preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica
TRANSCRIPT
![Page 1: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/1.jpg)
Preparazione di campioni biologiciper la microscopia ottica
ed elettronica
![Page 2: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/2.jpg)
Il microscopio ottico ed elettronico (T.E.M)
OCULARE
OBBIETTIVI
TAVOLINO PORTA CAMPIONE
CONDENSATORE
DIAFRAMMA DI CAMPO
LAMPADA
CANNONEELETTRONICO
PORTA CAMPIONE
CONDENSATORE
OBBIETTIVO
SCHERMOFLUORESCENTE
CAMERAFOTOGRAFICA
![Page 3: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/3.jpg)
1 mm
100 µm
10 µm
1 µm
100 nm
10 nm
1 nm
1 Å
Occhio umanoOcchio umano
Microscopio otticoMicroscopio ottico
Microscopio elettronico Microscopio elettronico a trasmissionea trasmissione
Microscopio elettronico Microscopio elettronico a scansionea scansione
LA
RISOLUZIONE
LA
RISOLUZIONE
Aumentando la risoluzione aumentanoproporzionalmente anche gli artefatti ela loro visibilità
![Page 4: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/4.jpg)
• la luce del microscopio ed il fascio di elettroni possono attraversare solo materiale di spessore molto ridotto
• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi ed utramicrotomi
• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli
• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito– Fissazione – Inclusione– Congelamento
• i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto
• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato o contrastato
• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica
Problematiche…
![Page 5: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/5.jpg)
Fasi della preparazione
• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• Colorazione
![Page 6: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/6.jpg)
Prelievo
• Il prelievo è l’operazione fisica con la quale si ottiene il campione da esaminare
• Deve essere eseguito da materiale biologico vivente
• Riduzione 10x10x3 mm per la microscopia ottica
Spessore ≤ 2 mm per la microscopia elettronica
• Deve essere eseguito il più velocemente possibile
![Page 7: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/7.jpg)
Fasi della preparazione
• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• Colorazione
![Page 8: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/8.jpg)
La FissazioneHa lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolostabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti
Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandonela morfologia
Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking)
FISICA
CHIMICA
Congelamento in N2 o -30°CCalore (fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino
Esposizione del tessuto a T molto alte o molto basse:
Uso di sostanze chimiche:
PerfusioneImmersioneCon vapori
![Page 9: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/9.jpg)
La fissazione chimicaLE ALDEIDI
FORMALDEIDE• usata in soluzione (4-10%) in tampone pH 7.4
• elevato potere di penetrazione ( 0.8 mm/h)
• agisce formando legami crociati con gli aa delle proteine (reversibili)
• preserva una buona morfologia
PARAFORMALDEIDE
• preserva la reattività delle macromolecole
• indicata per indagini biochimiche
Formaldeide 4-10% + Saccarosio 2%in PBS pH 7.4
4 ore 4°C
Microscopia Ottica
PFA 10% + Saccarosio 2%in PBS pH 7.4
4 ore 4°C
![Page 10: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/10.jpg)
GLUTARALDEIDE• penetra bene nei tessuti, ma meno rapidamente della formaldeide
• forma cross-legami più velocemente e più stabilmente della formaldeide
• non fissa i lipidi, quindi per preservare le membrane
La fissazione chimicaLE ALDEIDI
Microscopia Elettronica
GA 2-4% in Tampone Fosfato pH 7.4
2-4 ore 4°C
Post-fissazione con Osmio Tetrossido
• Fissa i lipidi insaturi
• agisce rapidamene, ma penetra molto poco Fissativo 2°
• reagisce in modo differente con i vari componenti cellulari accentuando le differenze di densità e fornendo una sorta di colorazione
OsO4 1-2%In Tampone Fosfato pH 7.4 2 ore 4°C buio
![Page 11: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/11.jpg)
I TamponiI fissativi devono essere diluiti in tamponi a pH 7-7.4 in modo che non ci sia diversitàdi pH fra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti dovuti a differenze diosmolarità
Gli stessi tamponi utilizzati per diluire i fissativi devono essere impiegati per effettuarei lavaggi che seguono la fissazione (1-2 ore)
PBS
Tampone fosfato di Sorensen
Tampone Cacodilato
Fosfato bisodico 0.2M + Fosfato monosodico 0.2M
Cacodilato di Na 0.24M + HCl 0.2M
Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico che è tossico
![Page 12: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/12.jpg)
Fasi della preparazione
• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• Colorazione
![Page 13: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/13.jpg)
La DisidratazioneE’ il passaggio che permette la sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con unsolvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine)La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni
Alcool 70%
Alcool 90%Alcool 100%
Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70%(T.E.M.)
