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Principios y tcnicas de Microscopia

Resumen

El primer microscopio ptico fue desarrollado en 1590 por Z. Janssen y su sobrino H. Janssen.

Robert Hooke, que observo las primeras clulas y por Antonie van Leeuwenhoek, quienes mejoraron el

microscopio para vislumbrarnos por primera vez la estructura interna de las clulas.

En la dcada de 1930 se desarroll el microscopio electrnico que revoluciono nuestra capacidad de

explorar la estructura y la funcin celular, ya que es 100 veces mejor que el microscopio ptico para

visualizar objetos

En el microscopio se necesitan siempre tres elementos para formar una imagen: una fuente de

iluminacin, una muestra para ser examinada y un sistema de lentes que enfocan la iluminacin sobre la

muestra y que forma la imagen.

La longitud de onda de la iluminacin establece un lmite en el tamao de los objetos que pueden ser

observados.

La interferencia es uno de los procesos por el cual dos o ms ondas se combinan para reforzarse o

cancelarse, produciendo una onda igual a la suma de las dos iniciales.

En los mejores microscopios pticos la apertura angular es alrededor de 70.

La apertura angular de una lente es uno de los factores que determina la resolucin de un microscopio,

que se define como la distancia mnima que existe entre dos puntos separados cuando se observa con

un microscopio.

La resolucin est determinada por tres factores: la longitud de onda de la luz que se emplea para

iluminar la muestra, la apertura angular y el ndice de refraccin del medio que rodea la muestra.

El lmite de resolucin para un microscopio que emplea luz visible es aproximadamente 300nm en seco y

200nm con lentes para aceite de inmersin y 2nm para el microscopio electrnico. (La resolucin puede

ser optimizada hasta valores de 100nm empleando luz ultravioleta como fuente de iluminacin.

Con objeto de incrementar la apertura numrica, algunas lentes de microscopio estn diseadas para

utilizar aceite de inmersin entre la lente y la muestra.

Debido a que el lmite de resolucin determina la capacidad de una lente para distinguir entre dos

objetos que estn muy prximos, tambin establece el lmite superior de los aumentos tiles posibles

con cualquier lente.

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Los aumento tiles en un microscopio ptico estn limitados aproximadamente a 1000 X en seco y a

1400 X con aceite de inmersin. Los aumentos por encima de estos lmites se denominan ya que no proporcionan informacin adicional acerca del objeto que se estudia.

El video microscopa digital puede registrar imgenes consecutivas optimizadas. En la que se registran y

se almacenan imgenes microscpicas poniendo una cmara de video en el plano de la imagen

producido por la lente ocular.

En el microscopio electrnico tienen dos diseos bsicos: el microscopio electrnico de transmisin y el

microscopio electrnico de barrido. Ambos son similares ya que cada uno utiliza un haz de electrones

para producir la imagen

Cuadro comparativo

Fuente de Iluminacin

Microscopio ptico Microscopio electrnico

Es luz visible, y el sistema de lentes consiste en una serie de lentes de vidrio. La imagen puede ser vista o bien directamente a travs de un ocular o bien se puede enfocar sobre un detector como una pelcula fotogrfica o una cmara electrnica.

Es un haz de electrones emitido por un filamento de tungsteno calentado, y el sistema de lentes consiste en series de electroimanes. El haz de electrones se enfoca en una pantalla fluorescente, en una pelcula fotogrfica o es visualizada digitalmente empleando un detector.

Resolucin

En un microscopio ptico se emplean lentes de vidrio para dirigir la direccin de los fotones

En un microscopio electrnico se emplean electroimanes como lentes para dirigir la direccin de los electrones.

Aumentos

Limitados por 1000 X en seco y 1400 X en aceite de inmersin, despus de estos rangos de dice que son aumentos vacos ya que no proporciona ninguna informacin adicional.

Son 100 veces mejor que el ptico, es decir 100,000 X ms pequea que la de un fotn de luz visible, el lmite terico de resolucin de un microscopio electrnico (0.02nm) en algunos ordenes de magnitud menor que el del microscopio ptico (200nm).

