primer design traduzido
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PCR e Primer Design
Agradecimento: Alguns destes slides forammodificados da palestra ministrada por Li
Liu, M.D.
Centro Interdisciplinar para Pesquisas emBiotecnologia.
Universidade da Florida
10 de Junho de 2003
Aula 4
PCR
PCR
PCR
PCR
Características desejáveis em um Primer
• Temperatura de melting (Tm) na faixa de 52 ºC a 65 ºC.
• Ausência da capacidade de dimerização.
• Ausência significativa da formação de grampos (>3 bp).
• Inexistência de sítios secundários de anelamento dos primers.
• Baixa especificidade na ligação na extremidade 3' (ie. Menorconteúdo de GC para promover mispriming).
Uniqueness- Deve existir somente um sítio de pareamento no DNA moldeonde ocorra a ligação do primer, o que significa que a seqüênciados primers é única na seqüência do DNA molde.
- Não devem existir sítios de anelamento em possíveis fontes de contaminação, tais como o ser humano, rato, cobaia, etc. (buscaBLAST no genoma correspondente).
Primer candidate 1 5’-TGCTAAGTTG-3’
Primer candidate 2 5’- CAGTCAACTGCTAC-3’
TGCTAAGTTG CAGTCAACTGCTAC
Template DNA5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3’
NOT UNIQUE!
UNIQUE!
TGCT AGTTGA
Comprimento
- O comprimento do primer influencia a uniqueness e as temperaturas de melting e anelamento.
- Quanto maior o comprimento do primer, maior a possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma quemaiores serão as temperaturas de melting e anelamento.
- De uma forma geral, o comprimento do primer não deve ser inferior a 15 bases para assegurar a uniqueness. Geralmente, nós sintetizamos primers com 17-28 bases de comprimento.
- A existência desta faixa está baseada no fato de se buscarunique primers que apresentem temperatura de anelamento dentro da faixa considerada como a mais adequada.
Composição de Bases
- A composição de bases afeta a especificidade da hibridização, as temperaturas de melting e anelamento, e a estabilidade interna.
- Composição de bases randômica é preferível. Sempre que possíveldevem ser evitadas longas regiões ricas em (A+T) e (G+C).
- Geralmente, a quantidade de (G+C) deve estar em torno de 50-60% para assegurar-nos as temperaturas de melting e anelamentoadequadas à reação de PCR, e, desta forma, fornecer estabilidade nahibridização. Porém, as temperaturas de melting e anelamento e a estabilidade na hibridização são afetadas por outros fatores, os quaisnós discutiremos mais tarde.
• Therefore, (G+C) content is allowed to change.
Template DNA5’...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3’
TGCCCG GCCCGATCATGCT GCCCG GCCCGCAT T T AT GC
Temperatura de Melting
-Temperatura de Melting, Tm – É a temperatura na qual metadedas fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metadena forma de dupla hélice.
- Tm é dependente da composição do DNA, de modo queaumento do conteúdo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior número de ligações de H.
Determinação
(Composição de Base): Tm = 59.9 + 0.41*(%GC) - 600/comprimento
Outros métodos mais precisos são disponíveis.
Temperatura de Anelamento
Tanneal= Tm_primer– 4°C
Temperatura de anelamento, Tanneal – É a temperatura naqual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm .
Para assegurar que o pareamento dos primers ao DNA moldeocorra antes que as duas fitas se liguem uma a outra, énecessário que: Tm_product – Tanneal≥ 30 °C .
Estringência no Anelamento do Primer
-A estringência determina a especificidade no produto de DNA a ser amplificado.
-Tanneal é o fator mais significante que afeta a estringência no anelamento do primer.
Tanneal : muito baixa � menor estringência � primer pareiaem qualquer lugar.
muito alta � maior estringência � primer pode nãoparear.
Outros fatores:
• GC%: pares de GC são mais estringntes que pares de AT.
• Concentração de sais & tampão.
Estrutura InternaSe os primers puderem parear com eles mesmos, ou parearem um com o outro mais facilmente do que com o DNA molde, então a eficiência do PCR irá ser reduzida significativamente. Primers com estas características devem ser evitados.
Entretanto, às vezes estas duas estruturas não são problemáticas, uma vez que a ocorrência destas pode ser restringida através dadeterminação da temperatura de anelamento. Por exemplo, algunsdímeros ou grampos são formados a 30 °C, enquanto que durante o ciclo do PCR a temperatura mais baixa seja de 60 °C.
Primer Pair Matching
- Primers trabalham em pares –forward primer e reverse primer. Uma vez que eles são usados na mesma reação de PCR, serápreciso que as condições do PCR estejam adequadas aofuncionamento de ambos.
- Um ponto crítico são suas temperaturas de anelamento, as quaisdeverão ser compatíveis entre si. A máxima diferença que pode ser obervada entre elas é de 3 °C. The closer their Tanneal are, the better.
Resumo ~ Quando um primer é um primer?