ChiarificazioneL’ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione
Xilolo
Acetone assolutoOssido di propilene
Paraffina
Resine idrofobiche per T.E.M.
InfiltrazioneDopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o l’acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione)
3:1 2:1 1.1 1:2 1:3
![Page 14: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/14.jpg)
Fasi della preparazione
• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• Colorazione
![Page 15: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/15.jpg)
InclusioneE’ il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanzaduro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili
PARAFFINA (M.O.)
RESINE(T.E.M.)
• Miscela di idrocarburi saturi
• solida a T ambiente
• punto di fusione a 54-60°
• insolubile in H2O, solubile in xilolo
• Epon, Araldite• liquida a T ambiente• polimerizza a 60-70°C
• insolubile in H2O, solubile in acetone• si preparano a partire da soluzioni di monomeri, da sostanze plasticizzanti che migliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimico per la reazione di polimerizzazione
Il campione viene immerso in paraffinao resina pura per completarne l’infiltrazione
![Page 16: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/16.jpg)
T ambiente4°C
PolimerizzazioneParaffina (m.o.) Resina (T.E.M)
60-70°C
Blocchetti prontiper esseretagliati insezioni
![Page 17: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/17.jpg)
Il taglio delle sezioni
MICROTOMOStrumento che permette di sezionarei blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 uM
![Page 18: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/18.jpg)
La raccolta delle sezioni
La colorazione
I coloranti sono di solito in soluzione acquosa Le sezioni devono essere
sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H2O)
Metodica ematossilina eosina
Ematossilina 10 min
Lavaggio con H2O corrente
Eosina 1 min
Disidratazione
Montaggio
VetriniXilanizzati
![Page 19: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/19.jpg)
Ematossilina: nucleiEmatossilina: nuclei
Eosina: citoplasmaEosina: citoplasma
ematossilinaeosina
![Page 20: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/20.jpg)
COLORANTI PER MICROSCOPIA COLORANTI PER MICROSCOPIA OTTICAOTTICAI tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle
strutture che li compongono
ACIDIACIDI carica negativa formano sali con basi colorano citoplasma
BASICIBASICI carica positiva formano sali con acidi colorano i nuclei
NEUTRINEUTRI formati dall’unione di un colorante acido con uno basico
NATURALINATURALI
animali : es. carminio (colorante acido nucleare)vegetali: es. ematossilina (colorante acido)
ARTIFICIALIARTIFICIALI
eosina (colorante basico citoplasmatico)
fucsina, violetto di genziana(coloranti nucleari)
![Page 21: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/21.jpg)
COLORAZIONCOLORAZIONII
• chimichechimiche: reazione tra colorante e substrato
evidenziano molecole come lipidi e zuccheri
COLORAZIONI ISTOCHIMICHE
OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI)• o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere
• alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi
• o.r.o si deposita al loro postoP.A.S. (PER ZUCCHERI)
• acido periodico di schiff ossida i gruppi CHOH-CHOH
degli zuccheri
CHOH-CHOHreagisce con composto fucsina-acido solforoso e da’ colorazione fucsia
CHO-CHO
chimiche
fisiche
chimico fisiche
![Page 22: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/22.jpg)
• FISICHEFISICHE: precipitazione di metalli su strutture biologiche
• CHIMICO-FISICHE CHIMICO-FISICHE : meccanismo di assorbimento elettrico
substrato e colorante hanno cariche diverse e formano sali fra loro
EMATOSSILINA
EOSINA
Es. impregnazione argentica Sali d’argento + sostanza riducenteliberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologicheargentofile (fibre nervose)
![Page 23: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/23.jpg)
ULTRAMICROTOMOStrumento usato per sezionare i blocchetti di resina in sezioni molto sottili
SEMIFINI: sezioni di 1 uM di spessore, la cui osservazione al m.o. permette di selezionare i campi utili destinati ell’esame ultrastrutturaleal T.E.M.
![Page 24: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/24.jpg)
SEZIONI ULTRAFINI: sezioni di 60-70 nm di spessore
Lama didiamante
Il tagliodelle sezioni
Raccolta dellesezioni
retino
![Page 25: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/25.jpg)
LA COLORAZIONELA COLORAZIONE
• il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione
• piu’ e’ alto il numero atomico, piu’ elettroni sono dispersi, maggiore e’ il contrasto
• le molecole biologiche sono costituite da atomi con numero atomico basso (H, C, O)
• le sezioni vengono contrastate con sali di metalli pesanti
Acetato di Uranile Acetato di Uranile eeCitrato di PiomboCitrato di Piombo
![Page 26: Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062512/5542eb4f497959361e8bf28e/html5/thumbnails/26.jpg)
…un esempio di applicazione
semifini
UVB 1 MED UVB 10 MED
fini