Roma, 27 settembre 2018

Club del Globulo Rosso

Rosario NotaroCancer Genetics and Gene Transfer

Core Research Laboratory - ISPRO

Florence

PNH – EPNEmoglobinuria Parossistica Notturna

Rosario Notaro: Nessun conflitto d’interesse

Conflitti d’Interesse

Emolisi cronica intravascolare: con crisi

Trombosi:venose, addominali, spesso multiple

Emoglobinuria Parossistica Notturna

L’EPN è una rara malattia clonale acquisita del sangue

caratterizzata dalla triade clinica:

Citopenie (Insufficienza midollare):comune, a volte grave

WBC /µl Plts /µl

Emolisi e insufficienza midollare in EPN

Emolisi

Citopenie

EPN

Aplasia

EPN/Aplasia(PNH/AA syndrome)

Test di Ham nell’EPN

Globuli Rossi

di un Paziente EPNControllo

Siero Siero In. Siero

+ acido + acido + acido

Proteine assenti sulle cellule ematiche EPN

CD59, CD90, CD109

CD55

CD58*

CD59

CD48

CDw52

PrPc

CD16*

CD24 CD55

CD58* CD59

CD48 PrPC

CD73 CDw108

CD55

CD58*

CD59

CD109

PrPC

GP500

Gova/b

CD55

CD58*

CD59

PrPC

AChE

JMH Ag

Dombroch

HG Ag

CD55 CD58*

CD59 CD14

CD16 CD24

CD48 CD66b

CD66c CD87

CD109 CD157

LAPNB1 PrPC

p50-80 GPI-80

ADP-RT

NA1/N

A2

CD14 CD55

CD58* CD59

CD48 CDw52

CD87 CD109

CD157 Group 8

PrPC GPI-80

CD16*

CD55 CD58*

CD59 CD48

CDw52 CD87

CDw108 PrPc

ADP-RT CD73

CD90 CD109

CD16*

Hematopoietic

Stem Cell

Platelets

RBC

PMN

B cells

Monocytes

T cells

NK cells

Tutte queste Proteine

sono legate con l’ancora GPI

51%91%

93%

Neutrofili Monociti Globuli rossi

Diagnosi di EPNCitofluorimetria per marcatori GPI-linked sulle cellule del sangue

CD66b FITC CD14 FITC

Pazie

nte

EP

NN

orm

ale

CD59 FITC

Patogenesi Molecolare dell’EPN- mutazioni somatiche nel gene X-legato PIGA -

Staminale normaleStaminale EPN

ER

nucleo

X chr.

PIGA

protein

Inositol-P

PIG-A

Ancora GPI

+

GPI

PIG-A

Cellula normale

Etn-P

glycan

GlcN

Cellula mutata in PIGA

• Emolisi Intravascolare

• Trombosi

• Insufficienza midollare

Emoglobinuria Parossistica Notturna

Patogenesi

• Emolisi Intravascolare

• Trombosi

• Insufficienza midollare

Emoglobinuria Parossistica Notturna

Patogenesi

C5

C3

CD55

CD59

Factor H

CD46

CR1

Factor I

C5

C3

C4bp

Inibitori del Complemento

Membrana Solubili

Il Sistema Complementare MicroorganismsAntigen-Antibody

Constitutive/

Microorganisms

Via

Classica

Via

Lecitin

e

Via

Alternativa

Modificato da Brown et al, Nat Clin Pract Nephrol 2007

Clusterin

Protein S

C1 Inh

Factor I

CD55

CD59

in EPN

Complesso di

Attacco alla Membrana

Loop di

amplificazion

e

C5b-C9

CD55

C5C3 C5C3

Eritrocita normaleClassical

pathway

Lectin

pathway

Alternative

pathway

Il Controllo del Complemento nei soggetti sani

C5C3 C5C3

Classical

pathway

Lectin

pathway

Alternative

pathway

C5b-C9

Il Controllo del Complemento nei Pazienti EPN

Eritrocita EPN

Conseguenze dell’emolisi intravascolare

Emosiderinuria

Perdita di Ferro

ANEMIA(bassa Hgb)

Deplezione

Ossido nitrico

distonia

muscolatura liscia

• Dolori addominali

• Astenia

• Disfagia

• Disfunzione erettile

• (Insufficienza renale)

• (Ipertensione polmonare)

Emolisi Intravascolare

Emoglobinemia

Emoglobinuria

Elevato LDH

Elevati

Reticolociti

• Emolisi Intravascolare

• Trombosi

• Insufficienza midollare

Emoglobinuria Parossistica Notturna

Patogenesi

Hall et al, Blood, 2003

La Trombosi è Frequente nell’EPN

Distretto cerebrale, addominale e polmonare

in > 50% dei pazienti

ricorrente, grave, spesso mortale

Coagulazione Complemento

Modified from Markiewski et al, Trends Immunol 2007

Coagulazione, Complemento ed EPN

Associazione a Delinquere?

