6 1.9 230
19. Turan Gjethe 8‘ 1.76 530
20. Bitinckë Kërcell 1 2 80
21. Bitinckë Kërcell 9 1.7 520
22. Bitinckë Gjethe 3‘ 1.66 250
23. Bitinckë Gjethe 4‘ 2 100
24. Dvoran Trung 1‘ 2 120
25. Dvoran Gjethe 8 1.62 470
26. Cangonj Gjethe 4‘ 1.6 210
27. Cangonj Gjethe 5 2 400
28. Cangonj Gjethe 9 1.6 260
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
126
Përgatitja e xhelit agarozë 1,5%
2.4g Agarozë + 160ml TAE (1x)
EtBr; 0.5 μL nga stoku 10 mg/mL; sasia e duhur: 8 µl
Përgatitja e mostrave për elektroforezë
Volumi total 55 µl; 40 µl + 15 µl loading buffer
Përgatitja e markerave
Marker; 0.5 µl nga stoku 500 µg/ml
Markeri 100bp; 1µl marker, 10 µl loading buffer, 5 µl H2O
Markeri 1kbp; 1µl marker, 10 µl loading buffer, 5 µl H2O
Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Bitinckë
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Trung 0.038 1.31 0.029 380
2 Trung 0.023 1.21 0.019 230
3 Trung 0.025 1.09 0.023 250
4 Trung 0.023 0.96 0.024 230
5 Trung 0.024 0.92 0.026 240
6 Trung 0.029 1.38 0.021 290
7 Trung 0.022 1.05 0.021 220
8 Trung 0.035 1.3 0.027 350
9 Trung 0.034 1.26 0.027 340
10 Trung 0.036 1.06 0.034 360
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Trung 0 0 0 0
2‘ Trung 0 0 0 0
3‘ Trung 0 0 0 0
4‘ Trung 0.034 1.31 0.026 340
5‘ Trung 0.021 1.23 0.017 210
6‘ Trung 0.016 1.14 0.014 160
7‘ Trung 0.051 1.21 0.042 510
8‘ Trung 0.03 1.2 0.025 300
9‘ Trung 0.02 1.25 0.016 200
10‘ Trung 0.026 1.24 0.021 260
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Kërcell 0.008 2 0.004 80
2 Kërcell 0.006 1.5 0.004 60
3 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40
4 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40
5 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40
6 Kërcell 0.003 1.5 0.002 30
7 Kërcell 0.025 1.4 0.018 250
8 Kërcell 0.017 1.13 0.015 140
9 Kërcell 0.052 1.7 0.031 520
10 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
127
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Rrënjë 0.022 1.22 0.018 220
2 Rrënjë 0.043 1.23 0.035 430
3 Rrënjë 0.025 1.14 0.022 250
4 Rrënjë 0.033 1.22 0.027 330
5 Rrënjë 0.03 1.2 0.025 300
6 Rrënjë 0.022 1.22 0.018 220
7 Rrënjë 0.041 1.14 0.036 410
8 Rrënjë 0.034 1.26 0.027 340
9 Rrënjë 0.026 1.3 0.02 260
10 Rrënjë 0.024 1.14 0.021 240
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Rrënjë 0.017 1.3 0.013 170
2‘ Rrënjë 0.02 1.18 0.017 200
3‘ Rrënjë 0.022 1.16 0.019 220
4‘ Rrënjë 0.023 1.15 0.02 230
5‘ Rrënjë 0.025 1.19 0.021 250
6‘ Rrënjë 0.033 1.38 0.024 330
7‘ Rrënjë 0.028 1.12 0.025 280
8‘ Rrënjë 0.022 1.3 0.017 220
9‘ Rrënjë 0.029 1.32 0.022 290
10‘ Rrënjë 0.026 1.3 0.02 260
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Gjethe 0 0 0 0
2 Gjethe 0.005 5 0.001 50
3 Gjethe 0.022 1.5 0.015 220
