Dra Gabriela M. Santiso

Unidad Micología Hospital Muñiz

Centro de Referencia en Micologia CABA

72º Congreso Argentino de Bioquímica

22 al 25 de agosto de 2017

Hotel Panamericano, Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Afrontando el Constante Desafío de la Bioquímica

Las técnicas moleculares tienen 4 aplicaciones fundamentales en micología:

• Aplicaciones taxonómicas para identificar las especies fúngicas

• Diagnóstico clínico temprano de las infecciones fúngicas

• Detección de los mecanismos de resistencia a los antifúngicos

• Tipificacion de subespecies y especies crípticas

Multilocus enzyme electroforesis (MLEE)

DNA fingerprinting

Random amplification of polimorphic DNA

(RAPD)

Amplified fragment length polymorphism (AFLP)

PCR fingerprinting

Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

Sequencing of ITS1-ITS2 rDNA region

Multilocus sequence typing (MLST)

Multilocus microsatellite typing (MLMT)

MALDI-TOF

Técnicas

Tipos de marcadores moleculares

Genes nucleares

• ARNr: LSU, SSU, 5.8S

• Proteinas especificas: β tubulina, αtubulina, calmodulina, factor de elongación de la traducción 1α, actina

Genes mitocondriales

Genoma

Secuencias primarias de proteinas especificas

Las especies están formadas por individuos que comparten la misma “esencia” (esencialismo aristotélico-platónico) Cada especie se separa de las demás por una clara discontinuidad morfológica (concepto morfológico) (1700)

El código de barras de ADN : análisis estandarizado de fragmentos de ADN cortos y de fácil amplificación por PCR, para la identificación de organismos a nivel de especie (Hebert y col., 2003; Stockinger y col., 2010). Precisa, rápida, económica, independiente del cultivo, universal y útil para ser aplicado por personal no especialista en el área (Frézal y Leblois, 2008). Un código de barras de ADN facilita la identificación de especies, diferenciación de especies crípticas, así como identificación de fragmentos de organismos o bien en cualquier etapa de su ciclo de vida (anamorfo y teleomorfo) lo cual no es posible por métodos basados en morfología (Gilmore y col., 2009).

• Son especies reconocidas por la variación de A.N. pero que no tienen diferencias fenotípicas.

Especies cripticas

• Especies que comparten el mismo ancestro común.

Especies hermanas

• Clado monofilético de especies con relevancia clínica equivalente

Complejo de especies

Especies crípticas • En biología un complejo críptico de especies es un grupo de especies

que satisfacen la definición biológica de especie —que están aislados reproductivamente de otras especies— pero no son distinguibles morfológicamente.

• Las especies individuales dentro del complejo sólo pueden ser separadas usando datos no morfológicos, como distintos análisis moleculares.

Importancia • Pueden diferir en:

• virulencia

• respuesta a los antifúngicos

• respuesta inmunológica

• Su correcta identificación es de especial importancia para el adecuado diagnóstico y tratamiento del paciente

Diferencias en

distribución geográfica

Diferencias en epidemiología

Diferencias en

sensibilidad a ATF

Diferencias en respuesta

inmunológica

Paracoccidioides brasiliensis complex

• S1

• PS2

• PS3

• PS4

Paracoccidioides lutzii

4 especies cripticas MLST Caracterizada por diferentes rasgos y distribución geográfica

Por estudio de polimorfismo de los genes GP43, ARF y PRP8 GP43 (43 KDa immunodominant glycoprotein), ARF (ADP-ribosylation factor) PRP8 intein (intervening parasitic genetic element from the PRP8 gene)

• Distribución geográfica

S1: Brasil, Argentina, Paraguay, Uruguay, Peru y Venezuela; PS2: Venezuela y Brazil, PS3: Colombia P lutzii: centro-oeste de Brasil

Diferenciación morfológica:

Debido a las sutiles o inexistentes diferencias morfológicas entre las especies crípticas, las técnicas moleculares se han convertido en la herramienta de elección para diferenciarlas

Se observó que el tamaño de la célula de levadura puede variar en un aislado dado y en aislados de la misma especie, pero no distingue entre S1, PS2, PS3 y P. lutzii.

