Primena HPLC na biološkim materijalima

HPLC analiza i fluorescentna detekcija 3-D-hidroksibuterna kiseline, deravitizacija sa benzofurazanom;Primena u analizi ljudske plazme

Ukratko:

Opisana je jednostavna i nova metoda za odredjivanje D-3- HBA u plazmi.Zasniva se na reakciji (2S)-2-amino-3-metil-1-[4-(7-nitro-benzo-2,1,3-oksadiazol-4-il)-piperazin-1-il]-butan-1-one (NBD-PZ-Val) sa D-3-HBA u prisustvu O-(7-azobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3tetrametiluronijum heksafluorofosfata (HATU) i N-etildiizopropilamin (DIEA),pri čemu nastaje fluorescentni derivat.Derivat je praćen fluorimetriski na λex = 489 nm i λem = 532 nm.HPLC analiza je pokazala zadovoljavajucu linearnost (r2 = 0.9997) u opsegu koncentracije 20 to 500 μmol/L.Granica detekcije je bila 7.7 μmol/L,a granica kvantifikacije 25.8 μmol/L.Analitička metofa je uspešno primenjena na uzorcima ljudske plazme kod zdravih individua.

Uvod:

Koncentracija D-3-HBA u serumu je indikator za oksidaciju masnih kiselina u jetri,pri povećanoj produkciji acetosirćetne kiseline,koja se pretvara u D-3-HBA u katalizovanoj reakciji sa D-3-hidroksibuterne dehidrogenaze.D-3-hidroksibuterna kiselina predstavlja glavni oblik ketonskih tela posebno kod stanja kao što je metabolička glad,dijabetes melitus,gde je oksidacija masnih kiselina u jetri poboljšana.

Brojne metode radjene su u ovu svrhu:

1. Enzimski testovi koji se zasnivaju na reakciji reverzibilnog pretvaranja 3-D-HBA do acetoacetata,uz pomoć enzima D-3-hidrokisbuterne dehidrogenaze(absorbanca na 340 nm).Ova enzimska-spekrofotometrijska metoda je jednostavna i tacna,ali nije dovoljno osetljiva i stroga.

2. GC-MS-primenjuje se kod uzoraka krvi i urina,koji sadrže ovo jedinjenje,pri koncentraciji većoj od 20 μmol/L. Medjutim ova metoda zahteva specifičnu i skupu aparaturu.

Koristeći drugačiji pristup,naucnici su razvili metodu fluorescentne deravitizacije za enantioselektivno odredjivanje oba enantiomera 3-hidroksibutarata u normalnim tkivima pacova,i tkivima pacova obolelim od dijabetesa,korišćenjem HPLC sistema,imajući u vidu prethodna ograničenja razvili su i osetljiv i pogodan HPLC sistem za kvantitativno određivanje D

enantiomera 3-hidroksibuterne kiseline,iako L-3-hidroskibuterna kiselina nema biološki značaj,potrebno je odvojiti oba enantiomera.

Enantiomeri su odvojeni pomoću HPLC,koristeći se dvema metodama.Direktna metoda zasniva se na uoptrebi hiralne stacionarne faze.Druga metoda je indrektna metoda,koja se bazira na formiranju diastereoizomera sa odgovarajućim hiralnim derivatizacionim reagensom,koja je pogodna za anilizu enantiomera koji se nalaze u tragovima u biološkm uzorcima,zato što visoko osetljiva detekcija može biti izvršena sa opcijom kuplovanja analita sa pogodnim hiralnim reagensima koji imaju visok UV–Vis absorptivitet(ε) ili kvantni prinos pri visokoj fluorescenciji.(Φ).Označivanje hiralnih jedinjenja sa reagenskom koji apsorbuje u UV-Vis regionu je najpopularniji deravitizacijom.Stoga se primenjuju mnoge Uv oznake za označavanje različitih funkcionalnih grupa.Medjutim u nekim realnim uzrocima apsorpitivitet tako dobijenih derivata nije dovoljno visok da osigura adekvatnu osetljivost.Metoda koja se koristi za detekciju enantiomera u tragovima UPLC–MS/MS je prilično skupa,i van domašaja mnogih laboratorija,a reakcija deravitizacije je spora i traje 90 minuta.