• Emolisi Intravascolare

• Trombosi

• Insufficienza midollare

Emoglobinuria Parossistica Notturna

Patogenesi

Rotoli & Luzzatto, 1989

Tempo

Cellule

PIGA-

Cellule PIGA+

danneggiate

Agente NocivoCellule

PIGA+

Espansione Paradossa del Clone EPN(Teoria della Fuga)

Staminale normale (GPI+) Staminale EPN (GPI-)

Modello per la Patogenesi dell’EPN e dell’AA:L’ancora GPI è il bersaglio dei linfociti autoreattivi T

anti-GPI TCR

CD1d

Karadimitris et al, Blood 2000; Gargiulo et al, Blood 2007; Gargiulo et al, Blood 2013; Gargiulo et al, Blood 2017;

Espansione Paradossa del Clone EPNIl caso di Alessia, dalla Teoria alla Pratica…

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

0 2 4 6 8 10 12

Plts *104/µl

LDH *UNL

Hb (g/dl)

Retics *105/µl N *103/µl

N GPI-neg

2 years months

95%

Eculizumab

pRBC units

59%

76%

Gestione Clinica

Emoglobinuria Parossistica Notturna

(EPN)

Emoglobinuria Notturna ParossisticaOpzioni Terapeutiche nel XX secolo

Trattamenti di Supporto• Acido Folico

• Ferro

• Transfusioni di eritrociti

• Profilassi anti-coagulante• (Trombolisi)

Trattamenti Patogenetici• Trapianto Allogenico di CSE

• Immuno-soppressione (ALG/CSA)• (androgeno)•

Sopravvivenza dei Pazienti EPN

100

80

60

40

20

0

0 10 20

Anni dalla diagnosi

So

pra

vviv

en

za

(%) Popolazione di controllo

EPN (n 80; Hillmen 1995: 1950-1980)

30 40

EPN (n 424; De Latour 2008: 1970-2000)

Mortalità a causa di:

Trombosi

Insufficienza Midollare(SMD/leucemia?)

Emoglobinuria Notturna ParossisticaOpzioni Terapeutiche nel XXI secolo

Trattamenti di Supporto• Acido Folico

• Ferro

• Transfusioni di eritrociti

• Profilassi anti-coagulante• (Trombolisi)

Trattamenti Patogenetici• Trapianto Allogenico di CSE

• Immuno-soppressione (ALG/CSA)• (androgeno)•• Inibizione del complemento

Blocco del Complement

- eculizumab -

Emoglobinuria Parossistica Notturna

CH

3C

H2

Rother et al, Nature Biotech 2007

Eculizumab

Anticorpo monoclonale umanizzato anti-C5

Variable

heavy chain

Variable light

chain

Human constant

light chain Ck

Human constant

heavy chain

IgG4 CH2 and CH3

Human constant

heavy chain

IgG2 CH1 and hinge

Human framework

regions

Murine

complementarity

determining regions

nel Paziente EPN Trattato con Eculizumab

C5C3

CD

55

CD

59

CD

46

CR

1C5C3

Regolazione della Cascata del Complemento

CD

55

CD

59

Classical

pathway

Lectin

pathway

Alternative

pathway

C5b-C9

EculizumabFa

cto

r H

Fa

cto

r I

C4b

p

Inibitori del Complemento

Un caso clinico

Emoglobinuria Parossistica Notturna

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

pre-ecu

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Hb (g/dl)

LDH (*UNL)

13Trasfusioni RBC

2 U/mese

anni dall’inizio dell’eculizumab

Eculizumab (900 mg/14 days)

Paziente EPN pesantemente trasfuso e con trombosi ricorrenti

Non più trasfusioni, non più trombosi

(nonostante lo stop della terapia anticoaugulante)

-2 -1

Hb (g/dl)

LDH (*UNL)

inizia l’eculizumab e la storia cambia ……………

Trombosi

ricorrenti

(Budd Chiari)

