priprema preparata za mikroskop biologija

Uvod u mikrobiologiju tla - vježbe

ISTRAŽIVANJE MIKROORGANIZAMA

MIKROSKOPIMA


Mikroskop (grč. mikros=malen, sitan; skopeo = gledam) je optičkiinstrument koji se upotrbljava za promatranje objekata, kao što sumikroorganizmi, koji su presitni da bi se mogli vidjeti golim okom - to je osnova primjene mikroskopa za stvaranje slike mikrobnog svijeta

MIKROSKOP

• razvoj:- 1600. god. Zacharias i Hans Janssen konstruirali prvi složeni mikroskop- 1625.god. Giovanni Faber - daje nazivmikroskopu- 1665.god. Robert Hooke primitivnimmikroskopom otkrio žive stanice- 1674.god. Antony van Leeuwenhoekpomoću jednostavnog mikroskopa(bikonveksna leća umetnuta izmeđumjedenih ploča) otkrio nevidljive oblikeživota - “najsitnije životinje” tj. mikroorganizme

• Svjetlosni ili optički mikroskopi:a) mikroskop sa svijetlim vidnim poljemb) mikroskop s tamnim vidnim poljemc) fluorescentni mikroskop - uzorak je fluorescentan; reflektirana i fluorescentna

svjetlost se razdvajaju zrcalom – propušta se samo fluorescentna svjetlost iz dijela uzorka u ravnini žarišta objektiva; velika rezolucija

d) fazno-kontrastni mikroskop – povećanje kontrasta preparata obavlja se promjenom faze svijetla što prolazi kroz preparat u odnosu na svijetlo koje prolazi pozadinom i tako se eliminira potreba za bojanjem promatranih organizama; omogućuje istraživanje unutarnje strukture stanice

Mikroskopi koji se danas koriste sastavljeni su od niza optičkih i mehaničkih djelova, a u osnovi razlikujmo dva tipa: svjetlosne (optičke) i elektronske mikroskope

(c)

(c) (d)


• Elektronski mikroskop:

a) transmisijski mikroskop – omogućuje velika povećanja tankih presjeka preparata

b) pretražni elektronski mikroskop – omogućuje 3-dimenzionalno promatranje preparata pod povećanjem najčešće oko 10000 puta

(a)


Grafički prikaz tipova uzoraka što se istražuju često upotrebljavanimmikroskopima u mikrobiologiji i srodnim područjima. Prikazan je i djelotvoran domet tih instrumenata.


Jednostavni svjetlosni mikroskop

- ima samo jednu leću i nalik je napovećalo

- sastoji se najmanje dvaju sustava leća: objektiva koji povećava uzorak i okulara koji povećava sliku što je dobivena od objektiva

- kao izvor svjetlosti u složenom mikroskopu se upotrebljava vidljivi dio spektra- upotrbljava se za istraživanje vrlo sitnih objekata, a i njihove fine detalje iliultrastrukture

- ukupno povećanje mikroskopa dobiva se tako da se pomnoži povećanjeobjektiva s povećanjem okulara

Složeni svjetlosni mikroskop



Mehanički dijelovi mikroskopa:1. postolje (podloga)2. stativ (ručica)3. tubus s revolverom4. stolić mikroskopa5. makrovijak i mikrovijak6. uređaj za osvjetljavanje

Optički dijelovi mikroskopa:1. okular2. objektiv3. kondenzor4. iris-zaslona


Optički dijelovi - služe za uvećavanje i osvjetljavanje predmeta koji se promatraju

1. OKULAR- kratka cijev koja sadrži dvije leće (gornja ili okularna i donja ili sabirna leća)- nalazi se na gornjem kraju tubusa- povećanja okulara su: 1x, 2x, 5x, 10x, 15x

2. OBJEKTIV- najvažniji optički dio mikroskopa - leće objektiva služe za skupljanje i koncentriranje zraka svjetlostikoje dolaze iz preparata i za povećavanje stvorene slike predmeta

