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Principles of Fluorescence Spectroscopy

Chemistry Department

XMU

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Chapter Three

Fluorophores

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Fluorophores

3.1 Organic molecule fluorescence

3.2 metal –ligand compounds3.3 Probe

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3.1 有机分子荧光 有机分子的电子结构

E

*

*

n

可能产生的吸收跃迁组合为

* *

* *

n * n *

一般情况下， n-* 跃迁所需能量小。但当 n 电子与溶剂作用，如形成氢键、质子化等，使 n轨道能量降低， n-* 跃迁能量增大。

轨道能量区分激发态能量

< 200 nmS 和 P 轨道→、和 n 轨道

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分子激发态的多样性

CH2=CH2

*

CH2=CH2—CH2=CH2

1

2*

1*

2

CH2=CH2—CH2=CH2—CH2=CH2

1

2*

1*

2

3*

3

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电子激发态的类型——单线态与三线态

分子处于激发态时，单线态与三线态的势能曲线交叉，容易发生系间窜跃（ intra-system crossing )

hvA hvF

S1

T1

S0

hvP

ISC 效率的高低决定于自旋 - 轨道耦合程度。增加重原子常常促进 ISC 过程。

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3.1.1 有机分子荧光与结构的关系

大的共轭 键结构刚性的平面结构取代基团为给电子取代基最低的激发单重态 S1 为 ,* 型，而

不是 n, * 型抗磁性

强荧光物质所具有的结构特征

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电子离域程度对荧光的影响

化合物名 化合物结构 F

EX

nm

EM

nm

苯 0.11 205 278

萘 0.29 286 321

蒽 0.46 365 400

丁省 0.60 390 480

戊省 0.52 580 640

例 1 绸环芳烃

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例 2 1,2 – 二苯乙烯

C C(Z)

HH

C C(E)

H

H

顺式， 不发光反式，发光

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刚性平面结构

例 1 荧光素与酚酞

F0.92

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例 2 笏与联苯

例 3 偶氮苯与杂氮菲

F 1 F 0.2

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例 4 金属配合物

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例 5 荧光衍生化

硫胺荧 ]O[1BV

N

N

N

S

CH3

C2H5OH

NH2HClH3C

(Z)

N

N

N

S

CH3

C2H5OH

H3C

(Z)

N (E)

硫胺素， VB1 ， 非荧光

硫胺荧，强荧光

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例 6 联萘与北

观测到萘的荧光

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取代基的影响

要点：

1 ）取代基影响分子的荧光光谱特性，其影响的方式及程度视取代基的不同而不同，有的影响不大，有的影响严重。

2 ）一般规律，取代基的电子云如果能与共轭 键发光基团作用，降低能量，增大 电子的离域区域，则荧光增强，发射波长红移。

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给电子取代基 增强荧光—NH2, —NHR, —NR2, —OH, —OR, 等