Microscopio ptico compuesto de campo claro

Recorrido de la luz Partes y funciones principales

Comienza con la fuente de iluminacin, localizada en la base del instrumento, los rayos de luz procedentes de esta fuente pasan a travs de lentes condensadoras que dirigen la luz hacia la muestra montada en un portaobjetos de vidrio dispuesto en la platina del microscopio. La lente objetivo es la responsable de la formacin de la

Ocular: Aumenta la imagen formada por el objetivo. Tubo del cuerpo: transmite la imagen del objetivo al ocular. Brazo: da soporte al microscopio. Lentes objetivos: principales lentes que aumentan la muestra.

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imagen primaria. La imagen primaria es posteriormente aumentada por la lente ocular, en algunos microscopios entre el objetivo y el ocular se posiciona una lente intermedia para conseguir an ms aumentos.

Platina: Mantiene la posicin de la preparacin microscpica Condensador: Enfoca la luz a travs de la muestra. Diafragma: Controla la cantidad de luz que entra en el condensador Tornillo de enfoque rapido. Iluminador: Fuente de luz. Base: Soporte del microscopio. Tornillo de enfoque fino.

Caractersticas especiales

Las nicas muestras que se pueden observar directamente mediante el microscopio de campo claro son aquellas que tienen color o tienen alguna otra propiedad que afecta a la luz que la atraviesa. Muchas muestras biolgicas carecen de esas caractersticas y por lo tanto deben ser tenidas con colorantes o examinadas con tipos especiales de microscopios.

Microscopia de contraste de fases

Incrementa el contraste sin necesidad de cortar ni teir, haciendo uso de las diferencias de grosor y de ndice de refraccin de varias regiones de las clulas que se examinan.

La microscopia de contraste de fases usa una placa de fase: que es un componente ptico dispuesto en el recorrido de la luz por encima del objetivo para poner en fase los rayos directos no difractados con aquellos que han sido difractados por la muestra. (Corrige la luz alterada por el lente objetivo para que el ojo humano no pueda detectar estos cambios de fase).

Como resultado

Las estructuras internas de las clulas se visualizan a menudo mejor mediante microscopia de contraste de fase que con ptica de campo claro. Esta modalidad en microscopia ptica es particularmente til para examinar muestras vivas y sin teir ya que los materiales biolgicos producen difraccin de la luz de manera casi inevitable.

En donde se emplea?...

Generalmente en microbiologa y en la investigacin de cultivos celulares para detectar bacterias, orgnulos celulares y otras partculas presentes en las muestras vivas.

Microscopia de contraste de interferencia diferencial (DIC)

Utiliza un disociador del haz de luz para detectar diferencias de fase. Se asemeja a la microscopia de fase, pero es ms sensible ya que emplea un prisma especial para separar el haz de luz en dos rayos separados. La imagen tiene apariencia tridimensional como resultado de una ilusin de fusin de sombras que se produce ya que las diferencias de fase son positivas en un lado de la cebra y negativas en el lado opuesto.

Componentes pticos Necesarios

Incluye un Polarizador, un analizador y un par de Prismas de Wollanston El polarizador y el primer prisma de Wollanston separan el rayo de luz, creando haces separados por una pequea distancia en una direccin. Despus de atravesar la muestra, los haces se recombinan para formar un rayo idntico al que entro inicialmente el polarizador y en el primer prisma de Wollanston.

El efecto neto es un marcado incremento en la resolucin, que hace que esta tcnica sea

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especialmente til para estudiar muestras vivas y sin teir.

Microscopia de Fluorescencia

Permite detectar la presencia de molculas o iones especficos dentro de las clulas. Es un tipo especializado de microscopia ptica que emplea luz para excitar fluorescencia en la muestra.

Que lo hace diferente

Un microscopio de fluorescencia tiene un filtro de excitacin entre la fuente de luz y el condensador, que transmite nicamente luz de una longitud de onda particular. El condensador enfoca la luz sobre la muestra, produciendo que los compuestos fluorescentes de la muestra emitan luz de una longitud de onda ms larga.

Qu se debe de hacer para emplear la Microscopia de Fluorescencia?...

Se emplean indicadores especiales de las molculas denominadas sondas fluorescentes, una sonda fluorescente es una molcula capaz de emitir luz fluorescente y que puede emplearse para indicar la presencia de una molcula o un ion especifico. Una de las aplicaciones ms frecuentes de las sondas fluorescentes es la Inmunotincion. (ver glosario)

Qu tcnicas se emplea para la Microscopia de Fluorescencia?...

