principios y aplicaciones de oncología molecular
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Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular. Dr. Andrés Báez-Astúa, PhD. Hospital Dr. Rafael A. Calderón Guardia 02 de octubre del 2012. CONTENIDO. Introducción Genética del Cáncer Métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular
Dr. Andrés Báez-Astúa, PhD.
Hospital Dr. Rafael A. Calderón Guardia
02 de octubre del 2012
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• Introducción
• Genética del Cáncer
• Métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• Fluorescencia in situ para estudios en cáncer
• Citometría de Flujo
• Cultivo de tumores
• Proyectos de investigación y colaboraciones
CONTENIDO
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NIH launches project to map cancer genome
Unlocking cancer genesTCGA – The Cancer Genome Atlas Pilot Launched
Unraveling cancer
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Cancer’s Reach
•Men have an almost 1 in 2 lifetime risk of developing cancer.
Source: Cancer Facts & Figures 2004, American Cancer Society
In the United States:
Women have a more than 1 in 3 lifetime risk of developing cancer.
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Imagen cortesía de Nature, Feb. 15, 2001
A Defining Moment in the Nation’s “war on cancer” — Unprecedented Potential for
Exponential Progress Toward Personalized Medicine (Molecular Oncology)
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ClinicalData
Molecular Data
Data Generation: Unprecedented ScaleData Generation: Unprecedented Scale
Databases (Current and Developing): partial genomes; SNPs; gene expression profiles; gene sequence; chromosome changes; copy number changes; chemical genomic libraries; epigenomics; “signatures”; disease biomarkers; pathologic; imaging – various types; chemical libraries; proteins (mass spec); proteins (chips); biospecimens/biorepositories; patient records; antibodies; pathology; molecular pathology; clinical trials; adverse events; pharmacogenomics; molecular epidemology; ...........
.
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• El estudio de cambios moleculares han llevado históricamente a la identificación de oncogenes y supresores tumorales. Clarke MF. Pathol Biol, 2006
• Los tumores se desarrollan por acumulación de alteraciones moleculares y genómicas. Futreal P. Nature Reviews Cancer 2004
• El Proyecto Genoma Humano facilitó el enfoque hacia el estudio de alrededor de 30,000 genes que codifican proteínas. McKusick VA. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2005
• Un paso limitante del ritmo de descubrimientos de nuevos oncogenes y genes supresores ha sido la falta de enfoques eficaces para su identificación. Garnis C. Molecular Cancer, 2004
Introducción
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Genes de Cáncer
• Afectan positivamente (Oncogenes) o negativamente (Supresores) el crecimiento celular.
• Oncogénesis: el cáncer emerge a través de una serie de alteraciones somáticas en el ADN.
• Consecuencia de errores de replicación del ADN aleatorios, exposición a cancerígenos o por procesos de reparación del ADN defectuosos.
• Asociación familiar de cáncer ocurre en ciertas familias que portan una mutación de línea germinal en un gen de cáncer.
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Genómica bioinformática, secuenciación genómica, ingeniería genética, terapia genética, genómica comparada, epigenética
Transcriptómica expresión genética, regulación de mARN
Proteómica separación, identificación, cuantificación, análisis de secuenciación, proteómica estructural, proteómica de interacción, modificación protéica, proteómica celular
Pharmacogenómica correlación de expresión genética o polimorfismos con eficacia y toxicidad de una droga
Aplicación de Bases Moleculares
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Objetivo General
Brindar servicio de apoyo a la red oncológica a través
de un centro altamente especializado en técnicas
avanzadas de biología celular y molecular aplicadas a
la prevención, diagnóstico, tratamiento y seguimiento
de personas con riesgo o portadoras de
enfermedades neoplásicas
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Beneficios de los Estudios Moleculares en Cáncer
Incrementar la sensibilidad y reproducibilidad diagnóstica
Descubrir pocas células con cambios genéticos para estimular cambios de exposición a factores de riesgo, intervención temprana o quimio-prevención
Identificar moléculas tumorales para dirigir un tratamiento idóneo
Detección de enfermedad residual mínima o recurrente
Distinguir entre metástasis de un tumor o un segundo primario
Conocer mejor la biología de las neoplasias más importantes en nuestro medio
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Better targeted diagnosticsBetter targeted diagnostics(In-vitro diagnostics, imaging)(In-vitro diagnostics, imaging)
Look for genetic links to diseaseLook for genetic links to disease
TreatmentTreatment
Monitoring and preventionMonitoring and prevention
Treatment selectionTreatment selection
Treatment monitoringTreatment monitoring(In-vitro diagnostics, imaging)(In-vitro diagnostics, imaging)
treat
detect
track
predict
pinpoint
personalize
Vision: 21st Century Personalized Medicine
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Personalized Medicine Is Transforming Discovery/Development/Delivery
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Ensayos Basados en PCR
Evaluar pérdida de regulación celular por
• Alteraciones en secuencias
• Metilación de ADN
• Infecciones virales
Genes que controlan división celular, reparación celular, apoptosis y angiogénesis
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Ensayos PCR cuantitativa Tiempo Real (Real Time-Polimerase Chain Reaction):
Identificación presuntiva de SNP’s e inestabilidad de microsatélites en cáncer de colon.
