Bioinforma)cs  Primary  Analysis  Tutorial  

Phil  Richmond,  PRA  Dowell  Lab  

University  of  Colorado,  Biofron)ers  Ins)tute  

 

Outline  

•  Intro  – Things  that  will  be  covered  – Things  that  won’t  be  covered  

•  Workflow  •  Mapping  with  Bow)e  •  File  Conversion  with  Samtools  •  Visualiza)on  with  IGV  •  Extras  

Sequencing  

•  There  are  many  different  types  of  sequencing  including  454,  Illumina,  SOLiD,  IonTorrent,  and  more.  

•  If  you  are  interested  in  each  type  of  sequencing…  

Things  that  will  be  covered  

•  The  primary  analysis  that  I  will  walk  through  is  a  “bare  bones”  analysis,  meant  to  take  your  reads  from  Illumina  sequencer  to  visualizer,  as  well  as  some  organiza)onal  prac)ces  – Mapping  (Bow)e/BWA)  – File  format  conversion  – Visualiza)on  

Things  that  won’t  be  covered  

•  Post/preprocessing  steps  that  I’m  leaving  out  include:  –  FastX  analysis  of  raw  reads  and  adapter  clipping,  etc.  –  PCR  duplicate  marking  (Illumina)  on  raw  reads  –  Base  Quality  Score  Recalibra)on  (GATK)  on  mapped  reads  –  Local  Realignment  around  indels  on  mapped  reads  

•  Any  Secondary  or  Ter)ary  analysis  or  scrip)ng  techniques  –  Secondary  analysis  by  personal  appt.  –  Scrip)ng  techniques  by  joining  Dave  Knox’s  python  class  

Login  to  Tuxedo  

•  Login  with  –X  op)on  to  open  X11  viewer.  •  On  a  PC…see  me  for  separate  instruc)ons  to  pipe  visualiza)on  

•  ssh  –X  richmonp@tuxedo.colorado.edu  

Working  Directory  

•  We  will  be  working  in  /data/Tutorial/<Student>  –  cd  /data/Tutorial/Phil/  

•  The  necessary  files  for  the  tutorial  are  in  /data/Tutorial/Files/  –  Parent113010.fa  is  the  reference  (e.  coli)  genome  –  Parent120710.gff  is  the  annota)on  file  –  Sample1_single.fastq  is  the  reads  file  we  are  working  with  

Organiza)on  

•  In  your  own  directory  (/data/Tutorial/<Student>/)  create  the  following  sub-­‐directories:  – Genome/  

•  Keep  the  fasta  and  gff  files  here  – Bow)e/  

•  Keep  the  Bow)e  alignments,  and  post-­‐processing  of  bow)e  alignments  here  

– Fastq/  •  Keep  the  raw  fastq  files  here  

Workflow  Raw  Reads  (Fastq)  

Mapped  Reads  (SAM)  

Mapping  (Bow)e)  

Binary  Mapped  Reads  (SORTED.BAM)  

File  Conversion  (SAMTOOLS)  

Visualiza)on  (IGV)  

Workflow  Raw  Reads  (Fastq)  

Mapped  Reads  (SAM)  

Mapping  (Bow)e)  

Binary  Mapped  Reads  (SORTED.BAM)  

File  Conversion  (SAMTOOLS)  

Visualiza)on  (IGV)  

Fastq  file  

•  File  extension  .fastq  or  .fq  •  Example:  @Read_iden)fier_and_flowcell_info  ACGTCCGGTTNNN…  +  B$!?NP\\\[%&C…  

•  For  more  info  on  ASCII  encoding  QV  scores…go  to  wikipedia  

Read  ID  Read  Sequence  Read  QV  ID  Read  QV  Sequence  

Workflow  Raw  Reads  (Fastq)  

Mapped  Reads  (SAM)  

Mapping  (Bow)e)  

Binary  Mapped  Reads  (SORTED.BAM)  

File  Conversion  (SAMTOOLS)  

Visualiza)on  (IGV)  

Mapping  the  Short  Reads  •  Taking  each  read  and  mapping  it  to  a  reference  genome    

– Bow)e  

 

TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCAAAAAGCATGCATGCA  

TGCATGAATGCAAAAAGCATGCA  

Bow)e-­‐Build  Command  

•  In  order  to  map  the  reads  to  a  genome,  you  must  acquire  the  genome  in  the  .fasta  (.fa)  format,  and  then  index  it.  

