prezentacja programu powerpoint - jagiellonian university · prezentacja programu powerpoint...
TRANSCRIPT
![Page 1: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/1.jpg)
Definicje
Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis) Technika, umożliwiająca wprowadzenie mutacji w ściśle określonym miejscu łańcucha DNA. Aby można ją było zastosować, konieczna jest znajomość wyjściowej sekwencji nukleotydów w genie. Obecnie, ukierunkowaną mutagenezę przeprowadza się standardowo w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) i odpowiednio zmodyfikowane oligonukleotydy (startery).
Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Rekombinowany DNA jest efektem złożenia za pomocą wybranych technik laboratoryjnych fragmentów materiału genetycznego pochodzących z różnych źródeł/organizmów. Utworzone w ten sposób sekwencje DNA nie występują naturalnie w przyrodzie. Jednak dzięki obecności odpowiednich elementów regulatorowych mogą być powielane oraz mogą ulegać ekspresji po wprowadzeniu do komórek gospodarza.
![Page 2: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/2.jpg)
PCR Powielany fragment DNA
Cykl 2
3’ 5’ 3
’
5’
5’
3’ 3
’ 5’ 3’
5’ 3
’ 5’ 5
’ 3’
5’
3’
matrycowy DNA produkt reakcji z cyklu 1 produkt reakcji z cyklu 2 produkt reakcji z cyklu 3
Cykl 3
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3
’ 5’
3’
5’ 3
’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3
’
5’ 3’
5’
3’
3’
5’
3’ 5’
5’ 3’
5’
3’
5’ 5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’ 3’ 5’
5’ 3’ 3’ 5’
Cykl 1 powielany odcinek DNA
Denaturacja (95°C)
przyłączenie starterów (45-65°C) i wydłużanie nici DNA
(72°C)
![Page 3: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/3.jpg)
PCR, w praktyce wygląda to tak… Powielany fragment DNA
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’ 3’ 5’
5’ 3’ 3’ 5’
Sekwencja startera 2 (reverse, right) pokrywa się z sekwencją nici antysensownej (matrycowej)
sekwencja startera 1 (forward, left) pokrywa się z sekwencją nici sensownej (kodującej)
![Page 4: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/4.jpg)
Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR
OE PCR, metoda wydłużania nakładających się odcinków
3’ 5’5’ 3’
5’3’3’5’
3’5’5’3’
PCR 1
A
C
5’3’3’5’
3’5’5’3’
PCR 2 B
D
3’5’
5’3’3’5’5’3’
PCR 3
A
B
![Page 5: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/5.jpg)
Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR
OE PCR, metoda wydłużania nakładających się odcinków
3’ 5’5’ 3’
5’3’3’5’
3’5’5’3’
PCR 1
A
C
5’3’3’5’
3’5’5’3’
PCR 2 B
D
3’5’
5’3’3’5’5’3’
PCR 3
A
B
reakcja 1 reakcja 2
starter A starter D
starter C starter B
produkt reakcji 1 produkt reakcji 2 zmieszanie
denaturacja rehybrydyzacja
dNTP, polimeraza, startery B i A
nie ulega wydłużeniu
ulega wydłużeniu
produkt reakcji 3
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’ 3’ 5’
3’ 5’ 5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
3’
3’
3’
3’
![Page 6: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/6.jpg)
Wprowadzanie modyfikacji na końcach genów
3’5’
5’3’
5’3’3’5’
3’5’
5’3’
5’3’3’5’
Wykorzystanie zmodyfikowanych starterów do wprowadzania mutacji na 5’ i 3’ końcu genu
Wprowadzenie/usuwanie sekwencji Shine-Dalgarno/Kozak, kodonu STOP, kodonu START, miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych
![Page 7: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/7.jpg)
3’5’
5’3’
5’3’
3’5’
Na początku lub na końcu genu
W środku genu
3’5’
3’5’
5’3’
5’3’
5’3’
3’5’
3’5’3’5’
5’3’
5’3’
A
C
D
B PCR 1 – startery A i C PCR 2 – startery D i B
PCR 3 – startery A i B
Modyfikacje DNA, wprowadzanie delecji przy pomocy PCR
![Page 8: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/8.jpg)
Mutageneza ukierunkowana c.d., metoda Quik Change ®
Większość szczepów E. coli prowadzi metylację dam+. Endonukleaza DpnI rozpoznaje i trawi jedynie metylowaną sekwencję 5´-Gm6ATC-3´.
1. Wektor z genem wyizolowany z bakterii dam+, docelowe miejsce wprowadzenia mutacji
2. Startery wprowadzające mutację są do siebie komplementarne
3. Powielanie dwóch nici wektora, wprowadzenie mutacji
4. Trawienie bakteryjnego DNA, usunięcie nici nie zawierających mutacji
Stratagene
![Page 9: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/9.jpg)
Quik Change ® – warunki reakcji
W wysokiej temperaturze DNA może ulegać depurynacji. Proporcjonalnie, dłuższe matryce będą bardziej uszkodzone niż krótkie. Przy powielaniu długich fragmentów DNA istotne jest skrócenie czasu denaturacji oraz obniżenie temperatury wydłużania.
