H D B M B – 4 0 G O D I N A

HRVATSKO PRIRODOSLOVNO DRU[TVO (OSNOVANO 1885.) Mjese~nik za popularizaciju

prirodnih znanosti

Godina 106., Broj 1049

25 KUNAPriroda izlazi od 1911. godine

ISSN 0351-0662

1–2/16.

Priroda

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016. 71

S T A N I � N E K U L T U R E

Dubravka ŠVOB ŠTRAC i Branko BRDAR, Zagreb

Poku si na laboratorijskim životinjama omogu�ili su broj-na važna dostignu�a u medicini te se bez njih za sada još uvijek ne može o�ekivati zna�ajniji napredak u sprje-

�avanju, dijagnosticiranju i lije�enju bolesti ljudi. S druge stra-ne, u radu s pokusnim životinjama sve se više pažnje posve�uje eti�kim postupcima u skladu s na�elima 3R. To je skup na�ela koji obuhva�a: zamjenu korištenja pokusnih životinja metoda-ma koje ne zahtijevaju njihovu primjenu (engl. replacement,

STANI�NE KULTUREKAO ZAMJENA ISTRAŽIVANJANA POKUSNIM ŽIVOTINJAMA

Slika 1. Stani�na linija raka vrata maternice (HeLa) ko-risti se u istraživanjima od 1951. godine. HeLA stanice pod laserskim skeniraju�im mikroskopom. Flourescen-tnim proteinima ozna�eni su Golgijev aparat (naran-�asto), mikrotubuli (zeleno) i DNA (plavo) (preuzeto: ht tp://www.pixcove.com/tag/electron-microscope/

PRIRODA • SRPANJ/KOLOVOZ • 2015.72

D O G A \ A N J A

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016.72

S T A N I � N E K U L T U R E

zamjena), primjenu što manjeg broja pokusnih životinja (eng. reduction, smanjenje), poboljšavanje uvjeta uzgoja, smještaja i skrbi pokusnih životinja, kao i metoda provo�enja pokusa, te smanjenje boli i patnje laboratorijskih životinja (engl. refine-ment, poboljšanje).

Vjerojatno najve�i utjecaj na zamjenu pokusa na laboratorij-skim životinjama imala je sve šira primjena kultura tkiva i sta-nica u znanstvenim istraživanjima (sl. 1.). Povijesno gledano, u razvoju kulture tkiva i stanica postoje sljede�e faze:

(1) eksploracijska, po�etkom 20. stolje�a;(2) ekspanzivna, 1950-ih godina;(3) specijalizirana za istraživanje kontrolnih mehanizama i

diferencijacijskih funkcija i(4) tkivno inženjerstvo i embrionalne mati�ne stanice.

Po�etak ekspanzivne faze u razvoju stani�ne kulture kasnih 1950-ih i ranih 1960-ih godina obilježen je istraživanjima sa-stava hranjivih podloga, koje bi najbolje odgovarale okruženju stanica i tkiva u živom organizmu. Nedugo nakon uvo�enja definiranih teku�ih hranjivih podloga i korištenja tripsina za izolaciju stanica iz embrionalnih i zrelih tkiva , i to u sterilnim uvjetima rada, stani�na je kultura (poglavito mišje L-stanice) korištena u »Radiobiološkom laboratoriju« (voditelji Branimir Mileti� i Marija Drakuli�) Instituta Ru�er Boškovi� kao ekspe-rimentalni sustav za radiobiološka istraživanja, koja su bila dio doktorskih disertacija B. Brdara (obranjena 1963. godine) te D. Petrovi�a i A. Hana (obranjene 1964. godine).

Ovaj po�etak primjene stani�ne kulture potaknuo je u Hrvat-skoj daljnja istraživanja u nekoliko smjerova kao što su radiotera-

pija i kemoterapija tumorskih stanica, mehanizam onkogene transformacije tumorskim virusima, antivirusna kemoterapija, genska terapija tumorskih stanica i HIV-a, mehanizam stani�-nog starenja te tkivno inženjerstvo. Ste�ena su se znanja preno-sila na mla�e generacije studenata i znanstvenika ponajprije u okviru kolegija za animalnu i biljnu stani�nu kulturu na dodi-plomskom i poslijediplomskom studiju biologije i molekularne biologije Prirodoslovno-matemati�kog fakultetu Sveu�ilišta u Zagrebu, kao i u okviru razli�itih znanstveno-istraživa�kih proje-kata. Danas se kulture stanica i tkiva vrlo u�estalo primjenjuju kako u istraživanjima, tako i u nastavi na brojnim fakultetima, institutima, bolnicama i drugim ustanovama diljem Hrvatske.