Potreban je selektivni i osetljiv sistem za detekciju malih količina hiralnih jedinjenja kod bioloških uzoraka.Fluorescentno obeleživanje je jedna od najefikasnijih načina za kvantitativno odredjivanje bioloških uzoraka u smislu osetljivosti i/ili selektivnosti.

U ovu svrhu sintetisan je hiralni fluoroescentni deravitizacioni reagens,koji ima benzofuranoznustrukruru,(2S)-2-amino-3-metil-1-[4-(7-nitro-benzo-2,1,3-oksadiazol-4-il)-piperazin-1-il]-butan-1-one-(NBD-PZ-Val),koji lako i kvantitativno reaguje sa D i L mlečnom kiselinom,i formira visoko stabilno,i fluorescentno jedinjenje distereomerni amid.

Zbog toga,primenjuje se visoko osetljiva RP-HPLC metoda za detekciju D-3-HBAu plazmi sa fluoroescentnom detekcijom posle deravitizacije sa NBD-PZ-Val,u prisustvu agensa za kuplovanje (HATU/DIEA).

Eksperimentalni deo:

Hemikalije:

(NBD-PZ) (DIEA) O-(7-azobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronium heksafluorofosfat (HATU) D,L-3-hydroxybutyric and D-3-Hidroksibuterna kiselina, (S)-2-(Boc-amino)-metilbuterna

kiselina (Boc-L-valin; enantiomerna ćistoća ≥99.0%), O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N ,N -tetrametil-′ ′

uronium heksafluorofosfat (HBTU), trifluorsirćetna kiselina(TFA), N,N-dimetilformamid (DMF) i HCl

NBD-PZ-Val

Uzorci plazme:

Dobijeni su standardnom procedurom.Ljudska krv je čuvana u epruvete koje sadrže EDTA kao antikoagulans.Plazma je dobijena centrifugiranjem 2000 obrtaja u toku 15 minuta,a uzorci su čuvani na −80°C do analize.

Priprema uzoraka:

40 μl uzorka(bilo humane plazme ili 20–500 μmol/L rastvora natrijum D-3-hidroksibutarata ili D,L-3-hidroksibutarat u vodi) je pomešano sa 40 μL vode is a 120 μL rastvora CH3CN,i s mesa se centrifugira 6 min na 4,500 obrtaja.Nakon toga 40 μL dobijenog rastvora dodat je u 40 μL 6 to mmol/L NBD-PZ-Val u CH3CN ,u prisustvu 40 μL HATU i DIEA (oba su 8 mmol/L u rastvoru CH3CN), i dobijeni rastvor inkubiran je na 30 °C u toku 5 mina zatim zakišeljen sa 80 μL 1 mol/L HCl.

Aparatura i hromatografski uslovi:

HPLC analiza izvodi se na Agilent 1100 system(Agilent Technologies, Inc.)opremljen sa onlajn vacuum degasterom,injektorom,grejač kolona,fluorescentni detektor.

HPLC razdvajanje racemskog 3-HBA i D-3-HBA izvedeno je na reverzno faznoj C koloni Synergy Hydro (Phenomenex, Torrance, CA, USA) 150 mm × 3 mm, (i.d.),mobilne faze su 0.1% vodeni rastvor trifluorosirćetne kiseline i MeOH(A i B respektivno).Odvajanje je izvršeno pri brzini protoka od 600 μL/min,ekvilibrisana kolona na 30% B;gradijent linearnosti je povećan na 50% B u toku 20 minuta,onda je dostigla 100% B u toku 5 minuta ,i dalje se održava na 100% B u toku 2 minuta za vreme ispiranja kolone.Re-ekvilibracija vršena je 8 minuta; ukupno vreme analiziranja bilo je 35 minuta;grejač kolone podešen je na 30 °C.Injektirano je 5 μL uzorka u

kolonu.Derivatozovani D-3-HBA je fluorescentno detektovan sa eksitacijom na 489 nm i emisijom na 532 nm.

Kalibracija i linearnost:

5 standarnih rastvora D-3-HBA u opsegu kocentracije 20–500 μmol/L,su kalibrisani. Oni su bili

analiyirani 3x dnevno tokom 4 dana. rezultati linearne regresivne analize D3HBA, koji predstavljau povrsine pikova, su kombinovani sa koncentracijama D3HBA cime su dobijeni kalibracioni parametri za D3HBA.

