présentation de la biotechnologie à merck serono ... · 100 gr ! 47 6 mois dans le département...
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Agenda
• Présentation de la biotechnologie à Merck Serono
• Importance des gazomètres pour la biotechnologie
• 1 an dans le département biotechnologie
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Agenda
• Présentation de la biotechnologie à Merck Serono
• Importance des gazomètres pour la biotechnologie
• 1 an dans le département biotechnologie
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Qu’est ce que la biotechnologie ?
• Biotechnologie = ensemble de méthodes et techniques qui utilisent des organismes vivants pour des applications dans de multiples domaines : alimentation, agriculture, pharmacie, médecine.
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Utilisation de la biotechnologie à MSA
• Merck Serono Aubonne : site de production de protéines recombinantes pour des médicaments injectables
• Technologie : Culture de cellules animales transfectées avec un vecteur d'expression contenant le gène humain de la protéine d’intérêt
Noyau cellulaire
Vecteur d’expression Gène de la protéine d’intérêt
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Utilisation de la biotechnologie à MSA
• Processus de production
Etape d’amplification
Etape de production
Etape de purification
Bouteilles roulantes, T-flask, wave-bag,
bioréacteur…
Bioréacteurs
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Utilisation de la biotechnologie à MSA
• Objectifs de l’entreprise : Garantir la qualité du médicament et son innocuité. Produire la protéine d’intérêt en quantité significative.
• Cela implique d’avoir la protéine adéquate (repliement, glycosylation, non-antigénique, biologiquement active) à de grands volumes, identique de lot à lot.
L’élément-clé : la culture cellulaire
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• Conditions requises pour le succès de la culture cellulaire
Utilisation de la biotechnologie à MSA
• Règles applicables quel que soit le mode de culture en bioréacteur
– Maintien d’un environnement physiologique optimal: Fixer des paramètres opérationnels selon les étapes du procédé, Définir les limites de contrôles des paramètres critiques Réguler le procédé pour éviter les dérives
– Mettre à disposition les nutriments essentiels
– Offrir une surface / un volume de culture adéquat
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• Les modes de culture en bioréacteur que nous utilisons
Utilisation de la biotechnologie à MSA
Fed-Batch Culture Continue (perfusion)
Volume variable Système « ouvert »
T°C
P
Air
pH Apport milieu
gaz
Volume constant Système « ouvert »
T°C
P
Air
pH Milieu NaOH
gaz
Débit
Tout dépend du type de cellules et le la fragilité de la molécule
NaOH
Surnageant de culture
Surnageant de culture
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• Offrir une surface de culture
Utilisation de la biotechnologie à MSA
Air
Milieu NaOH
Unité de contrôle
Cellules en suspension
Surnageant de culture
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• Offrir une surface de culture
Utilisation de la biotechnologie à MSA
Air
Milieu NaOH
Unité de contrôle
Lit fluidisé
Cellules + microporteurs
Surnageant de culture
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Agenda
• Présentation de la biotechnologie à Merck Serono
• Importance des gazomètres pour la biotechnologie
• 1 an dans le département biotechnologie
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• Pourquoi des analyseurs de gaz du sang ? – Nos cultures se font avec des cellules de mammifères
– Pour des raisons historiques : • Premiers analyseurs de gaz du sang vers les années 60 • Premiers analyseurs pour la biotechnologie vers les années 90
– Pour des raisons de gain de temps
– Pour des raisons techniques
Importance des gazomètres pour la biotechnologie
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Les gazomètres
• Gazomètres utilisés pour le suivi des productions commerciales en bioréacteur
• Gazomètres mesurent les paramètres du gaz du sang + pH et selon les modèles, mesurent de paramètres supplémentaires – ABL5 (gaz) – EML105 (glucose, lactate) – ABL805 (gaz, glucose, lactate)
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Importance des paramètres : le pH
• Procédé avec pH fixe (pH régulé à ± 0,1 unité) • pH constamment suivi par une sonde interne • pH suivi quotidiennement par une mesure externe
contrôle de la dérive de la sonde interne
• Important en phase de croissance pour : – Une multiplication cellulaire rapide – Atteindre la densité cellulaire souhaitée
• Important en phase de production pour : – Obtenir une molécule conforme – Produire la quantité souhaitée de molécule d’intérêt
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Importance des paramètres : la pCO2
• pCO2 varie selon les étapes en bioréacteur
• Limites de contrôle haute : 120 mmHg
• pCO2 suivie quotidiennement par une mesure externe (Pas de sonde pCO2 sur le bioréacteur)
• Mesure externe difficile (dégazage rapide de l’échantillon)
• Important pour : – Contrôler l’efficacité de l’aération de surface
– prédire une bonne productivité spécifique
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Importance des paramètres : le glucose et le lactate
• Les métabolites sont apportés de manière dis/continue dans le bioréacteur (fed batch/perfusion)
• Paramètres critiques selon le procédé
• Concentrations des métabolites suivies quotidiennement par dosage externe uniquement
• Important pour : – Piloter la croissance des cellules – Piloter la production de molécule d’intérêt
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Importance des paramètres : le glucose et le lactate
• Piloter la croissance des cellules à partir du glucose résiduel
Croissance Production
Limite : 0,25g/L
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Importance des paramètres : le glucose et le lactate
• Piloter la croissance des cellules à partir du lactate produit
Croissance Production
Action
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Croissance Production
Importance des paramètres : le glucose et le lactate
• Piloter la production à partir du « glucose consommation rate specific » ou « lactate production rate specific »
