primerjalna študija predelave surove celuloze …vsa uporabljena celulozna vlakna smo pred in po...
TRANSCRIPT
Diplomsko delo
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
september, 2015 Urška Hajdinjak
Urška Hajdinjak
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
Diplomsko delo
Maribor, 2015
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje
Študent: Urška Hajdinjak
Študijski program: univerzitetni študijski program I. stopnje Kemijska tehnologija
Predvideni strokovni naslov: diplomirana inženirka kemijske tehnologije (UN)
Mentor: red. prof. dr. Andreja Goršek
Komentor: doc. dr. Darja Pečar
Maribor, 2015
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
I
Kazalo
Kazalo ......................................................................................................................................... I
Izjava ........................................................................................................................................ III
Zahvala .................................................................................................................................... IV
Povzetek .................................................................................................................................... V
Abstract .................................................................................................................................... VI
Seznam tabel .......................................................................................................................... VII
Seznam slik ........................................................................................................................... VIII
Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................. IX
1 Uvod in opredelitev problema ............................................................................................ 1
2 Materiali ............................................................................................................................. 3
2.1 Celuloza in celulozna vlakna ...................................................................................... 3
2.2 Kemikalije ................................................................................................................... 4
2.3 Steklovina.................................................................................................................... 5
2.4 Ostala laboratorijska oprema ...................................................................................... 5
2.4.1 Reaktorski sistem EasyMax 102 .......................................................................... 5
3 Metode dela ........................................................................................................................ 7
3.1 Priprava acetatnega pufra ............................................................................................ 7
3.2 Predobdelava celuloze s fosforno kislino .................................................................... 7
3.2.1 Mletje celuloze listavcev in iglavcev s kavnim mlinčkom .................................. 8
3.2.2 Toplotna obdelava celuloze s fosforno kislino ................................................... 8
3.2.3 Mešanje in dodajanje ledeno mrzle vode ............................................................. 9
3.2.4 Centrifugiranje ..................................................................................................... 9
3.3 Izvedba encimske hidrolize z encimom celulaza ...................................................... 10
3.4 Priprava umeritvene krivulje in absorbcijska spektrofotometrična analiza vzorcev 11
3.5 Analiza vzorcev s FTIR spektroskopijo .................................................................... 12
4 Eksperimentalni del .......................................................................................................... 13
4.1 Priprava standarnih vzorcev za pripravo umeritvene krivulje .................................. 13
4.2 Postopek priprave acetatnega pufra .......................................................................... 13
4.3 Priprava celuloze za encimsko hidrolizo .................................................................. 14
4.3.1 Mletje celuloze listavcev in iglavcev ................................................................. 14
4.3.2 Toplotna obdelava celuloze listavcev in iglavcev ............................................. 14
4.3.3 Predobdelava celuloze z 1-butil-metil-imidazol-kloridom (BMIMCl) ............. 14
4.3.4 Predobdelava celuloze listavcev in iglavcev s fosforno kislino ........................ 15
4.4 Encimska hidroliza celuloze z encimom celulaza ..................................................... 16
4.5 Analiza vsebnosti glukoze po encimski reakciji in izračun presnove ....................... 17
5 Rezultati in diskusija ........................................................................................................ 18
5.1 Presnove encimskih reakcij ....................................................................................... 18
5.1.1 Presnove encimskih reakcij z zmleto celulozo .................................................. 18
5.1.2 Presnove encimskih reakcij s toplotno obdelano celulozo ................................ 19
5.1.3 Presnove encimskih reakcij s celulozo raztopljeno v 1-butil-metil-
imidazolium-kloridom (BMIMCl)..................................................................... 19
5.1.4 Presnove encimske reakcije v odvisnosti od časa ............................................. 20
5.1.5 Presnove encimskih reakcij za homogenizirano celulozo ................................. 20
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
II
5.1.6 Presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino
po 48 h ................................................................................................................ 21
5.1.7 Presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino . 21
5.1.8 Presnove encimskih reakcij za celulozo listavcev obdelano s fosforno kislino . 22
5.1.9 Presnova encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo (MCC) ................. 22
5.2 Primerjava najvišjih presnov kislinsko predobdelanih celuloz ................................. 23
5.3 Mikroskopski posnetki zmlete celuloze in obdelane celuloze s fosforno kislino ..... 23
5.4 FTIR spektri celuloze po fizikalni in kemijski obdelavi ........................................... 24
6 Zaključek .......................................................................................................................... 31
7 Literatura ........................................................................................................................... 32
8 Ţivljenjepis ....................................................................................................................... 34
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
III
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.
Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:
Vir: ScienceDirect (http://www.siencedirect.com/)
Gesla: Število referenc
enzyme cellulose 28
pre-treatment of cellulose 14
enzymatic hydrolysis of cellulose 12
cellulose and ionic liquids 3
Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid)
Gesla: Število referenc
encimska hidroliza celuloze 5
predobdelava celuloze 7
Skupno število pregledanih člankov: 16
Skupno število pregledanih knjig: 9
Maribor, september 2015 Urška Hajdinjak
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
IV
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici, red. prof. dr. Andreji Goršek,
za vso strokovno pomoč in nasvete pri izdelavi
diplomskega dela. Posebna zahvala gre tudi somentorci,
doc. dr. Darja Pečar, za pomoč in vodenje pri
eksperimentalnem delu.
Na koncu bi se še zahvalila staršem in vsem prijateljem,
ki so mi tekom študija stali ob strani in so verjeli vame.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
V
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
Povzetek
Osnovni cilj diplomskega dela je bil proučiti najučinkovitejšo predobdelavo celuloze
listavcev in iglavcev kot alternativnega materiala za obnovljivo energijo. Za učinkovit
potek hidrolize celuloze do glukoze smo določili ustrezne procesne pogoje in primerjali
izkoristke reakcij.
Celulozo smo predobdelovali na več načinov; z mletjem, toplotno obdelavo, ionskimi
tekočinami in fosforno (V) kislino. S predobdelavo smo zmanjšali področja kristaliničnosti,
kjer so glukozne molekule med seboj povezane z močnimi vezmi.
Encimsko hidrolizo celuloze smo izvajali v reaktorju EasyMax 102 (Mettler Toledo) z
encimi celulaze. Encimska hidroliza se največkrat izvaja v blagih procesnih pogojih, zato
so bile reakcije učinkovite pri temperaturi 45 ˚C in pri uporabi acetatnega pufra (pH = 5).
Reakcije so potekale 24 h, njihova izvedba je bila hitra in preprosta.
Produkt reakcij hidrolize je bila glukoza, katere koncentracijo smo določili s
spektrofotometrično metodo. Na podlagi dobljenih rezultatov smo primerjali izkoristke
reakcije s celulozo listavcev in iglavcev. Najučinkovitejša je bila kislinska predobdelava.
Rezultati so pokazali najvišje presnove pri celulozi listavcev, v našem primeru evkaliptusa,
saj so njegova celulozna vlakna najkrajša in najtanjša. Vsa uporabljena celulozna vlakna
smo pred in po kislinski predobdelavi mikroskopirali ter jih posneli z FTIR
spektrofotometrom. Posnetki so potrdili naše ugotovitve glede doseţenih presnov
posameznih reakcij.
Ključne besede: celuloza, vlakna, predobdelava celuloze, encimska hidroliza, encim
celulaza
UDK: 631.461.6:[633.877+674.031](043.2)
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
VI
Comparative study of processing raw pulp of deciduous and coniferous
Abstract
The basic purpose of the thesis was to study the most effective pre-treatment of cellulose of
deciduous and coniferous trees as an alternative material for renewable energy. For an
effective process of hydrolysis of cellulose to glucose we specified appropriate process
conditions and compared the yields of the reactions.
The cellulose was pre-treated in several ways; with grinding, thermal treatment, ionic
liquids and phosphoric (V) acid. With the pre-treatment we reduced the areas of
crystallinity, where the glucose molecules are interconnected with strong bonds.
Enzymatic hydrolysis with cellulase enzymes was carried out in an EasyMax 102 (Mettler
Toledo) reactor. Enzymatic hydrolysis is most often carried out in mild process conditions,
so we achieved the most effective reactions at the temperature of 45 ˚C and with the use of
the acetate buffer (pH = 5). The reactions lasted for 24 hours and their execution was quick
and easy.
The product of hydrolysis reactions was glucose, the concentration of which was
determined by a spectrophotometric method. Based on the acquired results we compared
the yields of reactions with the cellulose of deciduous and coniferous trees. The most
effective was the acidic pre-treatment. The results have shown the highest levels of
conversion in the cellulose of deciduous trees, in our case the eucalyptus tree, because they
have the shortest and thinnest cellulose fibres. All the used cellulose fibres were
microscoped before and after the acidic pre-treatment and filmed them with a FTIR
spectrophotometer. The images have confirmed our findings concerning the achieved
conversions of individual reactions.