1A – denat. 94°C/60 sek. 2A – denat. 94°C/30min/bez DNA matrycowego/test. aktywności polimerazy 3A – denat. 94°C/10 sek./z DNA matrycowym
A B
Etap Cykl Temperatura Czas
1 1 95°C 30 sek. 2 12–18 95°C
55°C 68°C
30 sek. 1 min 1 min/1kz DNA
Etap Cykl Temperatura Czas
1 1 95°C 3 min 2 25–30 95°C
55°C 72°C
30 sek. 1 min 1 min/1kz DNA
QC PCR
Normalny PCR
![Page 10: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/10.jpg)
Klonowanie klasyczne
wektor
wektor pocięty enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI
wektor po wklonowaniu wstawki – rekombinowanego DNA
fragment DNA zawierający interesujący nas gen
fragment DNA (wstawka) po trawieniu enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI
ligacja (ligaza DNA)
![Page 11: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/11.jpg)
Enzymy restrykcyjne a metylacja DNA
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy) wystę-pują naturalnie u sinic i bakterii. Razem z komplementarnymi metylazami tworzą system restrykcji-modyfikacji, dzięki któremu mikroorganizmy bronią się przed wnikaniem obcego DNA, np. bakteriofagów.
Specyficzna metylacja własnego DNA służy ochronie przed restryktazami syntetyzowanymi przez organizm – obcy DNA, niemetylowany według określonego wzoru, ulega degradacji.
![Page 12: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/12.jpg)
Enzymy restrykcyjne
EcoRI
EcoRV
PstI
Izoschizomery – enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same sekwencje i tnące je w ten sam sposób, np. MspI i HpaII 5'...C^C G G...3' 3'...G G C^C...5'
Neoizoschizomery – enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same sekwencje, ale tnące je w różny sposób, np. SmaI 5'...C C C^G G G...3‘ i XmaI 5'...C^C C G G G...3‘ 3'...G G G^C C C...5‘ 3'...G G G C C^C...5‘
![Page 13: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/13.jpg)
Metoda OE PCR cloning – klonowanie przy pomocy PCR
Wektor, do którego
chcemy wprowadzić
gen
Gen, który chcemy wprowadzić do wektora
Projektujemy startery, częściowo komplementarne do genu a częściowo komplementarne do wektora
W wyniku reakcji PCR otrzymujemy gen, na którego końcach
znajdują się sekwencje
komplementarne do wektora
Tak zmodyfikowany gen wykorzystywany jest w kolejnej reakcji PCR, gdzie służy za starter
Po zakończeniu reakcji zmetylowany wektor,
który służył jako matryca zostaje pocięty
za pomocą enzymu DpnI
Namnożony,niezmetylowany wektor z wklonowanym
genem zostaje wprowadzony
do komórek gospodarza,
gdzie gen może ulec ekspresji
![Page 14: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/14.jpg)
Termostabilne polimerazy DNA
Polimeraza Pochodzenie Aktyw. 5’ – 3’
egzonukl.
Aktyw. 3’ – 5’
egzonukl.
Częstość błędów [1x10-6]a
Wydłu- żanie
3’-końca Termo-
stabilność Proce-
sywnośćb
Taq 1976 Thermus aquaticus tak nie 22 tak 9’ w 97,5°C 50
Pwo Pyrococcus
woesei nie tak 3,2 nie >2h w 100°C 20–30
Pfu 1991 Pyrococcus
furiosus nie tak 2,6 nie 4h w 95°C
DeepVent Pyrococcus
szczep GB-D nie tak 5 nie 8h w 100°C
Phusion nie tak 0,44 nie
a częstość błędów: ilość błędów/pz/cykl b ilość nukleotydów przyłączonych zanim polimeraza odłączy się od matrycy
![Page 15: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/15.jpg)
PCR – ogólne zasady projektowanie starterów
Długość starterów – od 18 do 30 zasad, krótsze startery mogą się niespecyficznie wiązać z matrycą
3’ koniec startera – nie powinien zawierać więcej niż 3 zasady G i/lub C, gdyż mogą one stabilizować niespecyficzne oddziaływania starter–matryca
5’ koniec startera – jest mniej krytyczny dla specyficznego przyłączania startera do matrycy dlatego może być modyfikowany
Zawartość GC – zasady GC powinny stanowić od 40 do 60 % sekwencji
Hybrydyzacja – 3’ koniec starterów nie powinien tworzyć struktury spinki do włosów, startery używane w reakcji nie powinny tworzyć homo- i/lub heterodupleksów
Temperatura topnienia – startery używane w reakcji powinny mieć zbliżoną temperaturę topnienia (różnica 2–5°C), optymalnie – nieco powyżej 60°C
hybrydyzacja starterów na końcu 3’
![Page 16: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/16.jpg)
Optymalizacja warunków PCR
Stężenie starterów: końcowe stężenie każdego ze starterów powinno się zawierać w przedziale między 0,1 a 0,5 µM (6×1012 – 3×1013 cząsteczek). Wyższe – zwiększa prawdopodobieństwo powstania niespecyficznych produktów
Stężenie matrycy DNA: ilość używanego matrycowego DNA zależy od jego pochodzenia. Zwykle stosuje się 100–250 ng genomowego i 20–50 ng plazmidowego DNA na 50 µl reakcji
Stężenie nukleotydów: końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów powinno wynosić ok. 0,2 mM (ilość, która pozwala uzyskać ok. 6–6,5 µg DNA)
Ilość cykli – od 25 do 35, w zależności od pochodzenia DNA i ilości matrycy
Czas wydłużania starterów – zwykle przyjmuje się regułę 60 sek/1000 zasad
![Page 17: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/17.jpg)
Bufor – standardowy bufor zawiera 50 mM KCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Podniesienie stężenia KCl do 70–100 mM może zwiększyć wydajność syntezy fragmentów o długości <500 pz. Niektóre bufory obok jednowartościowych jonów K+
zawierają jony NH4+ (obecność jonów NH4
+ minimalizuje potrzebę optymalizacji stężenia jonów Mg2+ oraz temperatury przyłączania starterów.