4 Gjethe 0.009 0 0 90
5 Gjethe 0.005 0 0 50
6 Gjethe 0.006 0 0 60
7 Gjethe 0.002 0 0 20
8 Gjethe 0.028 0 0 280
9 Gjethe 0.011 3.6 0.003 110
10 Gjethe 0.012 4 0.003 120
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Gjethe 0.026 1.52 0.017 260
2‘ Gjethe 0.04 4 0.01 40
3‘ Gjethe 0.025 1.66 0.015 250
4‘ Gjethe 0.010 2 0.005 100
5‘ Gjethe 0.002 0 0 20
6‘ Gjethe 0 0 0 0
7‘ Gjethe 0 0 0 0
8‘ Gjethe 0.009 0 0 90
9‘ Gjethe 0.007 2.3 0.003 70
10‘ Gjethe 0.032 3.5 0.003 320
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
128
Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Korçë
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Kërcell 0.013 2 0.006 130
2 Kërcell 0.012 1.2 0.01 120
3 Kërcell 0.009 1.5 0.006 90
4 Kërcell 0.009 1.8 0.005 90
5 Kërcell 0.018 1.2 0.015 180
6 Kërcell 0.006 1.2 0.005 60
7 Kërcell 0.017 1.7 0.01 170
8 Kërcell 0.016 1.45 0.0011 160
9 Kërcell 0.013 1.62 0.008 130
10 Kërcell 0.015 1.2 0.013 150
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Trung 0.012 1.09 0.011 120
2 Trung 0.013 0.9 0.014 130
3 Trung 0.01 1.1 0.09 100
4 Trung 0.011 1.1 0.01 110
5 Trung 0.013 0.9 0.014 130
6 Trung 0.016 0.9 0.017 160
7 Trung 0.012 0.9 0.013 120
8 Trung 0.009 0.8 0.011 90
9 Trung 0.014 0.8 0.016 140
10 Trung 0.013 1 0.013 130
Mbas ripastrimit
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Trung 0.01 1.25 0.008 100
2 Trung 0.005 1.25 0.004 50
3 Trung 0.014 1.27 0.011 140
4 Trung 0.008 1.33 0.006 80
5 Trung 0.005 1.25 0.004 50
6 Trung 0.01 2 0.005 100
7 Trung 0.01 1.42 0.007 100
8 Trung 0.022 1.7 0.013 220
9 Trung 0.003 1.5 0.002 30
10 Trung 0.012 2 0.006 120
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Rrënjë 0.016 1.06 0.015 160
2 Rrënjë 0.024 1.4 0.017 240
3 Rrënjë 0.015 1.15 0.013 150
4 Rrënjë 0.019 1.26 0.015 190
5 Rrënjë 0.022 1.15 0.019 220
6 Rrënjë 0.016 1.14 0.014 160
7 Rrënjë 0.014 1.4 0.01 140
8 Rrënjë 0.015 1.25 0.012 150
9 Rrënjë 0.019 1.26 0.015 190
10 Rrënjë 0.014 1.27 0.011 140
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
129
Mbas ripastrimit
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Rrënjë 0.009 1.3 0.007 90
2 Rrënjë 0.009 1.5 0.006 90
3 Rrënjë 0.009 1.3 0.007 90
4 Rrënjë 0.011 1.4 0.008 110
5 Rrënjë 0.003 1.5 0.002 30
6 Rrënjë 0.016 1.8 0.009 160
7 Rrënjë 0.004 1.33 0.003 40
8 Rrënjë 0.004 1.33 0.003 40
9 Rrënjë 0.014 1.3 0.011 140
10 Rrënjë 0.006 1.5 0.004 60
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Gjethe 0.002 2 0.001 200
2 Gjethe 0.009 1.8 0.005 90
3 Gjethe 0 0 0 0
4 Gjethe -0.005 0 -0.003 0
5 Gjethe 0 0 0.001 0
6 Gjethe -0.002 0 -0.001 0
7 Gjethe 0.011 1.83 0.006 110
8 Gjethe 0.014 1.4 0.01 140
9 Gjethe 0.005 0.7 0.007 50
10 Gjethe 0.04 2 0.02 400
Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Turan