Utilizando tcnicas de inmunofluorescencia indirecta, se trata de un tejido o una clula con un anticuerpo sin marcar. Este anticuerpo, llamado anticuerpo primario, se une a los sitios antgenos especficos dentro del tejido o de la clula. Entonces se aade un segundo tipo de anticuerpo llamado anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario est marcado con una partcula fluorescente y se une al anticuerpo primario.

Como resultado produce una amplificacin de seal y es mucho ms sensible que la utilizacin de un nico anticuerpo primario. El mtodo es ya que no detecta directamente donde se unen los anticuerpos a los antgenos; tcnicamente la fluorescencia refleja el sitio al que se ha unido el anticuerpo secundario, y refleja el lugar donde se localiza la molcula de inters.

Algo ms sobre la Microscopia de Fluorescencia!...

Se puede utilizar para monitorizar la distribucin subcelular de varios iones adems para detectar macromolculas como protenas. Para conseguirlo, los qumicos han sintetizado molculas cuyas propiedades de fluorescencia son sensibles a las concentraciones de iones como Ca2+, H+, Na+, Zn2+ y Mg2+, as como potenciales elctricos a travs de la membrana plasmtica.

Transferencia de energa por resonancia de Fluorescencia (FRET), Qu es?...

Cuando dos molculas fluorescentes cuyas propiedades de fluorescencia estn emparejadas y muy prximas entre s, es posible que sufran FRET. En FRET la iluminacin de una clula a la longitud de onda de excitacin del primer fluorforo (donante) produce la transferencia de energa al segundo fluorforo (aceptor). Esa transferencia energa no implica un fotn de luz, pero una vez que ocurre induce la emisin de luz por el aceptor en su longitud de onda caracterstica.

Microscopia Confocal

Funcin principal: Minimiza el aspecto borroso mediante la exclusin de la luz fuera del foco de la imagen. Definicin: Es un tipo especializado de microscopio ptico que emplea un haz de luz lser para producir una imagen de un nico plano de la muestra en un momento determinado. Esta aproximacin mejora la resolucin a lo largo del eje ptico del microscopio as se pueden distinguir las estructuras localizadas en el centro de la clula de las que estn en la superficie o de la parte inferior.

Como alternativa a la Microscopia laser Confocal

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El microscopio confocal de disco giratorio emplea discos que giran rpidamente y que contienen un conjunto de pequeas lentes y una serie correspondiente de pinholes. Aunque no puede producir secciones pticas tan finas como los microscopios laser confocal, puede generar imgenes confocales que se pueden adquirir rpidamente usando cmaras digitales.

Para qu se emplea un Pinhole en la Microscopia Confocal?...

Para eliminar la luz fuera del foco, el resultado es una imagen ntida, aunque las molculas por encima y por debajo del plano focal de la lente objetivo estn siendo excitadas por la luz incidente

Cmo reducir la Foto toxicidad de las molculas excitadas fluorescentes?...

Esto es posible utilizando la microscopia de excitacin multifoton, se emplea un lser que emite pulsos de luz de muy alta energa y muy rpidamente para irradiar la muestra. Para que se produzca fluorescencia, la molcula fluorescente debe absorber una rpida sucesin de fotones (en algunos casos tres o ms).

Cul es la tercera tcnica empleada?...

La Microscopia digital de deconvolucin para producir imgenes muy ntidas, se basa en un principio completamente diferente. Se emplea microscopia de fluorescencia convencional para adquirir series de imgenes fluorescentes a lo largo del espesor de la muestra. Entonces se emplea un ordenador para procesar digitalmente o deconvolucionar, cada plano focal para eliminar matemticamente la distribucin debida a la luz fuera del foco.

Microscopia de Fluorescencia de reflexin (TRIF)

Supone un mtodo incluso ms preciso para observar las molculas fluorescentes. TRIF se basa en una propiedad til de la luz: cuando la luz se mueve desde un medio con un alto ndice de refraccin (como el vidrio) a un medio con un ndice de refraccin menor (como el agua o una clula), si el ngulo de incidencia de la luz supera un cierto valor (denominado ngulo critico), la luz es reflejada.

Por qu es til la TRIF si se refleja toda la luz?...

Una capa de luz muy pequea, llamada el se extiende hacia el agua o la clula. Esta capa es muy fina, de alrededor de 100nm, haciendo que TRIF sea 10 veces mejor que un microscopio confocal para resolver objetos pequeos muy prximos a la superficie del cubreobjetos.

