prevalencia de rotavirus

Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua UNAN – León

Escuela de Bioanálisis Clínico

Índice

- Índice………………………………………………………………………. 01

- Introducción …….………………………………………………………......02

- Antecedentes …….……………………………………………...……….....03

- Justificación …….…………………………………………………...…...…04

- Planteamiento del problema…………………………………………..…….05

- Objetivos: Objetivo General…………………………………………….…06 Objetivos Específicos....…....……..……………………...…….06

- Marco Teórico…….……………………………………………..…………..07 Definición…….…………………………………………..……..08 Epidemiología…………………………………………….…….08 Clasificación…….………………………………………….….. 10 Características Clínicas…….…………………………………....11 Diagnóstico Clínico…….……………………………………….11

- Diseño Metodológico…….……………...…………………………..………21

- Resultados y análisis…….……………………..……………………………23

- Conclusiones…….…………………………………………………………..28

“Prevalencia y características clínicas en niños menores de 4 años con diarrea

por Rotavirus en los Centros y Puestos de salud de la ciudad de León en el periodo

abril – septiembre 2008”

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Escuela de Bioanálisis Clínico- Bibliografía…….……………………………………………………………29

- Anexos………………………………………………………………………30

Introducción

El Rotavirus es la principal causa de enfermedad diarreica y deshidratación en niños pequeños, fue descubierto en 1973, éste se presenta en todo el mundo y afecta entre el 90 y el 100% de la población menor de los 3 años de edad. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Es un virus, llamado así por sus partículas virales en forma de rueda vistas en el microscopio electrónico, son virus no envueltos, en su cápside se observan 3 capas (externa, media e interna). El virus se encuentra en grandes cantidades en las heces de las personas infectadas; por ello es importante lavarse las manos después de ir al baño, ya que se requiere poca cantidad del virus para infectar además los objetos contaminados pueden retener al virus por varios días. (1)

Es un virus altamente contagioso, la principal vía de transmisión se da por medio de la entrada del virus por la boca a nuestro cuerpo, por mala higiene de las manos antes de comer, es decir vía fecal-oral; después de un intervalo comprendido entre 18 - 24 horas de la infección, se desarrollan síntomas.

Genera diarrea por muchas causas, pero en general destruye las células intestinales y produce una enterotoxina, dando lugar así la pérdida de sustancias necesarias para la absorción de sodio y agua; así mismo provoca una disminución en la absorción de proteínas, grasas y carbohidratos. La muerte de pequeñas zonas del intestino produce un aumento en substancias toxicas, provocando más daño al intestino, que produce aumento en el movimiento intestinal por parte del sistema nervioso intestinal, dando como resultado una mala absorción de los alimentos.(2)




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http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Enterotoxina&action=edit&redlink=1


Escuela de Bioanálisis ClínicoEn el 2006, dos vacunas contra el Rotavirus mostraron ser seguras y efectivas en los niños: Rotarix desarrollada por los laboratorios Glaxo Smith Kline y RotaTeq desarrollada por los laboratorios Merck, ambas se administran vía oral y contienen virus desactivados vivos.

En Nicaragua desde el año 2006 los niños reciben gratuitamente durante un período de tres años la vacuna RotaTeq, indicada para la prevención de la gastroenteritis pediátrica y desarrollada por la empresa Sanofi Pasteur MSD y Merk. (3)

Este estudio esta destinado a evaluar la prevalencia de Rotavirus en los puestos y centros de salud de León.

Antecedentes.

El Rotavirus fue descubierto en Australia por la Dra. Ruth Bishop en 1973, su genoma esta compuesto de 11 segmentos de ARN de doble-hebra, que codifican por seis proteínas estructurales y seis no estructurales (uno de sus segmentos codifica para 2 proteínas), es estable en el medio ambiente y pueden llegar a medir 70 nm de diámetro. Se han identificado siete grupos, tres de los cuales (Grupo A, B y C) infectan a los humanos; el grupo A es el más común y el màs esparcido, causando el 90% de las infecciones.

La incidencia de la diarrea por Rotavirus, a diferencia de otros agentes etiológicos, es muy similar en todo el mundo porque no está asociada a grado de desarrollo. Esta varía de 0.15 a 0.8 episodios/niño/año; o tasas de 2.9 a 8.5 x 1000 niños < 2 años. La frecuencia en pacientes hospitalizados oscila entre 14-70%, pero su detección es menor (2-35%) en pacientes tratados ambulatoriamente y mucho más baja (10%) cuando se investiga en la comunidad. (4)




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http://es.wikipedia.org/wiki/ARN

http://es.wikipedia.org/wiki/Genoma


Escuela de Bioanálisis ClínicoLos

Rotavirus son altamente “democráticos”, se han encontrado en todo el globo terráqueo e infectan por igual a ricos y pobres, niños y niñas, habitantes del norte o del sur y de países de clima templado o tropical. En 34 países evaluados se encontró una media de 33% de prevalencia de Rotavirus. (2)

En Venezuela, en 1975, dos años después de su descubrimiento, los Rotavirus fueron identificados por primera vez en niños hospitalizados en el Hospital de Niños de Caracas 24. Desde entonces, se han encontrado con una frecuencia que varía entre el 10% y 45% 25, 26,27. En un estudio prospectivo realizado en Caracas, se determinó una incidencia de 0.16 episodios/niño/año y se estimó que los Rotavirus causaban 101.400 episodios y 18.000 hospitalizaciones por año durante los 2 primeros años de la vida. (5)

El Ministerio de Salud de Nicaragua en el 2005 declaró emergencia sanitaria en dos departamentos del norte ante una epidemia de diarrea que provoco la muerte de 56 niños, la emergencia afecto a los departamentos de Estelí y Madriz, donde se registraron 1.926 casos de diarrea, el doble de lo reportado en el mismo período del 2004. (4)

Justificación.