P. lutzii ha presentado conidios muy largos característica frecuente de esta especie, haciendo que el tamaño y forma de los conidios potenciales marcadores morfológicos para diferenciación entre P. lutzii y las tres especies crípticas del complejo de P. brasiliensis (S1, PS2 y PS3).

Económica Rápida Fácil de llevar a cabo e interpretar Buena discriminación de especies

PCR-RFLP α Tubulina (BclI + MspI)

Implicancia clínica y diagnóstica

Clinica

• P lutzii: formas linfangíticas abdominales

Diagnóstico

• El diagnóstico inmunológico sólo detecta un genotipo de P brasiliensis complex: falsos negativos

• Dos subpoblaciones: centro y sur California

• Sur de California: Valle de San Joaquín

• Se extiende hasta frontera con México C immitis

• 3 subpoblaciones: Arizona, México/Texas, Sudamérica

• Nueva zona: Este de Washington C posadasii

Especies hibridas?

Existen comunicaciones de Ci en la zona de Lara, Venezuela, en Argentina y 3 autoctonos en Colombia

C posadasii

C immitis

Comparación entre especies

Caracteristicas C immitis C posadasii

Nicho ecológico Muy similares

Dist geográfica Limitada Amplia

Crecimiento en ClNa Más rápido Lento

Tamaño artroconidios Grandes Pequeños

Nucleotidicas

No presenta (gen) Gen: 2/prolina-rica

Quitín-sintasa, dioxigenasa, orotidina descarboxilasa,

serina proteinasa, quitinasa y 13 genes mas

Análisis filogenético de la secuencia de ADN correspondiente a una parte de cuatro genes independientes que codifican a proteínas: Arf (factor de ribosilación de ADP), anti-H (precursor del antígeno H), Ole (ácido graso desaturasa delta-9) y Tub 1 (alfa tubulina)

La variabilidad genética existente da la presencia de ocho clados separados e identificados, siete de los cuales están representados por grupos que podrían ser reconocidos genéticamente como especies filogenéticas, el clado Euroasiático muestra haber sido originado dentro del clado A de Latinoamérica

Phylogeography of the fungal pathogen Histoplasma capsulatum, Kasuga et. Al Mol. Ecol Volume 12, Issue 12 December 2003 Pages 3383–3401

Especie

Conidios sésiles pigmentados en PDA

Col › 50 mm en PDA a 30ºC 21 d

Crecimiento a 37ºC

Asimilación de Sacarosa en YNB

Asimilación de Rafinosa en YNB

S brasiliensis SI NO SI - -

S luriei NO NO SI - -

S globosa SI NO NO + -

S mexicana SI SI SI + +

S schenckii SI NO SI + +

S albicans NO SI SI + -

Secuenciacion de ITS, Calmodulina translation elongation factor-1 (TEF1) y 3 (TEF3).

Asia S. globosa (99.3 %), Australia y sur de Africa S. schenckii (94 %), sudeste de Sudamérica S. brasiliensis (88 %), oeste de Sudamerica y centro y norte de America S. schenckii (89 %).

FUSARIUM TIENE UNA Sensiblidad CAMBIANTE !!!

TODOS SON COMPLEJOS

Criterios moleculares en la taxonomía de Fusarium ha permitido demostrar que las clásicas especies patógenas del género, como son F. verticillioides (F. moniliforme), F.oxysporum y

F. solani, constituyen en realidad complejos de especies

Fusarium sp o Especie del complejo F.solani

Dada la dificultad de identificar morfológicamente muchas de las cepas de especies filogenéticas implicadas en casos clínicos, para permitir reconocer dichas cepas y poder realizar estudios epidemiológicos, se ha establecido una nomenclatura particular de secuencias tipos o haplotipos obtenidas mediante la secuenciación de los genes EF-1α, RPB1 y RPB2.

