presentación de un articulo cientifico

7/24/2019 Presentacin de un articulo cientifico

1/30

Purifcation o a

Pyrogen-Free HumanGrowth Hormone

antagonistTingyue Gu, Yizhou Zheng, et

al.Deartament o chemical!ngineering an" Deartamento #iological $ciencies, !"ison#iotechnolo %nstitute, &hio


2/30

%ntro"ucci3n

La Hormona de crecimiento humana esuna protena con 191 aminocidos (PM:22kDa)


3/30

%ntro"ucci3n

Alteracin del !en de la h"H# cam$iando"l% (")12& Ar!inina (')

$ser*aron +ue esa nue*a mol,culaactua$a como anta!onista# suprima

si!ni-cati*amente el crecimiento La h"H % el anta!onista (h"H"12&')poseen distintas retenciones en una ./ 'P0HPL.


4/30

Fig. 0. Dierencias en el tiemo "e retenci3n "e la hGH

y su antagonista en 4P-HP56.

ci3n


5/30

Donstream para puri-car h"H"12&' deun culti*o celular de cel L de ratn

La h"H"12&' es secretada en 3orma acti*apor las c,lulas

4ratamiento para en3ermedades en la +ueha%a ni*eles altos de h"H (Dia$etes tipo1)

%ntro"ucci3n


6/30

6l anta!onista se necesita en 3ormain%ecta$le por lo +ue de$e ser li$re depir!enos % puri-cado

6s inesta$le

6ste tra$a7o proporciona al!unos detallesso$re el desarrollo de proceso de

dostream para la puri-cacin deh"H"12&' a partir de un culti*o c,lulas Lde ratn recom$inantes

%ntro"ucci3n


7/30

7eto"olog8a

.ulti*o de la c,lulas animales Donstream HPL. anlisis de h"H"12&' 6nsa%o de pir!enos 6nsa%o de acti*idad $iol!ica


8/30

.ulti*o: e reali;o un culti*o celular a partirde c,lulas L de ratn recom$inantes+ue contenan el !en de h"H"12&'

(dise .2 a?.(medio: /#5 !@L !lucosa 5B5

m!@L l0!lutamina)4odos los das se toma$an 2&&025&mLen 1& tu$os# +ue se di*idan en dos

!rupos de 5 Los cuales se

7eto"olog8a


9/30

Downstream7eto"olo

g8a


10/30

Dowstream

1.lari-cacin celular: 5&&mLcentri3u!ados a 8&&& rpm por &min(81&&!)

2Precipitacin % re suspensin:a!re!ado de sul3ato de amonio# paraprecipitar la protena centri3u!acin %

re suspensin en a!ua (concentrarla protena)

=ltra-ltracin con un mem$rana Bk:

esta -ltracin retiene la protena %

7eto"olog8a


11/30

Downstream

1=ltra-ltracin con una mem$rana de1&&k: Ahora pasa la protena a tra*,sde la mem$rana % se retienen las

cosas mas !randes# como pir!enos uotras protenas contaminantes2'P0HPL. (3ase re*ersa): se utili;ocomo sol*ente A.C (acetonitrilo) /&>

> 4A (triEuoroacetico)"radiente 3ue de /&> A.C0B&> A.Cdurante 8& min a 5mL@min (medido a

22&nm)

7eto"olog8a


12/30

Downstrean

1eparacin de 3ases a $a7atemperatura: la 3raccin +ue contenala protena es 8&>0 &>A.C>4A A 02&?. la protena+ueda en la 3ase con!elada# por serhidro3lica Los F no se con!elan aesa temperatura

2Guer eIchan!e: dia-ltracin parasacarnos de encima mol,culas de$a7o PM

Lio-li;acin: mediante una

7eto"olog8a


13/30

9n:lisis "e HP56

Durante todo el proceso depuri-cacin se cuanti-co laconcentracin de la protena#

mediante HPL. Para la che+uear la puri-cacin delproducto -nal se eli!i anin0

eIchan!e HPL. (con un !radiente deCa.l M# pH B) % 6. si;eeIclusin HPL. ($icar$onato deamonio &5 M)

7eto"olog8a


14/30

!nsayo "e Pir3genos

e reali; con un test LAL (en;ima sustrato incoloro 6 coli endotoIinaestndar) +ue consiste en un reaccin

en;imtica +ue da como resultado unproducto coloreado

7eto"olog8a


15/30

!nsayo "e ;ioacti(i"a"

e reali;o un ensa%o con una h"H marcadaradiacti*amente e incu$aron mem$ranasde ratn trans!,nicos % sal*a7es# con JKh"H

a!re!ando cantidades de h"H"12&' Lue!o se incu$o hr se 3reno la reaccin#se centri3u!o % se midi radiacti*idad enlos pellets

7eto"olog8a


16/30

4esulta"os y "iscusi3n

Anlisis del proceso de puri-cacin: La $ase del proceso es el paso de 'P0HPL.# para reducir el *olumen de la

muestra % eliminar impure;as lamuestra se concentra % puri-ca

l "


17/30

Fig. lulas y restos celulares yo;tener un so;rena"ante rico en hGHG04.