La Organización Mundial de la Salud ha estimado que cerca de 2.5 millones de niños mueren

anualmente por diarrea infantil en países en vías de desarrollados. La infección por Rotavirus

representa casi el 50 % de todos los casos de gastroenteritis y es la principal causa de

hospitalización por deshidratación severa en niños menores de 5 años. Estudios de seroprevalencia




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Escuela de Bioanálisis Clínicoy

seguimientos de cohorte en niños indican que al llegar a los 3 años de edad prácticamente todo

individuo habrá tenido al menos una infección por Rotavirus. El rol de los Rotavirus como causa

importante de diarrea infantil a nivel mundial ha motivado intensos esfuerzos para el desarrollo y

la implementación de vacunas, las cuales son una realidad en el presente tiempo.

En Nicaragua constituye la principal causa de hospitalización y muerte en niños menores de tres

años, anualmente se presentan aproximadamente 2300 casos de diarrea en niños menores de cinco

años de los cuales es responsable en un 60% de los casos el Rotavirus, siendo predominante el

grupo A, por ser el más importante agente etiológico responsable causar gastroenteritis severa

aguda en niños.

Es necesario contar con una técnica rápida y sencilla que de respuesta al diagnóstico de la

patología de la diarrea e identificar si esta es provocada por Rotavirus, es aquí que se ve la

importancia del laboratorio para dar mayor certeza del diagnostico clínico.

Para determinar el impacto del Programa Global de Inmunizaciones implantado en Nicaragua se

debe vigilar y dar seguimiento a la prevalencia del Rotavirus y determinar la eficacia de la vacuna.




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Planteamiento del problema:

¿Cuál es la prevalencia y las características clínicas de niños menores

de 4 años con diarrea por Rotavirus de los centros y puestos de salud

de la ciudad de León en el período abril – septiembre 2008?

Objetivo General:




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Conocer la prevalencia y características clínicas de diarrea por Rotavirus en la

población estudiada.

Objetivos Específicos:

Describir las características clínicas de diarrea por Rotavirus en niños

menores de 4 años.

Conocer la prevalencia de infecciones por Rotavirus en niños con diarrea en

los centros y puestos de salud de León.

Explicar el método de IDEIATM Rotavirus utilizado.




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Definición

Los Rotavirus son agentes infecciosos pertenecientes a la familia Reoviridae, los cuales han sido reportados como la mayor causa de gastroenteritis en el hombre y animales (6).

Características morfológicas:1. Las partículas de los virus maduros son de aproximadamente de 70 nm de diámetro.

2. Su estructura esta conformada de un icosaedro simétrico.

3. Virus de triple cápside conformada por una capa externa compuesta por dos proteínas VP7 y VP4, la capa interna compuesta por la proteína VP6.

4. Dentro de la capa interna se encuentra la tercera capa que es donde se encuentra el genoma viral, compuesto por tres proteínas VP1, VP2 y VP3.

5. Genoma segmentado constituido por ARN de doble cadena.

6. El Rotavirus presenta sesenta proyecciones que asemejan espigas extendidas desde la superficie lisa de la cápside externa que corresponde a la proteína VP4, una hemaglutinina que sirve de adherencia del virus a los enterocitos (7).

Epidemiología

Se calcula que anualmente en los países en desarrollo ocurren 125 millones de casos de diarrea por Rotavirus en niños menores de 5 años de edad y 660 mil son fatales (8).

La infección por Rotavirus es transmitida por vía fecal- oral y la cantidad de virus que se esparce durante cada episodio diarreico es grande, aùn incluso antes de los síntomas clínicos, el virus es




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Escuela de Bioanálisis Clínicoestable en el medio ambiente y puede sobrevivir horas en las manos y días en objetos contaminados.

Los Rotavirus se diseminan más fácilmente en condiciones de hacinamiento y condiciones higiénicas sanitarias pobres. Con una pequeña cantidad de virus puede iniciarse la infección.

Las epidemias son comunes en lugares como centros infantiles y hospitales donde el virus puede difundirse fácilmente e infectar a los niños.

En la región Panamericana el Rotavirus es la causa de aproximadamente 75,000Hospitalizaciones y cerca de 15,000 muertes anuales.

En Nicaragua en el 2005 se reportaron 46785 casos de diarrea en niños menores de 5 años, de las cuales se colectaron muestras con un 59% positiva para Rotavirus.

La primera información sobre la etiología de las infecciones virales gastrointestinales, fue obtenida de un estudio realizado en 406 niños con diarrea y 252 niños asintomáticos de la ciudad de León, cuya ocurrencia de Rotavirus en especímenes fecales fue significativamente más alta en los casos de diarrea (7.5%) que en los controles(2.5%) (9).

Otros estudios realizados en 1987 en dos centros de tratamiento de niños con diarrea en la ciudad de Managua no reportaron Rotavirus en 206 muestras fecales en niños con diarrea, examinados por ELISA (10).