Key words: cellulose, fiber, pre-treatment of cellulose, enzymatic hydrolysis, enzyme
cellulase
UDK: 631.461.6:[633.877+674.031](043.2)
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
VII
Seznam tabel
Tabela 4-1. Masa glukoze za dane koncentracije glukoznih raztopin .................................. 13
Tabela 5-1. Presnova encimskih reakcij z zmleto celulozo listavcev (evkaliptus) ............... 18
Tabela 5-2. Presnova encimskih reakcij z zmleto celulozo iglavcev ................................... 18
Tabela 5-3. Presnova encimskih reakcij s prekuhano celulozo listavcev (evkaliptus) ......... 19
Tabela 5-4. Presnova encimskih reakcij s prekuhano celulozo iglavcev .............................. 19
Tabela 5-5. Presnova encimskih reakcij s topilom BMIMCl predelane celuloze iglavcev .. 19
Tabela 5-6. Presnova encimske reakcije za homogenizirano celulozo iglavcev ................. 20
Tabela 5-7. Presnova encimske reakcije za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino po
24 in 48 h .............................................................................................................................. 21
Tabela 5-8. Presnova encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino . 21
Tabela 5-9. Presnova encimskih reakcij za celulozo listavcev (bukev) obdelano s fosforno
kislino ................................................................................................................................... 22
Tabela 5-10. Presnova encimskih reakcij za celulozo listavcev (evkaliptus) obdelano s
fosforno kislino ..................................................................................................................... 22
Tabela 5-11. Presnova encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo (MCC) obdelano s
fosforno kislino ..................................................................................................................... 23
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
VIII
Seznam slik
Slika 2-1. Pregled strukture lesa do celuloznih vlaken [10] ................................................... 3
Slika 2-2. Dve vzporedni celulozni verigi povezani z vodikovimi vezmi [13] ..................... 4
Slika 2-3. Reaktorski sistem EasyMax 102 ............................................................................ 6
Slika 3-1. Celuloza iz papirnice (levo) in fino zmleta celuloza (desno) ................................. 8
Slika 3-2. Kuhanje celuloze s fosforno kislino v šarţnem mešalnem reaktorju ..................... 9
Slika 3-3. Mešanje raztopine na mešalni plošči ...................................................................... 9
Slika 3-4. Dobljeni fazi po centrifugiranju ........................................................................... 10
Slika 3-5. Centrifuga 5804 R (Eppendorf) ............................................................................ 10
Slika 3-6. Spektrofotometer (Cary 1-E UV-Visible) ............................................................ 12
Slika 4-1. Obdelana celuloza po centrifugiranju (obdelana v enostavnem šarţnem mešalnem
reaktorju) ............................................................................................................................... 15
Slika 4-2. Obdelana celuloza po centrifugiranju (obdelana v EasyMax-u 102) ................... 16
Slika 5-1. Presnova reakcije hidrolize celuloze iglavcev v odvisnosti od časa ................... 20
Slika 5-2. Primerjava najvišjih presnov celuloz, obdelanih s fosforno kislino ..................... 23
Slika 5-3. Celulozna vlakna iglavca (levo), listavca bukev (v sredini) in listavca evkaliptus
(desno) po mletju .................................................................................................................. 24
Slika 5-4. Obdelana celuloza iglavca (levo), listavca bukev (v sredini) in listavca evkaliptus
(desno) ................................................................................................................................... 24
Slika 5-5. FTIR spekter celuloze evkaliptusa po fizikalni obdelavi ..................................... 25
Slika 5-6. FTIR spekter celuloze evkaliptusa po kemijski obdelavi ..................................... 25
Slika 5-7. FTIR spekter celuloze bukve po fizikalni obdelavi. ............................................. 26
Slika 5-8. FTIR spekter celuloze bukve po kemijski obdelavi ............................................. 27
Slika 5-9. FTIR spekter celuloze iglavca po fizikalni obdelavi ............................................ 28
Slika 5-10. FTIR spekter celuloze iglavca po kemijski obdelavi ......................................... 28
Slika 5-11. FTIR spekter celuloze mikrokristalinične celuloze (MCC) po fizikalni obdelavi
............................................................................................................................................... 29
Slika 5-12. FTIR spekter mikrokristalinične celuloze (MCC) po kemijski obdelavi ........... 30
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
IX
Uporabljeni simboli in kratice
Simboli
A absorbanca (/)
c koncentracija (g/mol)
m masa (g)
M molska masa (g/mol)
pKA negativni desetiški logaritem disociacijske konstante kisline
V volumen (L)
x naklon krivuje v enačbi premice
XA presnova komponente A (%)
y presečišče premice z x osjo
Grški simboli eksponent (-)
ρ gostota (g/cm3)
Kratice AFEX ekspanzija vlaken z amoniakom (ammonia fibre expansion)
A-
konjugirana baza
BMIMCl 1-butil-3-metilimidazol klorid
D D – konfiguracija (D – configuration)
DP stopnja polimerizacije (the degree of polymerization)
GOD glukoza oksidaza (glucose oxidase)
HA kislina
ILs ionske tekočine (ionic liquids)
MCC mikrokristalinična celuloza (microcrystalline cellulose)
NMMO N-metilmorfolin-N-oksid
POD peroksidaza (peroxidase)
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
1
1 Uvod in opredelitev problema
Fosilna goriva povezujemo z emisijami toplogrednih plinov, ki onesnaţujejo okolje.
Uporaba bioetanola kot alternativnega goriva je pritegnila veliko pozornosti zaradi ničnega
neto izpusta ogljikovega dioksida v ozračje, saj se ta reciklira s pomočjo fotosinteze.
Celulozni substrati zagotavljajo cenejše surove materiale za proizvodnjo bioetanola in se
teţje biološko razgrajujejo v primerjavi s tistimi na osnovi škroba. Predobdelava celuloznih
materialov pred njihovo uporabo je zato pritegnila ogromno raziskovalnega zanimanja za
učinkovito in donosno proizvodnjo bioetanola. [1]
V lesu najdemo okoli 45 % celuloze, zato poraba lesa v svetu narašča ter s tem tudi teţnja
po njegovi racionalnejši uporabi in proizvodnji kakovostnejših izdelkov. Les različnega
izvora se med seboj razlikuje po zgradbi in obliki, saj je zgrajen iz različnih anatomskih
elementov, ki opravljajo različne naloge. Organizmi na Zemlji se počasi spreminjajo, kar je
posledica razlike v zgradbi lesa iglavcev in listavcev. Iglavci predstavljajo prvotnejšo
obliko drevja kot listavci, kar je posledica enostavnejše zgradbe. [2]
V papirni industriji nastajajo velike količine odpadkov, ravnanje z njimi predstavlja velike
stroške. Odpadki še vedno nimajo prave vrednosti, tudi če se uporabljajo kot sekundarna
surovina, stroški predelave pri predelovalcih pa so visoki. V procesih recikliranja papirja
velik del proizvedenih odpadkov predstavlja papirniški mulj. Suhi papirniški odpadki imajo
relativno dobro kalorično vrednost, zato je najbolj smiselno odpadke izţeti do čim večje
suhosti in jih energetsko predelati v energijo. [3] Z uporabo različnih tehnik predobdelave
(mehanična, termična, kemična in biološka) se lahko izboljša kakovost in uporabnost
posameznih odpadkov in s tem pridobi izdelke z dodano vrednostjo. Lesni odpadki se
pogosto uporabljajo kot obnovljivi vir energije ter predstavljajo potencial za pridobivanje
zelenih kemikalij in encimov. [4]
Celuloza je zaradi svojega preobilja, moţnosti obnove in nizke cene popolna surovina za
proizvodnjo različnih materialov. Pribliţno tretjino svetovne proizvodnje prečiščene
celuloze uporabljajo kot osnovno snov za številne derivate z vnaprej oblikovanimi
različnimi lastnostmi, odvisnimi od vsebovanih skupin in stopnje derivatizacije. Celuloza
ima velik potencial za pripravo novih materialov (npr. termoplastov) in ima tudi številne
znane prednosti kot npr. biokompatibilnost, visoka togost, dobre mehanske lastnosti ter
biorazgradljivost. [5]
Zaradi kompaktne kristalinične strukture je celulozo teţko hidrolizirati v fermentacijske
sladkorje. Ta visoko urejena struktura celuloze mora biti odpravljena zato, da je postopek
hidrolize izvedljiv za proizvodnjo sladkorjev. [6] Čeprav je veliko tehnologij, ki se trenutno
uporabljajo za proizvodnjo celuloze izrazito neprijaznih okolju, je precej teţko raztopiti
celulozo v najpogostejših organskih topilih, zaradi njenih togih molekul in zaprte veriţne
sestave iz številnih intermolekularnih in intramolekularnih vodikovih vezi. [7] Raztapljanje
celuloze v tovrstnih topilih zahteva visoke temperature za predelavo in včasih vključuje
tudi dodatne okoljske, energijske, varnostne in druge teţave. [8] Dobra topila so ključnega
pomena za boljše izkoriščanje celuloze. Ionske tekočine (ILs) so bile uporabljene na
številnih področjih, od medija za organsko sintezo in katalizatorjev, do maziv. Nedavno so
pridobile veliko akademskega zanimanja kot nadomestila za okoljsko škodljiva hlapna
organska topila. [7]
Osnovni namen diplomske naloge je bil poiskati primerne encime za razgradnjo celuloze iz
dreves listavcev in iglavcev ter določiti procesne pogoje teh reakcij. Celulozo smo
predobdelali in s tem pripravili pogoje za učinkovit potek hidrolize. Na osnovi primerjave
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
2
izkoristkov reakcij smo izbrali tisto vrsto celuloze, ki se je najbolj učinkovito razgradila.
Hidroliza celuloze je proces, ki je povezan s pH, zato smo poiskali njegov optimum in
eksperimente izvajali v ozkem področju pH vrednosti.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
3
2 Materiali
Odpadni papir je postal enako pomemben vir novega papirja kot les in danes predstavlja
več kot polovico vlaken, ki so uporabljena v proizvodnji papirja, kar prikazuje slika 2-1. [9]
Slika 2-1. Pregled strukture lesa do celuloznih vlaken [10]
V tem poglavju opisujemo značilnosti celuloze in njenih vlaken. Predstavljamo uporabljene
kemikalije, ostalo laboratorijsko opremo in reaktorski sistem EasyMax 102, v katerem smo
izvajali encimske reakcije.
2.1 Celuloza in celulozna vlakna Celuloza je najbolj razširjen polisaharid v naravi. Pojavlja se v rastlinah v obliki
mikrovlaken, ki so sestavni deli strukturno močnega okvira celičnih sten. Nekatere bakterije
proizvajajo celulozo tudi v zelo hidrirani obliki, vendar so te večinoma pripravljene iz lesne
celuloze. Gre za linearni polimer iz β-(1,4)-D-glukopiranoznih enot v konformaciji C1.
Popolna ekvatorialna konformacija ostankov β-vezanih glukopiranoz stabilizira glavno
strukturo in zmanjšuje njeno fleksibilnost. Zaradi razširjenih intramolekularnih in
intermolekularnih vodikovih vezi med celuloznimi verigami ima ta biopolimer visoko
kristalno strukturo. Posledično je popolnoma netopen v vodi ali v običajnih topilih, kar vodi
do teţav pri kemijskih predelavah. [5] Dobro se topi v Schweitzerjevem reagentu (raztopini
bakrovega hidroksida v amoniaku) in 0,5 % ţveplovi kislini. [11]
Celulozne molekule so nitaste, med seboj povezane v makrofibrile, kjer se izmenjujeta
kristalinični in amorfni pas. Mikrofibrile predstavljajo temeljno ogrodje celične stene.
Kristalinični pasovi omogočajo trdnost in odpornost celične stene, amorfni pa dajejo
potrebno proţnost. V makrofibrile se zdruţuje 15 do 20 mikrofibril, kjer so 10 µm široki
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
4
interfibrilni prostori, napolnjeni s poliozami in manj urejenimi molekulami celuloze.
Molekule celuloze se medsebojno zdruţujejo v podolgovate paličice, imenovane miceli, ki
se v obliki snopičev-fibril linearno povezujejo med seboj in dajejo celulozni vlaknini
mehansko trdnost. [12]
Celuloza ima kristalno strukturo, v kateri so molekule glukoze povezane z močnimi
vodikovimi vezmi, zato ta struktura omogoča zelo nizko dostopnost kemikalij in encimov.
[1] Kristalno strukturo celuloze prikazuje slika 2-2.