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Kërcell 0.01 1.25 0.008 100
2 Kërcell 0.007 1.75 0.004 70
3 Kërcell 0.022 1.69 0.013 220
4 Kërcell 0.03 2.5 0.012 300
5 Kërcell 0.004 1 0.004 40
6 Kërcell 0.01 1.66 0.006 100
7 Kërcell 0.012 1.5 0.008 120
8 Kërcell 0.003 0.75 0.004 30
9 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40
10 Kërcell 0.014 1.55 0.009 140
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Trung 0.004 4 0.001 40
2 Trung 0.003 0.75 0.004 30
3 Trung 0.002 1 0.002 20
4 Trung 0.002 2 0.001 20
5 Trung 0.002 1 0.002 20
6 Trung 0.003 1 0.003 30
7 Trung 0.003 3 0.001 30
8 Trung 0.004 1.33 0.003 40
9 Trung 0.003 1 0.003 30
10 Trung 0.002 1 0.002 20
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
130
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Rrënjë 0.001 1 0.001 10
2 Rrënjë 0.004 1.33 0.003 40
3 Rrënjë 0.003 1 0.003 30
4 Rrënjë 0.018 1.2 0.015 180
5 Rrënjë 0.023 1 0.023 230
6 Rrënjë 0.004 1.33 0.003 40
7 Rrënjë 0.012 1.09 0.011 120
8 Rrënjë 0.002 1.1 0.018 20
9 Rrënjë 0.002 1 0.002 20
10 Rrënjë 0.013 1.08 0.012 130
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Gjethe 0.018 1.4 0.013 180
2 Gjethe 0.014 1.3 0.011 140
3 Gjethe 0.022 1.6 0.014 220
4 Gjethe 0.041 1.7 0.024 410
5 Gjethe 0.028 1.3 0.022 280
6 Gjethe 0.023 1.9 0.012 230
7 Gjethe 0.017 1.4 0.012 170
8 Gjethe 0.035 1.5 0.023 350
9 Gjethe 0.02 1.3 0.015 20
10 Gjethe 0.014 1.55 0.009 140
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Gjethe 0.02 1.3 0.015 20
2‘ Gjethe 0.023 1.2 0.019 230
3‘ Gjethe 0.033 1.3 0.026 330
4‘ Gjethe 0.015 1.67 0.009 150
5‘ Gjethe 0.015 1.5 0.01 150
6‘ Gjethe 0.025 1.5 0.017 250
7‘ Gjethe 0.016 1.3 0.012 160
8‘ Gjethe 0.053 1.76 0.03 530
9‘ Gjethe 0.023 1.2 0.02 230
10‘ Gjethe 0.014 1.3 0.011 140
Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Cangonj
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Kërcell 0.012 1 0.012 120
2 Kërcell 0.01 1 0.01 100
3 Kërcell 0.013 0.9 0.014 130
4 Kërcell 0.014 0.8 0.016 160
5 Kërcell 0 0 0 0
6 Kërcell 0.004 1 0.004 40
7 Kërcell 0.003 0.75 0.004 40
8 Kërcell 0.002 1 0.002 20
9 Kërcell 0.004 1.33 0.003 40
10 Kërcell 0.013 1.08 0.012 130
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
131
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Trung 0.02 1 0.02 200
2 Trung 0.029 1.3 0.022 290
3 Trung 0.021 1.2 0.017 210
4 Trung 0.017 1 0.017 170
5 Trung 0 0 0 0
6 Trung 0 0 0 0
7 Trung 0.028 1.1 0.025 280
8 Trung 0.02 1.2 0.017 200
9 Trung 0.007 1 0.007 70
10 Trung 0.016 1 0.016 160
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Rrënjë 0.009 0.8 0.011 90
2 Rrënjë 0.01 1 0.01 100
3 Rrënjë 0.015 1 0.015 150
4 Rrënjë 0.01 1.1 0.09 100
5 Rrënjë 0.002 1 0.002 20
6 Rrënjë 0.016 1.1 0.014 160