Posteriormente se realizaron dos estudios en la ciudad de León por Espinoza et al, en 1994. El primer estudio se realizo en una cohorte de 235 niños, vigilados durante dos años, la infección por Rotavirus fue demostrada en un 27%(11).




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Escuela de Bioanálisis ClínicoEl otro estudio se realizó en 296 niños hospitalizados por diarrea demostrándose Rotavirus en un 28% (12).

Clasificación

El Rotavirus en sus serogrupos incluye virus que comparten reacciones antigénicas cruzadas detectables en los métodos serológicos. Actualmente se han detectado siete serogrupos, los cuales presentan diferentes grupos antigénicos nombrados desde A – G; afectando al hombre los de tipo A, B y C.

El grupo A es el principal causante de diarrea severa en niños y adultos. El grupo B ha sido asociado a brotes epidémicos de diarrea grave en adultos en China y el grupo C se ha reportado esporádicamente en niños mayores con diarrea.

Los Rotavirus del grupo A, a su vez se clasifican en serotipos G y P dependiendo de la estructura de las proteínas VP7 y VP4. Hasta el momento se han identificado en ensayos inmunológicos con la proteína VP7, catorce serotipos G (glicoproteínas), siendo los serotipos G 1, 2, 3 y 4 los de mayor importancia epidemiológica en humanos. (13)

Actualmente los genotipos son determinados en estudios de vigilancia mediante la técnica PCR.




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Escuela de Bioanálisis ClínicoEl

Rotavirus del grupo A tiene características particulares de emigración de los segmentos 10-11 de ARN a los cuales se les llama electroferotipos cortos y largos, cuyos patrones han sido usados como marcadores de cepas de Rotavirus en estudios epidemiológicos. (14)

Características clínicasLa infección puede variar en intensidad, desde una infección asintomática a una forma grave con deshidratación isotónica.Primeramente las células que están en los extremos de las vellosidades intestinales se destruyen, lo que altera la hidrólisis de carbohidratos y la absorción intestinal, también se tienen evidencias de una proteína no estructural del Rotavirus (NSP4) que actúa como enterotoxina incrementando la pérdida de líquidos de la células. Otros estudios sugieren que los Rotavirus estimulan el sistema nervioso entérico, provocando que la células que recubren el intestino secreten agua.

Tiene un periodo de incubación de aproximadamente 24 a 48 horas, en la que la mayoría de los lactantes y niños provoca gastroenteritis

Como primer síntoma encontramos vómito precediendo la diarrea acuosa profusa que dura de 3 a 8 días, a menudo hay fiebre, dolor abdominal y anorexia.

Las heces por Rotavirus se caracterizan por no presentar glóbulos blancos, no hay sangre y el moco escaso o inexistente.La mayoría de las infecciones por Rotavirus producen deshidratación que va de leve a moderada, pero en casos fatales resultan disturbios severos en el equilibrio hidro-electrolítico (15).

Diagnostico de Rotavirus

A partir del kit de IDEIATM Rotavirus.

Un inmunoensayo enzimático para la detección de Rotavirus en muestras fecales humanas.

La prueba de IDEIATM Rotavirus es inmunoensayo enzimático cualitativo para la detección de Rotavirus (grupo A) en muestras fecales humanas, con el puede leerse visualmente o por




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Escuela de Bioanálisis Clínicofotometría, como una ayuda en el diagnóstico de gastroenteritis aguda causada por Rotavirus del grupo A.

El Rotavirus no es un virus de ARN envuelto consistente en un núcleo interno esférica y dos obuses de cápside externa. Por lo menos seis serogrupos (A-F) dentro del género Rotavirus se han identificado.

Serotipos humanos del Rotavirus del grupo A, son una causa importante de gastroenteritis en niños pequeños en todo el mundo. Gastroenteritis por Rotavirus también se produce en niños mayores y adultos en mayores poblaciones. El virus se asocia con las infecciones nosocomiales en los pabellones pediátricos y neonatales viveros. Los brotes pueden dar lugar a la hospitalización prolongada y el tratamiento de niños infectados. Gastroenteritis por Rotavirus puede ser severo, incluso en peligro la vida, en desnutridos o inmuno comprometidos lactantes.

El laboratorio de diagnóstico de infecciones por Rotavirus desempeña un papel importante en el manejo del paciente y permite una gestión eficaz y el control de brotes.

En la actualidad los serotipos humanos de Rotavirus no crecen fácilmente en los sistemas de cultivo celular, por lo que son difíciles de aislar de muestras clínicas. Por lo tanto, el diagnóstico de laboratorio de infecciones por Rotavirus se basa en la detección directa del virus o antígenos virales en las muestras fecales. Se puede realizarse mediante microscopía electrónica, en radioinmunoensayo para detectar el virus o antígenos virales, en poliacrilamida electroforesis en gel, para detectar el ARN del genoma de Rotavirus. Estos procedimientos son técnicamente exigentes y requieren equipo especializado que limitan su aplicación.




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Escuela de Bioanálisis ClínicoMás

recientemente, inmunoensayos, utilizando monoclonales específicos o anticuerpos policlonales, se han descrito para la detección directa de Rotavirus en muestras clínicas. Estas pruebas ofrecen una respuesta rápida, sensible y específica. Un método para la detección de Rotavirus en muestras fecales.