Slika 2-2. Dve vzporedni celulozni verigi povezani z vodikovimi vezmi [13]
Pridobivajo jo iz lesa iglavcev (smreka, jelka, bor) in listavcev (bukev, topol), ki vsebuje
celulozo z ustrezno stopnjo polimerizacije. [11]
Obe vrsti lesa iglavcev in listavcev se razlikujeta po dolţini vlaken, saj imajo iglavci v
povprečju daljša vlakna. Pri iglavcih je povprečna dolţina celuloznih vlaken (3‒6) mm, pri
listavcih pa le (0,5‒1,8) mm. Premer vlaken iglavcev je povprečno (25‒45) µm, listavcev
pa (10‒36) µm. Listavci imajo v povprečju debelejše stene vlakna, ki merijo (3‒6) µm, pri
iglavcih pa (2‒5) µm. [14]
2.2 Kemikalije Pri eksperimentalnem delu smo poleg surove celuloze listavcev in iglavcev uporabili še
naslednje kemikalije:
citronsko kislino (C6H8O7); Sigma – Aldrich,
dinatrijev hidrogen fosfat dodekahidrat (Na2HPO4 * 12H2O); Sigma – Aldrich,
1-butil-3-metilimidazol klorid; Sigma – Aldrich,
fosforno (V) kislino (H3PO4), 85 %; Kemika Zagreb,
glukozni reagent; Roche,
D-(+)-glukozo; Sigma – Aldrich,
aceton, 99 %; Chem-Lab NV,
encim celulazo (Cellulase from Aspergillus sp.); Sigma – Aldrich,
natrijev acetat (CH3COONa); 99 %; Panreac,
ocetno kislino (CH3COOH); 99,8 %; Fluka,
mikrokristalinično celulozo (MMC); Sigma – Aldrich,
deionizirano vodo.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
5
2.3 Steklovina
Pri eksperimentalnem delu smo uporabili naslednjo steklovino:
čaše (50 mL, 100 mL, 150 mL),
bučke (100 mL, 250 mL, 1000 mL),
merilni valj (50 mL),
lijake,
stekleno palčko,
urno steklo.
2.4 Ostala laboratorijska oprema
Med eksperimentalnim delom smo poleg kemikalij in steklovine uporabljali še:
reaktor EasyMax 102 (Mettler Toledo),
centrifugo (Eppendorf),
spektrofotometer Cary 1-E UV-Visible,
FTIR spektrofotometer IR Affinity-1 (Shimadzu),
mlinček za mletje,
analitsko tehnico (Mettler Toledo),
termostat, Toramix SHP-10,
ultrazvočno kopel,
pH meter (Mettler Toledo),
šarţni mešalni reaktor s termostatom (Lauda),
kalibrirane avtomatske pipete (100‒1000 µL),
filtrni papir,
filtrno nučo,
kuhalnik,
homogenizator,
mikroskop (Motic F-11).
Pri delu smo uporabljali programsko in računalniško opremo:
Simple Reads-Offline Varian (meritev absorbanc s pomočjo spektroskopske metode),
Microsoft Excel 2010 (program za risanje grafov in obdelavo rezultatov).
2.4.1 Reaktorski sistem EasyMax 102
Reaktor je nova dimenzija avtomatiziranih reaktorskih sistemov, primernih za sintezne
laboratorije. Za vzdrţevanje temperature tega reaktorja ne potrebujemo ledene kopeli ali
nevarnih olj; tako so poizkusi varni. Vse parametre (temperaturo, pH, vrtilno frekvenco
mešala ali dodatek reagenta) lahko nadzorujemo preko zaslona na dotik. Sprememba
nastavitev reaktorja je hitra in preprosta. Naprava ima vgrajen termostat, ki samostojno
vzdrţuje temperaturo v območju med ‒40 °C in 180 °C. Ima dva reaktorja, ki delujeta
neodvisno eden od drugega. Uporablja se za volumne med 0,5-100 mL. Slika 2-3 prikazuje
reaktorski sistem EasyMax 102.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
6
Slika 2-3. Reaktorski sistem EasyMax 102
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
7
3 Metode dela
Glavni cilj diplomske naloge je bila ustrezna priprava celuloze listavcev in iglavcev za čim
bolj učinkovito hidrolizo. S primerno predobdelavo smo ţeleli zmanjšati tesno ureditev
vlaken celuloze v področjih kristaliničnosti za nadaljnjo encimsko hidrolizo do glukoze.
Poiskati smo morali učinkovite encime za hidrolizo celuloze iz dreves listavcev in iglavcev
ter določiti procesne pogoje teh reakcij. Za dosego ţelenih ciljev smo uporabili naslednje
metode dela:
priprava acetatnega pufra,
predobdelava celuloze s fosforno kislino (mletje celuloze listavcev in iglavcev s kavnim
mlinčkom, kuhanje celuloze s fosforno kislino, mešanje in dodajanje ledeno mrzle vode,
centrifugiranje),
izvedba encimske hidrolize z encimom celulaza,
priprava umeritvene krivulje in absorpcijska spektrofotometrična analiza vzorcev.
3.1 Priprava acetatnega pufra Pufer je vodna raztopina, sestavljena iz mešanice šibke kisline in njene konjugirane baze,
ali obratno. Uporablja se kot sredstvo za ohranjanje pH, saj se ta ob dodatku kisline ali baze
neznatno spremeni. To se doseţe zaradi prisotnosti ravnovesja med HA kislino in njeno
konjugirano bazo A-. [15] Delovanje pufrov lahko kvantitativno ovrednotimo z uporabo
disociacijskega ravnoteţja, npr. ocetne kisline, da dobimo zvezo, ki jo prikazuje Henderson
– Hasselbalch-ova enačba (en. 3.1) [16]:
pH = pKa + log (cA-/cHA), (3.1)
kjer je pKa negativni desetiški logaritem disociacijske konstante kisline in cA koncentracija
soli.
Puferne raztopine so potrebne za ohranjanje pravilnega pH za delovanje encimov v
številnih organizmih. Številni encimi delujejo samo pri določenih pogojih; če se pH
premakne izven ozke omejitve, potem encimi prenehajo delovati in se denaturirajo. V
številnih primerih lahko denaturacija trajno onemogoči njihovo katalitično dejavnost. [15]
Pufer, ki smo ga uporabljali pri encimski hidrolizi, je bil sestavljen iz ocetne kisline in
natrijevega acetata (NaOAc/HOAc), torej mešanice šibke kisline in njene konjugirane baze.
Pri tem smo morali najprej določiti natančno maso obeh komponent za dani pH.
3.2 Predobdelava celuloze s fosforno kislino Raztapljanje celuloze s topilom ni najbolj preprosta metoda za razpad kristalinične strukture
celuloze. Do danes so našli ţe veliko derivativnih in nederivativnih topil celuloze. Da bi jih
celuloza prepoznala in hidrolizirala, se lahko za pripravo obnovljene celuloze za encimsko
hidrolizo uporabljajo samo nederivativna topila. V zadnjem času so bili za raztapljanje
celuloze uporabljeni nederivativni reagenti, kot na primer ionske tekočine, N-
metilmorfolin-N-oksid (NMMO) in koncentrirana fosforna kislina (85 %). Celuloze,
predobdelane s hitrim obarjanjem raztopljenih adsorbentov celuloze s protitopilom, kot
recimo vodo, so pokazale veliko izboljšanje pri kinetiki encimske hidrolize. Poleg dragih
reagentov za topljenje celuloze, kot na primer ionske tekočine in NMMO, je bilo
ugotovljeno tudi to, da lahko celulozo dobro raztapljajo tudi poceni NaOH/vodne raztopine
sečnine. [17]
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
8
V literaturi smo zasledili, da so kljub visoki stopnji kristaliničnosti celuloze s predhodnim
raztapljanjem s fosforno kislino dosegli najvišje stopnje in rezultate saharifikacije. Pri
raztapljanju celuloze s fosforno kislino se stopnja polimerizacije (DP) in kristaliničnosti
ustrezno zmanjšata, površina celuloze se močno poveča. [18] Z večanjem površine se
poveča dostopnost encima do celuloze, kar omogoči bolj učinkovito hidrolizo. [19]
Predobdelava z raztapljanjem fosforne kisline lahko doseţe visoke reakcijske stopnje in
močno izboljša hidrolizo celuloze. Vendar je njena cena običajno višja od nekaterih
postopkov fizikalno-kemijske predobdelave, kot npr. eksplozija pare ali AFEX. Za
encimsko hidrolizo ali postopke fermentacije je potrebna nevtralizacija pH. [20]
Fosforna kislina se v zadnjem času pogosto uporablja za raztapljanje celuloze, saj lahko
kristalinično celulozo raztopi pri atmosferskem tlaku z zmerno temperaturo. [18]
Iz navedenih razlogov smo zato pri eksperimentalnem delu tudi sami poskusili s
predobdelavo celuloze s fosforno kislino.
3.2.1 Mletje celuloze listavcev in iglavcev s kavnim mlinčkom
Cilj mehanske predobdelave je zmanjšanje velikosti delcev in kristaliničnosti. Kot surovo
celulozo smo uporabili večplasten papir iz obstoječe papirnice, kar prikazuje slika 3-1 levo.
Ena vrsta celuloze je pripadala lesu listavca, druga lesu iglavca. Celulozo smo narezali na
manjše koščke in jo zmleli s kavnim mlinčkom. Mleli smo tako dolgo, dokler nismo dobili
fino zmlete celuloze, ki jo prikazujemo na sliki 3-1 desno. Ta je na videz in otip spominjala
na vato. Opazili smo, da smo iz malega koščka surove celuloze dobili voluminozno zmleto
celulozo.
Slika 3-1. Celuloza iz papirnice (levo) in fino zmleta celuloza (desno)
3.2.2 Toplotna obdelava celuloze s fosforno kislino
V reaktorsko posodo reaktorskega sistema EasyMax 102 smo nalili 85 % fosforno kislino
in dodali predhodno zmleto celulozo. Raztopino smo kuhali toliko časa, da se je celuloza
popolnoma raztopila. Za kuhanje raztopine smo uporabljali tudi šarţni mešalni reaktor s
termostatom, kar prikazuje slika 3-2.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
9
Slika 3-2. Kuhanje celuloze s fosforno kislino v šarţnem mešalnem reaktorju
3.2.3 Mešanje in dodajanje ledeno mrzle vode
Čašo smo do polovice napolnili z vodo in dodali nekaj ledu. V čašo smo dali še mešalo in
jo postavili na mešalno ploščo, kar prikazuje slika 3-3. Med zmernim mešanjem smo počasi
dodajali vročo raztopino kisline. Vsebina čaše se je obarvala belo; le-to smo še nekaj časa
mešali ob zmernem mešanju.
Slika 3-3. Mešanje raztopine na mešalni plošči
3.2.4 Centrifugiranje
V centrifugirke smo nalili vso raztopino in jih dali centrifugirat. Po centrifugiranju smo
dobili dve fazi; spodnja gosta faza je bila bele barve, medtem ko je bila zgornja faza bistra
(slika 3-4). Zgornjo bistro fazo smo pri vseh centrifugirkah odlili. Vsebino celuloze na dnu
centrifugirk smo zbrali le v dveh in ju dopolnili z destilirano vodo.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
10
Slika 3-4. Dobljeni fazi po centrifugiranju
Pred centrifugiranjem smo centrifugirki dobro premešali. Centrifugiranje z destilirano vodo
smo še dvakrat ponovili. Nato je sledilo centrifugiranje z acetonom, ki smo ga prav tako
dvakrat ponovili. Aceton (C3H6O) je povzročil hitrejše sušenje celuloze. Slika 3-5 prikazuje
centrifugo, ki smo jo uporabili pri eksperimentu.