7 Rrënjë 0 0 0 0
8 Rrënjë 0.011 1 0.011 110
9 Rrënjë 0 0 0 0
10 Rrënjë 0.005 0.7 0.007 50
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Gjethe 0.038 3.1 0.013 380
2 Gjethe 0.005 0 0 50
3 Gjethe 0.039 1.2 0.032 390
4 Gjethe 0.007 0 0 70
5 Gjethe 0.04 2 0.02 400
6 Gjethe 0 0 0 0
7 Gjethe 0 0 0 0
8 Gjethe 0 0 0 0
9 Gjethe 0.026 1.6 0.016 260
10 Gjethe 0.021 5.2 0.004 210
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Gjethe 0.016 1 0.016 160
2‘ Gjethe 0 0 0 0
3‘ Gjethe 0.015 15 0.001 150
4‘ Gjethe 0.021 1.6 0.013 210
5‘ Gjethe 0.007 0 0 70
6‘ Gjethe 0 0 0 0
7‘ Gjethe 0 0 0 0
8‘ Gjethe 0 0 0 0
9‘ Gjethe 0.005 5 0.001 50
10‘ Gjethe 0.005 5 0.001 50
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
132
Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Dvoran
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Kërcell 0.016 1.14 0.014 160
2 Kërcell 0.012 1.2 0.01 120
3 Kërcell 0.016 1.23 0.013 160
4 Kërcell 0.016 1.33 0.012 160
5 Kërcell 0.017 1.42 0.012 170
6 Kërcell 0.019 1.12 0.017 190
7 Kërcell 0.028 1.65 0.017 280
8 Kërcell 0.316 2.32 0.136 316
9 Kërcell 0.016 1.14 0.014 160
10 Kërcell 0.014 1.27 0.011 140
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Kërcell 0.028 1.4 0.02 280
2‘ Kërcell 0.015 1.15 0.013 150
3‘ Kërcell 0.015 1.15 0.013 150
4‘ Kërcell 0.028 1.33 0.021 280
5‘ Kërcell 0.216 2.2 0.098 216
6‘ Kërcell 0.471 2.32 0.203 471
7‘ Kërcell 0.017 1.21 0.014 170
8‘ Kërcell 0.024 1.1 0.022 240
9‘ Kërcell 0.017 1.21 0.014 170
10‘ Kërcell 0.022 1.1 0.02 220
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Trung 0.02 1 0.02 200
2 Trung 0.03 1 0.03 300
3 Trung 0.01 0.5 0.02 100
4 Trung 0.026 0.27 0.096 260
5 Trung 0.03 0.2 0.15 300
6 Trung 0.016 1.14 0.014 160
7 Trung 0.031 1.55 0.02 310
8 Trung 0.03 1.5 0.02 300
9 Trung 0.018 1.3 0.014 180
10 Trung 0.018 1.2 0.015 180
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Trung 0.012 2 0.006 120
2‘ Trung 0.27 2.6 0.102 270
3‘ Trung 0 0 0 0
4‘ Trung 0.015 1.15 0.013 150
5‘ Trung 0.013 0.11 0.013 130
6‘ Trung 0.013 1 0.013 130
7‘ Trung 0.022 1.29 0.017 220
8‘ Trung 0 0 0 0
9‘ Trung 0 0 0 0
10‘ Trung 0.018 1.2 0.015 180
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
133
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Rrënjë 0.022 1.38 0.016 220
2 Rrënjë 0.023 1.2 0.019 230
3 Rrënjë 0.032 1.28 0.025 320
4 Rrënjë 0.052 1.68 0.031 520
5 Rrënjë 0.023 1.28 0.018 230
6 Rrënjë 0.019 1.2 0.016 190
7 Rrënjë 0.018 1.2 0.015 180
8 Rrënjë 0.026 1.3 0.02 260
9 Rrënjë 0.022 1.16 0.019 220
10 Rrënjë 0.029 1.53 0.019 290
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Rrënjë 0.019 1.2 0.016 190
2‘ Rrënjë 0.021 1.24 0.017 210
3‘ Rrënjë 0.035 0.21 0.16 350
4‘ Rrënjë 0.029 1.38 0.021 290
5‘ Rrënjë 0.03 1.3 0.023 300