Constant
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Importance des gazomètres en biotechnologie
• Utilisation stricte pour être en adéquation avec les GMP – Qualification/documentation pour
introduire l’appareil
– Avant utilisation : • Vérification de l’état du système
• Vérification de la bonne calibration de l’appareil avec un contrôle
– Suivi des appareils consigné dans les logbooks
– Consignation des résultats dans les dossiers de production
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Agenda
• Présentation de la biotechnologie à Merck Serono
• Importance des gazomètres pour la biotechnologie
• 6 mois dans le département biotechnologie
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6 mois dans le département biotechnologie : Jeu de l’oie
Présentation d’évènements liés à la culture cellulaire et aux gazomètres au travers d’un jeu de l’oie :
– Vous êtes chef d’équipe de l’unité de production qui pilote les bioréacteurs
– Votre but : produire 100 g d’hormone humaine recombinante conforme en 1 an
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T°Ccroissance : 37°C; T°Cproduction : 33°C P=1bar pH=7 Vitesse agitation : 15rpm
6 mois dans le département biotechnologie : Jeu de l‘oie
Durée du procédé : Etape de croissance : 6 jours Etape de production : 32 jours
Milieu (débit variable) 3g/L de glucose 0g/L de lactate
Prélèvement pour analyses off-line
Récolte de surnageant de culture
Observation visuelle pH, pCO2, Glc, Lac, Comptage des cellules
Contrôle qualité molécule
Air : 45% O2
Sortie Air
NaOH Anti-mousse
[cellules inoculation] =30 milliard/ml Vculture = 200 L
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6 mois dans le département biotechnologie
• Phase de croissance : réglage du débit de milieu
Références de la précédente campagne Run 1
Suivi de la production de lactate
Suivi du débit de milieu
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6 mois dans le département biotechnologie
• La phase de croissance s’est bien déroulée
Références de la précédente campagne Run 1
Courbe de la croissance cellulaire
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6 mois dans le département biotechnologie
• La phase de croissance s’est bien déroulée
Références de la précédente campagne Run 1
Suivi du glucose résiduel
0,45 g/L
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6 mois dans le département biotechnologie
• Phase de production : quelques interventions pour la régulation du pH
Régulation du pH
D > 0,05
pH ABL5 7,06
pH Sonde 7,00
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• La phase de production s’est bien déroulée
6 mois dans le département biotechnologie
Suivi de la consommation spécifique en glucose
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6 mois dans le département biotechnologie
• Félicitation ! Vous avez produit 9,41g Production cumulée de la protéine d’intérêt
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6 mois dans le département biotechnologie
• Félicitation ! Vous avez produit 29,5 g en 3 runs Run 1 Run 2 Run 3 Mais
Beaucoup d’intervention sur l’EML105 Mesures préventives nécessaires
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6 mois dans le département biotechnologie
• Panne grave sur un EML105
• Mesure préventive pour l’EML105 : Les appareils sont vieux Remplacement par une nouvelle
génération d’analyseur Glucose/Lactate Quelle stratégie et quels besoins? Business Case
• Votre choix :
+ =
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6 mois dans le département biotechnologie
• Introduction de l’ABL805 : Documentation du remplacement – URS pour le service des achats, CCP dans TrackWise
• Il faut nous assurer que l’appareil répond bien à nos besoins – Protocole de qualification d’installation et qualification opérationnelle
– Protocole de qualification des performances • Précision, répétabilité
• Équivalence des paramètres avec les appareils qu’il remplace selon la norme DIN38402-71 (important pour garder la protéine adéquate)
Démonstration de l’équivalence de mesure En cas de non équivalence, calcul d’un facteur de correction
– Exécution des tests et rédaction des rapports
– Procédure d’utilisation de l’appareil
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6 mois dans le département biotechnologie • Pendant ce temps…Vous avez conduit 2 runs supplémentaires
… et produit 49,59 g
Run1 Run2 Run3 Run4 Run5
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6 mois dans le département biotechnologie
Attention déviations!
Action : Confirmation ou non par un prélèvement Action corrective Investigation
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6 mois dans le département biotechnologie
• Félicitation ! Vous avez produit 69,17 g
Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8
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6 mois dans le département biotechnologie
pH < 6 [Glucose] : 0,2 g/L
Et les autres paramètres… [lactate] : 2,5 g/L pCO2 > 120 mmHg
Etat frais
• Alarme pH! Glucose très bas! • Vous avez contaminé le bioréacteur du run 6!
Investigation sur le germe et la cause
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6 mois dans le département biotechnologie
• Vous avez trouvé les causes de la contamination
Germe : Bacillus subtilis Origine de la contamination : filtre à air mouillé
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6 mois dans le département biotechnologie
Félicitation ! Vous avez produit 89,29g
Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8 Run9 Run10
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6 mois dans le département biotechnologie
Analyse multivariée des tous les paramètres des campagnes de production
Runs : production > 10g ; Runs : 10g > production > 9g ; Runs : production < 9g
Recommandations
Suivi de la pCO2
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6 mois dans le département biotechnologie
100 gr !
Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8 Run9 Run10 Run11
100,48 g !
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Conclusions
• Les gazomètres nous permettent d’être à l’écoute des cellules
• Ils font partie intégrante de nos procédés
• Ils participent à la production d’une molécule de qualité et à la reproductibilité de cette molécule d’un lot à un autre