IDEIATM Rotavirus es un ensayo inmunoenzimático para la detección de Rotavirus del grupo A en muestras fecales. La prueba utiliza un anticuerpo policlonal para detectar grupo de proteínas específicas, incluidas las principales proteínas de cápside interna (VP6), presente en el grupo A de Rotavirus.

Principio de la prueba IDEIATM Rotavirus:Utiliza un anticuerpo policlonal en una fase sólida sándwich inmunoensayo enzimático para detectar a grupos específicos de antígenos presentes en el grupo A de Rotavirus.(ver anexos)Aparte de contar con micropocillos, estos están recubiertos con anticuerpos policlonal de Rotavirus específicos. La suspensión fecal o muestra de control se añade a los micropocillos y se incuba simultáneamente con un anticuerpo policlonal específico de Rotavirus conjugado con peroxidasa de rábano.El antígeno de Rotavirus presente en la muestra es capturado entre la prevalencia de anticuerpos en la fase sólida y la enzima conjugada con anticuerpos.Después de 60 min de incubación a temperatura ambiente, los micropocillos se lavan en tampón de lavado debidamente preparado, para eliminar el exceso de muestra y cualquier enzima conjugada a anticuerpos. Un cromógeno se añade a los micropocillos y se incubaran durante 10 minutos a temperatura ambiente.

La presencia específicamente de la enzima esta obligada a unirse al anticuerpo del micropocillo resultando un cambio de color, con la detección de la reacción por la adicción del acido (solución stop). Un color intenso, es significado de la presencia del antígeno de rotavirus en la especie o control.

Cada kit contiene suficiente material para 96 determinaciones.

Contenido de IDEA TM ROTAVIRUS




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Escuela de Bioanálisis ClínicoInstrucciones de un folleto para su uso.Placa micropipeta: Con 96 micropocillos de microtitulación de 12x8, lo cuales están recubiertos con anticuerpos policlonales de conejo específicas de Rotavirus. Una bolsa de plástico que se proporciona, para su almacenamiento cuando no es utilizada.

Una botella de cada una de las siguientes, a menos que se indique lo contrario.Diluyente para muestra: 110ml muestra diluyente: solución salina amortiguadora que contiene agente antimicrobiano y colorante rojo.Control positivo: 5ml control positivo: Rotavirus bovino inactivado (cepa de Rotavirus ternero 3209176) en una solución tampón que contiene agente antimicrobiano y tinte rojo.Conjugado: 13ml conjugado: anticuerpo policlonal de conejo específicas de Rotavirus conjugados con peroxidasa de rábano en una solución tampón que contiene proteína, agente antimicrobiano y colorante azul.Tampón de lavado(x25): 50ml tampón de lavado. Concentrado (x25): solución de lavado que contenga agente antimicrobiano y detergente.Sustrato TMB: 13mL Sustrato: estabilizada de peróxido de 3,3`y -5,5` tetrametilbenzeno diluido en una solución tampón. TMB ha informado de que no son cancerígenos. Sin embargo, los equipos de protección individual se recomiendan para evitar la exposición directa.Solución stop: 12mL: 0.46mol / L de ácido sulfúrico.

Equipos El siguiente equipo se requiere:

Contenedores adecuados para la recogida de muestras fecales. Tubos ependor (3mL mínimo de capacidad) para la preparación de suspensiones fecales. Papel limpio absorbente. Placa lavadora automática (opcional) o un equipo adecuado para el lavado de 8

micropocillos unidos en forma de tiras. (se usaron pipetas multichanel).




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Escuela de Bioanálisis ClínicoRecolección y preparación de especimenes fecales.

Recolección de especimenes.Muestras fecales deben ser recogidas tan pronto como sea posible tras la aparición de los síntomas. Los picos de Rotavirus por excreción en heces de pacientes con gastroenteritis se reporta que se produzca 3-5 días después de la aparición de los síntomas.Espécimen fecales directos para las pruebas deberán ser recogidos en recipientes que no contengan: medios de transportes, conservantes, sueros de animales, iones metálicos agentes oxidantes o detergentes, ya que todos estos aditivos pueden interferir la prueba.Los hisopos rectales utilizados, deberán poder captar material suficiente para obtener un 10% de suspensión de las heces, las especímenes pueden almacenarse a 2-8 º C para el día antes de la prueba. Para almacenamiento a largo plazo de muestras fecales, almacenar a -20 º C.

Preparación de especímenes fecales.Agregar 1 ml de diluyente de muestra, con un adecuado etiquetado y la utilización de contenedores para preparar un 10% de suspensión o dilución de muestras fecales de adición de aproximadamente 0.1g sólidos de heces (pequeño tamaño guisante parte), o aproximadamente 100 μL de líquido de las heces. Mezclar bien con ayuda del rotador (ver anexos) y dejar reposar durante 10 minutos antes de la prueba.Los especímenes suspendido / diluido en la muestra diluyente puede ser almacenado a 2-8 º C hasta un máximo de 8 días antes de la prueba.

Proceso de la pruebaReactivos y muestras deben ser llevados ante la temperatura ambiente (15-30 º C) antes de su uso.