5’ 3’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
Resumo ~ Critérios para Primer Design
1. Uniqueness: assegurar o pareamento correto dos primers;
2. Comprimento: 17-28 bases. Esta faixa é variável;
3. Composição de bases: a quantidade de (G+C) deve estar em torno de 50-60%; se possível devem ser evitadas longas regiões ricas em(A+T) e (G+C);
4. Otimizando o pareamento de bases: é crítico que a estabilidade daextremidade 5’ seja maior que a da 3’ para minimizar erros no pareamento.
5. Tm entre 55-80 °C é desejável;
6. Esteja certo que os primers a serem usados em uma mesma reação de PCR tenham temperaturas de anelamento com uma diferença entreelas que não seja superior a 2 – 3 °C.
7. Minimizar estruturas secundárias internas: grampos e dímeros nãosão desejáveis.
Computer-Aided Primer Design
Primer design is an artart when done by human beings, and a far better done by machinesfar better done by machines.
Alguns programas paraprimer design que nós utilizamos:
- Oligo: Life Science Software, standalone application.
- GCG: Accelrys, ICBR maintains the server.
- Primer3: MIT, standalone / web application http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
- BioTools: BioTools, Inc. ICBR distributes the license.
- Others: GeneFisher, Primer!, Web Primer, NBI oligo program, etc.
Software para determinação da temperatura de melting:- BioMath : http://www.promega.com/biomath/calc11.htm
Task
Desenhar um par de primers para a seqüência “NM_203378” no NCBI GenBank, então a seqüência que codifica a “human myoglobin” será amplificada usando PCR.
Entre 156..620
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
Primers UniversaisPrimers podem ser desenhados para amplificarem apenas um
produto.
Primers também podem ser desenhados para amplificarem múltiplosprodutos. Nós chamamos tais primers de “primers universais”.
Por exemplo, os primers desenhados para amplificarem todos osgenes HPV.
Estratégia:
1. Alinhar grupos de seqüências que você quer amplificar.
2. Encontrar a região mais conservada entre as extremidades 5’ e 3’.
3. Desenhar o forward primer na região conservada na porção 5’.
4. Desenhar o reverse primer na região conservada na porção 3’.
5. Matching forward e reverse primers para encontrar o melhor par.
6. Garantir uniqueness em todas as seqüências molde.
7. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.
Primers Semi-Universais
Primers podem ser desenhados para amplificarem apenas um subgrupo de seqüências-molde pertencentes a um grande grupo de seqüênciassimilares. Por exemplo, desenhar um primer para amplificar o gene HPV tipos 1e 6, e não amplicar os demais.
Estratégia:
1. Alinhar todos os tipos de genes HPV.
2. Identificar um subgrupo de genes que são mais similares entre si queem relação a outros subgrupos. Neste caso, os tipos 1 e 6.
3. Encontrar as regiões 5’ e 3’ que são mais conservadas entre o tipo 1 e o tipo 6, mas que sejam variáveis nos outros tipos.
4. Desenharforward primers na região 5’ e reverse primers na região 3’.
5. Matching forward e reverse primers para encontrar o melhor par.
6. Garantiruniqueness em todas as seqüências molde.
7. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.
Primers Degenerados /Guessmer
- Em alguns casos, as seqüências de DNA não estãodisponíveis ou são difíceis de serem alinhadas. Então, uma ouum grupo de proteínas podem ser escritas como umaseqüência de nucleotídeos e utilizadas como molde paradesenhar primers/probes. Nós denominamos estes primers de guessmer.
- Transcrever proteínas em nucleotídeos é problemático e, aomesmo tempo, é o recurso disponível em alguns casos. Umavez que o código genético é degenerado, diferentes organismosapresentam preferential biases no códon correntementeusado, os quais podem ser usados para minimizá-los quandoda conversão da seqüência de aminoácidos na de nucleotídeos.
Guessmer
Estratégia:
• Transcrever proteínas em nucleotídeos usando o códigocorrespondente da tabela de códons. Identificar regiões 5’ e 3’ que apresentem a menor variabilidade possível.
• Design e match forward/reverse primers como vistoanteriormente.
•Os primers deverão possuir em torno de 30 bases de comprimento em contrapartida das bases mismatchedreduzirem a especificidade na hibridização.
• Utilize elevada temperatura de anelamento para aumentar a estringência do primer durante o pareamento.
Resumo ~ Primer DesignAvançado
Primers podem ser desenhados no intuito de serem empregadoscom diferentes propósitos.
Primer universal, primer semi-universal e guessmers são algunsdeles.
Existem outras várias situações onde a experiência em primer design são requeridas, tais como real-time PCR (PCR em tempo real), estudo de polimorfismo em populações (microsatellite, AFLP, SNP …), e internal probe design, dentre outros.
Entretanto, as regras básicas a serem sempre empregadas são: ConseguirConseguir queque a a estabilidadeestabilidade e a e a especificidadeespecificidade nana hibridizaçãohibridização sejamsejamadequadasadequadas..