Como resultado

Esto hace que TRIF se especialmente til para estudiar la liberacin de vesculas de secrecin o para la observacin de la polimerizacin de actina.

Tcnicas de preparacin de muestras para Microscopia ptica

La preparacin de las muestras frecuentemente implica su fijacin, seccionamiento y tincin. En los preparativos para la tincin de clulas, los tejidos deben ser tratados previamente con Fijadores que matan las clulas, al tiempo que preservan su apariencia estructural.

Los fijadores ms ampliamente usados

Son los cidos y aldehdos como el cido actico, el cido pcrico, el formaldehido y el glutaraldehdo. Una forma de fijacin de los tejidos es sencillamente sumergirlos en la solucin fijadora

El paso siguiente luego de Fijar la Muestra

Consiste en cortar la muestra en secciones que sean las suficientemente finas para transmitir la luz. De otra forma la muestra seria opaca bajo el microscopio y no seran visibles las estructuras discernibles. Para preparar estas secciones finas, la muestra se incluye en un medio (como plstico o parafina) que puede mantener su posicin mientras se obtienen las secciones.

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Y por ltimo paso

Las secciones se montan entonces en un portaobjeto y se procede a su tincin con cualquiera de los colorantes, que se han adaptado para este propsito.

Para qu se emplea el Micrtomo?...

Despus de la inclusin o la congelacin rpida, la muestra se corta en secciones finas de pocos micrmetros de grosor empleando un micrtomo, un instrumento que funciona de forma parecida a un seccionador de embutidos.

La Autorradio grafa Microscpica

Es una aproximacin con importancia histrica para la localizacin de componentes especficos dentro de las clulas; es una tcnica que emplea una emulsin fotogrfica para determinar en qu lugar se localiza un compuesto radiactivo especfico dentro de la clula en el momento en que esta se fija y se corta para microscopia.

Microscopia Electrnica de Transmisin (TEM)

Forma una imagen a partir de los electrones que se transmiten a travs de la muestra que est siendo examinada.

Caractersticas Principales: Sistema de Vaco

Los electrones no pueden viajar muy lejos a travs del aire, se debe de mantener un intenso vaco a lo largo de todo el recorrido del haz de electrones. Para crear este vaco dos tipos de bombas de vaco funcionan manera conjunta. En algunos TEMs se incorpora un dispositivo llamado Trampa de vaco ayuda a establecer un nivel de vaco elevado.

Canon de Electrones

Los electrones en TEMs son generados por un canon de electrones un conjunto compuesto por diversos componentes. El Ctodo un filamento de tungsteno semejante al filamento de una bombilla, libera electrones de su superficie cuando es calentado. La punta del ctodo est cerca de una apertura circular de un cilindro de metal. Un voltaje negativo en este cilindro ayuda a controlar la emisin de electrones y a dar forma al haz. En el otro extremo del cilindro se encuentra en nodo. El nodo se mantiene a 0 V mientras que el ctodo se mantiene a 50-100 kV. Esta diferencia de voltaje hace que los electrones se aceleren al pasar a travs del cilindro y por lo tanto se denomina Potencial de aceleracin.

La formacin de la imagen

Depende tanto de la longitud de onda como de las propiedades particulares de los electrones. Al tiempo que el haz abandona el canon de electrones, entra en una serie de Lentes Electromagnticas. Cada lente es simplemente un espacio bajo la influencia de un campo electromagntico. La distancia focal de cada lente se puede incrementar o disminuir variando la cantidad de corriente elctrica aplicada a la espiral.

La Lente Condensadora

Es la primera en afectar al haz de electrones. Funciona de la misma forma que su equivalente en el microscopio ptico para enfocar el haz sobre la muestra.

La lente Objetivo, la Lente Intermedia, y la Lente de Proyeccin

Es la parte ms importante del sistema de lentes del microscopio electrnico, producen una imagen final en una pantalla que emite fluorescencia cuando recibe impactos de los electrones o en un detector que genera directamente la imagen.

Cmo se forma la imagen a partir de la accin de estas lentes electromagnticas sobre un haz de electrones?

Recuerda que el haz de electrones generado por el ctodo pasa a travs de un sistema de lentes

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condensadoras y afecta a la muestra. Cuando impactan sobre la muestra, algunos electrones son dispersados por la muestra, mientras que otros continan su recorrido relativamente sin desviacin.