Preparación de controlesControl negativoAgregar 1 ml de diluyente de muestra a un ependor idénticos a los utilizados para la dilución de la muestra. Ojo estos controles son tratados como una muestra más.Control positivo Mezclar suavemente antes de su uso. Al menos un control negativo y un control positivo debe ser incluido con cada lote de muestras analizadas.




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Procedimiento de ensayo.Cuando se utilizan reactivos de gotero, hay que mantenerlo verticalmente con la punta aproximadamente 5 mm por encima de la micropocillos sin tocar los lados. Evitar la contaminación boquilla del gotero.Añadir 2 gotas o 100 μL de cada espécimen fecal diluido a cada micropocillos que serán nuestras muestras. De igual forma agregar los controles negativo o positivo para el control independiente de los micropocillos. Al menos un control negativo y un control positivo deben incluirse en cada microplato.Evitar la perturbación o la toma de muestras de sedimentos en todo el vial (es importante tomar la muestra de su parte superior en el tubo ependor).

Adición del conjugado

Tras la adición de todos los especímenes y los controles, añadir 2 gotas (o 100 μL) de conjugado a cada microcubetas y mezclar suavemente con la pipeta multichanel, de forma homogénea.

Primera incubación. Incubar la microcubeta a 20-30 º C durante 60 minutos y taparlos con su bolsa para evitar contaminaciones.

Lavar las microcubetas. Preparación de la solución de lavado.Las microcubetas deben lavarse utilizando recién preparada tampón de lavado.Se prepara con una relación de 9.6 de agua destilada con 0.4 de búfer del kit (9.6:0.4).Ejemplo: se requieren 1.5ml de solución de lavado para cada micropocillos, lo cual para 25 muestras ser requerirían preparar 37.5ml, estos se harán el los tubos falcon de 40ml y su relación estará en 38.4:0.6, los que serán 36.6 de agua destilada y 0.6 de buffer.

La técnica de lavado es fundamental para la prueba de rendimiento, al igual que el vaciado total de los micropocillos.




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Escuela de Bioanálisis ClínicoCinco ciclos de lavado son esenciales, ya sea por automatizada o manual de técnicas de lavado.

El lavado manual: aspirar el contenido de los micropocillos, desecharlo y luego utilizar recién preparada tampón de lavado, asegúrese de completar el llenado y vaciado de cada uno. Se harán cinco ciclos de lavado. Tras el final de lavado, la placa debe ser invertida y golpeando contra el papel absorbente para eliminar los últimos vestigios de tampón de lavado.

Adición del substrato.Añadir 2 gotas (o 100 microlitro) o sustrato para cada micropocillo.

Segunda incubación. Incubar microcubetas a 20-30 º C durante 10 min. Las microcubetas se pueden leer visualmente inmediatamente después de la segunda incubación, el color tomado por la reacción es azulado.

El alto de la reacción del sustrato se da añadiendo 2 gotas (o 100 microlitro), de solución stop a cada micropocillo. Garantizando la homogeneización de la mezcla de las microcubetas antes de leer los resultados. El color amarillo resultante de la adicción de la solución stop, es estable durante un máximo de 30 minutos después de la adición de solución.

Leer los resultados de la prueba.

La lectura visual Los micropocillos se pueden evaluar visualmente inmediatamente después de la segunda incubación. Se recomienda que los micropocillos en el que la intensidad del color es difícil de interpretar cuando se compara con el control negativo también se lea por fotometrìa después de la adición de solución.

Lectura en el espectrofotómetro




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Escuela de Bioanálisis ClínicoLos microplatos debe leerse por fotometría a los 30 minutos después de la ultima adicción. Mezclar el contenido de los micropocillos y leer la absorbancia de cada uno de microtitulación utilizando un espectrofotómetro adecuado o EIA su lector de placas a 450nm. Garantizar que los fondos de los micropocillos estén limpios antes de la lectura y comprobar que no haya materia extraña presente.

Lectura espectrofotométrica. (Espectrofotómetro Biotex)Pasos:

1. Seleccionar leer.2. Escogerla longitud de onda.3. Determinar el número de muestras.4. Seleccionar el orden de lectura.5. Seleccionar leer.6. Imprimir

Por otra parte, si el espectrofotómetro o lector de placas de EIA permite la utilización de una referencia de longitud de onda (620 a 650nm), longitud de onda de doble lectura debe realizarse, ya que elimina cualquier posible interferencia causados por aberraciones, como la suciedad o marcas, en la óptica de superficie de los micropocillos.

Resumen del procedimiento de ensayo IDEA TM ROTAVIRUS

Garantizar que todos los reactivos alcancen la temperatura (15-30ºC) ambiente antes de su uso.

Añadir 2 gotas (100μL) de control o la muestra de análisis.

Añadir 2 gotas (100μL) de conjugado.




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Lavar por 5 veces.

Añadir 2 gotas (100μL) de sustrato.

Leerse visualmente inmediatamente (azul) O

Añadir 2 gotas (100μL) de solución stop.

Leer absorbancia fotométrica a 450nm (amarillo) con 620-650nm referencia.

Interpretaciones de resultados.

Control negativoComo se detalla en la preparación de controles, por lo menos un control negativo debe ser incluido en cada ensayo. Determinación visual. Todas los micropocillos de control negativo deben ser incoloras. Si este no es el caso, los resultados de la prueba no deben ser determinados visualmente. Los resultados deben leerse por fotometría o se repetirá la prueba.Determinación fotométrica.El control valor negativo, o media de los valores de control negativo, debe ser inferior a 0,150 unidades de absorbancia.