OH NH

H

EM 285-365 nm 270-310 nm 310-405 nm

相对荧光强度 1.8 1.0 2.0

O N

H

H

H

荧光减弱荧光减弱 如何理解？如何理解？

吸收增强

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酚盐吸收性质

化合物 max max

203.5 7400 254 204

210.5 6200 270 1450

235 9400 287 2600

OH

O

介质（ 2% 甲醇）

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吸电子取代基

C

OC

O

O

N+

O

O

n 电子不与 电子共轭

羰基类 1 ） n* 跃迁禁阻，小， 10-2

2 ）最低单重态为 n,* 型，易于 ISC 。荧光弱，磷光强

O

O

OH

OH

非荧光 强荧光

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吸电子取代基

硝基 引起 ISC 增大，荧光量子产率降低，磷光也弱，主要是增强 IC 过程。

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取代基的位置

要点 1 ） 有利于电子离域的，则荧光增强。 因此，一般邻位、对位给电子基团导致荧光增强。

2 ）有利于形成环，导致分子刚性增大，荧光增强。

COOH

OH

CO

H

OH

O

COOH COOH

OHHO

荧光强度较弱

荧光强度较强

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3 ）双取代基

可以是协同作用，也可以是非协同作用，当为非协同作用时，以作用大的为主。

CH

CH

N+

O-

O

N

H3C

H3C

协同作用

4 – 二甲基胺 - 4‘ – 硝基苯乙烯

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重原子效应

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重原子效应 P F

2-Cl 萘

2-Br 萘

2- I 萘

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重原子效应

N

N N

N

O

H3C

CH3

CH3

O

F 0.22 10-5

P 0.14 0.43

P 1.9 s 0.024 s

N

N N

N

S

H3C

CH3

CH3

O

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最低单重态的性质

,* 不含有杂原子（ N,O,S ）的有机化合物均属于这一类，其特点是自旋允许跃迁，大， 104 ，荧光强

n,* 1) 含有杂原子（ N,O,S ）的有机化合物多属于这一类，含有 n 电子，其特点是自旋禁阻 ， 小， 102,

ISC 速率大，荧光弱。

2) n 轨道的能量受环境的影响大，如质子化或生成氢键等，将使 n 轨道的能量降低，导致 n* 跃迁的能量增大。荧光分子的最低激发态可能变成 ,* 。

分为两类 含氮杂环有机物

含羰基杂原子有机物

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含氮杂环有机物

N

荧光随极性的增大而增强例 1 喹啉

介质 苯 乙醇 水

相对荧光 1 30 1000

可以理解为 N 上的孤对电子与水形成氢键，使 n 轨道能量降低，从而使最低单重激发态由 n,* 变成 ,* 。

例 2 8- 羟基喹啉在酸性介质中荧光增强

N

OH

NH

OH

H+

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含羰基有机物芳香类 S1 与 T1 能级间隙小， ISC 效率高，接近于 1 。

脂肪类 有微弱的荧光， ISC 效率低一些

0.991.001.010.840.930.870.87

ISC

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抗磁性

COOR

R= N O

N OAcR=

D/P

0.0082

0.47

57

Diamagnetic / paramagnetic

荧光量子产率

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抗磁性COOR1

R2OOC

R1=R2= N O

N OAcR1=R2=

D/P

0.011

0. 66

60

荧光量子产率

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抗磁性

NF O + R NF O R

弱荧光 强荧光猝灭机理

1 ） IC 加剧2 ） ISC 加剧

3 ）能量转移

4 ）电荷转移

N. V. Blough and D. J. Simpson, “ Chemical mediated fluorescnece yield switching in nitroxide-fluorophore adducts: optical sensors of radical / redox reactions”, J. Am. Chem. Soc, 1988, 110, 1915-1917

N. V. Blough and D. J. Simpson, “ Chemical mediated fluorescnece yield switching in nitroxide-fluorophore adducts: optical sensors of radical / redox reactions”, J. Am. Chem. Soc, 1988, 110, 1915-1917

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抗磁性金属有机化合物

0.57 0.21 0.012

Reference

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Reference

Kazuyuke Ishii, Nagao Kobayashi, “The excited multiplet states of metalloporphyrins and metallophthalocyanines coordinated of linked to nitroxide radicals”

Coordination Chemistry Reviews, 198(2000), 231-250

Kazuyuke Ishii, Nagao Kobayashi, “The excited multiplet states of metalloporphyrins and metallophthalocyanines coordinated of linked to nitroxide radicals”

Coordination Chemistry Reviews, 198(2000), 231-250

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3.2 Metal – ligand compounds 金属离子 - 有机配体化合物的发光特性与金属离子和有机配体最低激发态的能级的相对高低有关

M*S1 T1

M LS0

M*S1 T1

M LS0

M*S1 T1

M LS0

M*

S1 T1

ML

S0

MLCTLMCT

Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ

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3.2 Metal – ligand compounds配体发光

M*S1 T1

M LS0

1 ）配体发光2 ）配合前后发光特性发生变化，最低激发态发生转变 , n,*向 ,* 变化3 ）配合增加刚性，荧光增强

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配体发光

N

OH

N

O

Mg2+

Mg/2

强发光 弱发光

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MLCT Metal – ligand charge transfer