0.6larifcaci3n celular

4esulta"os

4 l "


18/30

0.Preciitaci3n y resusensi3n

Fig. * . Perfl "e 4P-HP56 "el reciita"o resusen"i"oen agua. $e o;ser(an menos imurezas en el tiemo "e

retenci3n 0=-min. !ste aso concentro la muestra.

4esulta"os

4 l "


19/30

0.'ltrafltraci3n con la mem;rana "e +?.

Fig. . Perfl "e HP56 "e la mem;rana +?. $e o;ser(a

@ue las rote8nas "el suero ueron reteni"as.

4esulta"os

4 lt "


20/30

0.'ltrafltraci3n con la mem;rana "e0?.

Fig. A. Perfl "e HP56 "e la mem;rana 0? racci3n @ue

aso la mem;rana.

4esulta"os


21/30

0.'ltrafltraci3n con la mem;rana "e0?.

Fig. =. Perfl "e HP56 "e la mem;rana 0?, racci3n @ueue reteni"a. $e (e @ue las rote8nas "el suero ueron

reteni"as

4 lt "


22/30

0.4P-HP56 /ase re(ersa2

Fig. +. Perfl 4P-HP56 "e la racci3n hGHG04 "esu>s la 4P-HP56. 6on este aso se alcanz3 la ureza necesaria. 5aFracci3n tu(o un (olumen "e 0+ m5.

4esulta"os

4 lt "


23/30

1eparacin de 3ases: la ultima 3raccino$tenida contiene entre un 8&>0&> deA.C % > de 4A i se lio-li;adirectamente se puede da


24/30

1Guer eIchan!e: este paso remo*i elresto de A.C % 4A a tra*,s de ladia-ltracin con a!ua usando una

mem$rana de 1&k Despu,s de este pasoel *olumen +ue +uedo de muestra 3ue demL

4esulta"os

4 lt "


25/30

5ioflizaci3nB16sta 3orma es desea$le para el almacenamiento %

3ormulacin de la 3amilia de protena "H

Fig. 1. Perfl "e 4P-HP56 "e hGHG04 urifca"a y

re"isuelta en soluci3n.

4esulta"os

4 lt "


26/30

'endimientos: el promedio de cada paso 3ue

95#5> Pero el !eneral 3ue del 89> De$ido a lacantidad de pasos no se puede lo!rar unrendimiento alto uitar pasos podracomprometer la pure;a de la muestra % lasosteni$ilidad del proceso

4esulta"os

4es lta"


27/30

Anlisis de pir!enos: el anlisis LAL lue!o de lamem$rana de Bk 3ue de 1# 6=@m! h"H"12&'Despu,s de la -ltracin de 1&&k se redu7o el ni*elde pir!enos a & 6=@m! h"H"12&' 6lproducto -nal 6=@m! h"H"12&' ue resultamenor a 5#& 6=@k! de peso

Anlisis de pure;a del producto: en el ultimo!ra-co se *en poca cantidad de impure;as en eltiempo 1#/ min Antes de la -ltracin con la

mem$rana de Bk se paso la muestra por un 6.#la cual tiene me7or resolucin +ue la ultra-ltracin#% por otro lado por una ion0eIchan!e HPL. 6lpaso de la 6. me7ora la puri-cacin pero

consume tiempo

4esulta"os

4esulta"


28/30

6nsa%os de $ioacti*idad: este ensa%o muestra +uela puri-cacin produce h"H"12&' en 3ormaacti*a ActNa como un anta!onista 6l producto sein%ecto en ratones dia$,ticos % los resultadosiniciales mostraron una disminucin del ni*el del3actor Jnsulinlike !roth como se ha$a predicho

4esulta"os


29/30

6onclusiones

6l proceso de puri-cacin es capa; de producirh"H"12&' acti*a

Puede ser modi-cado: 'eempla;ar la precipitacin con sales por una

-ltracin con mem$rana# para aumentar el*olumen

Antes de la precipitacin reali;ar una h%dropho$icinteraction chromato!raph% para remo*er

protenas del suero La centri3u!acin se puede reempla;ar por una

micro-ltracin para reducir el tiempo


30/30

7uchas GraciasC

presentación de un articulo cientifico

Documents