Cálculo del valor umbral Los valores umbral se calcula mediante la adición de 0,100 unidades de absorbancia a la negativa de control de valor o valor medio cuando más de un control negativo está incluido.

Control positivo




Incubar a 20-30ºC por 60 min.

Incubar a 20-30ºC por 10 min.

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Escuela de Bioanálisis ClínicoComo se detalla anteriormente en la preparación de los controles, por lo menos un control positivo deben ser incluidos en cada ensayo plazo. Determinación visual. El micropocillo control positivo debe mostrar un color azul que lo distingue claramente del control negativo. Si no es el caso los resultados de las pruebas no se determina visualmente. Los resultados deben leerse por fotometría o se repetirá la prueba.

Determinación fotométrica El control positivo debe tener un valor superior a 0.500 unidades de absorbancia.

EspecímenesDeterminación visualCualquier espécimen dando un color azul más intenso que el de control negativo es positivo. Todos los especímenes con color igual o menos el control negativo es negativo. Microposillos en el que la intensidad del color es difícil de interpretar cuando se compara con el control negativo debe leerse después en fotometría. Además de detener la solución con solución stop, o reanalizada.Si después de la adición del substrato, el contenido de un micropocillo se convierte azul oscuro y azul forma un precipitado negro, la muestra debe interpretarse como positiva.

Toda muestra con valores de absorvancia menores de 0.150 se deben de tomar negativas y valores mayores a 0.500 deben de tomarse como muestras positivas.

Las limitaciones de rendimiento




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Escuela de Bioanálisis ClínicoUn

resultado negativo no excluye la posibilidad de la infección por Rotavirus en el paciente. El hecho de no detectar el Rotavirus puede ser el resultado de factores como la recogida de muestra en un momento inadecuado en la enfermedad cuando muy pocos viriones están presentes, mala toma de muestras y / o la manipulación de la muestra

La prueba IDEIATM detecta a grupos específicos de proteínas virales presentes Humanos de serotipos de Rotavirus del grupo A. La prueba no puede ser utilizada para diferenciar entre los serotipos de Rotavirus del grupo A, o para detectar otros serogrupos Rotavirus (B-F)

La prueba es altamente específica, ya que se ha probado, dando negatividad para otros microorganismos presente en la muestra.

Todos los reactivos se proporcionan en las concentraciones de trabajo fijo. Prueba de rendimiento pueden ser afectados negativamente si los reactivos son modificados o mal almacenados.

Un resultado positivo no excluye la presencia de otros patógenos entéricos. Si bien la relación entre la gastroenteritis por Rotavirus y está bien establecida, la infección simultánea con otros patógenos microbianos es posible.

Los resultados de las pruebas deben interpretarse en relación con la información disponible de estudios epidemiológicos, evaluación clínica del paciente y otros procedimientos de diagnóstico

Valores previstos Las tasas de positividad pueden variar en función de la prevalencia de Rotavirus en diferentes poblaciones, la ubicación geográfica, muestra recogida, manipulación, almacenamiento, el transporte de especímenes y el ambiente general de salud de la población de pacientes en estudio.

El Rotavirus es la causa más común de gastroenteritis en niños de edades comprendidas entre los 6 meses y 3 años y es responsable de 30-50% de diarrea hospitalizados en enfermedades infantiles y




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Escuela de Bioanálisis Clíniconiños de corta edad. Rotavirus se asocia también con los brotes de diarrea en la población geriátrica o en instituciones.

Diseño metodológico




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Tipo de estudio: el estudio aplicado a nuestro trabajo investigativo fue de tipo descriptivo y de prevalencia.

Población: niños con diarrea menores de cuatro años que asisten a los centros y puestos de salud de la ciudad de León.

Muestra Clínica: niños con diarrea menores de cuatro años que asisten a los centros y puestos de salud en el período comprendido de abril – septiembre del 2008

Instrumento de recolección de datos: ficha individual para datos personales.

Procedimiento de captación y toma de muestra: las muestras se tomaron todos los días de los meses en estudio, en los Centros y Puestos de Salud bajo la supervisión de una Enfermera responsable de esto, las muestras de heces se colocaron en un contenedor estéril con tapa de rosca y etiqueta de debida identificación, posteriormente fueron llevadas a las oficinas del ”Proyecto Vacuna” donde se guardaron en refrigeración (– 20 ºC) hasta que se realizó su análisis clínico; todas las muestras correspondieron a niños con diarrea menores de tres años.

Método de determinación de Rotavirus: se realizó el análisis mediante la aplicación del método ELISA (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), tipo sándwich, con el Kit IDEIATM

Rotavirus.

Análisis estadísticos: mediante medidas de asociación y comparación con ji cuadrado, Riesgo Relativo y Frecuencias en porcentaje para cada variable.




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Operacionalización de las Variables.

Variable Sub variable Indicador

I- Puestos de Salud 1. Puestos de Salud

a- Primero de mayo-----b- Oscar Pérez C. ------c- William Fonseca -----d- San Felipe -----

a- Perla Maria Norori----b- Mántica Berríos ------c- gPedro Pablo Picado----

III- Análisis de la muestra

1. Resultado de la prueba

2. Lugar de mayor frecuencia.

a -Positivo ----b- Negativo ----

Centros y puestos de salud en estudio.