M*S1 T1

M LS0

Rh Ru Os Ir Re

铑 钌 锇 铱 铼

N

N

NN

N

NRu2+

2Cl-

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弱发光或不发光

M*S1 T1

M LS0

M→M*通常很弱

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金属离子发光

M*

S1 T1

ML

S0

LMCT ligand-metal charge transfer

1) f*f 跃迁， Eu, Td, 锐线光谱

Tb3+-Trion 发射光谱

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LMCT2) d* →d 或 *→d 发光 Ru, Rh, Ir 等， 宽带光谱

Ru 联二吡啶、联三吡啶，邻菲啰呤

Os 联二吡啶、联三吡啶， 4 ， 6 双（甲硫基 - 3 – 氨基 -

嘧啶）等Ir 联二吡啶、联三吡啶，邻菲啰呤

Ru 邻菲啰呤等

问题： Demas 等人认为 - 二亚胺类配体易被还原，与铂系元素形成的配合物应为 MLCT.

问题： Demas 等人认为 - 二亚胺类配体易被还原，与铂系元素形成的配合物应为 MLCT.

引自“荧光分析法” 陈国珍等人编写。

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3.2.1 铂系金属有机配体化合物Rh Ru Os Ir Re

铑 钌 锇 铱 铼

Rhodium Ruthenium Osmium Iridium Rhenium

特点 1 ）荧光量子产率高，高达 0.5, 一般为 0.04 – 0.2

2) 固有荧光各项异性值高， 高达 0.35

3 ）荧光寿命长 有利于寿命的测定有利于表征生物分子的旋转运动

4 ）可以选择不同的中心金属离子和不同的配体，以适应特定的需要（分子工程）

代表性工作

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Reference

J. N. Demas and B. A. Degraff, “ Design and application of highly luminescence trasition metal complexs” Anal. Chem., 63(17) 829A-837A, (1991)

J. N. Demas and B. A. Degraff, “ Design and application of highly luminescence trasition metal complexs” Anal. Chem., 63(17) 829A-837A, (1991)

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电子结构以 d6 型金属离子和二亚胺（ diimine) 配体为主进行讨论。

ML6 正八面体晶体场

dz2,dx2-y2

dxy, dxz, dzy

e

t2

分裂能

能量简并 能量分裂

分裂能的决定因素

1 ）晶体场的强度

Crystal field strength of the ligand

2) 中心金属离子

Central metal ion

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配体 关注 轨道

e

t26

12

2*

1*

22

t26,1*1

t25,1*1

t25, e1

t26 S0

3dd*

1d→d*

1,3 MLCT

→*

可能的跃迁与电子态轨道能级

t26,1

1,e1 1,3LMCT →d*

d→*

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跃迁特性1 ） dd* 禁阻，寿命长，受环境影响大，易猝灭，量子产率低。

2 ） CT MLCT 铂系金属离子

LMCT d*d 发光

f*→f 发光 稀土金属离子

金属离子还原性越强，配体的氧化性越强，越易发生 MLCT

N N

bipyridine

能量转移

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能量转移

abc

de

+

S0

S1

S2

T1

T2

Ligand Ln

A FP Ln-F

Energy transfer

稀土配合物的荧光产生示意图 A：吸收； F ：荧光；P：燐光； Ln：稀土离子； Ln-F ：稀土离子荧光 .