Caracterización oncogenes relacionados con cáncer de mama hereditario: BRCA1 y BRCA2.
Alteraciones en oncogenes/genes supresores en cáncer de cérvix (p53, pRb, p16INK4a).
Carcinoma de Colon No-Polipomatoso Hereditario: MLH1, MLH2, MSH6.
Poliposis Familiar Adenomatosa: gen APC.
Expresión de factores biológicos (citocinas, factores de crecimiento, moléculas indicadoras de muerte celular alterada).
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Microarreglos (microarrays) de expresión genética
cDNA Arrays: generados por PCROligonucleotide Arrays: proceso fotolitográfico o directamente oligos25% de estudios con microarrays son en cáncerDepende de factores difíciles de controlar
e.g. infiltración estromal y de células inflamatorias ARN de tejido premaligno escaso se puede amplificar en cADN
Metodologías para Análisis Genómico Global Perfil de Expresión
Pollack JR. et al Nature Genetics, 1999.
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Modelos de Progresión de Cáncer
Cáncer de mama
Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.
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Modelos de Progresión de Cáncer
Cáncer de próstata
Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.
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Carcinoma pulmonar de células escamosas (NSCLC)
Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.
Modelos de Progresión de Cáncer
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Cáncer colorectal
Inestabilidad microsatélite: genes de reparación
Inestabilidad cromosómica: APC y -catenina
Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.
Modelos de Progresión de Cáncer
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EGFR
KRAS
Growth factors
Cell membrane
Monoclonal antibodies
• Cetuximab (Erbitux)• Panitumumab (Vectibix)
Y
Cell proliferation and survival
– Mutations in KRAS leads to resistance to anti-EGFR antibodies due to constantly active KRAS
– KRAS mutations are complex, multiposition mutations
– The most common KRAS activating mutations are found in codons 12, 13 and 61
– The KRAS status of a tumor may be indicative of prognosis and predictive of response to certain drugs
KRAS mutation status
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Wild typeKRAS
Codons
GGT GGCTGT AGCCGT CGCAGT TGCGTT GACGCT GTCGAT
12 13CAAAAAGAACGACCACTACACCAT
61
wt
Sequence to analyze: GGT GGC GTA GG
Mutations of importance within codons 12, 13 and 61 of the KRAS gene
Example of analysis of position 2 in codon 12
PyroMark KRAS AssayQuantitive results and sequence information
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KRAS silvestre
KRAS Mutante
codon 12
KRAS Resultados cuantitativos einformación de secuencia
Codon 12 mutación: GGT > GAT
Codones
GGT GGCTGT AGCCGT CGCAGT TGCGTT GACGCT GTCGAT
12 13CAAAAAGAACGACCACTACACCAT
61
wt
Sequence to analyze: GGT GGC GTA GG
Mutaciones de importancia en codones 12, 13 y 61 del gen KRAS
Ejemplo de análisis de posición 2 en codon 12
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Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)
PCR distrajo la conciencia de otras tecnologías prometedoras como la hibridación in situ
1990’s Técnicas de fluorescencia revolucionan microscopía de luz
Revela info. acerca de cambios cromosómicos e.g. pérdida o ganancia de material genético
Debe ser interpretada en el contexto del ambiente celular y morfológico combinando la info. morfo-histológica y molecular para lograr un Dx
Herramienta esencial para el Dx y manejo de variedad de tumores sólidos y malignidades hematológicas
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Visualización microscópica los DNA cromosómicos (hasta 1-2 Kb)
Sonda marcada con un compuesto fluorescente que emite señal
Cada señal corresponde al número presente de genes
Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)
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Pheno Path Labs, 2005
VENTAJAS:
Técnica directa es relativamente rápida y sensible
Dirigido a molécula relativamente estable
No requiere cultivo celular
Resultado más fácil de interpretar que cariotipos complejos
Puede combinarse con inmunotinciones
DESVENTAJAS:
Requiere cámara y sistema captura de imágines
Número limitado de sondas comercialmente disponibles
Sólo casos moderadamente o altamente cargados de células anormales
Proporciona información sobre sondas analizadas, no detecta otras aberraciones
Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)