- MOĆ RAZDVAJANJA - najvažnija osobina objektiva -sposobnost leće da istakne fine detalje i strukturu

- većina mikroskopa ima 3 objektiva s različitim povećanjima:malo povećanje (10x)srednje povećanje (40x) veliko povećanje (100x)

Prema načinu promatranja preparata razlikujemo 2 sistemaobjektiva:

a) SUHI sistem objektiva - za promatranje gljiva, algi, protozoa- između frontalne leće i preparata nalazi se zrak- zrak nema isti indeks refrakcije kao staklo te dolazido prelamanja svjetlosnih zraka

- malo i srednje povećanje

b) ULJNO IMERZIONI (MOKRI) sistem objektiva - za promatranje bakterija, njihovih oblika i rasporeda stanica- između preparata i frontalne leće nalazi se imerzijska tekućina (anisol,

cedrovo ulje i sl.) kojoj je indeks refrakcije blizu indeksa refrakcijestakla

- veliko povećanje



3. KONDENZOR- kondenzor se nalazi ispod stolića mikroskopa između izvora

svjetla i promatranog preparata- sastoji se od sustava leća koje sabiru svjetlosne zrake i

usmjeravaju ih prema promatranom preparatu

4. IRIS-ZASLON- služi za kontrolu intenziteta svjetla tj. za reguliranje količine svjetla koja ulazi u kondenzor


Elektronski mikroskop

- mikroskop koji upotrebljava snop elektrona kao izvor svjetlosti za dobivanje slike predmeta

- prvi elektronski mikroskop načinili su Knoll i Ruska 1931. godine→ temeljni način rada tog mikroskopa nije promijenjen ni do današnjih dana

- moć razdvajanja koja se postiže elektronskim mikroskopom za biološke pripravkeiznosi oko 0,4 nm (dok kod svjetlosnog mikroskopa iznosi “samo” 0,2 mm)


PRIPRAVA UZORAKA ZA MIKROSKOPIRANJE

SVJETLOSNIM MIKROSKOPOM


Mikroskopski preparati služe nam za promatranje morfološkihkarakteristika mikroorganizama.

Dijelimo ih u dvije kategorije:

1. NEBOJENI (NATIVNI) PREPARATI2. OBOJENI PREPARATI

1. NEBOJENI (NATIVNI) PREPARATI

- koriste se za mikroskopiranje živih, većih mikroorganizama kao što su kvasci, plijesni, alge, veće bakterije

- mikroskopiraju se pod povećanjem od 400x

Vrste nebojenih preparata: a) vlažni preparati – služi za mikroskopiranje mikroorganizama u

normalnome živom stanju, tj. oblika i rasporeda stanica

b) viseća kap – služi za pripremanje pripravaka u kojima se određuje pokretljivost bakterijskih stanica


2. OBOJENI PREPARATI

- većina mikroorganizama je bezbojna, a da bismo ih mogli istraživati svjetlosnim mikroskopom, moramo ih obojati

Obojeni preparati omogućuju:- bolje i detaljnije izučavanje mikroorganizama- bolje uočavanje pojedinih struktura (spore, st. stjenka) - razlikovanje različitih tipova mikroorganizama

- bojila za bojanje mikrobnih stanica najčešće su u obliku soli, u kojima je jedan od iona nosilac boje – kromogeni dio

- sposobnost bojila da se veže na makromolekulske komponente stanice ovisi o električnom naboju na kromogenom dijelu, a i o staničnim komponentama koje se boje

MIKROBIOLOŠKE BOJE

- budući da je najveći broj mikroorganizama gotovo bezbojan često ih moramo bojati kako bismo ih mogli istraživati standardnim svjetlosnim mikroskopom

KISELA (anionska) bojila - imaju negativan naboj i afinitet prema pozitivno nabijenim dijelovima stanice

- kiseli fuksin (crveno), eozin (crveno), eritrozin (crveno), fluorescein (žuto), nigrozin (crno)

