UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA

CURSO: QUÍMICA ORGÁNICA IV

CATEDRA: LICDA. IDOLLY CARRANZA

LUIS ALBERTO RIZZO HURTADO

200412350 – QQ

INFORME FINAL D E P R O Y E C T O D E L A B O R A T O R IO

“Extracción y modificación química de Piperina, de la especie Piper nigrum; Evaluación y comparación de efecto antimicrobiano de la Piperina,

ácido pipérico y piperonal en Staphylococcus aureus in-vitro”

ANTECEDENTES

• La Pimienta es originaria de la India y se cultiva en zonas tropicales de Asia. Los países principales productores de pimienta son India y Brasil, seguidos de Malasia, Indonesia y otros países sudaméricanos.

• El fruto es una drupa (aproximadamente 5 mm) que se puede usar entera o en polvo obteniendo variedades como la negra, blanca o verde, con la única diferencia del grado de maduración del grano.

ANTECEDENTES

La clasificación botánica de la pimienta negra es:

• Reino: Plantae • Clado: Angiospermas • Orden: Piperales • Familia: Piperaceae • Género : Piper nigrum

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ANTECEDENTES • Los frutos de pimienta contienen un aceite esencial (aproximadamente 3 %),

responsable de su aroma. El aceite esencial está constituido por más de cien componentes distintos, principalmente hidrocarburos terpénicos: 50-74 % de monoterpenos (beta-pineno, limoneno, etc.) y 20-35 % de sesquiterpenos (beta-cariofileno, etc.); además una proporción mucho menor de terpenoides oxigenados (13 %).

• Los responsables del sabor picante son amidas de la piperidina con ácidos aromáticos insaturados, principalmente piperina (amida de la piperidina y del ácido pipérico) en su conformación trans, trans. Se encuentran también amidas pirrolidínicas y algunas isobutilamínicas. Tanto el aceite esencial como las amidas forman parte de la oleorresina, obtenida a partir de los frutos mediante el empleo de disolventes y muy utilizada comercialmente por su fácil manejo.

ANTECEDENTES Probablemente la pimienta es la especia más consumida en el mundo y una de las que se conocen desde hace más tiempo. Pero no solamente mejora las cualidades organolépticas de los alimentos y favorece su conservación sino que además, está dotada de propiedades terapéuticas interesantes que pueden ser beneficiosas para la salud. Algunos estudios han demostrado que la piperina presenta actividad antimicrobiana, insecticida y larvicida, y es rubefaciente cuando se aplica por vía tópica.

JUSTIFICACIÓN

En esta investigación se realizó una comparación de actividad antimicrobiana de la piperina, el ácido pipérico y el piperonal en cultivos in-vitro de Staphylococcus aureus buscando aportar nuevos conocimientos para una nueva línea de investigación con un fin aplicable.

ESTRUCTURAS

Piperina

Ácido pipérico

Piperonal

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GENERAL • Evaluar y comparar la actividad antimicrobiana de la Piperina, Ácido

pipérico y Piperonal en cultivos in-vitro de Staphylococcus aureus. ESPECÍFICOS • Extraer, purificar y caracterizar piperina de la especie Piper nigrum. • Evaluar la modificación estructural de la piperina para formar ácido pipérico. • Evaluar la modificación estructural del ácido pipérico para obtener

piperonal.

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La modificación estructural de la piperina presenta alteraciones en la actividad antimicrobiana en la especie Staphylococcus aureus.

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Extracción General, separación y caracterización de la Piperina 1. Se recolectó media libra (alrededor de 225 g) de pimienta negra, corroborando que dicha pimienta perteneciera a la especie