La identificación de los aislados clínicos a nivel de especie o de haplotipos tiene un gran interés científico y epidemiológico, pero desde un punto de vista práctico con respecto al tratamiento del enfermo se ha demostrado que en general la mayoría de especies filogenéticas suelen ser resistentes a los antifúngicos utilizados en clínica

Complejos de especies de Fusarium que agrupan especies filogenéticas de importancia clínica

Complejo de especies Especies filogenéticas

Fusarium chlamydosporum 3

Fusarium dimerum 5

Fusarium incarnatum/equiseti 20

Fusarium oxysporum 20

Fusarium sambucinum 3

Fusarium solani 21

Fusarium tricinctum 4

Gibberella fujikuroi 11

Filogenia

se han descripto varias especies crípticas que además tienen un

patrón de resistencia a los antifúngicos diferente por lo que su identificación es de

gran relevancia en clínica.

presenta también una sensibilidad disminuida a la anfotericina B.

Estudios de secuenciación multilocus han demostrado que la nueva especie

Aspergillus alabamensis dentro del complejo puede colonizar sujetos

inmunocompetentes y presenta una sensibilidad disminuida a la anfotericina B

, se han descripto varias especies patógenas humanas una

nueva especie, que presenta una sensibilidad reducida a los triazoles, a la que se

denominó Aspergillus calidoustus

Recomendaciones Para la identificación molecular de cepas clínicas de Aspergillus a nivel de especie. Una primera identificación fenotípica del aislado continuar con la secuenciación de la región ITS y de los genes de la β-tubulina o Calmodulina.

Cryptococcus neoformans

C. neoformans

var. grubii

Serotipo A

Genotipo VNI

Genotipo VNII

C. neoformans

var. neoformans

Serotipo D

Genotipo VNIV

Hibrido

Serotipo AD Genotipo VNIII

Cryptococcus gattii Serotipos B y C

Genotipos VGI, VGII,

VGIII, VGIV

8 t

ipo

s m

ole

cula

res

o g

eno

tip

os

Genotipificación Género Cryptococcus

Extracción de ADN a partir de cultivos de Cryptococcus spp PCR-RFLP amplificación con primers URA 5 (orotidin monofosfato pirofosforilasa) y SOJ 1 Corte con enzimas de restricción: HhaI y Sau96I.

207 cepas estudiadas 174 VNI (84,05%) 14 VNII (6,76%) 10 VNIII (4,83%) 2 VNIV (0,97%) 3 VGI (1,45%) 3 VGII de (1,45%) 1 VGIII (0,49%). Todos los aislamientos VNI correspondieron a pacientes con criptococosis diseminada asociada al sida y los genotipos VGI, VGII y VGIII a criptococosis en enfermos VIH negativos.

Amplificacion por PCR del Gen que codifica para la proteína de la pared 1 (HWP1) • C. albicans 1180 pb • C. dubliniensis 930 pb • C. africana 750 pb

Candida nivariensis fue descrita originariamente en España a partir de muestras clínicas y posteriormente aislada de diferentes tipos de infecciones en Indonesia, Japón e Inglaterra. Es menos sensible a los azoles que C. glabrata. Candida bracarensis ha causado diferentes tipos de infecciones en Portugal, Inglaterra y EE. UU, su sensibilidad a los antifúngicos muy parecida a la de C. glabrata

•PCR multiplex

•Amplificación del gen de la deshidrogenasa alcohólica secundaria por PCR y los productos son analizados mediante cortes con enzimas de restricción, mediante el uso de la enzima BanI.

•PCR multiplex • C parapsilosis forma mas

biofilm y es mas R a FCZ y Equinocandinas

• C metapsilosis y C orthopsilosis tienen CIM mas bajas a los ATF

Conclusiones ?