6‘ Rrënjë 0.018 1.4 0.013 180
7‘ Rrënjë 0.022 1.3 0.017 220
8‘ Rrënjë 0.022 1.3 0.017 220
9‘ Rrënjë 0.016 1.07 0.015 160
10‘ Rrënjë 0.019 1.2 0.016 190
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Gjethe 0.034 1.42 0.024 340
2 Gjethe 0.005 5 0.001 50
3 Gjethe 0.007 0 0 70
4 Gjethe 0.036 1.1 0.033 360
5 Gjethe 0.025 1.5 0.017 250
6 Gjethe 0.022 1.3 0.017 220
7 Gjethe 0.06 1.2 0.05 400
8 Gjethe 0.047 1.62 0.029 470
9 Gjethe 0.018 1.3 0.014 180
10 Gjethe 0.016 1.5 0.011 160
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Gjethe 0.005 5 0.001 50
2‘ Gjethe 0.007 7 0.001 70
3‘ Gjethe 0.004 4 0.001 40
4‘ Gjethe 0.02 1.25 0.016 200
5‘ Gjethe 0.032 1.33 0.024 320
6‘ Gjethe 0.002 1 0.002 20
7‘ Gjethe 0.027 2.4 0.021 270
8‘ Gjethe 0.016 1.23 0.013 160
9‘ Gjethe 0.017 1.3 0.013 170
10‘ Gjethe 0.022 1.57 0.014 220
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
134
Rezultatet e matjeve në spektrofotometër për mostrat e plantacionit Zëmblak
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Kërcell 0.038 1.1 0.035 380
2 Kërcell 0.014 1 0.014 140
3 Kërcell 0.015 1 0.015 150
4 Kërcell 0.02 1 0.019 200
5 Kërcell 0.028 1.1 0.026 280
6 Kërcell 0.013 0.9 0.014 130
7 Kërcell 0.019 1 0.019 190
8 Kërcell 0.022 1 0.022 220
9 Kërcell 0.035 1.3 0.028 350
10 Kërcell 0.02 0.8 0.022 200
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Kërcell 0.018 0.9 0.019 180
2‘ Kërcell 0.015 1 0.015 150
3‘ Kërcell 0.019 1 0.018 190
4‘ Kërcell 0.012 1 0.012 120
5‘ Kërcell 0.021 1 0.021 210
6‘ Kërcell 0.044 1 0.043 440
7‘ Kërcell 0.019 1 0.019 190
8‘ Kërcell 0.014 0.87 0.016 140
9‘ Kërcell 0.016 0.8 0.018 160
10‘ Kërcell 0.021 1 0.02 210
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Trung 0.04 1.1 0.037 400
2 Trung 0.028 1 0.028 280
3 Trung 0.025 1.1 0.022 250
4 Trung 0.026 1 0.025 260
5 Trung 0.018 1 0.018 180
6 Trung 0.024 1 0.023 240
7 Trung 0.02 1 0.02 200
8 Trung 0.014 0.8 0.017 140
9 Trung 0.016 1 0.015 160
10 Trung 0.013 0.9 0.014 130
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Trung 0.019 1 0.018 190
2‘ Trung 0.025 1 0.024 250
3‘ Trung 0.023 1 0.022 230
4‘ Trung 0.023 1 0.022 230
5‘ Trung 0.021 1 0.02 210
6‘ Trung 0.028 1 0.027 280
7‘ Trung 0.024 1.14 0.021 240
8‘ Trung 0.033 1.13 0.029 330
9‘ Trung 0.015 1 0.015 150
10‘ Trung 0.016 1 0.015 160
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
135
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Rrënjë 0.026 1 0.026 260
2 Rrënjë 0.043 1 0.043 430
3 Rrënjë 0.037 1 0.035 370
4 Rrënjë 0.036 1 0.036 360
5 Rrënjë 0.051 1 0.051 510
6 Rrënjë 0.034 1 0.032 340
7 Rrënjë 0.04 1.2 0.034 400
8 Rrënjë 0.02 0.9 0.022 200
9 Rrënjë 0.027 1.2 0.023 270
10 Rrënjë 0.031 1 0.029 310
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Rrënjë 0.023 1.1 0.021 230