BAZIČNA (kationska) bojila - imaju pozitivan naboj te afinitet prema negativno nabijenim dijelovima stanice

- metilensko modrilo (plava), gentiana violet(ljubičasta), karbol fuksin (crveno)


Vrste postupaka bojenja:- JEDNOSTAVNO bojanje – koristi se jedno bojilo, služi za vizualizaciju

morfološkog oblika- DIFERENCIJALNO bojanje – upotreba dvaju kontrasnih bojila:

a) izdvajanje u skupine (bojanje po Gramu)b) vizualizacija struktura (bojanje čahura, spora, bičeva, jezgre)

JEDNOSTAVNO BOJANJE – postupak:

1. Priprema preparata za bojanje- odmašćivanje stakalca- nanošenje kapljice vode- nanošenje mikrobne kulture u kap vode - ezom se nanesena kap razmaže

po površini predmetnice- sušenje na zraku- fiksiranje

2. Bojanje s jednom mikrobiološkombojom

3. Ispiranje vodom nakon bojanja4. Sušenje pomoću upijajućeg papira5. Mikroskopiranje uz kap anisola i najveće

povećanje mikroskopa

Postupak bojanja po Gramu

Bojanje bakterijskih endospora po Schaeffer – Fultonovoj metodi


Bojanje bakterijskih čahura (kapsula)



HRANJIVE PODLOGE ZA UZGOJMIKROORGANIZAMA

Hranjive podloge - služe nam za uzgoj mikroorganizama u laboratorijskimuvjetima

- svojim sastavom i karakteristikama osiguravajumikroorganizmima onakve uvjete života koje bi oniimali u prirodnim sredinama

Hranjive podloge

način primjene konzistencija

kemijski sastav


a) Hranjive podloge prema načinu primjene dijelimo:

obične podloge - služe za izolaciju i uzgoj većeg brojamikroorganizama

specijalne podloge - služe za uzgoj točno određene grupemikroorganizama

Za utvrđivanje specifičnosti koristimo selektivne i diferencijalne podloge.

SELEKTIVNE hranjive podloge – sadrže komponente koje inhibiraju rast nekih mikroorganizama te potiču rast ostalih organizama ili im ne škode

DIFERENCIJALNE hranjive podloge - omogućuju lakše razlikovanjekolonija željenog mikroorganizma od drugih kolonijakoje rastu na istoj hranjivoj podlozi

b) Hranjive podloge prema kemijskom sastavu dijelimo na:

b1) prirodne hranjive podloge - točan kemijski sastav takvih podloga nijepoznat, a priređuju se od produkata biljnog (plodovi, sokovi) iliživotinjskog (mlijeko, krvni serum, žuč) porijekla

b2) umjetne (sintetske) hranjive podloge - pripremaju se iz čistihkemijskih spojeva po određenim recepturama čije komponente mogubiti organskog ili anorganskog sastava

b3) kompleksne hranjive podloge služe za uzgoj većine heterotrofnih gljiva i bakterija. Kemijski sastav takvih podloga varira i djelomično je poznat→ komponente su im kvasni i mesni ekstrakt

Svaka hranjiva podloga mora osiguravati mikroorganizmima izvor ugljika, dušika, fosfora, aminokiselina, vitamina.


c) Hranjive podloge prema konzistenciji dijelimo na:

- tekuće- čvrste (krute)- polutekuće

-čvrstoća podloge postiže se dodavanjem agara tekućim hranjivimpodlogama

Agar - heteropolisaharid koji se dobiva iz morsih algi roda Gelidium- zagrijavanjem agara (koji je u obliku praška) na temperaturu 95-98°C on se otopi u tekućoj podlozi, a prilikom hlađenja kod temp. 40-45°C uzrokuje skrućivanje hranjive podloge

- koncentracija agara u čvrstim hranjivim podlogama je1-2%, a u polučvrstim podlogama 0,1-0,5%



Bez obzira na pripadnost pojedinoj skupini nabrojenih hranjivih podloga, svaki hranjivi supstrat mora:

• sadržavati sve hranjive sastojke koji su potrebni za rast i razmnožavanje• sadržavati dovoljnu količinu vode• imati povoljnu pH vrijednost• biti sterilan• biti prozračan


STERILIZACIJA

Sterilizacija kemijskim putem vrši se pomoću nekih kemijskih agensa(dezinficijensi, antiseptici) koji suzbijaju rast mikroorganizama(npr.bakteriostatici) ili ubijaju mikroorganizme i endospore.