Sistema de Captura de Imagen

La utilizacin de pelcula permite crear impresiones fotogrficas que se denominan Micrografas Electrnicas y que se transforman en un registro fotogrfico permanente de la muestra.

Voltaje

El haz de electrones es demasiado dbil para penetrar en las muestras biolgicas, de forma que las muestras que se examinan mediante microscopia electrnica de transmisin convencional deben ser extremadamente finas (normalmente no ms de 100nm de grosor) de lo contrario, los electrones no seran capaces de atravesar la muestra y la imagen seria completamente opaca.

Microscopia Electrnica de Barrido (SEM)

Produce imgenes a partir de electrones reflejados por la superficie externa de la muestra (en lugar de los electrones transmitidos a travs de la misma). Es una tcnica especial espectacular debido a la sensacin de profundidad que confiere a las estructuras biolgicas, permitiendo estudiar la topografa de superficie.

Caractersticas Principales

El sistema de vaco y la fuente de electrones son similares a los del TEM, aunque el voltaje de aceleracin es ms bajo. La principal diferencia es la forma en que genera la imagen. En un SEM el sistema de lentes electromagnticas enfoca intensamente el haz de electrones en un punto que se mueve sobre la superficie de la muestra mediante placas cargadas denominadas Deflectores del haz localizados entre la lente condensadora y la muestra. (pg. 22 libro)

Tcnicas de Preparacin de Muestras para Microscopia Electrnica

En la Microscopia Electrnica de Transmisin: La obtencin de secciones ultra finas y la tincin son tcnicas preparativas comunes.

Implica el seccionamiento de tejidos y clulas en secciones ultra finas de no ms 50-100 nm de grosor, las muestras deben ser previamente fijadas qumicamente y estabilizadas. Los fijadores que se emplean son habitualmente soluciones de aldehdos y muy comnmente glutaraldehdo. Despus de la fijacin se tie habitualmente con una solucin al 1-2% de treta oxido de osmio tamponado (OsO4). Se une a varios componentes celulares hacindolos ms densos a los electrones.

Los Fijadores Qumicos: Efecto 1, son lentos; la difusin del fijador en la muestra para fijar sus estructuras requiere una mnima cantidad de tiempo. Efecto 2, extraen componentes celulares, a menudo se pierden en la fijacin algunas estructuras pequeas dentro de las clulas

Congelacin a alta presin: Sin ella se forman cristales de hielo dentro de las muestras lo que produce danos en sus estructuras. Crio sustitucin: El agua de la muestra es reemplazada muy lentamente por un solvente orgnico, como la acetona, durante un periodo de das.

El tejido posteriormente pasa a travs de una serie de soluciones de alcohol que los deshidratan, y posteriormente se sumergen en una solucin de un disolvente como acetona u oxido de propileno para prepararlo para su inclusin en una resina liquida plstica de tipo epoxi.

Se tien de nuevo, esta vez con soluciones que contienen plomo y uranio, este paso incrementa el

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contraste de la muestra ya que el plomo y el uranio confieren una densidad electrnica mayor a regiones especficas de la clula.

Se pueden localizar molculas en Micrografas Electrnicas con Radioistopos o anticuerpos

Para el TEM, la muestra que contiene componentes marcados radiactivamente se examinan simplemente en secciones ultra finas sobre rejillas de cobre en lugar de en secciones finas montadas en portaobjetos de vidrio.

Inmunomicroscopia Electrnica (Inmuno EM): La fluorescencia no se puede visualizar en el microscopio electrnico y para visualizar los anticuerpos estos deben ser unidos a sustancias densas a los electrones y por lo tanto visibles como puntos opacos.

Una de las aproximaciones ms comunes es acoplar las molculas anticuerpo con partculas de Oro coloidal.

La Microscopia Correlativa para cubrir el espacio entre las microscopias pticas y electrnicas

La Microscopia Correlativa: En ella se captan imgenes dinmicas de una clula empleando microscopia ptica, a menudo usando anticuerpos y/o GFP.

Generalmente se emplea inmunoEM para determinar la localizacin de la protena con una alta resolucin.

La microscopia correlativa establece as un puente entre las imgenes dinmicas de microscopia ptica y las imgenes detalladas que solamente se pueden adquirir mediante EM.

La tincin Negativa en EM

Tincin Negativa: es una de las tcnicas ms simples en microscopia electrnica de TEM, las muestras intactas se visualizan simplemente en relieve en contraste con un medio tenido intensamente.