Slika 3-5. Centrifuga 5804 R (Eppendorf)
3.3 Izvedba encimske hidrolize z encimom celulaza Celulaza se najpogosteje uporablja za hidrolizo celuloze v glukozo zaradi blagih reakcijskih
pogojev in specifičnega delovanja pri hidrolizi, pri čemer ne proizvede praktično nikakršnih
snovi, ki povzročajo razgradnjo glukoze. [17]
Celulaza je encimski kompleks, ki je sestavljen iz endo-1,4-β-D-glukanaz ali endoglukanaz,
ekso-1,4-β-D-glukanaz ali celobiohidrolaz in 1,4-β-D-glukozidaz. Endoglukanaze sproţijo
postopek hidrolize, prekinejo notranje β-1,4-glikozidne vezi vzdolţ celulozne verige in
povečajo število koncev celuloznih verig, ki so na voljo za eksoglukanaze. Te hidrolizne
reakcije potekajo preteţno na amorfnih območjih celuloze. Eksoglukanaze lahko nato
razcepijo dve celobiozni enoti od vsakega konca teh krajših celuloznih verig. Glukozidaze
hidrolizirajo celobiozne enote disaharidov v dve monosaharidni (glukozni) enoti.
Učinkovitost encimske hidrolize je odvisna od tesnega stika med celulazo in celulozo. Po
drugi strani pa je dostopnost celulaze celulozi odvisna od drugih reakcij celuloze v
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
11
heterogenem (trdnem/tekočem) stanju, od strukturnih značilnosti, npr. površine, poroznosti,
indeksa kristaliničnosti. [21]
Dostopnost celulaze do omejenih območij adsorbcije na kristaliničnih strukturah celuloze
na splošno velja za pomemben dejavnik pri določanju stopnje hidrolize celuloze. Za
povečanje površine, dostopne za adsorpcijo celulaze, so substrati celuloze pogosto
izpostavljeni fizični ali kemični predobdelavi, ki prekine tesno ureditev vlaken celuloze v
področjih kristaliničnosti. [17]
Encimske reakcije smo izvajali v reaktorskem sistemu EasyMax 102. V reaktorsko posodo
smo zatehtali celulozo, ki smo jo predhodno obdelali s kislino in temu dodali acetatni pufer
(pH = 5). Vse reakcije smo izvajali 24 h. Na začetku reakcije smo dodali še encim celulaza,
ki je bil ključnega pomena za hidrolizo celuloze.
3.4 Priprava umeritvene krivulje in absorbcijska spektrofotometrična analiza vzorcev
Kemijsko sestavo materiala, vsebnost določenih kemijskih elementov ali delcev v vzorcu
lahko določimo s spektrofotometrično metodo. Ta temelji na principu absorbcije svetlobe
(UV, vidne) v raztopini. [22]
Koncentracijo glukoze je mogoče enostavno testirati s pomočjo naslednje metode. Enačbi
3.2 in 3.3 prikazujeta encimsko kolorimetrično metodo [23]:
→ (3.2)
→ (3.3)
Glukoza se ob prisotnosti encima glukoze oksidaze (GOD) in atmosferskega kisika oksidira
v glukonolakton. Pri tem nastaja tudi vodikov peroksid, ki se pri nadaljnji reakciji ob
prisotnosti encima peroksidaze (POD) porabi za oksidacijo indikatorja 4-
aminoantipirin/fenola v barvilo kinonimin. Intenziteta rdečega barvila je sorazmerna s
koncentracijo glukoze, zato jo lahko merimo fotometrično. [23]
Za umeritveno krivuljo smo pripravili standardne raztopine glukoze z masnimi
koncentracijami, ki so pokrivale celoten interval pričakovanih koncentracij spojin v
vzorcih. S spektrofotometrom smo izmerili absorbanco za slep poskus in vse standardne
raztopine pri določeni valovni dolţini ter z računalniškim programom Excel narisali graf
umeritvene krivulje. Na podlagi predhodno pripravljenih umeritvenih krivulj smo lahko
določili koncentracijo glukoze v vzorcu. Slika 3-6 prikazuje spektrofotometrični sistem.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
12
Slika 3-6. Spektrofotometer (Cary 1-E UV-Visible)
3.5 Analiza vzorcev s FTIR spektroskopijo
Za analizo strukture celuloze smo uporabili FTIR spektrometrijo. Gre za vibracijsko
spektroskopsko metodo, kjer se vzorec obseva z infrardečo (IR) svetlobo. Molekule v
izbranem območju absorbirajo za njih značilne frekvence infrardeče svetlobe. [24]
Tehnika se uporablja za določanje funkcionalnih skupin in molekul. IR spektroskopija meri
vibracije atomov in na podlagi tega je mogoče določiti funkcionalne skupine. Na splošno
bodo močnejše vezi in lahki atomi vibrirali pri visoko raztezajoči se frekvenci. [25]
IR spektri so pridobljeni na posebnem orodju, ki ga imenujemo IR spektrometer. Uporablja
se za zbiranje informacij o strukturah spojin, ocenjevanje njihove čistosti in včasih tudi
njihove identifikacije. Infrardeče sevanje je del elektromagnetnega spektra med vidnimi in
mikrovalovnimi polji. Infrardečo sevanje absorbirajo organske molekule in jo pretvorijo v
energijo molekularnih vibracij (raztezanje ali zvijanje). Različne vrste vezi, in s tem
različne funkcionalne skupine, absorbirajo infrardeče sevanje različnih valovnih dolţin.
[26]
S FTIR spektrofotometrom IR Affinity-1 smo posneli spektre celuloze po kemijski in
fizikalni obdelavi in jih primerjali.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
13
4 Eksperimentalni del
V tem poglavju podrobneje predstavljamo naše delo in vse izvedene izračune. Predstavili
bomo vse predpriprave celuloze, ki smo jih izvedli za nadaljnjo encimsko reakcijo hidrolize
do glukoze.
4.1 Priprava standarnih vzorcev za pripravo umeritvene krivulje Za umeritveno krivuljo je bila potrebna priprava glukoznih standardnih vzorcev. Pripravili
smo raztopine glukoze z različnimi mnoţinskimi koncentracijami (0, 5, 10, 15, 20, 25 in
30) mmol/L. Po enačbi 4.1 smo izračunali ustrezne mase za dane koncentracije; te so
podane v tabeli 4-1. V 100 mL bučkah smo zatehtano maso glukoze raztopili z deionizirano
vodo in analizirali standardne vzorce glukoze.
, (4.1)
kjer je:
Mglukoze = 180,1559 g/mol
Tabela 4-1. Masa glukoze za dane koncentracije glukoznih raztopin
cglukoze (mmol/L) mglukoze (g)
0 (deionizirana voda) 0
5 0,0901
10 0,1802
15 0,2702
20 0,3603
25 0,4504
30 0,5405
Pred analizo smo izmerili absorbanco praznih kivet pri valovni dolţini 500 nm. Iz vseh 7
pripravljenih standardnih raztopin smo odpipetirali 10 µL raztopine v prazne kivete. K
temu smo dodali 990 µL glukoznega reagenta in začeli z merjenjem časa. Raztopine so se
zaradi tvorbe barvila obarvale rdeče. S pomočjo vorteksa smo jih dobro premešali in jih
termostatirali pri 35 °C. Po 10 min od vnosa glukoznega reagenta smo s spektrofotometrom
izmerili absorbance in z računalniškim programom Excel narisali graf za umeritveno
krivuljo.
4.2 Postopek priprave acetatnega pufra Acetatni pufer smo pripravili iz natrijevega acetata (c = 0,2 mol/L) in ocetne kisline (c = 0,2
mol/L). Za pripravo 1 L acetatnega pufra smo zmešali 16,406 g natrijevega acetata in 11,47
mL ocetne kisline. Maso natrijevega acetata smo izračunali po enačbi 4.2:
(4.2)
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
14
Volumen ocetne kisline smo izračunali po enačbi 4.3:
(4.3)
Za pripravo acetatnega pufra s pH 5 smo zmešali 70 mL pripravljenega natrijevega acetata
in 30 mL ocetne kisline, kar je razvidno iz tabele v literaturi. [27]
Vrednost pH smo uravnavali s pH metrom, ki meri elektromotorično silo koncentracijske
celice in je sestavljen iz steklene in kalomelove elektrode.
Pri delu smo uporabili tudi pufer iz 0,2 mol/L citronske kisline in 0,2 mol/L Na2HPO4. V
hladilniku je prišlo do izločanja Na2HPO4, zato je bil pH niţji od 5. Acetatni pufer se je v
našem primeru izkazal kot boljša moţnost.
4.3 Priprava celuloze za encimsko hidrolizo
4.3.1 Mletje celuloze listavcev in iglavcev
Dobljeno celulozo iz papirnice smo narezali na manjše koščke in jo zmleli s kavnim
mlinčkom. Zmleta celuloza listavcev in iglavcev se na videz in na otip ni razlikovala. To
celulozo smo potem uporabili za hidrolizo z encimom.
4.3.2 Toplotna obdelava celuloze listavcev in iglavcev
Po mletju smo celulozo dali v ekonom lonec in jo 3 ure prekuhavali v destilirani vodi na
kuhalni plošči. Celulozo smo nato prenučirali, sušili ter po sušenju ponovno zmleli. Opazili
smo, da je postala na otip mehkejša in bolj fina, kot po samem mletju brez prekuhavanja.
4.3.3 Predobdelava celuloze z 1-butil-metil-imidazol-kloridom (BMIMCl)
Topila celuloze so ključnega pomena pri boljšem izkoriščanju celuloze. V zadnjem času so
veliko zanimanja pridobile ionske tekočine kot nadomestila za okoljsko škodljiva hlapna
organska topila. Ugotovljeno je bilo, da se celuloza lahko raztopi brez derivatizacije v
visokih koncentracijah z uporabo ionskih tekočin, kot so 1-alil-3-metil-imidazol-klorid, 1-
alil-3-metil-imidazol format, 1-butil-metil-imidazol-klorid in tako naprej. V literaturi smo
zasledili, da so se ionske tekočine izkazale kot učinkovita topila za raztapljanje celuloze
zaradi svojih edinstvenih lastnosti, kot so nizka tališča, zanemarljiv parni tlak, nehlapljivost
in vnetljivost. Zato smo poskusili z uporabo topila 1-butil-metil-imidazol-klorid
(BMIMCl).
V 50 mL čašo smo zatehtali 0,25 g zmlete celuloze in 5 g BMIMCl. Čašo smo za 2 h
postavili v ultrazvočno kopel. Najprej smo poskusili z raztapljanjem pri sobni temperaturi,
ker ni bilo nobene spremembe, smo zvišali temperaturo na 50 °C. Takrat je prišlo do
počasnega raztapljanja, zato smo povišali temperaturo do 90 °C ter čašo pustili v
ultrazvočni kopeli še 2 h. Dobili smo ţelatinasto snov rumene barve, kjer so bili vidni
mehurčki. V čašo smo dali mešalo in destilirano vodo, ter na kuhalni plošči segrevali do
100 °C. Opaziti ni bilo nobenih sprememb, zato smo čašo spet postavili v ultrazvočno kopel
pri temperaturi 90 °C. Ţelatinasto snov smo s pinceto natrgali na manjše koščke, ki so čez
čas postali bele barve. Vsebino čaše smo prenučirali, celulozo na filter papirju pa dobro
sprali z destilirano vodo, da smo odstranili celotno ionsko tekočino. Celuloza, ki je ostala
na filter papirju, je bila bele barve in gumijaste strukture. Filter papir s celulozo smo en dan
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
15
sušili na sobni temperaturi. Po sušenju smo celulozo prekuhali in dobro sprali z destilirano
vodo ter jo ponovno sušili. Ta celuloza je bila bele in modre barve. Celulozo smo v
nadaljevanju uporabili za encimsko reakcijo.