Recovery i preciznost:

Recovery D-3-HBA iz plazme procenjen je analizom humane plazme dobijene iz zdravih individua,posle dodavanja uzorka D-3-HBA pri različitim koncentracijama.Koncentracije bioloških uzoraka odredjivane su 3x dnevno. Intra test,reproduktivnosti metode,sastoji se od ponovljenih analiza uzoraka(n=3).Inter test sastoji se od ponovljenih analiza istog uzorka tokom 4 dana.

Rezultati:

Identifikacija proizvoda:

Deravitizovani uzorci oba racemata i D-3-HBA su analizirani LC–MS da bi se potvrdilo da se stvaranje diastereoizomera zapravo i dogodilo.Jon hromatogram EIC prikazuje signale razdvojenih diastereoizomera u 18.03 min (D-HBA-NBD-PZ-Val) i19.48 min (L-HBA-NBD-PZ-Val), respektivno.Maseni spektar svakog diastereozomera pokazuje odgovarajuce protonovane jone na t 435 m/z,adukti Na i K na 457 m/zi 473 m/z,respektivno.

Fluorescentna svojstva

Spekti eksitacije i emisije hiralnog reagensa i derivate D-3-HBA u acetonitrilu.

Vreme:

Najveći porast pika primećen je u 5 minutu,i nije se značajno promenio do 60 minuta.

Hromatografsko razdvajanje

Hromatogram standardih rastvora derivatizovanog racemskog D-3-HBA u vodi pokazuje odlično razdvajanje.

Derivatizovani enantiomeri D-3-HBA u vodi,humanoj plazmi,i standardni rastvori D-3-HBA u humanoj plazmi.

Pik se odnosi na D-3-HBA pokazuje da je dobro razdvojen,sa vremenom zadržavanja 15,3 minuta.

Linearnost,limit kvantifikacije(LOQ) i limit detekcije (LOD):

Kalibraciona kriva dobijena za D-3-HBA u opsegu koncentracije 20–500 μmol/L.

Jednačina regresije :

y = 2.16x +6.70 (r2 = 0.9997).

LOK i LOD vrednosti računate su na kalibracionoj krivi,deljenjem tri do deset puta standardne devijacije.

LOD i LOQ vrednosti su 7.7 μmol/L i 25.8 μmol/L,respektivno.

Recovery i preciznost

Recovery je procenjen merenjem koncentracije analita u humanoj plazmi sa 4 različite koncentracije standardnih rastvora D-3-HBA u opsegu 83.3–90.9%

Inter i intra testovi se analiziraju se pomoću standardnih rastvora derivatizovanih enantiomera D-3-HBA u humanoj plazmi. Vrednosti Intra-testa su ispod 1% i vrednosti inter-testa iznad 2.13%.

Analiza derivata D-3-HBA u humanoj plazmi:

Koncentracije D-3-HBA u plazmi od 5 zdravih osoba bile su pogodne za procenu promene metode kod bioloških uzoraka.

Diskusija

Ova studija opisuje koristnu inirektnu metodu RP-HPLC,sa fluorescentnom detekcijom za kvantitativno odredjivanje D-3-HBA u humanoj plazmi,upotrebom hiralnih derivatizacionim reagensima.

Sinteza reagenasa je jednostavna,zahvaljujući blagim reakcionim uslovima,ne javlja se racemizacija.Kao dokaz reakcija enantiomerno čistog D-3-HBA sa hiralnim reagensom.proizvela je pik,čime se ukazuje da je hiralni derivatizacioni reagens optički čist,i da se ne javlja racemizacija u toku sinteze ovog reagensa ili tokom reakcije deravitizacije.

HPLC metoda pokazuje sasvim zadovoljavajuću preciznost i linearnost ,i uspešno je primenjena.za odredjivanje D-3-HBa u malim količinama (40 μL) u uzorcim humane plazme.

Diastereomer L-3-HBA je dobro odvojen od D diastereomera u puferu,skriven je u plazmi,zbog velikog pika,koji potice najverovatnije od mlecne kiseline.

Vazno je napomenuti da je ova metoda osetljivija od bilo koje druge metode .