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Resultados y análisis.

Tabla1. Distribución por sexo de casos de Rotavirus Positivo en el periodo de Abril-Septiembre. 2008.

Sexo Rotavirus

Frecuencia

Positivo

(%)

Rotavirus

Frecuencia

Negativo

(%)

Total %

Masculino 6 2.49 121 50.21 127 52,70

Femenino 1 0,41 113 46.89 114 47,30

Total 7 2.90 234 97.10 241 100.0

De todas las muestras recolectadas 127 (52.70%) fueron del sexo masculino y 114 (47.30%) del

sexo femenino, para un total de muestra de 241.

Se obtuvo una prevalecia con un total de muestras 7 positivas (2.90%) de una población de 241,

captadas en el periodo de abril – septiembre del 2008, lo que indica que habrán 3 casos positivos

de rotavirus por cada 100 niños con diarrea.

Se observa que del total de 7 muestras positivas, 6 (2.49%) correspondieron al sexo masculino, y

1(0.49%) muestra positiva del sexo femenino.

ji-cuadrado de Pearson:

X2 = 3.15 calculado. X2(0.95) (1) =3.84 tabulado.




26


Escuela de Bioanálisis ClínicoLos

datos no indican una relación significativa entre las variables o bien que no se encontró una

desviación significativa con respecto a la dependencia entre ellas. Lo que concluimos que: No

existe una relación entre la infección por rotavirus y el sexo.

Medida de asociación.

Riesgo Relatico = 5.8

El RR del sexo Masculino es 5.8 veces mayor de presentar diarrea por rotavirus que del sexo

femenino.

Tabla 2. Distribución por edades de casos de Rotavirus Positivo en el periodo Abril-Septiembre. 2008

Edades Rotavirus

Frecuencia

Positiv

o

(%)

Rotavirus Frecuencia Negativo

(%)

Total %

< 1 año 1 0.42 127 52.69 128 53.11

1- <2 años 2 0.82 82 34.02 84 34.85

2 - <3 años




27


Escuela de Bioanálisis Clínico2 0.8324

9.9526 10.78

3- <4 años 2 0.83 1 0.41 3 1.24

Total 7 2.90 234 97.10 241 100.0

Se observa que existen 2 casos positivos en aquellos niños que se encuentran entre los 1<2 años de

edad, lo que representa un 0.82% del total de casos, en 84 muestras(34.85%); en los niños de 2<

3 años se encontraron 2 casos positivos (0.83%) en 26 muestras, es decir el 10.78% de la muestra

total; en los niños cuya edad comprende los 3< 4 años se encontraron 2 casos positivos (0.83%) de

3 muestras, que representan 1.24% de la muestra total; por otro lado los niños menores de un año

de edad sólo presentaron 1 caso positivo en 128 muestras que representan el 53.11% de la muestra

total.

Tabla 3. Distribución por meses de casos de Rotavirus Positivo en el periodo Abril-Septiembre 2008.

Meses Rotavirus

Frecuencia

Positivo

(%)

Rotavirus

Frecuencia

Negativo

(%)

Total %




28


Escuela de Bioanálisis ClínicoAbril

5 2.0833

13.6938

15.77

Mayo 0 0 33 13.70 33 13.70

Junio 0 0 76 31.53 76 31.53

Julio 0 0 56 23.23 56 23.23

Agosto 1 0.41 25 10.38 26 10.79

Septiembre 1 0.41 11 4.57 12 4.98

Total 7 2.90 234 97.10 241 100.0

Se observó que el mayor número de casos positivos por Rotavirus fue en el mes de abril con un

total de 5 (2.08%) muestras de 38 recolectadas, seguido de los meses de agosto y septiembre con 1

(0.41%) muestra para cada uno.

El mayor número de muestras captadas fue en el mes de junio con 76 (31.53%), seguida de julio

con 56 (23.23%), y el mes que menos muestras fueron captadas fue septiembre con 12 (4.98%)

Tabla 4. Distribución por Centros de salud de casos de rotavirus positivo en el periodo Abril-Septiembre 2008.




29


Escuela de Bioanálisis ClínicoCentros/puestos de

salud.

Rotavirus

Frecuenci

a

Positivo

(%)

Rotavirus

Frecuencia

Negativo

(%) Total %

1ro Mayo 0 0 11 4.57 11 4.57

Augusto Cesar

Sandino 1 0.41 0 0 1 0.41

Coyolar 0 0 1 0.41 1 0.41

Guadalupe 0 0 1 0.41 1 0.41

La Chacaras 0 0 1 0.41 1 0.41

Mantica 0 0 3 1.25 3 1.25

Oscar Pérez 1 0.41 37 15.36 38 15.77

Perla María 0 0 67 27.81 67 27.81

Rpto. Linda Vista 0 0 1 0.41 1 0.41




30



Rpto. Rosendo Daniel

Pacheco0 0

10.41

1 0.41

Rpto. Todo Será

Mejor

00

31.25

3 1.25

Rpto. Venceremos 0 0 1 0.41 1 0.41

Rubén Darío 1 0.41 40 16.59 41 17.01

Sutiaba 4 1.67 67 27.80 71 29.47

Total 7 2.90 234 97.10 241 100.0

Se encontró que el mayor numero de casos fue en el puesto de salud de Sutiva con 4 muestras

positivas (1.67%) de 71 muestras recolectadas, seguido de los puestos de salud Oscar Pérez con

1(0.41%) muestra positiva de un total de 38 muestras recolectadas, el Augusto Cesar Sandino con

1 (0.41%) muestra positiva de 1 muestra recolectada y el Rubén Darío con 1(0.41%) muestra

positiva de 41 muestras recolectadas.