Pri naslednji obdelavi celuloze z 1-butil-metil-imidazoli-kloridom, kot topilom, smo v 50
mL čašo zatehtali 0,25 g zmlete celuloze in 5 g BMIMCl. V ultrazvočni kopeli smo
raztopili vsebino čase in jo dali na grelno ploščo pri 300 °C. Iz rumene ţelatinaste snovi
preide v temno rdeče-rjavo tekočino. Dodali smo še destilirano vodo in čašo postavili v
ledeno vodo, vse skupaj pa smo ves čas mešali. Nič se ni izločilo, zato smo sklepali, da smo
raztopino pregreli. Encimske reakcije tako nismo mogli izvesti.
4.3.4 Predobdelava celuloze listavcev in iglavcev s fosforno kislino
Zatehtali smo 3 g predhodno zmlete celuloze v reaktorsko posodo reaktorja EasyMax 102
in dodali 50 mL 85 % fosforne kisline. Pri 50 °C in vrtilni frekvenci mešala, fm = 200 min-1
smo kuhali 2 h. Medtem smo si pripravili 1000 mL čašo z mešalčkom in jo do polovice
napolnili z deionizirano vodo in ledom. Čašo smo postavili na mešalno ploščo. Ob
zmernem mešanju smo počasi dodajali raztopino. Raztopino, ki se je obarvala belo, smo še
nekaj časa pustili mešati. Z raztopino smo napolnili 9 centrifugirk do 50 mL in
centrifugirali 5 min pri vrtilni frekvenci mešala 5000 min-1
. Dobili smo dve fazi, zato smo
zgornjo, bistro, fazo odlili, spodnjo, belo, fazo (celulozo) pa zbrali iz vseh centrifugirk in jo
porazdelili v dve centrifugirki. Obe centrifugirki smo do 50 mL dopolnili z destilirano vodo
in ju pred naslednjim centrifugiranjem dobro premešali. Enak postopek centrifugiranja smo
ponovili še dvakrat pri istih pogojih. Sledilo je še drugo centrifugiranje, po katerem smo
odlili zgornjo fazo, dopolnili centrifugirki z acetonom do 25 mL in ju dobro premešali. To
centrifugiranje z acetonom smo ponovili še dvakrat. Zgornjo bistro fazo smo nato še
zadnjič odlili, vsebino (celulozo) na dnu obeh centrifugirk pa s pomočjo spatule prenesli na
urno steklo in sušili pri sobni temperaturi. Za spiranje z acetonom smo se odločili zaradi
hitrejšega sušenja, saj aceton hitreje izhlapi.
Kuhanje celuloze v fosforni kislini smo nekaj krat izvedli v preprostem šarţnem mešalnem
reaktorju s termostatom. Po celotni predobdelavi je bila ta celuloza še vedno mokra in
prozorne barve, kar je razvidno iz slike 4-1. Celuloza, ki smo jo kuhali v reaktorju
EasyMax 102, pa je bila bele barve, podobna prahu. Razlog za to je bila dobro prečiščena
celuloza, kar prikazuje slika 4-2.
Slika 4-1. Obdelana celuloza po centrifugiranju (obdelana v enostavnem šarţnem mešalnem
reaktorju)
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
16
Slika 4-2. Obdelana celuloza po centrifugiranju (obdelana v EasyMax-u 102)
4.4 Encimska hidroliza celuloze z encimom celulaza Dejavniki, ki vplivajo na encimsko hidrolizo celuloze so vrsta substrata, aktivnost celulaze
in pogoji reakcije (temperatura, pH in drugi parametri). [20]
Temperatura je pomemben dejavnik, ki ne vpliva le na hitrost encimske reakcije, temveč
tudi na aktivnost celulaze. Ko se temperatura v določenem razponu poveča, se praviloma
pospeši tudi encimska reakcija. Toda ko se temperatura poveča nad tem razponom, encim
postane denaturiran, kar vodi do zmanjšanja hitrosti encimske reakcije. Optimalna
reakcijska temperatura za celulazo je med 45 °C in 55 °C. Vsebina reducirajočega sladkorja
se postopoma zmanjša po 30 h reakcije. To je lahko posledica zaviranja encimske
aktivnosti zaradi nakopičenih produktov hidrolize. Spremembe vrednosti pH lahko
povzročijo izgubo aktivnosti celulaze ali disociacije med substratom in katalitično skupino
aktivnega centra encima, kar vodi do zmanjšane hitrosti encimske reakcije. Zato mora biti
pH v hidrolizni reakciji, katalizirani s celulazo, nadzorovan, da se doseţe maksimalna
aktivnost celulaze. Maksimalno hitrost reakcija doseţe pri pH 5. Ko je pH višji ali niţji od
5, se hitrost encimske reakcije zmanjša. [28]
Koncentracija substrata je eden glavnih dejavnikov, ki vplivajo na proizvodnjo in začetno
stopnjo encimske hidrolize celuloze. Pri nizkih ravneh substrata povečanje koncentracije
substrata običajno povzroči povečanje proizvodnje in stopnje reakcije hidrolize. Vendar
lahko visoka koncentracija substrata povzroči oviranje substrata, kar močno zniţa stopnjo
hidrolize, obseg oviranja substrata je odvisen od razmerja med skupnim substratom in
skupnimi encimi. [20]
Raziskave so pokazale, da je bila ob povečanju substratov izboljšana povratna inhibicija s
celobiozo in glukozo, kar je vodilo do zmanjšane proizvodnje reducirajočih sladkorjev pri
encimski reakciji. Ko je bila koncentracija substrata manjša od 3 %, se je hitrost encimske
reakcije povečevala v skladu z večanjem koncentracije substrata. Ko je postal substrat
nasičen in se je njegova koncentracija dodatno povečevala, se je koncentracija reducirajočih
sladkorjev postopno zmanjševala. [28]
Vse encimske reakcije smo izvajali pri 45 °C in 200 min-1
v reaktorju EasyMax 102.
Posamezna reakcija je trajala 24 h.
Najprej smo uporabljali pufer iz citronske kisline in Na2HPO4 pri pH 5. K 50 mL pufra smo
dodali 1 g predelane celuloze in nato še 500 µl encima celulaze. Zaradi slabih izkoristkov
smo sklepali, da lahko visoka koncentracija substrata povzroči lastno inhibicijo, kar moţno
zniţa stopnjo hidrolize. V nadaljevanju smo uporabili 0,1 g predelane celuloze. Za reakcijo
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
17
smo uporabili 50 mL acetatnega pufra, ki se je izkazal kot boljša moţnost. Drugi pogoji
reakcije so bili enaki.
Reakcije hidrolize smo poskusili tudi z uporabo mikrokristalinične celuloze (MCC). Gre za
prečiščeno, delno depolimerizirano celulozo, ki se pridobiva iz pulpe vlaknatega
rastlinskega materiala z mineralnimi kislinami. Stopnja polimerizacije mikrokristalinične
celuloze je običajno manjša od 400. V vodi je netopna in zagotavlja naraven vir vlaknin z
disperzijskimi lastnostmi.
4.5 Analiza vsebnosti glukoze po encimski reakciji in izračun presnove Vzorce smo pred analizo glukoze kuhali v vreli vodi pribliţno 10 min, da je prišlo do
denaturacije encima, s tem pa do prekinitve reakcije. Neznanemu vzorcu smo najprej
izmerili absorbanco. Vsebnost koncentracije v neznanem vzorcu smo grafično določili iz
umeritvene krivulje s pomočjo enačbe 4.4:
, (4.4)
kjer je:
A absorbanca neznanega vzorca (/),
cA koncentracija glukoze neznanega vzorca (mol/L),
x naklon krivulje,
y presešišče premice z x-osjo.
Za ravnoteţno encimsko reakcijo velja, da encim katalizira reakcijo:
( ) ( ) ( ) ( )
Zato velja:
Presnovo reakcije smo določili po enačbi 4.5:
, (4.5)
kjer je:
XA presnova,
cA koncentracija glukoze na koncu reakcije (mol/L),
cAO koncentracija glukoze na začetku reakcije (mol/L).
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
18
5 Rezultati in diskusija
Najpomembnejši del raziskav so rezultati z ugotovitvami, ki so lahko v pomoč pri
izboljšanju ter razširitvi procesa. V tem poglavju predstavljamo presnove encimskih
reakcij, ki smo jih izvajali z različno predobdelanimi celuloznimi materiali. Na osnovi
primerjav presnov smo ugotavljali, katera metoda predobdelave je bolj učinkovita za
nadaljnjo hidrolizo. Primerjali smo celulozna vlakna dveh vrst listavcev in iglavca po
mletju ter po obdelavi s fosforno kislino, kar smo posneli z mikroskopom Motic F-11.
Spremembo celulozne strukture smo primerjali tudi z FTIR spektri.
5.1 Presnove encimskih reakcij Vse encimske reakcije smo izvajali 24 h v reaktorju EasyMax 102 pri 45 °C in 200 min
-1, s
500 µL encima celulaze. Koncentracijo glukoze in presnovo reakcije v naslednjih tabelah
smo izračunali po enačbah 4.4 in 4.5. Zaradi ponovljivosti rezultatov smo za vsako reakcijo
izvedli dve ponovitvi. Iz umeritvene krivulje smo izračunali koncentracijo glukoze.
5.1.1 Presnove encimskih reakcij z zmleto celulozo
Za reakcijo hidrolize smo uporabili 50 mL pufra (0,1 mol/L citronske kisline in 0,2 mol/L
Na2HPO4) pri pH 5 in 1 g zmlete celuloze listavcev (evkaliptus).
V tabeli 5-1 so prikazane presnove encimskih reakcij z zmleto celulozo listavcev
(evkaliptus).
Tabela 5-1. Presnova encimskih reakcij z zmleto celulozo listavcev (evkaliptus)
Reakcija
hidrolize Obdelava
mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA
(%)
1. serija mletje 1 5,2388 4,71
2. serija mletje 1 5,5896 5,03
V naslednjem koraku smo za reakcijo uporabili 50 mL pufra (0,1 mol/L citronske kisline in
0,2 mol/L Na2HPO4) pri pH 5 in 1 g zmlete celuloze iglavcev.
V tabeli 5-2 so prikazani rezultati encimskih reakcij z zmleto celulozo iglavcev.
