princípios do diagnóstico laboratorial das micoses
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Alexandra Carvalho
George
Jéssica Moreira
Nara Leão
Mário Oliveira
Rosa Viana
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ColetaTransporteRecebimento
ProcessamentoMicroscopia Culturas
Relato e Análises dos Resultados Interações com Epidemiologistas Manutenção de Amostras e Registros
SIDRIM & ROCHA, 2004
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SIDRIM & ROCHA, 2004
Uso de antifúngicos
Amostras encaminhadas
Suspensão
Ficha padrão
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Unhas
Pelos , Cabelos, barba e bigode
Líquidos corpóreos ou lavados
Órgãos
Pele e mucosas
4SIDRIM & ROCHA, 2004
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ZAIZ et al., 2010; ANVISA, 2004; VERMELHO et al., 2006
Assepsia
Lâmina dermatológica/bisturisem fio de corte
Jarbas Porto
Debridação da lesão
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ZAIZ et al., 2010
Região de alopécia
Auxílio pinça flambada
Lâmpada de Wood
Antibioticoterapia prévia
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ZAIZ et al., 2010
Tesouras, limas, alicates de unhas e curetasdermatológicas
Região de progressão econfluência
Swabs ou pipeta Pasteur
Região mais adentro da matrizungueal
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ZAIZ et al., 2010
Swab
Exame direto e cultura
Solução salina
Refrigerar
Boca
Ânus
Vagina
Biópsia ou raspagem
Coletar as escamasCuretagem ou biópsia
4 swabs
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SIDRIM & ROCHA, 2004
Conjuntiva
Córnea
Tecidos e Órgãos
Raspagem ou debridação
Duas regiões bem demarcadas
Solução salina
Temperatura ambiente por até 24 horas
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Punção lombar
3-5ml em tubo estéril
Temperatura ambiente
LCR
Sangue Assepsia
Anticoagulante
MINAMI, 2003
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20-30ml do jato intermediário
Frasco estéril
Punção suprapúbica
Urina
Máximo de 2 horas para análise
Fezes
Swab retal
Máximo 2 horas
Cary-Blair
MINAMI, 2003
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MINAMI, 2003
Punção
Antissepsia
Refrigeração
Pus e líquidos patológicos
Amostra expectorada naturalmente
Saneamento bucal
Frascos estéreis Escarro
Aspirados Processamento
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MINAMI, 2003
Consistência
Coloração
Odor
Aspectos macroscópicos
Características da amostra analisada
Aspectos microscópicos
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Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
Exame microscópico e cultura
Pelos, cabelos, escamas de unha e pele
Centrifugação
Líquor, secreções e fluídos corporais
Semeado por esgotamento
Urina
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Digestão com enzimaExame microscópico e cultura
Escarro
Fragmentação → coloração/cultura
Tecidos
Centrifugação e cultura
Sangue
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Pelos, pele, unha, escarro,exsudatos espessos eoutros materiais densos
É um reativo que clarifica e digere o material clínico
Fonte: MEDRANO, D. J. A. Perfil de sensibilidade de cepas de Coccidioides posadasii a associação de drogas antimicrobianas. Universidade
Federal do Ceará - Programa de Pós-graduação em Ciências Medicas (Tese). Fortaleza, 2010. 156 p.
Coccidioides sp.
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Lactofenol Fluido de montagem
Azul de algodão Corante
Fonte: MEDRANO, Delia Jéssica Asteta. Perfil de sensibilidade de cepas de Coccidioides posadasii a associação de drogas antimicrobianas.
FORTALEZA. 2010. (Tese) Doutorado em Microbiologia Médica- Universidade Federal do Ceará. 2010.
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Líquor, urina, secreções ou exsudatos
Fungos capsulados
Erro frequente:confundir linfócitoscom células deleveduras
Nanquim preto
Criptococccus
Criptococoma.Fonte: <http://anatpat.unicamp.br/nptcripto1c.html#esfregnanquim>.
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Gram +Discrimina elementos fúngicos de artefatos existentes emurina, secreções e fezes
Exceção
Aspergillus flavus Cryptococcus neoformans
SIDRIM &ROCHA, 2004
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Histoplasma capsulatum
Medula óssea, sangue, aspirados e secreção cutânea
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O calcoflúor white (CFW) é um agente clareador – celulose e quitina
Utilizado em combinação com o KOH
DANIELLE L. H.; MARYAM Gerami-Nejad; CASSANDRA Kistler-Anderson; CHERYL A. Gale. Hyphal Guidance and Invasive Growth
in Candida albicans Require the Ras-Like GTPase Rsr1p and Its GTPase-Activating Protein Bud2p. American Society for Microbiology. 2005
Candida albicans
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Tinha nigra. Disponível em:<http://anatpat.unicamp.br/lampele2a.html>.