Piper nigrum por su morfología. 2. Se trituró la pimienta a un tamaño de partícula adecuado para hacer la extracción utilizando un martillo. Evitando que el

producto molido tuviera un aspecto aceitoso y grumoso. 3. Se pesaron 25 g de la pimienta triturada y se colocaron adecuadamente en el equipo Soxhlet. 4. Se agregaron 100 ml de n-hexano en el equipo de extracción Soxhlet y se realizar lavados de la pimienta para eliminar las

resinas y de esta manera hacer una extracción más efectiva. 5. Se descartó la solución resultante del lavado anterior. 6. Se agregaron 100 ml de etanol al 95% en el equipo Soxhlet y se extrajo el aceite esencial de los 25 g de pimienta. La

extracción es más efectiva en caliente, el producto no es termolábil a pH neutro (6). 7. Se eliminó el solvente con un sistema de destilación al vacío hasta un volumen de 20 ml. 8. Se colocó la solución obtenida en un recipiente cerrado y dejar en reposo por una semana a temperatura ambiente. 9. La separación de los cristales se provocó añadiendo 10 ml de agua y realizando una decantación posteriormente. 10. Los cristales fueron filtrados y lavados con etanol frío. 11. Se repitió el procedimiento 2 veces más desde el numeral 3 hasta el numeral 10. 12. Todos los cristales se depositaron en un mismo beacker y se confirmó la pureza por Cromatografia en Capa Fina (CCF), con

placas de Silica gel 60 Fw de aluminio de 3 cms. X 10 cm. con 10 ml de acetato de etilo como solvente. Las manchas se observaron bajo una lámpara de luz ultravioleta.

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Orozco G, I. (2000). “PROYECTO 10-98 - SÍNTESIS DE TRES POSIBLES MEDICAMENTOS POR MODIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE PIPERINA". Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONCYT. Ciudad de Guatemala.

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Formación de ácido pipérico a partir de piperina

Modificación No. 1: Formación de ácido pipérico a partir de piperina 1. Se colocaron 0.75 g de Piperina en un balón y se adicionaron 15 ml de Hidróxido de Potasio al 10%

preparado en etanol al 95%. 2. Se agitó y extrajo una alícuota de 0.3 ml (6 gotas) de la solución anterior. 3. Se armó un sistema de reflujo y se calentó durante 2 horas 30 minutos. 4. Se dejó enfriar y se tomó una alícuota de 0.3 ml (6 gotas) terminada la reacción. 5. Se saturó una cámara cromatográfica con 10 ml de acetato de etilo. 6. Se corrió una Cromatografia en Capa Fina (CCF), en placas de Silica gel 60 Fw de aluminio de 4 cms X

8 cm, con la primera alícuota (antes del calentamiento), la segunda alícuota (después del calentamiento) y el estándar de piperina. Se observaron las marcas bajo una lámpara de luz ultravioleta y se compararon semicuantitativamente para determinar la presencia de piperina.

7. A los 7 días se repitió el procedimiento desde el numeral 3 hasta el numeral 6 nuevamente. 8. Se eliminó el alcohol con un sistema de destilación a presión reducida, colocando el tubo recibidor en

un baño de hielo. 9. Se agregó agua caliente al balón para solubilizar su contenido y se acidificó la solución con 10 ml de

Ácido Clorhídrico al 10 %. 10. Se cortó el papel filtro con tijeras de punta redonda y se pesó en una balanza semianalítica. 11. Se filtró la solución al vacío, se lavó con agua fría, y se recristalizó utilizando 15 ml de etanol al 95% y se

dejó secar el sólido. 12. Se identificó el sólido obtenido midiendo el punto de fusión (ácido pipérico: 216-217°C) y comparando

su aspecto físico, sólido blancuzco-amarillento.

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Formación de ácido pipérico a partir de piperina

Ikan, R. (1991). “natural products - a laboratory guide" 2da Ed. Academic press, inc.

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Formación de ácido pipérico a partir de piperina

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Formación de piperonal a partir de ácido pipérico

Modificación No. 2: Formación de piperonal a partir de ácido pipérico 1. En un balón, se disolvió 1 g de bicarbonato de sodio en 40 ml de agua, y se calentó hasta ebullición. 2. De manera simultánea, se calentó una solución de 0.80 g de KMnO4 / 40 ml de agua. 3. Se colocaron 0.5 g de ácido pipérico en el balón que contiene la solución de bicarbonato y aplicar

agitación constante. 4. Agregar gota a gota, durante 40 minutos, la solución caliente de Permanganato de Potasio al balón que

contiene la piperina y el bicarbonato de sodio. 5. Se agregaron 15 ml de Alcohol Isopropílico. Observaciones: El alcohol isopropílico removerá

cualquier oxidante remanente. 6. Cortar el papel filtro con tijeras de punta redonda y se pesó en una balanza semianalítica. 7. Se filtró la solución en caliente. Observaciones: La solución pasa de marrón a ligeramente

amarilla. 8. Se dejó enfriar la solución y se recristalizó con agua. 9. Se identificó el sólido obtenido midiendo el punto de ebullición (piperonal: 36 -38 °C) y comparando

su aspecto físico, sólido blancuzco.