Tabela 5-2. Presnova encimskih reakcij z zmleto celulozo iglavcev
Reakcija
hidrolize Obdelava
mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA
(%)
1. serija mletje 1 4,4511 4,01
2. serija mletje 1 4,7329 4,26
Iz tabel 5-1 in 5-2 vidimo, da je presnova reakcij hidrolize s predhodnim mletjem celuloze
v primeru iglavcev in listavcev zelo majhna, tj. od 4 do 5 %. Vzrok za to je kristalinična
struktura celuloze, kjer so molekule izpostavljene močni vezavi z vodikom, zato ta
struktura omogoča le nizko dostopnost encima.
Če primerjamo presnovo listavcev in iglavcev, je ta pri listavcih minimalno boljša. Zaradi
slabih izkoristkov samo mehansko obdelane celuloze smo poskusili še s prekuhavanjem
celuloze z destilirano vodo.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
19
5.1.2 Presnove encimskih reakcij s toplotno obdelano celulozo
Za reakcijo smo si pripravili celulozo listavca (evkaliptus), ki smo jo predhodno prekuhali v
destilirani vodi. V 50 mL pufra (0,1 mol/L citronske kisline in 0,2 mol/L Na2HPO4) pri pH
5 smo odtehtali 1 g celuloze in izvedli reakcijo.
V tabeli 5-3 so prikazani rezultati encimskih reakcij s prekuhano celulozo listavcev
(evkaliptus).
Tabela 5-3. Presnova encimskih reakcij s prekuhano celulozo listavcev (evkaliptus)
Reakcija
hidrolize Obdelava
mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA (%)
1. serija toplotna 1 5,2201 4,70
2. serija toplotna 1 7,4701 6,72
Enak postopek smo izvedli še s celulozo iglavcev. Za reakcijo smo uporabili 50 mL pufra
(0,2 mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne kisline) pri pH 5 in 1 g v destilirani vodi
prekuhane celuloze iglavcev.
V tabeli 5-4 so prikazani rezultati encimskih reakcij s prekuhano celulozo iglavcev.
Tabela 5-4. Presnova encimskih reakcij s prekuhano celulozo iglavcev
Reakcija
hidrolize Obdelava
mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA (%)
1. serija toplotna 1 3,7997 3,42
2. serija toplotna 1 8,7818 7,90
Primerjava rezultatov tabel 5-3 in 5-4 pokaţe, da smo s prekuhavanjem celuloze dobili
nekoliko boljše rezultate (če gledamo obe seriji). Vendar je presnova glede na naše ţelje še
vedno prenizka. Pri iglavcih smo uporabili acetatni pufer (pH = 5).
5.1.3 Presnove encimskih reakcij s celulozo raztopljeno v 1-butil-metil-imidazolium-kloridom (BMIMCl)
Zaradi slabih presnov smo se odločili za predobdelavo celuloze s topilom 1-butil-metil-
imidazol-klorid (BMIMCl). Za reakcijo smo v 50 mL pufra (0,1 mol/L citronske kisline in
0,2 mol/L Na2HPO4) pri pH 5 odtehtali 0,23 g celuloze iglavcev.
V tabeli 5-5 so prikazane presnove encimskih reakcij s topilom BMIMCl predelane
celuloze iglavcev.
Tabela 5-5. Presnova encimskih reakcij s topilom BMIMCl predelane celuloze iglavcev
Reakcija
hidrolize Obdelava
mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA
(%)
1. serija raztapljanje v BMIMCl 0,23 5,4137 21,18
Pri tej reakciji smo dosegli boljšo presnovo, kot pri mletju in prekuhavanju. Iz tega
rezultata lahko sklepamo, da predhodno raztapljanje celuloze z močnim topilom poveča
učinkovitost reakcije hidrolize.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
20
5.1.4 Presnove encimske reakcije v odvisnosti od časa
Odvisnost presnove od časa smo dobili tako, da smo vzorec vzeli pred dodatkom encima
celulaze, po 1 h, po 2 h in po 24 h reakcije. Celulozo iglavcev smo pred tem obdelali s
fosforno kislino. V reaktorsko posodo smo k 50 mL pufra (0,2 mol/L natrijevega acetata in
0,2 mol/L ocetne kisline) s pH 5 odtehtali 1 g celuloze in izvedli reakcijo.
Presnove so bile tudi po 24 h zelo nizke. Koncentracija glukoze, in s tem presnova, sta
naraščali premosorazmerno s časom, kot je prikazano na diagramu slike 5-1.
Slika 5-1. Presnova reakcije hidrolize celuloze iglavcev v odvisnosti od časa
Reakcije hidrolize smo izvajali 24 h, saj so bile v tem času doseţene najvišje presnove.
Naše ugotovitve so v skladu s pregledano literaturo. Vsebnost reducirajočih sladkorjev je
bila v tem času najvišja. Po 30 h pa je prišlo do zaviranja encimske aktivnosti, predvsem
zaradi nakopičenih produktov hidrolize.
5.1.5 Presnove encimskih reakcij za homogenizirano celulozo
Zanimalo nas je, ali s homeniziranjem celuloze izboljšamo presnovo reakcije, zato smo
celulozo iglavcev homogenizirali. Za reakcijo smo uporabili 50 mL pufra (0,2 mol/L
natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne kisline) pri pH 5. Izvedli smo še reakcijo, ko smo
maso homogenizirane celuloze iglavcev 3-krat zmanjšali in poskusili ugotoviti, kako masa
celuloze vpliva na končno presnovo.
V tabeli 5-6 so prikazani rezultati encimskih reakcij za celulozo iglavcev, ki smo jo
homogenizirali. V tem primeru nismo izvajali ponovitev.
Tabela 5-6. Presnova encimske reakcije za homogenizirano celulozo iglavcev
Obdelava mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA (%)
homogeniziranje 0,9 8,7568 8,76
nehomogenizirana
celuloza 0,9 7,2417 7,24
homogeniziranje 0,3 9,5405 28,62
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30
XA (
%)
t (h)
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
21
Na podlagi vrednosti tabele 5-6 lahko primerjamo presnovo, ki smo jo dosegli z 0,9 g
homogenizirane in nehomogenizirane celuloze. Presnova homogenizirane celuloze je bila
nekoliko višja, vendar bistvene razlike s homogeniziranjem nismo dosegli. S trikratnim
zmanjšanjem mase predhodno obdelane celuloze pa smo dobili 3-krat večjo presnovo.
Torej lahko trdimo, da z zmanjšanjem koncentracije substrata povečamo stopnjo reakcije
hidrolize. Visoka koncentracija substrata povzroči, da je vse več encima v kompleksu s
substratom. Encim postaja tako vse bolj nasičen s substratom, kar se kaţe v zniţanju
stopnje hidrolize.
5.1.6 Presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino po 48 h
Glede na prejšnje rezultate, smo za reakcijo uporabili manjšo maso s kislino obdelane
celuloze iglavcev. Vzorce smo vzeli po 24 in 48 h.
Za reakcijo hidrolize smo zatehtali 0,2 g celuloze iglavcev. Uporabili smo 50 mL pufra (0,2
mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne kisline) pri pH 5 in reakcijo izvajali 48 h.
V tabeli 5-7 so prikazane presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev, ki smo jo
predhodno obdelali s fosforno kislino.
Tabela 5-7. Presnova encimske reakcije za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino po 24 in
48 h
Reakcija hidrolize Čas odvzemanja
vzorcev
cglukoze
(mmol/L)
XA
(%)
mceluloze = 0,2 g 24 h 13,6569 61,46
48 h 21,8606 98,37
Tabela 5-7 prikazuje, da smo z zmanjšanjem mase dobili še višjo presnovo. Po 48 h pa smo
dosegli ţe skoraj 100 % presnovo. Zaradi dobrih izkoristkov smo se odločili, da bomo pri
naslednjih reakcijah za reakcijo hidrolize uporabili 0,1 g obdelane celuloze s fosforno
kislino.
5.1.7 Presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino
Raztopine, ki smo jih uporabili za umeritveno krivuljo, smo v tem primeru termostatirali pri
35 °C, maso celuloze pa zmanjšali na 0,1 g. Celulozo iglavcev, ki smo jo uporabili za
reakcijo, smo kislinsko obdelali. Vse reakcije hidrolize smo izvajali 24 h.
Pri tem smo uporabili 50 mL pufra (0,2 mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne
kisline) pri pH 5.
V tabeli 5-8 so prikazani rezultati encimskih reakcij za celulozo iglavcev, ki smo jo
obdelali s fosforno kislino. Pri tem smo izvedli 4 ponovitve reakcije.
Tabela 5-8. Presnova encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino
Reakcije hidrolize Obdelava mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA
(%)
1. serija kislinska 0,1 9,7192 87,47
2. serija kislinska 0,1 9,2808 83,53
3. serija kislinska 0,1 8,9133 80,22
4. serija kislinska 0,1 9,6501 86,85
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
22
Vse presnove so dosegle vrednost nad 80 %. Z zmanjšanjem mase celuloze na 0,1 g smo
torej še povečali presnovo. Za primerjavo iglavcev z listavci smo izvedli še serijo reakcij s
celulozo listavcev.
5.1.8 Presnove encimskih reakcij za celulozo listavcev obdelano s fosforno kislino
Za reakcijo smo uporabili 50 mL pufra (0,2 mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne
kisline) pri pH 5 in celulozo listavcev (bukev). Celulozo smo pred reakcijo obdelali s
fosforno kislino. Masa celuloze je bila 0,1 g.
V tabeli 5-9 so prikazane presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev, ki smo jo
predhodno obdelali s fosforno kislino.
Tabela 5-9. Presnova encimskih reakcij za celulozo listavcev (bukev) obdelano s fosforno kislino
Reakcije hidrolize Obdelava mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA
(%)
1. serija kislinska 0,1 9,7159 87,44
2. serija kislinska 0,1 9,6998 87,30
3. serija kislinska 0,1 10,1017 90,92
Prav tako smo kislinsko obdelali še celulozo listavcev (evkaliptus) in nato izvajali reakcije
pri enakih pogojih, kot v prejšnjem primeru.
Tabela 5-10. Presnova encimskih reakcij za celulozo listavcev (evkaliptus) obdelano s fosforno
kislino
Reakcije hidrolize Obdelava mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA
(%)
1. serija kislinska 0,1 10,4479 94,04
2. serija kislinska 0,1 10,5182 94,67
Iz tabel 5-8, 5-9 in 5-10 vidimo, da s predobdelavo celuloze z raztapljanjanjem v fosforni
kislini doseţemo visoke presnove. Glede na literaturo lahko pojasnimo, da sta se v fosforni
kislini stopnja polimerizacije in stopnja kristaliničnost celuloze močno zmanjšali, saj se je s
tem povečala površina celuloznih vlaken. Dostopnost encima je zato večja, kar vpliva na
učinkovitost hidrolize. Če primerjamo presnove, ki so prikazane v tabelah 5-8, 5-9 in 5-10,
lahko vidimo, da smo s celulozo listavcev dosegli boljše presnove. Predvidevamo, da so
vzrok za to povprečno daljša celulozna vlakna pri iglavcih, ki jih je nekoliko teţje
razvlakniti.