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配体对发光的影响强金属 -配体化合物具备几个特点

1 ） 最低激发态为 CT 态或 * 态

2 ） d→d* 态应比最低激发态高得多，以避免 d→d* 的热激发。

3 ）自旋 - 轨道耦合应是有效的，以利于与无辐射去活化竞争。

4 ）单纯的 * 磷光寿命长，量子产率低。 CT 态将增加 * 磷光。

5 ）最低激发态（发射态）能量不能过低，否则将导致 IC 加剧。

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增加分裂能 中心金属离子

配位体场

配位体场的强度变化

Cl < Py << bpy, phen < CN < CO

Py, pyridine, 吡啶

bpy, bipyriding 联二吡啶

Phen, 1,10- phenanthroline 1,10- 邻菲啰呤

金属离子 分裂能随原子序数的增大而增大

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例 1 联二吡啶金属化合物

吸收 MLCT带 510 nm 450 nm 700nm

化合物 FeL32+ RuL3

2+ OsL32+

电子结构 3d6 4d6 5d6

N N

发光性质 非发光 发光 弱发光

S0

3dd*

3MLCT

3→*

能量间隙小， 易于非辐射几乎不发光

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例 2 铑 -联二吡啶化合物

化合物 Rh(bpy) 2Cl2+ Rh(bpy)3

3+ 发光性质

室温不发光

低温发光（ 77ºK)

无结构 740 nm

室温几乎不发光

低温发磷光（ 77ºK) 3→*

有精细结构 740 nm

dd* 发光无精细结构S0

3dd*

3MLCT

3→*

配位体发光有精细结构

配位体场的强度变化 Cl << bpy

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例 3 钌 -联二吡啶化合物

化合物 Ru(bpy)2(CN)2 Ru(bpy)2(CN) Cl

发光性质

室温发光 室温 不发光

S0

3dd*

3MLCT

3→*

配位体场的强度变化 Cl << CN

化合物 Ru(bpy)3 2+ Ru(bpy)2py22+

发光性质

室温发光 室温 发光不稳定 低温发光特性几乎一样

容易热激活

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3.2.2 非过渡金属元素的金属配体化合物

特点 1 ）金属离子的外电子层具有与惰性气体相同的电子结构2 ） 两个配位基团： 共价（键）配位

配位键 (提供孤对电子）

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偶氮类配体

HO

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四苯基卟啉类配体

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3.2.2 非过渡金属元素的金属配体化合物

3 ）形成配合物后 刚性增加

最低电子激发态发生变化

荧光增强

4 ）多应用于分析测定

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3.2.3 稀土金属离子 -有机配体发光稀土 钪（ Sc) 钇（ Y ）与镧系元素

电子结构 Eu 4f76S2 Eu3+ 4f6

Tb 4f96S2 Tb3+ 4f8

离子的特性 1 ）顺磁性 （注意区别顺磁性对芳香化合物激发态的猝灭）

2 ）吸收 f→f* 跃迁 类线状光谱3 ）发射 f*→f 跃迁 类线状光谱

离子的发光特性 1 ）水溶液中发光，配合后保留发光特性2 ）具有激光活性，可作为激光材料

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稀土有机配体化合物发光

4f4f 跃迁 弱， 类线状光谱

4f5d 跃迁 弱， 类线状光谱 吸收弱，发光也弱

电荷转移跃迁 配体的高吸收，经分子内能量传递，

（电荷离子发生的电荷密度从配位体的分

子轨道向稀土离子轨道进行重新分配的

结果。）获得发光效率很高的三价稀土

有机配合物。

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电荷转移发光光谱特性Stokes’ 位移大， 300 nm, 锐线光谱

Tb3+ - L ex = 337 nm, em = 625 nm, 643 nm

EX

EM

Eu3+ - L

Reference

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拉曼峰干扰比较

硫酸奎宁的荧光光谱受水溶剂的拉曼光的干扰A.水溶剂的拉曼光，低灵敏度； B. 0.1 µg/mL 溶液，低灵敏度； C. 0.033 µg/mL 溶液，较高灵敏度； D. 0.01 µg/mL 溶液，更高灵敏度。

F

硫酸奎宁

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拉曼峰干扰比较

exEu3+ - - 二酮

613 nm

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电荷转移发光光谱特性寿命长 （ 10 – 1000 s ，受微环境、配位体的影响）

荧光物质 荧光衰变（ ns)

人血清白蛋白 4.1

球蛋白 3.0

细胞色素 C 3.5

异硫氰酸荧光素 3.5

丹磺酰氯 14.0

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荧光寿命特性

Eu3+ 离子 水溶液 0.1 – 1.0 ms

非水溶液 2 - 2.5 ms

氘溶液 4 – 4.5 ms

固态 5 – 6 ms

配体化合物 - 二酮类 芳香羧酸类