Cmo se Realiza?...

La rejilla de cobre debe ser inicialmente cubierta con una pelcula de plstico muy fina. Entonces se suspende la muestra en una pequea gota de lquido que se aplica sobre la superficie de plstico y se deja secar al aire, una vez que la muestra se ha secado en la rejilla se aplica a la superficie de la pelcula una gota de colorante como acetato de uranillo o cido fosfotungsico. Los bordes de la rejilla se hacen contactar en diversos puntos con papel filtro para absorber el exceso de colorante, esto deja al colorante por debajo y alrededor de la muestra y de sus caractersticas ultra estructurales.

La Tcnica de Sombreado

Consiste en vaporizar una capa fina de un metal electro denso, como oro o platino, con un cierto Angulo sobre la superficie de la muestra biolgica y permite visualizar partculas aisladas como macromolculas.

Cmo Podemos Visualizar el ADN o RNA?...

Comnmente se emplea un procedimiento relacionado. En esta tcnica, se extiende una solucin de DNA y/o RNA en una interfase aire-agua, creando una mono capa molecular que se recoge como una fina pelcula que es visualizada al depositar uniformemente metal pesado sobre ella.

Para mayor informacin de la tcnica de sombreado: captulo 1. Pg. 26-27. Biologa Molecular y celular Wayne Becker, Alberto Garca Gonzales, Jaime Gonzales Poggio.

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La Crio fractura y El Grabado por Congelacin

Consta en lugar de cortar secciones uniformes a travs de la muestra de tejido (o de teir material sin seccionar), las muestras congelan rpidamente a la temperatura del nitrgeno lquido o de helio lquido, se someten al vaco, y se golpean con el borde de una cuchilla afilada. Las muestras congeladas a temperaturas bajas son demasiados duras para ser seccionadas.

Las membranas crio fracturadas aparecen como superficies lisas salpicadas con. Partculas Intramembranosas: estas partculas son protenas integrales de membrana que han permanecido en una u otra mono capa al pasar el plano de fractura por el interior de la membrana.

Grabado por congelacin: Aade un paso adicional respecto a la crio fractura y permite aportar ms informacin. A continuacin de la fractura de la muestra, pero antes del sombreado, se dispone el brazo del micrtomo directamente sobre la muestra durante un periodo corto de tiempo. Esta maniobra produce la evaporacin (sublimacin) de una pequea cantidad de agua de la superficie de la muestra sobre la superficie de la cuchilla y esta sublimacin produce un efecto de grabado que consiste en la acentuacin de los detalles de superficie.

Estereomicroscopia Electrnica

Se obtiene informacin tridimensional fotografiando la misma muestra desde dos ngulos ligeramente diferentes.

Cmo se consigue?...

Usando una mordaza especial que puede ser inclinada con respecto a las de electrones. La muestra se inclina inicialmente en una direccin y se fotografa, y despus se inclina la misma magnitud en la direccin opuesta y se fotografa de nuevo.

Preparacin de muestras para Microscopia electrnica de Barrido

El objetivo es preservar las caractersticas estructurales de la superficie celular y trata al tejido de forma que se minimice el dao causado por el haz de electrones.

El procedimiento es similar a la preparacin de secciones ultra finas en la TEM, pero sin el paso de cortado.

El tejido est fijado en aldehdos, postfijado en tetra xido de osmio y deshidratado mediante el procesamiento a travs de series de soluciones de alcohol.

Otros Mtodos de Imagen

La Microscopia de Barrido de Sonda

Denominado microscopio efecto de tnel (STM) desarrollado a principios de los aos 80 con el fin de explorar la estructura superficial de muestras a nivel atmico.

Caractersticas

Utiliza una sonda muy pequea que no emite un haz de electrones, sino por el contrario posee una punta hecha de un material conductor como el platino-iridio. La punta de la sonda esta extremadamente afilada estando compuesta por un nico tomo. Se puede mover en tres dimensiones sobre una superficie. Las dimensiones y barren la superficie, mientras que la controla la distancia de la punta sobre la superficie.

Limitaciones

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1) La muestra debe ser conductor elctrico, 2) la tcnica nicamente proporciona informacin de los electrones asociados con la superficie de

la muestra.