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Formación de piperonal a partir de ácido pipérico

Anny Mathew,Mary Sheeja TL, Arun Kumar T, K Radha, H.J.D.Med.,Vol. 3 (2), October 2011, pp.48-56. © 2011 Hygeia journal for drugs and medicines, all rights reserved.

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Formación de piperonal a partir de ácido pipérico

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Medición Antimicrobiana: cultivos in-vitro de Staphylococcus aureus

Medición Antimicrobiana: cultivos in-vitro de Staphylococcus aureus 1. Se realizaron 4 disoluciones utilizando 2 ml de DMSO (Dimetilsulfoxido) y 0.002 g de estándar de

piperina, extracción de piperina, ácido pipérico y piperonal y ampicilina respectivamente en viales debidamente etiquetados.

2. En un agar Mueller Hinton y en dos agares chocolate se realizó una siembra uniforme de Staphylococcus aureus.

3. Se cortaron 12 discos de papel filtro con un diámetro de 6 cm. 4. Se impregnaron los 12 discos de papel filtro con cada uno de las disoluciones preparadas en el inciso 1.

Observaciones: Realizar una inmersión del papel filtro en los viales y pinzas de ser necesario. 5. Se dejó secar evaporar el solvente por 5 minutos. 6. Se añadieron los discos anteriormente descritos a los cultivos. 7. Se añadieron dos disco de medicamentos estándar, uno de Ciprofloxacina y uno de Bacitracina 8. Los cultivos se dejaron durante 24 horas a 37 grados celcius. 9. Se observaron los resultados y se concluyó respecto a lo observado.

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Medición Antimicrobiana: cultivos in-vitro de Staphylococcus aureus

Shiva Rani S.K. (2013). “Antimicrobial Activity of Black Pepper (Piper nigrum L.)”. Global Journal of Pharmacology 7 (1): 87-90. Department of Botany, Osmania University College for Women, Koti, Hyderabad, India

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Medición Antimicrobiana: cultivos in-vitro de Staphylococcus aureus

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Medición Antimicrobiana: cultivos in-vitro de Staphylococcus aureus

RESULTADOS

Tabla No. 1: Extracción de piperina de la especie Piper nigrum.

Pimienta negra (Piper nigrum) utilizada [g] Piperina obtenida [g] Porcentaje de extracción m/m [%]

75 1.9 2.53

Fuente: Laboratorio 1 de Química Orgánica. Edificio T-12. Facultad de CCQQ y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. Campus Central - Zona 12.

Tabla No. 2: Porcentaje de rendimiento, cantidades utilizadas y cantidades obtenidas en modificaciones químicas.

Sustrato Cantidad utilizada

Producto Cantidad Obtenida Porcentaje de

rendimiento [%] [mmol] [g] [mmol] [g]

Piperina 2.63 0.75 Ácido pipérico 2.08 0.453 78.93

Ácido pipérico 2.06 0.45 Piperonal 1.13 0.169 54.64

Fuente: Laboratorio 1 de Química Orgánica. Edificio T-12. Facultad de CCQQ y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. Campus Central - Zona 12.

RESULTADOS

Tabla No. 3: Identificación del compuesto.

Compuesto Apariencia Física Pto de Fusión [°C]

Otras pruebas Teórica Experimental Teórico Experimental

Piperina Sólido, color marrón,

amarillo-verdoso

Cristales amarillentos-

marrones 131 134

Cromatografía en Capa Fina Silica Gel 60w aluminio, comparación con estándar de

piperina (98% pureza) utilizando acetato de etilo como fase móvil.

Rfestándar piperina = 0.8 Rfextracción piperina = 0.8

Ácido pipérico Sólido amarillento Sólido color amarillo 213 215

Cromatografía en Capa Fina Silica Gel 60w aluminio, comparación con estándar de

piperina (98% pureza) utilizando acetato de etilo como fase móvil:

Rfestándar piperina = 0.8 Rfácido pipérico = 0

Piperonal

Sólido de color blanco o incoloro. Tiene un

olor floral comúnmente descrito como similar al de la vainillina y la cereza.