2‘ Rrënjë 0.04 1 0.04 400
3‘ Rrënjë 0.05 1.4 0.044 500
4‘ Rrënjë 0.05 1.1 0.046 500
5‘ Rrënjë 0.041 1 0.039 410
6‘ Rrënjë 0.037 1.1 0.034 370
7‘ Rrënjë 0.021 1.1 0.019 210
8‘ Rrënjë 0.022 1.1 0.02 220
9‘ Rrënjë 0.023 1 0.022 230
10‘ Rrënjë 0.029 1 0.027 290
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1 Gjethe 0.013 1.44 0.009 130
2 Gjethe 0.016 1.23 0.013 160
3 Gjethe 0.025 1.5 0.017 250
4 Gjethe 0.02 1.25 0.016 200
5 Gjethe 0.029 1.5 0.02 290
6 Gjethe 0.024 1.3 0.018 240
7 Gjethe 0.023 1.4 0.017 230
8 Gjethe 0.023 1.2 0.019 230
9 Gjethe 0 0 0 0
10 Gjethe 0 0 0 0
Numri Kategoria OD 260 260/280 OD 280 Sasia
1‘ Gjethe 0.01 1.42 0.007 100
2‘ Gjethe 0.019 1.5 0.013 190
3‘ Gjethe 0.032 1.3 0.024 320
4‘ Gjethe 0.025 1.3 0.019 250
5‘ Gjethe 0.02 1.2 0.017 200
6‘ Gjethe 0.04 1 0.04 400
7‘ Gjethe 0.023 1.3 0.018 230
8‘ Gjethe 0.023 1.3 0.018 230
9‘ Gjethe 0 0 0 0
10‘ Gjethe 0 0 0 0
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
136
LISTA E PUBLIKIMEVE
REFERIME:
1. Desareda Mero, Ariola Bacu (2016): Amount of DNA extracted from
different tissues of apple trees in springtime can be used to describe the level of
infection. The International Conference of the University of Agronomic
Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest ―Agriculture for Life, Life for
Agriculture‖. 9-11 June 2016 Bucharest, Romania.
http://biotechnologyjournal.usamv.ro/index.php/scientific-papers/281-amount-
of-dna-extracted-from-different-tissues-of-apple-trees-in-springtime-can-be-
used-to-describe-the-level-of-infection-281.
2. Desareda Mero, Ariola Bacu, Margarita Hysko (2016): Comparison of three
detection methods of phytoplasma at apple trees proves the advantage of
amplification of specific 16srADN. The International Conference of the
University of Agronomic Sciences and Veterinary Medicine of Bucharest
―Agriculture for Life, Life for Agriculture‖. 9-11 June 2016 Bucharest,
Romania.
http://biotechnologyjournal.usamv.ro/index.php/scientific-papers/282-
comparison-of-three-detection-methods-of-phytoplasma-at-apple-trees-proves-
the-advantage-of-amplification-of-specific-16sradn-282.
3. Desareda Mero, Ariola Bacu, Margarita Hysko (2015): Krahasimi i të
dhënave fenotipike me ato të marra nga përdorimi i metodës DAPI për praninë
e fitoplazmave në drurët e mollëve të plantacionit Turan. XIth International
Symposium: Biodiversity Conservation and Sustainable Use for Rural
Development, Tiranë 21 Dhjetor 2015. (me proceeding)
4. Desareda Mero, Ariola Bacu, Margarita Hysko (2015) Zbulimi paraprak i
fitoplazmave nëpërmjet ngjyrimit DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) dhe
mikroskopisë fluoreshente. Konferenca Kombëtare e Shkencave të Aplikuara,
Tiranë 21 Nëntor 2015.