Critical Factors, for Successful PCR, Users Manual, Qiagen
temp °C
produkt PCR
niespecyficzne produkty PCR
Temperatura przyłączania starterów (annealing temperature) – im wyższa, tym bardziej specyficzny produkt reakcji
Optymalizacja warunków PCR
Stężenie jonów magnezu – im wyższe, tym większa wydajność reakcji ale także ilość produktów niespecyficznych
![Page 18: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/18.jpg)
Obliczanie temperatury topnienia starterów
Dla starterów liczących nie więcej niż 20 nukleotydów temperaturę topnienia (melting temperature) można wyliczyć wg empirycznej zasady Wallace’a: Tm = 2°C × (A + T) + 4°C × (G + C)
Dla dłuższych oligonukleotydów (do 70 zasad), gdy stężenie kationów jest ≤ 0,4 M można zastosować równanie: Tm = 81°C + 16,6 (log10 [K+]) + 0,41(%[G + C])
Temperatura hybrydyzacji (annealing temperature) jest na ogół o 5–10°C niższa od Tm, należy ją ustalić empirycznie.
Abso
rban
cja pr
zy 26
0 nm
Tm=69 °C
Dwuniciowy DNA
Częściowo rozwinięty DNA
Jednoniciowy DNA
Temperatura [°C]
![Page 19: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/19.jpg)
Czynniki wpływające negatywnie na PCR
Wysoka zawartość zasad GC jest odpowiedzialna za powstawanie struktur drugorzędowych w obrębie DNA, co prowadzić może do zahamowania aktywności polimerazy. Glicerol, DMSO (2–10%), chlorek tetrametyloamonu (0,01–10 mM), formamid (5–20%) poprawiają wydajność tego typu reakcji PCR.
Zanieczyszczenia związkami używanymi przy oczyszczaniu matrycowego DNA Do związków hamujących aktywność polimerazy należą: SDS (>0,005% w/v), fenol (>0,2% v/v), etanol (> 1% v/v), izopropanol (>1% v/v), octan sodu (>5 mM), EDTA (> 0,5 mM).
Czystość starterów zależy od sposobu ich oczyszczenia po syntezie. Standardowo startery oczyszcza się stosując sączenie molekularne. Startery o długości powyżej 70 zasad powinny być oczyszczane za pomocą HPLC.
![Page 20: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/20.jpg)
― stworzone na potrzeby klonowania i/lub ekspresji genów ― posiadają m. in:
• polilinker, MCS (multi cloning site) • ori (origin) miejsce startu replikacji • marker selekcyjny: np. gen oporności na antybiotyk • promotor
Wektory plazmidowe
― naturalnie występujące u bakterii pozachromosomalne, koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA, 1–200 kpz.
― ich replikacja przebiega niezależnie od chromosomalnego DNA ― posiadają mechanizmy umożliwiające zachowanie stałej liczby cząsteczek
w komórce gospodarza oraz odpowiednią segregację do komórek potomnych ― replikacja i transkrypcja genów plazmidowych przebiega zwykle w oparciu
o enzymy gospodarza ― w plazmidach naturalnych zawarta jest informacja decydująca o:
oporności/produkcji antybiotyków, syntezie bakteriocyn, enterotoksyn, wytwarzaniu enzymów restrykcyjnych, rozkładzie złożonych związków organicznych, oporności na jony metali ciężkich, zdolności do koniugacji, itp.
Plazmidy
Wektory plazmidowe
− dodatkowo mogą zawierać sekwencje kodujące metki ułatwiające oczyszczanie lub sekwencje białek wykorzystywanych jako partnerzy fuzyjni
![Page 21: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/21.jpg)
Wektor do tworzenia białek fuzyjnych (Clontech)
![Page 22: Prezentacja programu PowerPoint - Jagiellonian University · Prezentacja programu PowerPoint Author: Magdalena Tworzyd o Created Date: 11/21/2014 1:28:51 PM](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022043006/5f8f678af9da1c3cb27a8b51/html5/thumbnails/22.jpg)
Wektor do równoległej ekspresji dwóch białek (Invitrogen)