Sólido beige-grisaseo

38 43

Cromatografía en Capa Fina Silica Gel 60w aluminio, comparación con estándar de

piperina (98% pureza) utilizando cloroformo como fase móvil:

Rfestándar piperina = 0.85

Rfácido pipérico = 0.33 Rfpiperonal = 0.08

Prueba positiva para 2,4 DNFH

Fuente: Laboratorio 1 de Química Orgánica. Edificio T-12. Facultad de CCQQ y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. Campus Central - Zona 12.

RESULTADOS

Tabla No. 4: Actividad antimicrobiana sobre cultivo de Staphylococcus aureus en discos de 6 mm.

Compuesto Tamaño de halo en antibiograma agar

Müller-Hinton [mm]

Piperina (estándar) 8

Piperina (extracción) 8

Ácido pipérico 6

Piperonal 6

Ciprofloxacina (estándar) 37

Bacitracina (estándar) 8

Fuente: Laboratorio 202 de Microbiología. Edificio T-12. Facultad de CCQQ y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. Campus Central - Zona 12.

CONCLUSIONES

• La piperina extraida presentó actividad antimicrobiana de manera similar que el estándar de piperina en el cultivo in-vitro de Staphylococcus aureus, formando un halo de 8 mm para ambos componentes a una concentración al 1% en DMS.

• El ácido pipérico y el piperonal no presentaron una actividad antimicrobiana considerable en el cultivo in-vitro de S. aureus.

• Se lograron extraer, purificar y caracterizar 1.9 g de Piperina a partir de 75 g del grano en bruto de la especie Piper nigrum.

• Se logró evaluar satisfactoriamente la modificación estructural de la piperina para formar ácido pipérico, obteniendo 0.453 g representando este un 78.93% de rendimiento de reacción.

• Se evaluó la modificación estructural de 0.45g de ácido pipérico obteniendo 0.169 g de piperonal, lo que representa un 54.64 % de rendimiento.

RECOMENDACIONES

• Con los compuestos sintetizados realizar antibiogramas en diferentes colonias de bacterias in-vitro como pueden ser: Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Ya que la piperina presenta actividad antimicrobiana en esas especies.

• Con los compuestos sintetizados realizar antibiogramas en diferentes cultivos in-vitro de hongos como pueden ser: Alternaria alternata, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Fusarium oxysporum. Debido a que la piperina presenta actividad antimicrobiana en esas especies.

• Realizar modificaciones estructurales a la piperina sin afectar el grupo amida y realizar antibiogramas en las bacterias y en los hongos anteriormente mencionados.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS • C. Sweetman, Sean (2009). Martindale: The Complete Drug Reference (36ª edición). United Kingdom: The Pharmaceutical Press. p.

2034.

• Cameo Chemicals. «Piperonal» (en inglés). Consultado el 30 de diciembre de 2012.Menzie, C. M. (l974). «Metabolism of Pesticides,

An Update.». Wildlife (Washington, DC: U.S. Department of the Interior, Fish, Wild-life Service, Special Scientific Report) (184): 257–

257.

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PIPERINE ISOLATED FROM PIPER NIGRUM”. Faculty of Oriental Medicine, Rangsit University, Pathumthani 12000, Thailand. Thai J.

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• Gosselin, R.E.; H.C. Hodge, R.P. Smith, and M.N. Gleason (1976). Clinical Toxicology of Commercial Products: 169.

• Ikan, R. (1991). “natural products - a laboratory guide" 2da Ed. Academic press, inc. Pp. 236-238.

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PIPERINA". Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONCYT. Ciudad de Guatemala.

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Recuperado de www.merck.com.gt/

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• Shiva Rani S.K. (2013). “Antimicrobial Activity of Black Pepper (Piper nigrum L.)”. Global Journal of Pharmacology 7 (1): 87-90.

Department of Botany, Osmania University College for Women, Koti, Hyderabad, India.

• Wuts P. (2007) “GREENE’S PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS”. 4 ed. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken,

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