Trasfusioni

blocca l’emolisi intravascolare e i sintomi correlati

abroga o riduce il fabbisogno trasfusionale

riduce il rischio trombotico

Anemia

Emoglobinemia

• Spossatezza

• Disfagia

• Disfunzione Erettile

•Dolore Addominale

è sicuro, nonostante il rischio di infezioni da batteri capsulati

Però, non guarisce, e non è disponibile in tutto il mondo

Trombosi

Il trattamento con eculizumab in EPN

è sicuro anche in gravidanza

≤50%10,1%

>50%5,6%

Gestione Clinica del Paziente con EPN

Risposta ematologica all’eculizumab

• Normalizzazione del LDH in quasi tutti i pazienti

• 20-30% dei pazienti cintinua a trasfondere

• 50% dei pazienti non raggiunge 11 g/dl di emoglobina

• La reticolocitosi persiste in quasi tutti i pazienti

n= 51

Risitano, Notaro et al, Blood 2009

Hgb ≥1135.3%

8 ≤ Hgb < 1149.0%

Ridotta produzione di globuli rossi

1) Insufficienza midollare

2) Carenza di ferro o di vitamine

3) Inadeguata produzione di eritropoietina

Persistente emolisi intravascolare

1) Mancata inibizione del complemento (varianti genetiche del C5)

2) Aberrante “distruzione” del farmaco (‘breakthrough’)

3) Aumentata attivazione acuta e/o cronica del complemento

Emolisi extravascolare de novo

1) Opsonizzazione dei globuli rossi EPN a causa della “deposizione” di C3

Gestione Clinica del Paziente con EPN

cause di ridotta risposta ematologica all’eculizumab

Ridotta produzione di globuli rossi

1) Insufficienza midollare

2) Carenza di ferro o di vitamine

3) Inadeguata produzione di eritropoietina

Persistente emolisi intravascolare

1) Mancata inibizione del complemento (varianti genetiche del C5)

2) Aberrante “distruzione” del farmaco (‘breakthrough’)

3) Aumentata attivazione acuta e/o cronica del complemento

Emolisi extravascolare de novo

1) Opsonizzazione dei globuli rossi EPN a causa della “deposizione” di C3

Gestione Clinica del Paziente con EPN

cause di ridotta risposta ematologica all’eculizumab

0

400

800

1200

1600

LD

H U

/L

Eculizumab Eculizumab

14 giorni

Eculizumab Eculizumab

11 giorni 11 giorni14 giorni

‘Fuga’ dal Blocco del ComplementoIl caso del Signor Mario: Riduzione dell’intervallo

Ridotta produzione di globuli rossi

1) Insufficienza midollare

2) Carenza di ferro o di vitamine

3) Inadeguata produzione di eritropoietina

Persistente emolisi intravascolare

1) Mancata inibizione del complemento (varianti genetiche del C5)

2) Aberrante “distruzione” del farmaco (‘breakthrough’)

3) Aumentata attivazione acuta e/o cronica del complemento

Emolisi extravascolare de novo

1) Opsonizzazione dei globuli rossi EPN a causa della deposizione del C3

Gestione Clinica del Paziente con EPN

cause di ridotta risposta ematologica all’eculizumab

Emolisi Extravascolare

- un cambio di quadro nell’EPN -

Emoglobinuria Parossistica Notturna

Il blocco del C5 si associa al legame di C3 agli eritrociti EPN

CD

59-P

E

CD

59-P

E

C3-FITC

CD

59-P

E

CD

59

-PE

Paziente EPN non trattato

Paziente EPN durante il trattamento con eculizumab

Hgb≥12 8.5≤ Hgb <10 Transfused

C3-FITCC3-FITC

2% of

PNH RBC

45% of

PNH RBC 67% of

PNH RBC

C3-FITC

Risitano, Notaro et al, Blood 2009

C5C3 C5C3

C3

C3-FITC

CD

59-P

E

Paziente EPN trattato con eculizumab

45% of

PNH RBC

Alternative

pathway

Eculizumab

C5C3C3

C3

Risitano, Notaro et al, Blood 2009

Il Trattamento con l’Eculizumab è associato

alla Deposizione di C3 sui Globuli Rossi EPN

CD

59-P

E

Paziente EPN non trattato

C3-FITC

Alternative

pathway

Alta/Alta≈1000 molecole per cellula

Alta/Bassa100< molecuole per cellula <600

Bassa/Bassa≈100 molecole per cellula

L’espressione del Recettore 1 del Complemento (CR1)