5.1.9 Presnova encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo (MCC)
Encimsko hidrolizo smo poskusili izvesti tudi z mikrokristalinično celulozo, ki je bila delno
ţe depolimerizirana.
Za reakcijo smo uporabili 50 mL pufra (0,2 mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne
kisline) pri pH 5 in 0,1 g mikrokristalinične celuloze (MCC). To celulozo smo pred reakcijo
obdelali s fosforno kislino.
V tabeli 5-11 so prikazane presnove encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo
(MCC), obdelano s fosforno kislino.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
23
Tabela 5-11. Presnova encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo (MCC) obdelano s fosforno
kislino
Reakcija
hidrolize
mceluloze
(g)
cglukoze
(mmol/L)
XA
(%)
1.serija mikrokristalinična
(MCC) 0,1 9,7192 87,47
2. serija mikrokristalinična
(MCC) 0,1 9,2808 83,53
Presnove, ki smo jih dosegli s hidrolizo mikrokristalinične celuloze (tabela 5-11), so
podobne presnovam celuloze iglavcev, obdelane s fosforno kislino. Presnova je visoka, ker
gre za delno depolimerizirano celulozo, zato je bila razgradnja laţja.
5.2 Primerjava najvišjih presnov kislinsko predobdelanih celuloz
Kislinska predobdelava je bila pri vseh vrstah celuloze najučinkovitejša. Na koncu
encimskih reakcij smo dobili zelo visoke presnove. To smo dosegli tudi z uporabo
acetatnega pufra. Slika 5-2 prikazuje primerjavo najvišjih presnov celuloze iglavca, listavca
(bukev in evkaliptus) in mikrokristalinične celuloze, ki smo jih predhodno obdelali s
kislino. Iz slike 5-2 je razvidno, da je celuloza evkaliptusa najbolj razgradljiva, sledi
celuloza bukve in nato z enakima presnovama celuloza iglavca in mikrokristalinična
celuloza.
Slika 5-2. Primerjava najvišjih presnov celuloz, obdelanih s fosforno kislino
Razlog za razlike v presnovi so celulozna vlakna, ki se od drevesa do drevesa razlikujejo.
5.3 Mikroskopski posnetki zmlete celuloze in obdelane celuloze s fosforno kislino
Z mikroskopom (Motic F-11) smo posneli celulozna vlakna listavcev in iglavcev po mletju
pri 100-kratni povečavi. Celulozna vlakna vseh treh drevesnih vrst so trakaste oblike in se
med seboj prepletajo, kar prikazuje slika 5-3. Vlakna se razlikujejo po dolţini in debelini.
60
65
70
75
80
85
90
95
100
evkaliptus bukev iglavec MCC
X [
%]
vrsta celuloze
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
24
Slika 5-3. Celulozna vlakna iglavca (levo), listavca bukev (v sredini) in listavca evkaliptus (desno)
po mletju
Primerjava celuloznih vlaken vseh treh dreves pokaţe, da so po mletju celulozna vlakna
iglavcev najdaljša. Premer celuloznih vlaken je prav tako največji pri iglavcih, zato smo ta
celulozna vlakna teţje razgradili pred hidrolizo. Pri listavcu bukev so vlakna manjšega
premera, medtem ko so najkrajša in najtanjša pri listavcu evkaliptus. Posledica tega so
najvišje presnove. Pri evkaliptusu nam je uspelo celulozna vlakna najbolj skrajšati in s tem
zmanjšati stopnjo polimerizacije. Dobljene presnove so v skladu z mikroskopskimi
posnetki.
Posnetke smo naredili tudi po obdelavi celuloze s fosforno kislino. Slika 5-4 prikazuje vse
tri drevesne vrste po obdelavi.
Slika 5-4. Obdelana celuloza iglavca (levo), listavca bukev (v sredini) in listavca evkaliptus (desno)
Po obdelavi celuloze s fosforno kislino smo dobili najbolj groba zrna pri iglavcih, najbolj
fina pri evkaliptusu. Posnetki na sliki 5-3 torej potrjujejo, da je predobdelava s fosforno
kislino najučinkoviteje razgradila celulozo evkaliptusa. Posledica tega so bile najvišje
presnove encimske hidrolize.
5.4 FTIR spektri celuloze po fizikalni in kemijski obdelavi Celulozo smo proučili tudi s FTIR spektrometrijo. Metoda je občutljiva na strukturne
spremembe. Ţeleli smo ugotoviti, kakšne so strukturne spremembe celuloznih vlaken po
kemijski in fizikalni obdelavi.
Slika 5-5 prikazuje FTIR spekter celuloze evkaliptusa po mletju, torej po fizikalni obdelavi.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
25
Slika 5-5. FTIR spekter celuloze evkaliptusa po fizikalni obdelavi
Na sliki 5-6 je prikazan FTIR spekter celuloze evkaliptusa po kemijski obdelavi s fosforno
kislino.
Slika 5-6. FTIR spekter celuloze evkaliptusa po kemijski obdelavi
Spektra na sliki 5-5 in 5-6 sta si zelo podobna. V obeh so prisotni enaki vrhovi, značilni za
celulozo, vendar se razlikujeta v vibraciji OH. Po kemijski obdelavi je ta vrh nekoliko širši,
ker je prišlo do modifikacije, zmanjšanja kristaliničnosti. Opazne so tudi razlike v območju
500750100012501500175020002500300035004000
1/cm
67.5
75
82.5
90
97.5
%T
Evkalipt-zmlet
500750100012501500175020002500300035004000
1/cm
50
60
70
80
90
100
%T
Evkalipt-obdelan
C=N
C-H
O-H
C-O
O-H
C-H
C=N
C-O
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
26
valovne dolţine med 1800 cm-1
in 2500 cm-1
, kjer je po kemijski obdelavi najverjetneje
prišlo do zdruţevanja absorbcijskih trakov. To se kaţe v zmanjšanju urejenosti strukture.
Pri valovni dolţini 1430 cm-1
so značilne vibracije CH2, upogibanje HCH in OCH v ravnini
in vibracije medmolekulskih vodikovih vezi. Te se izrazito kaţejo pri fizikalno obdelani
celulozi, medtem, ko pri kemijski obdelavi vrh ni tako izrazit in se razširi.
Slika 5-7 prikazuje FTIR spekter celuloze listavca bukev po fizikalni obdelavi, slika 5-8 po
kemijski obdelavi.
Slika 5-7. FTIR spekter celuloze bukve po fizikalni obdelavi.
500750100012501500175020002500300035004000
1/cm
85
90
95
100
%T
Listavec-zmlet
C-O
O-H
C-H C=N
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
27
Slika 5-8. FTIR spekter celuloze bukve po kemijski obdelavi
Če primerjamo dobljena spektra na slikah 5-7 in 5-8, lahko opazimo, da sta tudi ta podobna.
Povsod se pojavljajo enaki vrhovi, ki se med seboj razlikujejo v širini in ostrini. Pri valovni
dolţini 3425 cm-1
variira močna vodikova vez. Za močne vezi in lahke atome pa je
značilno, da variirajo pri visoki raztezajoči se frekvenci. Po kemijski obdelavi se je ta vrh
nekoliko razširil. V območju med 1800 cm-1
in 2000 cm-1
je prišlo po obdelavi s kislino do
zdruţevanja absorbcijskih trakov. Pri zmleti celulozi listavca je viden vrh pri valovni
dolţini 1316 cm-1
, ki po kemijski obdelavi skoraj izgine. Tu se pojavi novi izraziti pik pri
1371 cm-1
, kjer so variiacije COH in HCC, celuloze in hemiceluloze. Razlika se pojavi tudi
pri dolţini pika 900 cm-1
, v variaciji COC glikozidnih vezi. Po kemijski obdelavi je ta pik
daljši in bolj izrazit.
Naslednji sliki, 5-9 in 5-10, prikazujeta FTIR spekter celuloze iglavca po kemijski in
fizikalni obdelavi.
500750100012501500175020002500300035004000
1/cm
50
60
70
80
90
100
%T
Listavec-obdelan
O-H
C-H
C-O
C=N
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
28
Slika 5-9. FTIR spekter celuloze iglavca po fizikalni obdelavi
Slika 5-10. FTIR spekter celuloze iglavca po kemijski obdelavi
FTIR spektra na sliki 5-9 in 5-10 sta si načeloma precej podobna. Do razširitve spektra po
kemijski obdelavi pride pri valovni dolţini 3425 cm-1
, kar je posledica strukturnih
sprememb celuloze. Na območju 1800 cm-1
do 2500 cm-1
pride po kislinski obdelavi
listavcev do vidnega zdruţevanja absorcijskih trakov, kar pa pri iglavcih ni tako očitno. Pri
500750100012501500175020002500300035004000
1/cm
67.5
75
82.5
90
97.5
%T
Iglavci-zmleto
500750100012501500175020002500300035004000
1/cm
80
85
90
95
100
%T
Iglavci-obdelano
O-H
C-H
C-O
C=N
O-H
C-H
C-O
C=N
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
29
iglavcih nismo bili tako uspešni pri zmanjšanju kristaliničnosti celuloze. To lahko potrdimo
tudi z rezultati presnov hidrolize, ki so bile zato pri iglavcih nekoliko niţje. Vrh pri valovni
dolţini 1430 cm-1
, kjer so vibracije medmolekulskih vezi, je izrazitejši po fizikalni
obdelavi. Ponovno se pojavi razlika v daljšem vrhu po kemijski obdelavi, kjer variirajo
glikozidne vezi.
Slika 5-11 prikazuje FTIR spekter mikrokristalinične celuloze (MCC) po fizikalni obdelavi.
Slika 5-11. FTIR spekter celuloze mikrokristalinične celuloze (MCC) po fizikalni obdelavi
Na sliki 5-12 je prikazan še FTIR spekter mikrokristalinične (MCC) celuloze po kemijski
obdelavi.
500750100012501500175020002500300035004000
1/cm
60
70
80
90
%T
Mikroceluloza
O-H
C-H
C-O
C=N
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
30
Slika 5-12. FTIR spekter mikrokristalinične celuloze (MCC) po kemijski obdelavi
Spektra 5-11 in 5-12 sta zelo podobna spektroma celuloze iglavca. V območju valovne
dolţine 1800 cm-1
in 2500 cm-1
tudi pri mikrokristalinični ni prišlo do bistvenih razlik.
Razlog za to so enake presnove encimskih reakcij celuloze iglavca in mikrokristalinične
celuloze.
Rezultati FTIR spektrov so bili prav tako v skladu z ugotovitvami raziskav, da je celuloza
listavcev nekoliko laţja za obdelavo, kakor celuloza iglavcev.
500750100012501500175020002500300035004000
1/cm
60
67.5
75
82.5
90
97.5
%T
Mikroceluloza-obdelana
O-H
C-H
C=N
C-O
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
31
6 Zaključek
Etanol je trenutno najbolj razširjen obnovljiv izdelek na globalnem trgu goriva. Ţe od
nekdaj je veljal za eno najboljših alternativ večini goriv, saj zniţuje odvisnost od rezerv
surove nafte in zagotavlja čistejše izgorevanje, kar vodi do bolj zdravega okolja. Na splošno
skoraj vsa gospodarsko izvedljiva proizvodnja bio-etanola temelji na fermentaciji saharoze
iz sladkornega trsa in melase ali glukoze, ki izvirata iz poljščin na podlagi škroba, npr.
koruza, pšenica in maniok. Po drugi strani so lignoceluloze najbolj razširjena in
nizkocenovna biomasa na svetu in zato trenutno velja za eno najboljših alternativnih
surovin za proizvodnjo etanola kot goriva.
Papirniški mulj je trden ostanek, ki nastane zaradi postopkov mečkanja lesa in izdelave
papirja, ki ga trenutno odlagajo na smetišča ali kurijo, s tem pa ne tratijo samo potencialno
dragocenih sredstev, ki jih je mogoče spremeniti v bioenergijo, ampak tudi onesnaţujejo
okolje.
Celuloza je najbogatejši obnovljivi vir v naravi. Njena pretvorba v energijo z dodatno
vrednostjo in kemikalije je pritegnila globalno pozornost. Vendar je celulozo teţko
hidrolizirati v fermentacijske sladkorje zaradi kompaktne kristalinične strukture, ki se
oblikuje predvsem z inter- in intramolekularnimi vodikovimi vezmi.
V diplomskem delu smo ţeleli čim bolj »zmotiti« tesno ureditev vlaken v področju
kristaliničnosti. Za raztapljanje celuloze se v zadnjem času uporabljajo nederivatna topila,
kot so ionske tekočine in koncentrirana fosforna kislina (85 %), zato smo tudi sami
poskusili s tem. Raztapljanje celuloze z ionskimi tekočinami v našem primeru ni bilo
uspešno; sklepamo, da smo raztopino pregreli.
Na podlagi dobljenih rezultatov lahko trdimo, da je predobdelava celuloze bistvenega
pomena za bolj učinkovito hidrolizo, saj s tem povečamo njeno površino, ki je zato
dostopnejša za encim celulazo. Najboljše presnove smo dobili pri predobdelavi celuloze s
fosforno (V) kislino, ki je najbolj zmotila tesno ureditev vlaken celuloze v področju
kristaliničnosti. Boljše izkoristke smo dobili pri listavcih zaradi krajših celuloznih vlaken.
Na encimsko hidrolizo celuloze je vplivalo več dejavnikov, kot so substrat, dejavnost
celulaze in pogoji reakcije (temperatura, pH in drugi parametri). Reakcije so bile uspešne
po 24 h encimske hidrolize z uporabo acetatnega pufra (pH = 5) in pri temperaturi 45 °C. Ti
pogoji so bili skladni s pregledano literaturo.
Encimsko hidrolizo smo izvedli z encimi celulaze, ki so zelo specifični. Stroški encimske
hidrolize so v primerjavi s kislinsko ali alkalno nizki, saj se encimska hidroliza običajno
izvaja v blagih pogojih (pH 5, temperatura od 45 oC do 50 °C) in ne povzroča teţav s
korozijo. Vse reakcije smo uspešno izvajali v reaktorju EasyMax 102. Izvajanje reakcij je
bilo preprosto in hitro. Reaktor EasyMax 102 smo uporabljali tudi pri predobdelavi
celuloze s fosforno kislino (85 %). Ta reaktor se je izkazal kot boljša moţnost v primerjavi
s šarţnim mešalnim reaktorjem.
Produkt hidrolize je bila glukoza, katere vsebnost je bila največja pri celulozi evkaliptusa.
Najvišja presnova je dosegla 94,67 %, torej se je celuloza tega drevesa najbolj razgradila.
Vzrok za to so krajša in tanjša celulozna vlakna, kar smo potrdili tudi z mikroskopskimi
posnetki. Višja vsebnost glukoze je pomembna pri nadaljni fermentaciji sladkorjev v etanol.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
32
7 Literatura
Vamashita Y., Sasaki C., Nakamura Y. Development of efficient system for ethanol [1]
production from paper sludge pretreated by ball milling and phosphoric acid.
Carbohydrate polymers, 79, 250-254, 2010.
Mihelač J. Anatomija s tehnologijo in sušenjem lesa. Škofja Loka: Poklicna lesna [2]
šola, 1975.
Gornjak I., Samec N. Ali je papirniški mulj strošek ali energent? Okolje, 80, 42-44, [3]
2013.
Seţun M. 2013. Moţnosti ponovne uporabe trdnih odpadkov iz papirne industrije. V: [4]
»Novi časi za tradicionalno papirno industrijo«. Zbornik povzetkov 17. Dneva
papirništva in 40. Mednarodnega letnega simpozija DITP. Bled 20.-21. november 2013.
Prebil Bašin P., Fister A. (ur.). Ljubljana. 31-31.
Gemos S., Zarafeta D., Kekos D., Kolisis F. Direct enzymatic acylation of cellulose [5]
pretreated in BMIMCl ionic liquid. Bioresource Technology, 102, 1378-1382, 2011.
Zhang J., Zhang B., Zhang J., Lin L., Liu S., Ouyang P. Effect of phosphoric acid [6]
pretreatment on enzymatic hydrolysis of microcrystalline cellulose. Biotechnology
Advances, 28, 613-619, 2010.
Ding Z. D., Chi Z., Gu W. X., Gu S. M., Liu J. H., Wang H. J. Theoretical and [7]
experimental investigation on dissolution and regeneration of cellulose in ionic liquid.
Carbohydrate Polymers, 89, 7-16, 2012.
Xu A., Zhang Y., Zhao Y., Wang J. Cellulose dissolution at ambient temperature: [8]
Role of preferential solvation of cations of ionic liquids by a cosolvent. Carbohydrate
Polymers, 92, 540-544, 2013.
Paperonline. Production, 2015. http://www.paperonline.org/paper-making/paper-[9]
production (dostop 2. 8. 2015).
Hierarchical Wood Structure, 2008. [10]
https://www.flickr.com/pHotos/fswoodlab/11437846663 (dostop 4. 7. 2015).
Pipa R. Anatomija in tehnologija lesa. Ljubljana: Lesarska zaloţba, 1997. [11]
Iglič B. Tehnologija pridobivanja vlaknin za izdelavo papirja: Pridobivanje [12]
lesovinskih vlaknin. Ljubljana: Tehnična zaloţba Slovenije, 1993.
Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. [13]
W. H. Freeman, 2005.
Novak G. Papir, karton, lepenka. 1. izdaja. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, [14]
Naravoslovnotehniška fakulteta, Oddelek za tekstilstvo, 1998.
Wikipedia, the free encyclopedia. Buffer solution, 2015. [15]
https://en.wikipedia.org/wiki/Buffer_solution (dostop 5. 7. 2015).
Henderson - Hasselbach-ova enačba. [16]
http://www.fkkt.um.si/sites/default/files/9_Ravnotezje_Dodatno%20gardivo.pdf
(dostop 5. 7. 2015).
Kuo C. H., Lee C. K. Enhancement of enzymatic saccharification of cellulose by [17]
dissolution pretreatments. Carbohydrate Polymers, 77, 41-46, 2009.
Shen F., Xiao W., Lin L., Yang G., Zhang Y., Deng S. Enzymatic saccharification [18]
coupling with polyester recovery from cotton-based waste textiles by phosphoric acid
pretreatment. Bioresource Technology, 130, 248-255, 2013.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
33
Abels C., Thimm K., wulfhorest H., Spiess A. C., Wessling M. Membrane-based [19]
recovery of glucose from enzymatic hydrolysis of ionic liquid pretreated cellulose.
Bioresource technology, 5, 1-26, 2013.
Sun Y., Cheng J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a [20]
review. Bioresource Technology, 83, 1-11, 2002.
Ogeda T. L., Silva I. B., Fidale L. C., El Seoud O. A., Petri D. F. S. Effect of [21]
cellulose physical characteristics, especially the water sorption value, on the efficiency
of its hydrolysis catalyzed by free of immobilized cellulase. Journal of Biotechnology,
157, 246-252, 2012.
Lobnik A., Skripta za vaje pri predmetu okoljska analitika. Maribor: Fakulteta za [22]
strojništvo, 2010.
Custombiotech. Glucose, 2011. [23]
http://custombiotech.roche.com/content/dam/internet/dia/custombiotech/custombiotech
_com/en_GB/pdf/Glucose_Test_Principle_05837804990_03.11.pdf (dostop
29.10.2015).
Kavkler K., Demšar A. Uporaba FTIR in ramanske spektroskopije pri kvalitativni [24]
analizi strukturnih sprememb celuloznih vlaken. Tekstilec, 55 (1), 32-44, 2012.
Infrared Spectroscopy. [25]
http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Vibrational_Spectrosco
py/Infrared_Spectroscopy (dostop 9.9.2015).
IR Spectroscopy Tutorial, 2011. [26]
http://orgchem.colorado.edu/Spectroscopy/irtutor/tutorial.html (dostop 9.9.2015).
Acetate buffers for amine coupling of proteins to Biacore sensor chip surfaces. [27]
http://www.fbs.leeds.ac.uk/facilities/biomolecular/documents/AcetatebuffersforSPRami
necoupling.pdf (dostop 4. 7. 2015).
Han L., Feng J., Zhang S., Ma Z., Wang Y., Zhang X. Alkali pretreated of wheat [28]
straw and its enzymatic hydrolysis. Brazilian Journal of Microbiology, 43, 53-61, 2012.
Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev
34
8 Življenjepis
OSEBNI PODATKI Urška Hajdinjak
Kruplivnik 88/c, 9264 Grad, Slovenija
+386 2 553 15 80 +386 31 610 707
Spol Ţenski | Datum rojstva 20. januarja 1991 | Drţavljanstvo slovensko
ŽELENO PODROČJE DELA
Kemik, kemijski tehnolog
DELOVNE IZKUŠNJE
01. marca 2013 – 30.
marca 2013
Praktično usposabljanje Pomurske mlekarne d.d
Industrijska ulica 10
9000 Murska Sobota
▪ delo v laboratoriju
IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE
september 2006 – julij
2010
oktober 2010 – oktober
2015
Gimnazijski maturatnt Gimnazija Murska Sobota
Šolsko naselje 12
9000 Murska Sobota
univ. dip. inž. kemijske tehnologije
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Smetanova ulica 17 2000 Maribor
KOMPETENCE
Materni jezik Slovenščina
Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE
Slušno razumevanje Bralno
razumevanje Govorno
sporazumevanje Govorno
sporočanje
angleščina B2 B2 B2 B2 B1
nemščina B2 B2 B1 B1 B1
Stopnja: A1/A2: Osnovni uporabnik - B1/B2: Samostojni uporabnik - C1/C2: Usposobljeni uporabnik
Skupni evropski jezikovni okvir
Komunikacijske kompetence
▪ komunikacijske in delavne veščine
▪ sposobnost dela v skupini
Računalniške kompetence
▪ dobro obvladovanje orodij Microsoft Office™ (Word, Excel, PowerPoint)
▪ hitro iskanje po svetovnem spletu
Vozniško dovoljenje ▪ B