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![Page 29: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/29.jpg)
Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)
Estado de Amplificación HER-2 Ca de Mama
Señal naranja: HER2
Señal verde: CEP17
No amplificado
4x
7x
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Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)
Estado de Amplificación gen HER-2 Ca de Mama
54%
38%
19%
0%
Vogel C, et al. Proc Am Soc Clin Oncol.2001
Mass R, et al. Proc Am Soc Clin Oncol.2001
![Page 31: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/31.jpg)
Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)
POBLACIÓN FISH-POSITIVA
de pacientes FISH positivos serían negativos por IHC (0/1+)
Falsos negativos privan a un paciente de una terapia potencialmente beneficiosa
EN RESUMEN: FISH en selección de terapia para Ca de mama
POBLACIÓN IHC-POSITIVA
de pacientes IHC-positivos (2/3+) serían negativos por FISH
Falsos positivos conducen a tratamientos médicos costosos de poca efectividad
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Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)
Monitoreo Recurrencia Cáncer de Vejiga
Pérdida de p16 es una de las alteraciones más importantes en Ca urotelial (9p21)
Aneuploidía cromosomas 3, 7 y 17
![Page 33: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/33.jpg)
Microscopía de Fluorescencia
• Fluorescencia de Hibridización in situ (FISH)
• Cáncer de mama: HER-2, TOP2A.
• Cáncer de próstata: c-myc.
• Cáncer de pulmón: LSI EGFR, LSI c-myc, CEP 6.
• Adenocarcinoma de colon: Urokinase, c-myc.
• Aplicación general en tumores: p53, p16.
![Page 34: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/34.jpg)
Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
1960’s Kametsky y colaboradores desarrollan concepto Stanford.
Citometría de Flujo es una técnica usada en sangre, muestras linfoides y tisulares.
Asociación de poblaciones celulares (“sorting”)
Tamaño celular (FSC)
Granularidad celular (SSC)
Emisión de fluorescencia
Medición de ploidía o análisis de ADN
![Page 35: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/35.jpg)
Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
585 nm
650 nm
530 nm
![Page 36: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/36.jpg)
Delimitación de poblaciones (Gating)
Forward Scatter
Sid
e S
catte
r
Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
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Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
![Page 38: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/38.jpg)
Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
![Page 39: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/39.jpg)
PI Fluorescence
DNA Analysis
2N2N 4N4N 4000 200 600 800 1000
Cou
nts
0
75
15
0 2
25
30
0
Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
![Page 40: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/40.jpg)
PI Fluorescence
0 200 400 600 800 1000
Coun
ts0
75
15
0 2
25 3
00
Aneuploid peakAneuploid peak
DNA index 1.21DNA index 1.21
DNA Analysis
Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
![Page 41: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/41.jpg)
Aplicaciones rutinarias de citometría.
•Conteo absoluto de células
•Análisis de ADN y ARN
•Análisis de expresión de genes indicadores
•Cuantificación antigénica
•Detección de apoptosis
•Discriminación de células no-viables
•Inmunofenotipeo
•Estudios funcionales de linfocitos
•Medición de proteínas intracelulares
•Medición de calcio intracelular
Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
![Page 42: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/42.jpg)
Cultivo de Tejidos
• Estudios para determinar resistencia a agentes citotóxicos.
• Cultivo de tumores sólidos para estudio de marcadores de sobrevida celular/apoptosis.
• Aislamiento de linfocitos y monocitos para ensayos de citotoxicidad in vitro contra antígenos tumorales (evidenciar presencia de respuesta inmune).
• Preparación de células y cDNA para banco de tumores.
• Manejo estéril general de biopsias.
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![Page 44: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/44.jpg)
Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.
![Page 45: Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/5681517b550346895dbfb4c2/html5/thumbnails/45.jpg)
Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.