- alkoholi, kiseline, halogeni, fenoli, soli teških metala, oksidirajući agensi

Sterilizacija podrazumijeva svaki proces, kemijski ili fizički, pomoćukojeg se ubijaju svi oblici života, osobito mikroorganizmi

Prema sredstvu kojim se sterilizacija provodi razlikujemo:

1) STERILIZACIJU TOPLINOM2) STERILIZACIJU FILTRACIJOM 3) STERILIZACIJU ZRAČENJEM4) STERILIZACIJU ULTRAZVUKOM


1. STERILIZACIJA TOPLINOM

- najčešći oblik sterilizacije koji je i najsigurniji i najprikladnijiA) Suha sterilizacija

a) plamenom – koristi se za sterilizaciju mikrobiološkog pribora od metala (žarenje eze),stakla (otvori epruveta radi spriječavanjakontaminacije hranjive podloge ili kulture mikroorganizama) te opaljivanje radnih površina

b) vrućim suhim zrakom - izvodi se pri temperaturi 160°C do 180°C uz trajanje1-2 sata ili pri temp. 200°C do 250°C ako se sumnja na kontaminaciju bakterijskim sporama

- vrši se u suhom sterilizatoru (Pasteurova peć)- primjena: sterilizacija metalnog i staklenog

laboratorijskog pribora- neprikldan za sterilizaciju tekućina koje isparavaju,

predmeta od gume ili sličnih materijala koji se tale ili zapale na visokoj temp

Suhi sterilizator – Pasteurova peć


B) Vlažna sterilizacija

a) sterilizacija kuhanjem (prokuhavanje u vrućoj vodi)- najjednostavniji oblik sterilizacije- rijetko se primjenjuje- spore nekih bakterija mogu preživjeti

b) sterilizacija vodenom paromb1) sterilizacija strujećom vodenom parom - odvija se u Kochovu loncu

- primjena: sterilizacija hranjivih podloga s tvarima koje nepodnose temperature iznad 100°C → za sterilizaciju svih materijala koji se mogu navlažiti i na koje zasićena vodena para ne djeluje štetno

- trajanje sterilizacije: 30 – 60 min

- jednokratna sterilizacija u Kochovu loncu ne ubija spore nekih vrsta bakterija → u tom slučaju primjenjuje se višekratna sterilizacija koja se naziva TINDALIZACIJA ili FRAKCIONA STERILIZACIJA

Materijal se nekoliko puta stavlja na sterilizaciju - npr. hranjive podloge ili neki drugi materijali se nakon sterilizacije ostave na sobnoj temperaturi ili u termostatu da bi spore mogle isklijati u vegetativni oblik, a nakon toga sterilizacija se ponovi (zbog sigurnosti i nekoliko puta).

Frakcionom sterilizacijom ili tindalizacijom uspješno se sterilizirajumaterijali koji sadrže spore aerobnih bakterija.


b3) pasterizacija

- djelotvoran način sterilizacije za većinu mezofilnih nesporulirajućih mo. koji se nalaze u mlijeku

- primjena: za sterilizaciju mlijeka i drugih napitaka- pasterizacija nije sterilizacija, ali uništava patogene i smanjuje kvarenje

reducirajući razinu nepatogenih mikroorganizama kvarenja (ne ubija spore i termorezistentne mikroorganizme)

