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“Producción en soya (Glycine max L.) de proteínas
multiepítope neutralizantes de varios aislados del Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (HIV) como una estrategia de
inmunización de bajo costo”
Dr. Sergio Rosales Mendoza
M.C. Lucía Orellana Escobedo
Universidad Autónoma de San Luis Potosí
Laboratorio de Biofarmacéuticos Recombinantes
Agosto 2, 2012
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Virus de la InmunodeficienciaHumana (VIH)
• VIH causante del SIDA.
• 33.4 millones de personas viven con VIH (UNAIDS).
• La vacunación se considera el método de elección para su erradicación.
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Vacunas
• Vacunas de virus atenuados
– Riesgoso
• Vacunas de virus inactivados
– Poco inmunogénicas
• Vacunas de subunidades
– Péptidos sintéticos (Agrawal et al., 2003; Bradney et al., 2002; Varona-Santos et al., 2006)
– Proteínas recombinantes (completas o quiméricas) (Pantaleo et al., 2004; Shu et al., 2007)
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Infección de linfocitos T
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Región C4 y el asa V3
C4: constituye una parte importante del sitio de unión (CD4) en la envoltura viral. V3: inducción de anticuerpos neutralizantes y capacidad inmunogénica(Gray et al., 2010; Haynes et al., 2006; Rerks-Ngarm et al., 2009; Varona-Santos et al., 2006).
Epítope neutralizante ELDKWA
Regiones conservadas, inducción de anticuerpos neutralizantes (Bomsel et al., 2011; Coutant et al., 2008; Delcroix-Genete et al., 2006; Dong et al., 2005; Yu et al., 2008).
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Epítopes del asa V3 de gp120 inducen respuestas neutralizantes
Zolla-Pazner et al., 2008. Virology.
Región variableEstrategias:•repetidos en tándem de variantes•Secuencias consenso
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Inmunización oral con CVLPs-ELDKWA induce anticuerpos neutralizantes
Zhang et al., 2004. Journal of Virology.
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Plantas: Plataforma para la producción de proteínas
• Producción a gran escala
• Bajos costos
• Habilidad de producir proteínas objetivo con las funciones biológicas y estructurales deseadas
• Ausencia de patógenos humanos o animales
• Desarrollo de vacunas orales
(Mason and Herbst-Kralovetz, 2012; Sharma and Sharma, 2009)
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Plantas: plataforma para producciónde proteínas
• Vacunas basadas en plantas
• Producción de antígenos (VIH)
– p24 (Gonzalez-Rabade et al., 2011)
– Tat (Cueno et al., 2010)
– Nef (de Virgilio et al., 2008)
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Vacunas, anticuerpos y proteínas terapéuticasbasadas en plantas
• E.coli LT-B (papa; diarrea; oral) Fase 1• Rabia GP/NP (espinaca; rabia; oral) Fase 1• H1N1 (tabaco; influenza; intramuscular) Fase 1
• Anti-CCR5 (tabaco; HIV; tópico) Pre-clínico• Anti-HIV gp120 (maiz; HIV; tópico) Pre-clínico
• Insulina (azafrán; diabetes; subcutáneo) Fase 2• Factor intrínseco (Arabidopsis thaliana; def B12; oral)
Fase 2
Yusibov et al., 2011
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Plantas transgénicasVector de expresión
Transferencia de vector Planta transgénica
Fase de cultivo in vitro
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Fitohormonas
• Derivadas del metabolismo secundario
• Papel central en la fisiología de plantas– Eventos de crecimiento, elongación, división y diferenciación
celular
• Inducen señalización a través de una variedad de receptores. – Modificación en la expresión de ciertos genes
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Fitohormonas
– Auxinas: Regulan expansión y son determinantes en la estatura de la planta y tamaño de los órganos.• Ácido naftalenacético (ANA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-
D), ácido indolbutírico (IBA).
– Citocininas: Controlan crecimiento a través de la divisióncelular y diferenciación.• Benciladenina (BA, BAP)
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Garbanzo (Cicer arietinum L.) y Soya(Glycine max L.)