Avaliação dos padrões de reações teciduais
Cora o tecido – ressalta a morfologia fúngica
Cromoblastomicose - Phialophora
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Aspergilose. Fonte: http://anatpat.unicamp.br/biinflaspergilose1c.html
Impregnação pela prata Cortes de tecido e esfregaço
Aspergilus
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Fungos que contêm cápsulamucopolissacarídica
Diferencia o Cryptococcus deoutros fungos similares emtamanho e forma
Núcleos – azul Mucinas - róseo para vermelho
Outros elementos – amarelo
Criptococoma. Fonte: <http://anatpat.unicamp.br/nptcripto1b.html#muci>.
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Glicogênio, mucinas neutras,membranas basais e evidenciar amaior parte de fungos eparasitas em tecidos
Produz artefatos facilmenteconfundíveis com Histoplasma eEporothrix
Glicogênio, mucina, membranabasal, fungos - vermelho
Núcleos - azul
C. neoformans
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FONTE: http://www.ijpmonline.org/viewimage.asp?img=IndianJPatholMicrobiol_2011_54_1_216_77417_u5.jpg
Evidencia a parede celularfúngica por reagir com pigmentosde melanina, bem como grânulosargentafins
Núcleos – rosa Grânulos argentafins – preto
C. neoformans
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Pelos, unhas, escamas de pele Exame microscópico + KOH
LíquorExame microscópio + tintananquim, coloração de gram,coloração de Giemsa ou panótica
Fluidos ocularesExame microscópico com KOH oucom coloração de gram
Sangue ,medula óssea
ZAITS
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1-Exame microscópico + KOH, 2 - Exame microscópio + tinta nanquim, 3 -Exame microscópio com coloraçãode gram, 4 - Exame microscópico com coloração de Giemsa ou panótica
Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
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Aspectos micro e macromorfológicos
Isolamento
Manutenção Estocagem
Enriquecimento
Estruturas de ornamentação e
frutificaçãoCor verso/reverso
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Para a cultura e isolamento primário de fungos, é necessário autilização de dois meios de cultura
A seleção do tipo de meio é feita de acordo com a experiênciaclínica do analista + dados clínicos repassados pela equipe médica
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Amostra semeada na superfície dos meios de cultura
Inoculação – alça de níquel-cromo ou pipeta Pasteur
O material não deve ser colocado em profundidade no ágar
Temperatura de incubação para todas as amostras
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Secreção respiratória
Líquor
Urina
Fluidos corporais
Swabs
Pele, pelos e escamas
Tecidos
Sangue
Fluidificação, centrifugação -sedimento
Centrifugação - sedimento
Centrifugação - sedimento
Centrifugação - sedimento
Centrifugação - sedimento
Nenhum
Fragmentação-maceração-imprint
Semeadura - esfregaço
Pus, secreções de abscesso Nenhum
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Aspergillus glaucus
Cultivo primário de fungos
Dextrose Peptona
Leveduras
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Infusão de coração,cérebro, peptona,sais, glicose, sanguee clorofenicol
Sporothrix schenckii
Isolamento de fungos patogênicos, não-patogênicos e dermatófitos
Blastomyces dermatitidisHistoplasma capsulatum
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Gênero Microsporum
Estruturas de frutificação
M. Audoinii → Microsporum
Diferencia
Produção de clamidosporos
M. canis
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Meio enriquecido
Estruturas de frutificação e ornamentaçãoMel de abelhasFarinha de trigoSolução de leite
M. canis
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Estruturas de frutificação e ornamentação
Microcultivo
Candida albicans
Meio enriquecido
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Seletivo
Antibióticos
Fungos inibidos clorofenicol:Cryptococcus neomorfans,Trichosporon beigelli, espécie deCandida e Aspergillus
Cloranfenicol Cicloeximida
Farinha de soja + glicose
Microsporum canis
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Pigmento avermelhado
Estruturas de frutificação
Trichophyton rubrum – demais espécies
Diferencia
Fubá de milhodextrose
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Trichophyton
Diferenciar
T. mentagrophytes T. rubrum
Hidrólise da ureia + Hidrólise da ureia -
Leveduras dos filos Ascomicotina e Basidiomicotina
Peptona, Glicose, NaCl,Fosfato de potássio,monobásico, Fenolvermelho, ureia
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Promove o crescimento de fungos lipofílicosMalassezia furfur
ASDAntibióticosÓleo de oliva
Bili de boi
Malassezia sp
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Identificação e diferenciação
Candida de interesse médico
PeptonaMistura
cromogênicaCloranfenicol
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Cultivo em lâminaestudar aspectos microscópicoscaracterísticos
Micélio vegetativo e micélioreprodutivo ou de frutificação
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SIDRIM & ROCHA, 2004
Tamanho
Bordas
Textura
Relevo
Pigmentação
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SIDRIM & ROCHA, 2004
Hifa
Conidióforo
Conídeos
Clamidosporos
Outras características
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Coccidioidis sp.