- izvodi se na temperaturama nižim od 100°C- 2 načina pasterizacije: niska pasterizacija – 30 min na 63°C

visoka, kratkotrajna pasterizacija – 15 sec na 72°C nakon čega slijedi hlađenje

- koristi se i sterilizacija mlijeka visokom temp. (140-150°C) 1-3 sec

b2) sterilizacija strujećom vodenom parom pod tlakom -odvija se u autoklavu

- najsigurniji način sterilizacije toplinom- uništavaju se sve vrste mikroorganizama (vegetativni oblici,spore)sterilizacija se provodi u autoklavu

- trajanje sterilizacije: 15 min do 1 sat pri 1-2 atm- primjena: za sterilizaciju većine hranjivih podloga i kemikalija te predmeta od gume, porculana i običnog stakla



2) STERILIZACIJA FILTRACIJOM- primjena: za sterilizaciju tekućina koje ne podnose sterilizaciju nekim

drugim načinom jer bi im se izmjenila fizikalna i kemijskasvojstva

- postupak: tekućine se filtriraju pod tlakom kroz filtre poznate veličinepora → filter zadrži mikroorganizme, a propusti tekućinu i u njoj topljive sastojke koje želimo sačuvati

- vrste filtera: a) Chamberlandovi (porculanski) filterib) Berkefeldovi filteric) Seitzovi azbestni filterid) Membranski ili ultrafilteri


3) STERILIZACIJA ZRAČENJEM

a) ultraljubičasto zračenje (UV) - zrake valnih duljina 240-280 nm- oštećuju i zaustavljaju sintezu mikrobne DNA

- primjena: za sterilizaciju zraka u laboratoriju, operacijskim dvoranama koriste se UV lampe (kvarcne lampe)

- djeluju samo na one mikroorganizme koji su im izravno izloženi

b) ionizacijsko zračenje - elektromagnetske x-zrake i gama zrake, infracrvene zrake

- jačeg mikrobicidnog djelovanja od UV-zraka- primjena: sterilizacija kirurškog pribora, laboratorijskog plastičnog posuđa

(medicina, prehrambena i farmaceutska industrija)- infracrvene zrake zagrijavaju materijal do temperature pri kojoj dolazi do

koagulacije proteina

4) STERILIZACIJA ULTRAZVUKOM- zvučni valovi visoke frekvencije uništavaju mikroorganizme- uglavnom se koristi za razbijanje stanica i oslobađanje intracelularnih enzima, rijeđe za sterilizaciju


METODE ZA IZOLACIJU ČISTIH KULTURA


IZOLACIJA je značajna mikrobiološka tehnika kojom se izdvajaju čistekulture mikroorganizama iz mješovite populacije

- za proučavanje morfoloških i fizioloških osobinamikroorganizama, kao i njihove identifikacije, potrebno jeimati njihove čiste kulture

Pod čistom kulturom se podrazumijeva kultura mikroorganizama koje sadržesamo jedan tip stanica.


Za dobivanje čistih kultura koriste se slijedeće metode:

1. METODA RAZRIJEĐENJA2. METODA ISCRPLJENJA

1. METODA RAZRIJEĐENJA - služi za izolaciju i određivanje broja mikroorganizama

POSTUPAK:

- u seriju od npr. 6 epruveta odpipetira se 9 ml vode- u prvu se odvaže 1 g tla ili nekog drugog materijala koji se istražuje- sterilnom pipetom se odpipetira 1ml iz prve epruvete i prenese u slijedeću, isti

postupak ponovimo do kraja (do šeste epruvete) mijenjajući pipete pri promjeni razrjeđenja – na taj način dobivamo željenu seriju razrjeđenja (10-1 do 10-6)

- kad želimo odrediti broj mikroorganizama uzimamo po 1ml suspenzije iz posljednja tri razrjeđenja (10-6, 10-5, 10-4) te stavljamo u Petrijevu zdjelicu, a potom se ulijeva hranjiva podloga. Postupak se vrši u 3 ponavljanja

- Petrijevke se stavljaju u termostat na inkubaciju -- na petrijevkama izraste određen broj kolonija- nakon inkubacije određuje se prosječan broj mikroorganizama ispitivanog uzorka