•  bow)e-­‐build  -­‐f  <in.fasta>  <out_prefix>  – $bow)e-­‐build  SGDv4.fasta  SGDv4_bow)e    

Bow)e  command  

•  Now  we  map  back  to  the  reference  we  just  indexed.  

•  bow)e  <reference_in.prefix>  -­‐q  <in.fastq>  -­‐S  <out.SAM>  2>  <out.stderr>  – $  bow)e  /data/Tutorial/Phil/Genome/Bow)e_index/SGDv3_bow)e  –q  Sample1.fastq  –S  Sample1_  bow)e.sam  2>  Sample1_bow)e.stderr  

Sam  File  

•  Tab  Delimited  •  hup://genome.sph.umich.edu/wiki/SAM  •  Open  Example  SAM  

Workflow  Raw  Reads  (Fastq)  

Mapped  Reads  (SAM)  

Mapping  (Bow)e)  

Binary  Mapped  Reads  (SORTED.BAM)  

File  Conversion  (SAMTOOLS)  

Visualiza)on  (IGV)  

Samtools  Commands  

•  samtools  view  –bS  <in.sam>  -­‐o  <out.bam>  – $samtools  view  –bS  Sample1_bow)e.sam  –o  Sample1_bow)e.bam  

•  samtools  sort  <in.bam>  <out.sorted>  – $samtools  sort  Sample1_bow)e.bam  Sample1_bow)e.sorted  

•  samtools  index  <in.sorted.bam>  – $samtools  index  Sample1_bow)e.sorted.bam  

Workflow  Raw  Reads  (Fastq)  

Mapped  Reads  (SAM)  

Mapping  (Bow)e)  

Binary  Mapped  Reads  (SORTED.BAM)  

File  Conversion  (SAMTOOLS)  

Visualiza)on  (IGV)  

IGV  

•  Located  at  /data2/IGV/  •  Several  different  versions  available,  recommend  either:  

•   /data2/IGV/IGV_2.1.19/igv.jar  •  /data2/IGV/IGV_1.5.64/igv.jar  

•  To  run  IGV:    –  java  –Xmx5g  –jar  <igv.jar>    

•  $java  –Xmx5g  –jar  /data2/IGV/IGV_1.5.64/igv.jar  &  

IGV:  Crea)ng  a  genome  

•  Reference  Instruc)ons  on  sheet.  

Bow)e  and  Bfast  IGV  

Bow$e  

Bfast  

Gene  

Advantages  to  Bfast  Gapped  Mapping  

Bow$e  

Bfast  

Gene  

Bfast  Mapping  Loosely  

Bow$e  

Bfast  

Gene  

If  you  are  gexng  the  hang  of  it  quickly…  

•  Try  going  through  the  next  few  commands  

BWA  Paired  end  •  /usr/local/src/bwa-­‐0.6.2/bwa  index  –a  is  –f  <in.fasta>  

•  Map  each  read  in  the  pair  independently  •  /usr/local/src/bwa-­‐0.6.2/bwa  aln  <reference.prefix>  <in_1.fq>  >  <out.sai>  

•  Finalize  the  mapping  by  conver)ng  (for  both  reads)  both  the  .SAI  and  the  .FQ  into  a  final  SAM  alignment:  

•  /usr/local/src/bwa-­‐0.6.2/bwa  sampe  <reference.prefix>  <in_1.sai>  <in_2.sai>  <in_1.fq>  <in_2.fq>  >  <out_paired.sam>    

Bow)e  Unique  Mapping  

•  Inves)gate  the  different  Bow)e  op)ons:  – Look  at  –m  (number  of  mappings  per  read),  -­‐v  (number  of  mismatches  per  seed)  

TopHat  Spliced  Mapping  

•  /usr/local/src/tophat-­‐2.0.4.Linux_x86_64/tophat  –G  <in.gff>    -­‐o  <output_directory>  <bow)e_index>  <in.fastq>    

The  end…for  now.