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Objetivo General
• Producir una proteína multiepítope del VIH en semillas de tabaco, garbanzo y soya y caracterizarlas en un modelo de inmunización en ratones BALB/c
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Objetivos específicos
• Diseño y obtención del gen sintético– Optimizado para su transcripción y traducción en plantas
• Clonación, transferencia y expresión del gen en modelos vegetales– Diferentes promotores y señales de retención
• Caracterización molecular de las líneastransgénicas– Comprobar presencia del transgén, niveles de expresión de la proteína y
su antigenicidad
• Caracterización de las propiedadesinmunogénicas de la proteína– Evaluación de la respuesta humoral en intestino y suero
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Metodología y Resultados
Diseño del gen sintético
Construcción de vectores de expresión
Transformación genética de tabaco,
garbanzo y soya
Análisis molecular de plantas
transgénicas
Análisis de Inmunogenicidad
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Optimización y síntesis por la compañía GenScript.
Confirmación mediante secuenciación.
C4Epítopes de V3
Epítope de gp41
Péptido señal de la glicinina
Sitio NcoICodón de incio
Sitio BstEIICodón de paro
Etiqueta de Histidinas
Diseño del gen sintético sHIV
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M A K L V F S L C F L L F S G C C F A C M P L V K Q I I N M W Q E V G K A M Y A L L A R P N N N T R K S I H I G P G R A F Y A T E A G A G G I K Q L Q A R V L A V E R Y A G G G N E Q E L L E L D K W A S L W N A G G G L K L D Q W A A G G A A L D S W N A G G A A L D K W D N G A G G A E L D K W A G A G A G P G R A F G P G R A F G P G R A F H H H H H H Stop
Péptido señal de la glicininaRegión C4Secuencia consenso V3 de HaynesEpítope ELDKWA de gp41Repeticiones de secuencias de V3M metionina de inicioStop paro
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Gen sHIVPromotor 35 S
Promotor Glicinina
Ncol y BstEII BamHI y BstEII BamHI y Ncol
Vector Gen sHIV Vector pCAMBIA 1304 Vector pCR-GPro
Ligación
pGly
Reportero GUS
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Transformación E. coli y A. tumefaciens
• Transformación E. coli mediante choquetérmico
• Transformación A. tumefaciens medianteelectroporación
Antes del pulso Durante el pulso Después del pulso
Membrana celular
Introducir genes
Campo eléctrico induce un voltaje a través de la
membrana celular
Vector entra en la célula
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Electroforesis y digestión con enzimas NcoI y BstEII (E. coli)
1000 bp
500 bp
Vector
Inserto sHIV
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Transformación genética de tabaco
Medio SelectivoBenciladenina 1 μg/ml
Acido naftalenacético0.1 μg/ml
Horsch et al., 1985No reguladores
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Plantas transgénicas de tabaco
• Generación de 20 líneas y se seleccionaron 4 de ellas para su análisis (T-0)
• Las plantas no han mostrado alteraciones fenotípicas
• Obtención de semillas de la generación T-1 para obtenerplantas generación T-2
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PCR (Tabaco)
MarcadorPM + 1 2 3 4 - 5 6 7 8 9
Amplificación del gen de resistencia a higromicina
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Western Blot Anti-histidinas (Tabaco)
+ 1 2+ _
25 kD
Preliminar
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Transformación genética de soya
Acido 2,4- Diclorofenoxiacético40 mg/L 20 mg/L
Medio de Maduración Ko et al., 2006
Histodiferenciación
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Transformación genética de garbanzo
Benciladenina 3 mg/L
Benciladenina 1 mg/L Polowick et al., 2004
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Transformación genética de garbanzo
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Experimentos pendientes
• ELISA
– Detección de proteínas heterólogas y estimarniveles de expresión.
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Experimentos pendientes
• Análisis molecular de plantas transgénicas:
– Confirmar mediante PCR la presencia de transgén en plantas regeneradas de garbanzo y plantas T-2 de tabaco
Análisis de inmunogenicidad Ratones BALB/c
Inmunizaciones en investigacionesparalelas
4 inmunizaciones por la vía oral4 inmunizaciones por la vía subcutánea• Sacrificio de ratones• Colección de suero y lavados
intestinales
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UNAM. Facultad de Estudios Superiores de Iztacala
Dra. Leticia Moreno Fierros
Universidad de Illinois, IL, USA
Dr. Schuyler S. Korban
INSTITUCIONES PARTICIPANTES
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GRACIAS POR SU ATENCIÓN