5. Desareda Mero, Margarita Hysko, Ariola Bacu (2014): Early detection
methods for apple phytoplasmas and data related to them in Korca district. 2nd
International Conference on Applied Biotechnology, Tiranë 22 Shtator 2014.
6. Besnik Skënderasi, Edmond Spahiu, Desareda Mero, Hekuran Vrapi (2015):
Vlerësim simptomatologjik i përhapjes së fitoplazmës së mollës (Candidatus
phytoplasma mali), në rajonin e Korçës. Konferenca e II-të Ndërkombëtare e
Bujqësisë, Ushqimit dhe Mjedisit‖, Korçë, 25 Shtator 2015.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
137
BOTIME:
1.
Desareda Mero, Ariola Bacu, Kristi Buzo (2016): Phytoplasmas detection effectiveness based on symptomatology, DAPI staining and specific PCR at plum plant material of different categories. European Journal of Biotechnology and Genetic Engineering (Online), ISSN 2397-2076. Vol. 3 No. 1, 2016, 75-82. http://www.idpublications.org/ejbge-vol-3-no-1-2016.
2.
Desareda Mero, Ariola Bacu (2017): Amplifıcation of Specıfıc Ribosomal and Non-Ribosomal phytoplasma DNA can serve to dıagnose their presence at Apple and Plum trees from Korca plantations. International Journal of Ecosystems and Ecology Science (IJEES) ISSN 2224-4980. Volume 7/1, 2017 Page 99-106. http://www.kitabig.com/journal/journal-40-
International--Journal-of-Ecosystems-and-Ecology-Science--(IJEES) Volume-7-1,-2017.html.
3. Desareda Mero (2015): Diagnostic techniques for detection of apple
phytoplasma diseases. Buletini Shkencor i Universitetit Fan.S.Noli, seria e
shkencave të zbatuara, viti XX i botimit, ISSN 2078-7111. Nr. 30, 2015, fq.
17-24. http://www.unkorce.edu.al/sq/node/682.
4. Desareda Mero, Ariola Bacu, Margarita Hysko (2016): Phytoplasmas
identification based on phenotypic data compared to DAPI staining at apple
plantation of Turan, Korçë. Journal of Agriculture and Animal Production
Science for Rural Development, ISSN 2224-7718. Vol. 6, No 1, 2016, 49-
52.
Mero D. (2017): Përdorimi i instrumenteve moderne për diagnostikimin e fitoplazmave
që shkaktojnë infeksione në bimët e mollëve (AP) dhe leptonekrozën e kumbullës (PLN)
138
PËRMBLEDHJE
Fitoplazmat janë përgjegjëse për një sërë sëmundjesh të bimëve të përhapura në të gjithë botën. Disa
prej sëmundjeve, veçanërisht ato të bimëve drunore janë letale. Si parazitë obligativë, ato janë adaptuar
për të jetuar në dy nishe ekologjike, floemën e bimëve dhe insekte. Fitoplazmat varen nga transmetimi
me anë të vektorëve hemipterë që ushqehen në floemë, pasi janë në përgjithësi të paaftë për të kaluar në
mënyrë direkte në farat e bimëve apo vezët e insekteve. Korça është një nga rajonet kryesore për
kultivimin e dru-frutorëve si molla dhe kumbulla në Shqipëri. Ekonomia e këtij rajoni bazohet
kryesisht në bujqësi dhe prodhimin e dru-frutorëve, ndaj diagnoza e hershme e fitopatologjive të
lidhura me to është shumë e rëndësishme. Deri pak kohë më parë, sëmundjet virale dhe ato të
shkaktuara nga MLO në plantacionet e mollëve dhe kumbullave janë dedektuar bazuar në simptoma, të
cilat shpesh janë të ngjashme dhe çojnë në interpretime të gabuara. Metodat mikroskopike dhe
molekulare janë ndër më të përdorurat për këtë qëllim. Dedektimi me anë të mikroskopisë me
fluoreshencë DAPI bazohet në përdorimin e 4', 6-diamidino-2-phenylindole, një substancë fluoreshente
që ndriçon nën rrezatimin UV. Metodat e bazuara në PCR i referohen shumëfishimit të rajoneve
specifike ribozomale dhe jo-ribozomale për fitoplazmat. Gjashtë plantacione, tre me mollë (Malus