è associato ad una variante genetica

detta polimorfismo HindIII

Pazienti EPN in terapia con Eculizumab

che non necessitano più di trasfusioni

- genotipo CR1 -

P= 0.016

A/A A/B B/B

Rondelli et al, Haematologica 2013

“Bisogni insoddisfatti” nel trattamento attuale dell’EPN

Persistente emolisi intra-vascolare

Crisi emolitiche intercorrenti (“breakthrough” farmacocinetico)

Saltuarie crisi emolitiche da infezioni/infiammazioni

Clinici

Sociali/individuali

Emolisi extra-vascolare

Pazienti ancora dipendenti dalle trasfusioni

Pazienti con livelli di emoglobina non ottimali (<10 g/dl)

Persistente reticolocitosi

“Dipendenza” dall’infusione ogni due settimane

Costo del farmaco: >300.000 € per anno

Nuove strategie terapeutiche

di blocco del complemento:

(non solo per EPN)

C5

C3

CD55

CD59

Factor H

CD46

CR1

Factor I

C5

C3

C4bp

Complement Inhibitors

Membrane Soluble

MicroorganismsAntigen-AntibodyConstitutive/

Microorganisms

Classicalpathway

Lectinpathway

Alternativepathway

Clusterin

Protein S

C1 Inh

Factor I

CD55

CD59Membrane

Attack Complex

Amplification

Loop

Eculizumab

Coversina

MoAb AntiC5 long lasting

MoAb AntiC5 sotto cute

Peptidi ciclici

siRNA

Compstatine

TT30simil CR1

MoAb AntiC3

simil Fattore H

Inibitori CFD

Inibitori CFBsiRNA anti CFB

MoAb AntiCFD

MoAb AntiCFB

Aptameri

Nuovi inibitori del Complemento

EPN e le altre

Complementopatie

Complementopatie

Condizioni patologiche in cui l’attivazione del Complemento è il principale fattore patogenetico

IL processo patologico può essere bloccato o rallentato dall’inibizione del complemento

L’inibizione (o la regolazione) del complemento deve avvenire al livello appropriato per il meccanismo patogenetico proprio di ogni condizione

Eculizumab nel falcemico conreazione emolitica ritardata post-trasfusionale

Boonyasampant et al, Transfusion, 2015

CRL, FlorenceGenetics and Gene Transfer

Rosario Notaro

Michela Sica, Irene Cosi, Caterina Nannelli,

Maria De Angioletti

Federico II University - NaplesAntonio Risitano, Giuseppina Ruggiero,

Fiorella Alfinito, Patrizia Ricci

Imperial College - LondonAnastassios Karadimitris

New York University - New YorkDavid Araten

Kanazawa University - KanazawaShinji Nakao

Sapienza University - RomeAnna Paola Iori

Ospedale Policlinico – MilanoAlberto Zanella, Wilma Barcellini

AOU Careggi - FlorenceRoberto Caporale, Renato Alterini, Valentina Carrai,

Barbara Scappini, Federica Barone

University of FlorenceAlberto Bosi, Cristina Nativi

Nursing Staff Careggi Hematology

Lucio LuzzattoMuhimbili University

Dar es Salaam (Tanzania)

IST, GenoaHuman Genetics

Sonia Lastraioli, Martina Serra,

Fabrizio Loiacono, Patrizia Piccioli

Former lab members

Luciana Gargiulo, Tommaso Rondelli, Margherita Berardi, Giulia Talini, Annamaria

Pellecchia, Emanuele Di Lorenzo, Manuela Gencarelli, Irene Sineo

Benedetta Peruzzi, Chiara Pescucci,

William Shakespeare, King Henry V, IV, i

There is a soul of goodness in things evil,

would men observingly distil it out.

William Shakespeare, Hamlet, I, 5

There are more things in heaven and earth, Horatio,

than are dreamt of in your philosophy.

Hematopoietic stem cellsGPI-targeted

noxious agent

Healthy

Hematopoietic System

Damaged

Hematopoietic stem cellsPNH clone(s)

(GPI-

deficient)

No clinical

consequences

PIG-A

mutation

Selective

expansion

of PNH clone(s)

PNHIntravascular

haemolysis Thrombosis

CD59(-)

red cells

Abnormal

platelets

Pancytopenia

Aplastic

Anaemia

A Unified Pathogenetic Model for PNH and AA