introducción

material y métodosPara la realización del muestreo en nuestra Comunidad se siguieron las pautas fijadas en el protocolo de la CE, para el nematodo de la madera del pino (Bursaphelenchus xylophilus) en

cumplimiento a la Decisión 2000/58/CE de la Comisión Europea del 11 de Enero de 2000, y que fueron las siguientes:

Se han detectado dos especies del género Bursaphelenchus, B. mucronatus y B. sexdentati. Dicha identificación se ha realizado en el caso de B. mucronatus siguiendo criterios morfológicos, morfométricos y por técnicas moleculares aplicando PCR , tal como lo requiere el protocolo oficial en el caso de que aparezcan machos típicos y hembras con mucrón que pudieran pertenecer a B. mucronatus, B. xylophilus o B. fraudulentus Rühm. La identificación de B. sexdentati se realizó morfológica y morfometricamente.

Bursaphelenchus mucronatus apareció en cuatro muestras de aserraderos y fábricas, dos en madera apeada de Pinus sylvestris de procedencia francesa y ucraniana, y las dos restantes en las pilas de serrín por lo cual no se puede precisar su origen ni especie de Pinus. B. sexdentati se detectó en una masa de Pinus spp próxima a un aserradero.

Otros géneros de nematodos saprófitos como Aphelenchoides, Laimaphelenchus, Rhabditidos también han aparecido en numerosas muestras.

En este muestreo no se detectó el nematodo de cuarentena B. xylophilus objetivo de esta prospección.

M Alu

I

Rsa

I

Msp

I

HaeIII

ITS

M

resultados

CONCLUSIONES!En esta prospección se han identificado dos especies del género Bursaphelenchus: B. mucronatus y B. sexdentati. El organismo de cuarentena Bursaphelenchus xylophilus en este

muestreo no ha sido detectado.

!La detección de B. mucronatus al haber sido realizada sobre cuatro muestras, dos de serrín y dos de madera apeada, cuyo lugar de origen ( Francia y Ucrania) solo es conocido en las dos

últimas, nos inclina a pensar que las restantes también hayan sido introducidas de madera importada, ya que esta especie aunque esta distribuida principalmente por Europa y Asia es

más común en Europa en los bosques del norte, centro y este.

!Bursaphelenchus sexdentati ha sido detectado sobre una plantación de Pinus sp próxima a un aserradero, por lo que pudo haber sido introducida en madera que lo abastecía. Esta

especie es mas frecuente en países de sur de Europa AMBROGIONI & CAROPPO (1998) por lo que su presencia coincide con su distribución natural.

PRESENCIA DE BURSAPHELENCHUS MUCRONATUS

Y B. SEXDENTATI EN GALICIA

PRESENCIA DE BURSAPHELENCHUS MUCRONATUS

Y B. SEXDENTATI EN GALICIA

Durante la prospección realizada en la Comunidad Gallega en marzo de 2000 en las zonas de máximo riesgo para determinar la presencia del nematodo de cuarentena Bursaphelenchus

xylophilus (Steiner & Buhser) Nickle, se han identificado dos especies de Bursaphelenchus hasta el momento no citadas en nuestro país, siendo estas B. mucronatus Mamiya & Enda y B.

sexdentati Rühm.

Identificación morfológica y morfométrica

1.- Extracción del DNA con el E.Z.N.A. Mollusc DNA kit (Omega Biotek).

2.- Amplificación con las Ready-To-Go PCR beads (Amersham Pharmacia).

Secuencias de los primers: Primer 1: 5´-CGTAACAAGGTAGCTGTAG- 3´(Ferris et al., 1993)

Primer 2: 5´-TTTCACTCGCCGGTTACTAAGG- 3´(Vrain, 1993)

3.- Fases del termociclador: 94ºC durante 2 minutos, 35 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 2 minutos y una extensión final de 5 minutos a 72ºC.