Aplicaciones

Es la medida de los cambios dinmicos en la conformacin de las biomoleculas en funcionamiento, por ejemplo: que pudieses visualizar el cambio de forma de una nica molcula de una enzima medida que hidroliza ATP para producir energa necesaria para transportar iones a travs de membranas.

Difraccin de rayos X

Este mtodo reconstruye imgenes a partir de los patrones de difraccin de rayos x que pasan a travs de una muestra cristalina o fibrosa, revelando la estructura molecular con una resolucin de nivel atmico.

La Cristalografa de rayos X

Proporciona unas visiones sin precedentes de las molculas biolgicas a nivel atmico, sin embargo la cristalografa requiere grandes cantidades de molculas purificadas.

Tcnica del CrioEM

Ayuda a rellenar los vacos, se congelan rpidamente mediante crio fijacin de molculas o agregados macromoleculares purificados. La congelacin rpida evita la formacin de cristales de hielo. Por el contrario, las molculas quedan embebidas en Hielo vtreo agua congelada no cristalina que preserva mejor las estructuras de las molculas embebidas.

Glosario:

Interferencia: Es cuando un haz de luz o de electrones para a travs de una lente y se enfoca en un

punto, la imagen que se forma es consecuencia de una propiedad de las ondas.

Difraccin: Es la imagen que se ve cuando se observa una muestra a travs de una serie de lentes es

realmente un patrn de interacciones aditivas y destructivas de las ondas que atravesaron las lentes.

Distancia focal: Es la distancia entre el punto medio de la lente y el punto focal en el que convergen los

rayos que atraviesan la lente.

Apertura angular: Es la mitad del ngulo del cono de luz que entra en el objetivo del microscopio a

partir de la muestra. Es por lo tanto una medida de la cantidad de iluminacin que sale de la muestra y

pasa a travs de la lente.

ndice de refraccin: Es una medida de la variacin de la velocidad de la luz al atravesar de un medio a

otro.

Microscopio compuesto: utiliza combinaciones de diversas lentes y se denomina por lo tanto

microscopio compuesto.

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Fluorescencia: Hace referencia al proceso que comienza con la absorcin de luz por una molcula y

termina con su emisin. La aproximacin a este proceso se optimiza considerando el comportamiento

de un cuanto de luz en contraposicin a su comportamiento ondulatorio.

Inmunotincion: Una tcnica basada en la capacidad de los anticuerpos de reconocer y unirse a

molculas especficas (las molculas a las que se unen los anticuerpos se denominan anticuerpos).

Foto blanqueamiento: Cuando las molculas fluorescentes son irradiadas con luz la longitud de onda de

excitacin apropiada durante largos periodos de tiempo, sufren un foto blanqueamiento (la irradiacin

induce que las molculas dejen de emitir fluorescencia).

(FRAP) La Recuperacin de la Fluorescencia despus del Foto blanqueamiento: Es una medida til de la

velocidad a la que las molculas difunden o son transportadas directamente.

Foto activacin: Produce la situacin contraria a la foto blanqueamiento, la liberacin local de una

molcula fluorescente produce un punto luminoso de fluorescencia que se puede seguir a medida que

las molculas siguen su camino a lo largo de la clula.

Perfusin: Inyeccin del fijador en el torrente circulatorio del animal antes de extraer los rganos.

Artefactos (preparacin de muestras): Son representaciones falsas o inexactas de la muestra, que se

producen por el tratamiento qumico o por la manipulacin de clulas y los tejidos.

La Crio fijacin: Consiste en una congelacin rpida (20 ms) de una muestra bajo condiciones de alta

presin, evita los problemas en perder pequeas estructuras celulares.

Crio proteccin: Reduce la formacin de cristales de hielo durante la congelacin.

Secador de punto crtico: Se emplea para secar la muestra en condiciones de presin y temperatura

controlada.

Interferencia Constructiva: Las ondas procedentes de dos orgenes entran en fase, su amplitud total es

aditiva.

Interferencia Destructiva: Si estn fuera de fase, su amplitud se reduce. (Este efecto se puede ver

cuando la luz pasa a travs de dos orificios en una pieza de material opaco y entonces incide sobre una

superficie blanca).

Nota: Si algn apartado no resulta lo ms claro posible revisar el libro de texto para mayor informacin;

Biologa Celular y Molecular de Wayne Becker Capitulo 1 [Principios y tcnicas de microscopio].

mailto:martjorge8@gmail.com?subject=biologia_capitulo_1