Algodonosa, branca ouacinzentada, reverso creme -amarronzado ao envelhecer
Hifa hialina, septado com artroconídios ede parede celular espessa
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Trichophyton verrucosum
Glabrosa a velutosa, relevo rugoso, branco-amarelo ocre.
Presença de cadeias formadas por clamidoconídios grandes.
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Epidermophyton floccosum
Algodonosas, com relevo umbilicado, pulverulenta
Macroconídeos em cacho
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Paracoccidiodes brasiliensis
Endurecida,franjas nas bordas, decentro elevado, irregular e com asuperfície de cor branca
Célula com múltiplos brotamentos
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Trichophyton mentagrophytes T. rubrum
Não perfuraPerfura o pelo radialmente
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T. mentagrophytes
T. rubrum
Meio vermelho
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Demonstração de elementosfúngicos em tecido
Diagnóstico de micosessubcutâneas e sistêmicas
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Auxílio diagnóstico
Tinea capitis
Pitiríase versicolorEritrasma
Corynebacterium minutissimum Fluorescência vermelho-coral.
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Trichophyton T1Ácido casamínico (sem vitaminas), Fosfatomonopotássico, Sulfato de magnésio,Dextrose
T2 T1+inositol Requerimento vitamínico
T6
T3
T4
T5
T7
T1+inositol+tiamida
T1+tiamida
T1+ácido nicotínico
T. verrucosum
T. tonsuras de T. violaceum
T. equinum
Nitrato de amônio, Fosfatomonopotássico, Sulfato demagnésio, Dextrose
Requerimento vitamínico
Trichophyton - T. megninni de T. rubrum
T6 + sol. de histidina
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Meios sem inoculação
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SIDRIM & ROCHA, 2004
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SIDRIM & ROCHA, 2004
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SIDRIM & ROCHA, 2004
Alçada de colônia isolada
Suspensão em 5 ml de soro ou plasma
Incubar a 37°C
Por 3h
Depositar uma gota da suspensãosobre lâmina e cobrir com lamínula
Examinar ao microscópio óptico A presença de tubo germinativo
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Álcoois, proteínas e aminoácidos– fontes de nitrogênio - meioisento de nitrogênio
Levedura irá assimilar e crescerem volta de determinadasfontes
Pelo halo de turvação resultantedo crescimento
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Maior sensibilidade
Reações sorológicas
Reações sorológicas
Epidemiologia e monitorização – Diagnóstico?
Eficiência relacionada à: sensibilidade, especificidade ereprodutibilidade
Antígenos – extratos brutos – conferem maior positividade – reatividade cruzada – componentes antigênicos comuns
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glicoproteína de 43 kDa- Ag imunodominante
Positivo para 1/32
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elevada sensibilidade e especificidade variável
Boa correlação com a clínica
Reatividade cruzada –histoplasmose, candidíase edoença de Jorge Lobo
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Identificação de fungos a nível de espécie
Diagnóstico precoce de infecções fúngicas invasivas
Especificidade e sensibilidade, rapidez
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Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica.
Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
SIDRIM, J. L. C.; ROCHA, M. F. O. Micologia Médica à luz de
autores contemporâneos. 2ª. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2004
ZAITZ, C.; MARQUES, S. A., RUIZ, L. R. B.; FRAMIL, V. M. de
S. Compendio de Micologia Médica. 2ª ed. Guanabara Koogan. 2010
LACAZ