domestica) dhe tre me kumbulla (Prunus domestica), ishin burimi i materialit të kontrolluar, që u morr
nga 10 drurë, 5 paralele nga çdo kategori (rrënjë, kërcej, gjethe, trung). Gjithsej u analizuan katër
kultivarë molle dhe dy kultivarë kumbulle. Metodologjia e ndjekur ishte simptomatologjia, ngjyrimi
DAPI dhe PCR specifike. Bazuar në rezultatet tona, dedektimi me anë të simptomatologjisë dhe
ngjyrimit DAPI varen nga sezoni i marrjes së mostrave, dhe pozicioni i mostrës në pemë. Ndërsa
simptomatologjia mund të japë informacion mbi praninë e sëmundjes në faza të avancuara, DAPI mund
të shërbejë për të identifikuar stade më të hershme të infeksionit. Sidoqoftë, për të qënë e suksesshme
nevojitet një përqëndrim i caktuar i fitoplazmave. Diagnostika e bazuar në PCR varet shumë nga cilësia
e ADN-së të pasuruar me fitoplazma. Në përfundim, ne rekomandojmë përdorimin e njëkohshëm të tre
metodave, të cilat plotësojnë njëra-tjetrën duke dhënë një rezultat të besueshëm.
Fjalët kyçe: fitoplazma, simptoma, DAPI, PCR, Korca.
ABSTRACT
Phytoplasmas are associated with diseases in numerous plant species worldwide. Some of these
diseases, especially those of woody plants, are lethal. As obligate parasites, they are adapted to live in
two ecological niches, plant phloem and insects. Very little is known about the mechanisms by which
phytoplasmas induce disease in plants and the reason for different reactions of the host plants to
phytoplasmal infections. Korca is one of the main areas of apple cultivation in Albania. The economy
of the district is based mainly on agriculture and especially at fruit-trees production, thus the efficient
early diagnosis of phytopathologies related to them is imperative. Until recently the diagnosis of
bacterial, viral or MLO diseases at apple and plum collections was done based on symptoms, which
very often are similar, and as a result the interpretation of them has lead to mistakes on treatment.
Microscopic and molecular methods are among the most used in this respect. DAPI staining detection
is based on the use of 4', 6-diamidino-2-phenylindole, a fluorescent stain, which lights under UV light,
and makes phytoplasmas visible. The PCR based methods of detection address mainly the
amplification of ribosomal and non-ribosomal specific DNA from phytoplasmas. Six collections,
respectively three with apple trees (Malus domestica) and three with plums (Prunus domestica), were
considered as resources of plant material, which were sampled from 10 trees, 5 paralel samples of each
category (root, stem, leaves, trunk). Altogether were analysed four apple cultivars and two plum
cultivars. Methodology followed were symptomatology, DAPI staining and specific-PCR. Based on our
results we conclude that the symptoms and DAPI staining detection depend on seasson of sampling,
and on the sampling position at each tree; While symptomatology can provide information on presence
of disease in advanced phases, DAPI can help identify earlier stages of infection. However, in order to
be successful a certain concentration of phytoplasmas is required. PCR based diagnostic is strongly
dependent on the quality of the DNA, extracted from plant tissues and enriched for the phytoplasmas
DNA content. In conclusion, we recommend the simultaneous use of the three methods, which
complement each-other assuring this way a more reliable result.
Key words: phytoplasma, symptoms, DAPI, PCR, Korca.