- broj živih stanica datog uzorka određuje se množenjem broja izbrojanih kolonija s faktorom razrjeđenja (faktor razrjeđenja je recipročna vrijednost eksponenta razrjeđenja)- dobivena vrijednost označava se kao CFU (colony forming unites) tj.jedinice koje tvore kolonije

- broj CFU jednak je broju živih stanica samo kada jedna kolonija nastaje od jedne stanice

broj izraslih kolonijaCFU = ------------------------------- x recipročna vrijednost razrjeđenja

volumen uzorka

CFU se izračunava prema formuli:


Metoda razrijeđenja


• metoda razrijeđenja: - daje nam brojnost živih, aerobinh mikroorganizama- nije uključeno: obligatni Anaerobi

mikroaerofili- izražava se: Colony Forming Unit (CFU)/gramu ili ml

NE kao ukupne bakterije (mikroorganizmi)

Ograničenja ove metode: mogu se prebrojati samo aerobni mikroorganizminije poznata nijhova vrstapodloge nisu univerzalneljudska greškaponekad je teško razlikovati čestice hrane i kolonijekolonije mogu biti premale da se vide


2. METODA ISCRPLJENJA - brz i kvalitetan postupak koji služi samo za izolaciju mikroorganizama

POSTUPAK:- na prethodno izliven i ohlađen hranjivi supstrat u Petrijevoj zdjelici stavimo kap mikrobiološkog materijala

- materijal razvlačimo po površini čvrste podloge pomoću Pasteurove vilice ili eze, te bez ponovnog uzimanja materijala razmažemo po drugoj i trećoj Petrijevoj zdjelici.

- na taj način smanjujemo brojnost mikroorganizama i na trećoj Petrijevoj zdjelici nalazi se najmanji broj kolonija.


IDENTIFIKACIJA BAKTERIJA


- identifikacija je praktičan dio taksonomije koji svrstava izolat u određenetaksone

-do danas je klasificirano i identificirano više od 2000 vrsta bakterija

- Fischer i Muller napravili prvu klasifikaciju i sistematizaciju- 1923. izašlo prvo izdanje Bergeyeva priručnika za bakterija- tijekom godina zabilježena su sva važnija dostignuća, zabilježene nove vrste,kriterijiklasifikacije i poboljšane sheme klasifikacije

- danas priručnik sadrži 4 podvolumena, a svaki od njih prikazuje specifične skupinebakterija

Karakteristike koje se koriste u klasifikaciji i identifikaciji mikroorganizama:

1. MORFOLOŠKE KARAKTERISTIKE KOLONIJA - svaka vrsta bakterijaima karakterističan tip kolonija na hranjivoj podlozi

2. MORFOLOŠKE KARAKTERISTIKE BAKTERIJA- oblik stanice, veličina, ultrastrukture, bojanje po Gramu, pokretljivost, raspored cilija i flagela, obliki smještaj edospora, stanične inkluzije

3. FIZIOLOŠKE I BIOKEMIJSKE KARAKTERISTIKE - odnose se na prirodu i aktivnost bakterijskih enzima i transportnih proteina- neke od fizioloških i biokemijskih karakteristika koje se ispituju su:izvor C i N, sadržaj st. stjenke, izvori energije, produkti fermentacije,sekundarni metaboliti, osmotska tolerancija, osjetljivost na metaboličkeinhibitore i antibiotike, pH optimum

5. SEROLOŠKE KARAKTERISTIKE - imunološke tehnike koriste se zakomparaciju proteina različitih mikroorganizama

6. GENETIČKE I MOLEKULARNE KARAKTERISTIKE - jedan od najvažnijihpristupa taksonomiji nastao kroz: analize proteina

analize nukleinskih kiselina



Hvala na pažnji

- sva pitanja, konzultacije, nejasnoće : Katarina Huić Babić, dipl.ing.

priprema preparata za mikroskop biologija

Documents