4.- RFLP: digestión de las muestras con las enzimas de restricción: AluI, HaeIII, RsaI, MspI (Grupo Roche) siguiendo las condiciones del fabricante.

Gel de agarosa al 3% mostrando los fragmentos de restricción de

la región ITS del rDNA de Bursaphelenchus mucronatus

con las enzimas AluI,RsaI, MspI y HaeIII.

TOMA DE MUESTRAS

En árboles y en madera apeada se tomaron con un trado de

20mm de diámetro recogiendo en 5 pies un total de 150 g de

viruta.

En aserraderos se recogieron además

muestras de serrín a diferentes alturas

de las pilas.

Pinus pinaster,

P. sylvestris

y P. radiata mayoritariamente.

ESPECIES MUESTREADAS:

A) LUGARES DE ALTO RIESGO:

1.- Aserraderos y fábricas madereras

2.- Masas próximas a puntos de manejo de madera

4.- Masas próximas a PIFs

5.- Entradas fronterizas

6.- Vías de comunicación de alto riesgo

B) OTRAS ÁREAS FORESTALES:

Muestreadas en una prospección anterior realizada en

nuestra Comunidad en octubre de 1999, no detectándose

nematodos del género Bursaphelenchus.

SELECCIÓN DE LAS ZONAS DE MUESTREO

Las muestras, en bolsas plásticas y

debidamente identificadas se remitieron al

Laboratorio de la Estación Fitopatológica “Do

Areeiro”. Antes de proceder a la extracción fueron

incubadas a 25 ºC durante dos semanas.

* Método de extracción: modificación de la

técnica del embudo de Baermann, se toman 50 g de la muestra (viruta o

serrín) y se sumergen en agua durante 48 horas, pasadas estas se recogía

la muestra de agua y se observaba a la lupa . Los nematodos extraídos,

se fijaron en lactofenol de Amman y se identificaron morfológica y

morfométrica al microscopio óptico. Aplicándose, a otros ejemplares,

dependiendo de la especie encontrada, la técnica PCR-RFLP.

Procesamiento de las muestras.

Parte anterior Detalle de la vulva Parte posteriorEspiculas

B. mucronatus L a b c Estilete V Espículas

Hembras 700-980 36.5-45.9 9.6-15.9 19.6-30.4 14-16 73-77

Machos 640-970 38.8-51.1 9.0-14.7 25.7-35.6 14-16 23-29

Dauer larvae 500-650 35.1-45.8 7.9-9.6 19.7-24.4 -

Tabla 1. Medidas morfométricas de B. mucronatus en mm. MARINARI PARMISANO, et al ( 1994)

Bursaphelenchus mucronatus (Mamiya & Enda, 1979)Bursaphelenchus mucronatus (Mamiya & Enda, 1979)

B. Sexdentati L a b c Estilete V Espículas

Hembras 613-1300 32-57 8.5-17 16.5-36 12.7-15.7 68-76

Machos 540-1150 36-58 8.2-16 22.5-36 12.1-15.7 13-18

Tabla 2. Medidas morfométricas de B. sexdentati en mm. (AMBROGIONI & CAROPPO, 1998)

Bursaphelenchus sexdentati (Rühm,1960)Bursaphelenchus sexdentati (Rühm,1960)Bursaphelenchus sexdentati (Rühm,1960)

Parte anterior Detalle de la vulva Parte posteriorCola y espiculas

Identificación por pcr-rflp de bursaphelenchus mucronatus

III Congreso Forestal Español, Sierra Nevada (Granada) 25-28 septiembre 2001 III Congreso Forestal Español, Sierra Nevada (Granada) 25-28 septiembre 2001

A. ABELLEIRA (1), J. P. MANSILLA (1,2), O. AGUIN, (1), C. PINTOS (1), M. SABARIS (1).

(1) Estación Fitopatológica “Do Areeiro”. Servicio Agrario. Excma. Diputación Provincial de Pontevedra. Subida a la Robleda s/n, 36153 Pontevedra. www. efa-dip.org(2) Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo