principi e basi della diagnostica virologica a.azzi, firenze 19.11.2004
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Principi e basi della Principi e basi della diagnostica virologicadiagnostica virologica
A.Azzi, Firenze 19.11.2004
L’importanza della diagnosiL’importanza della diagnosi
Esclusione di altre causeImpiego di terapie antiviraliNella prevenzione
Diagnosi precoce Diagnosi rapida
Approcci diagnosticiApprocci diagnostici
Diagnosi indiretta (sierologica)– Sieroconversione– Aumento del titolo– Presenza di IgM
specifiche– Avidità delle IgG
Diagnosi diretta
Ricerca del virus (o di sue componenti)
Manifestazioni cliniche
Il rischio infettivo in ambito trasfusionale
Diagnosi sierologicaDiagnosi sierologica
Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (03/03/03) del Sig ZZ: positivo
Il sig ZZ ha una infezione da HIV
Diagnosi sierologicaDiagnosi sierologica
Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo
Risultato ricerca di anticorpi anti-HBsAg nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo
Risultato ricerca di anticorpi anti HCV nel cs (04/04/04) del Sig XY: IgM neg, IgG pos
Il sig XY gode di ottima salute !!!
Diagnosi indiretta: limitiDiagnosi indiretta: limiti
Malattie causate da: – riattivazione di virus latenti o infezioni
persistenti
In:– pazienti immunodepressi
Disponibilità dei campioni
La ricerca del virusLa ricerca del virusIl microscopio elettronico
La ricerca del virusLa ricerca del virus
L’isolamento– Nell’aminale– Nelle uova embrionate
– Nelle colture cellulari
Isolamento nelle colture cellulariIsolamento nelle colture cellulari
Effetti dello sviluppo del virus– ECP (+/- specifico)– Emoadsorbimento – …………………
Necessità di test identificazione del virus: neutralizzazione, IEA, IF …………..
Effetti citopatici da virusEffetti citopatici da virus
Morte cellulare– Arrotondamento– Degenerazione– Aggregazione– Perdita di adesione al substrato
Cambiamenti istologici caratteristici: inclusioni nucleari o citoplasmatiche
Formazione di sinciziCambiamenti della superficie cellulare:
espressione di antigeni viraliemoadsorbimento
C y t o p a t h i c E ff e c t ( 2 )
S y n c y t i u m f o r m a t i o n i n c e l l c u l t u r e c a u s e d b y R S V ( t o p ) , a n d m e a s l e s v i r u s ( b o t t o m ) . ( c o u r t e s y o f L i n d a S t a n n a r d , U n i v e r s i t y o f C a p e T o w n , S . A . )
Problemi nell’impiego delle Problemi nell’impiego delle colture cellularicolture cellulari
Tempi lunghi per comparsa ECP Determinanti le condizioni di conservazione del
campione. Possibii contaminazioni batteriche e fungine. Sostanza tossiche presenti nel campione. Molti virus non crescono nelle colture cellulari e.g.
Hepatitis B, Diarrhoeal viruses, parvovirus, papillomavirus.
Rapid Culture Techniques
Posibilità di individuare antigeni virali nelle colturedopo 24- 48 ore. Es CMV
Nuovi sviluppi
Rapid Diagnosis Based on the Detection of Viral Antigens
Nasopharyngeal Aspirate RSVInfluenza A and BParainfluenzaAdenovirus
Faeces RotavirusesAdenovirusesAstrovirus
Skin HSVVZV
Blood CMV (pp65 antigenaemia test)
Test rapidiTest rapidi
Ricerca di Ag dei virus influenzali A e BTest immunoenzimatico (ELISA)Supporto: membrana di nitrocellulosaAb monoclonali specifici per la NP viraleCampioni: lavaggi e aspirati nasofaringei, TF
Tempo: 15 minutiDistinzione dei tipi (A-B)
Immunofluorescense
Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
CMV pp65 antigenaemia test
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
La ricerca di componenti del virus nel La ricerca di componenti del virus nel campione clinicocampione clinico
Antigeni virali– Nel siero: antigeni
solubili
– Nelle cellule : antigeni di superficie o intracellulari
Acido nucleico virale– Tecniche di
amplificazione– …. ma non solo
HBsAg, HBeAgp24Tecniche
di immunoprecipitazioneimmunoenzimatiche
Immunofluorescenzaimmunoistochimica
• Tecniche quantitativenel monitoraggio dell’infezionee della terapia • Analisi delle sequenze per la determinazione delle resistenze, per la genotipizzazione, per l’epidemiologia
Limiti tecniche “tradizionali”Limiti tecniche “tradizionali”
EM/IEM
Isolamento
Ricerca antigeni
Virus non coltivabili Scarsamente visualizzabili Agentisconosciuti
Costi Manualità Tempi Manualità Sensibilità
Difficoltà di individuare antigeni (HCV,TTV…)
Tecniche di ibridazioneTecniche di ibridazione
Impiego prevalente per rivelazione e conferma specifictà prodotti di amplificazione
Ibridazione in situ
Nuove versioni
Quali tecniche di Quali tecniche di amplificazioneamplificazione
Amplificazione della sequenza bersaglioAmplificazione del segnaleAmplificazione della sonda
Applicazioni qualitative e quantitativeNon solo PCR
Per quali esigenze:Per quali esigenze:
•per virus non coltivabili o •coltivabili con difficoltà•a lento sviluppo - effetto•per virus “ad alto rischio”•per la ricerca di virus nel liquoro comunque •in campioni in cui la carica virale sia bassa
Virus epatite B e CPapillomavirus Parvovirus B19, TTV
Impiego delle tecniche di biologia Impiego delle tecniche di biologia molecolare nella diagnostica virologicamolecolare nella diagnostica virologica
Applicazioni quantitative per
distinzione tra infezione latente e infezione attiva (riattivazione)
monitoraggio infezione (prognosi)
monitoraggio terapia
valutazione del rischio di trasmissione
La ricerca di componenti del virus nel La ricerca di componenti del virus nel campione clinicocampione clinico
Antigeni virali Acido nucleico virale
Sensibilità +++Specificità +++Rapidità ++
Sensibilità +Specificità +++Rapidità ++++
L’interpretazioneL’interpretazione
L’immunodepressione
Infezioni virali latenti e infezioni virali persistenti
Infezioni subcliniche
Può rendere poco attendibili i risultati della sierologia
L’uso di tecniche molto sensibili rende Necessario riconsiderare il valore diagnostico di un risultato positivo
I marcatori sierologici dell’HCV nel periodo seguente all’infezione
InfectionInfezione
HCV RNA HCV RNA1 2 EIA 3.0EIA 3.0
EIA 2.0EIA 2.03
EIA 1.0EIA 1.04
00 13 13 70 8070 80 150 (giorni)150
Ortho-Clinical Diagnostics
Nuovi sviluppiNuovi sviluppi
L’analisi delle sequenze nella diagnostica virologica– Genotipizzazione
Nuove tecnologie– Amplificazione real time– Microarray– Pyrosequencing