En los centros y puestos de salud Primero de Mayo, Coyolar, Guadalupe, Las Chacaras, Mantica,

Perla Maria, Rpto Linda Vista, Rpto Rosendo D. Pacheco, Rpto Todo Será Mejor y Rpto




31


Escuela de Bioanálisis ClínicoVenceremos no se encontró ningún caso positivo de un total de 90 muestras recolectas en todos

estos lugares.

Conclusiones

En respuesta a los objetivos planteados podemos concluir que:

1. Las características clínicas de diarrea por Rotavirus implican vómitos, deshidratación,

fiebre dolor abdominal y anorexia.

2. La prevalencia de Rotavirus en este estudio fue de 7 casos positivos en 241 muestras

analizadas en el periodo de abril-septiembre del 2008, es decir se esperan 3 casos positivos

por Rotavirus por cada 100 casos de diarrea.

3. El centro de salud Sutiaba tuvo el mayor número de casos positivos de 4, seguido por el

Oscar Pérez, Rubén Darío y Augusto Cesar Sandino, con 1 caso positivo respectivamente.

4. El método de ELISA IDEIATM Rotavirus, igual que todo procedimiento de laboratorio

requiere de suma calidad, control y orden. Este es sensible y muy específico para la

detección de Rotavirus del grupo A, el principio del método consiste en reacciones de




32



antígeno- anticuerpo y enzima-sustrato, donde la presencia del antígeno de rotavirus en la

muestra, será evidenciado por el color azulado, además de la lectura por

espectrofotometría.

Recomendación

De acuerdo a los resultados obtenidos recomendamos que:

1. El Ministerio de Salud (MINSA) junto con los padres de familia, tengan

un mayor control y vigilancia en la asistencia de los niños al Programa

Ampliado de Inmunizaciones (PAI), donde se garantice las tres dosis de

vacunas Rotatex.




33


Escuela de Bioanálisis Clínico2.

Los padres de familia tengan un mayor cuidado en las prácticas higiénico

sanitarias, evitando el fecalismo y a su vez la propagación y

contaminación por Rotavirus.

3. Los estudiantes que participan en las prácticas comunitarias lleven un

mejor control y registro del estado de salud, así como de las condiciones

higiénicas sanitarias de las personas y muy particularmente de l@s

niñ@s que habitan en las casas.

Bibliografia

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2. http://www.healthsystem.virginia.edu/UVAHealth/peds_infectious_sp/rota.cfm

3. http://:www.rotateq.com.mx/secure/resources/patient_edu

4. http:// www.digemid.minsa.gob

5. http://www.univision.com/content/content.jhtml




34

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9. Paniagua M: Infant diarrhoea in Leon, Nicaragua. Dissertation Karolinska Institute Stockholm. Sweden 1988.22-24

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35



15. Ove Lundgren and Lennart Svensson. Pathogenesis or rotavirus Diarrhoea. Microbe and infection, Editions scientifiques et medicals Elsevier SAS, 2001.3:1145-1156

16. Manual de uso del kit de IDEIATM Rotavirus, septiembre 2006 9807051EFG.




36






37



PROTOCOLO DE CONTROL DE MUESTRAS.

IDEATM Rotavirus Assay

DISTRIBUCION DE LAS MUESTRAS EN LOS MICROPOCILLOS

Fecha ___/___/____




38



Es usado para el control estricto y

riguroso de las muestras, ya que es una representación de la ubicación de cada muestra en el microplato, ordenándolas de arriba hacia abajo.




39

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Control

(+)

B Control

(-)

C

D

E

F

G

H



Esquema de la Ficha.

Prevalencia de Rotavirus en niños menores de 4 años con diarrea, de los centros y puestos de

salud de león.

Código: __________________

Nombre del paciente.________________________________________________

Fecha de Nacimiento. _________________

Sexo: Masculino ( ) Femenino ( )

Nombre del centro/puesto de salud._______________________________________

Resultado de ELISA para rotavirus en la muestra de materia fecal

1 Positivo ( )

2 Negativo ( )

Fecha en la que se realizo la prueba en el laboratorio.________________________




40



Explicación grafica del principio de la prueba ELISA para la detección de rotavirus.




41

Solución stop, el cual detiene la reacción enzima

sustrato, tornando un color amarillento.

Sustrato, que al reaccionar con la enzima tornara

con un color azulado.

Conjugado; un segundo anticuerpo unido a una

enzima.

Antígeno de la muestra.

Anticuerpo policlonal adherido a los

micropocillos.






Preparación de la muestras

(numeración y orden)

Preparación de las

diluciones.

Proceso de mezclado.

42






Proceso de

centrifugación.

Proceso de lavado

de muestras.

Adicción de la

solución stop

Microplato de 12x8 para 96 micropocillos, se muestra la

coloración tomada por los espécimen luego de haberle añadido la solución

stop.

Control positivo.Muestras positivas.

43






Espectrofotómetro

Biotex.

44

prevalencia de rotavirus

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