Tome su prije svega doprinijele brojne prednosti metoda in vitro koje prvenstveno uklju�uju strogo kontrolirani kemijsko-fizi-kalni okoliš stanica i fiziološke uvjete pokusa, te dobro okarak-teriziranu i homogenu stani�nu populaciju, �ime se zna�ajno smanjuje varijabilnost i broj potrebnih ponavljanja pokusa. Ove tehnike imaju dodatnu prednost brzine, malih razmjera, jednostavnosti manipulacije i pohrane, te lake kvantifikacije i statisti�ke analize. Nadalje, primjena metoda in vitro može do-nijeti znatne uštede resursa, zbog brzine kojom se mogu dobiti rezultati, odnosno manjih troškova održavanja stani�nih kul-tura u usporedbi s održavanjem laboratorijskih životinja.

Zbog svega navedenog stani�ne kulture danas se široko primje-njuju kao dobri modelni sustavi za temeljna istraživanja stani�ne biologije i biokemije, genomike i proteomike, unutarstani�nih (replikacija DNA, transkripcija, sinteza proteina, transport RNA, hormona i metabolita) i me�ustani�nih (embrionska in-

Slika 2. Visokoproto�ni in vitro probir spojeva u farmaceutskoj industriji (preuzeto: http://phar-ma.bayer.com/en/ innovation-par tnering/technologies-and-trends/research-technologies/high-throughput-screening/).

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016. 73

S T A N I � N E K U L T U R E

dukcija, metaboli�ka kooperacija, kontaktna inhibicija) procesa, interakcija izme�u uzro�nika bolesti bolesti (npr. virusa) i stanica, procesa uklju�enih u starenje, razvoj tumora i sli�no. Stani�ne kulture tako�er se koriste i u brojnim primijenjenim istraživanji-ma poput toksikoloških, farmakoloških, imunoloških i prehram-benih studija, probiru i razvoju novih lijekova, proizvodnji anti-tijela i vakcina, te biotehnologiji i tkivnom inženjerstvu.

S druge strane mnogi znanstvenici isti�u da, iako su vrlo korisno oru�e u znanstvenim istraživanjima, stani�ne kulture ipak pred-stavljaju umjetne, pojednostavljene modele bez kompleksnosti �itavog organizma, te da stoga interpretacije rezultata moraju biti oprezne i potvr�ene u istraživanjima in vivo. Me�utim, �ak i kada su pokusi na životinjama neizbježni unutar cjelokupnog programa istraživanja, mogu�e je zamijeniti primjenu životinja s metodama in vitro unutar pojedinog projekta, u pojedina�nom eksperimentu, ili �ak u samo jednom tipu postupka. Naime, i tamo gdje postoji valjani animalni model, kojeg alternativne me-tode ne mogu u potpunosti zamijeniti, odre�enim istraživa�kim pitanjima može se pristupiti bez korištenja životinja.

Primjenom metoda in vitro cilj je sakupiti što više informacija o molekularnim i stani�nim mehanizmima bolesti ili u�incima lijekova, prije primjene odre�enog animalnog modela. Na pri-mjer, tvari koje se istražuju kao potencijalni lijekovi prvo se proberu na kulturama stanica, poput humanih hepatocita ili embrionalnih mati�nih stanica, kako bi se predvidjelo njihovo djelovanje, metabolizam, bioraspoloživost i toksi�nost. Visoko-proto�ni probir spojeva koji me�udjeluju s odre�enim moleku-larnim ciljevima izme�u milijuna kemijskih struktura prakti�ki

je nemogu� bez primjene testova in vitro u farmaceutskoj indu-striji (sl. 2.). Na temelju dobivenih rezultata, samo se tvari koje vrijedi dalje razvijati ispituju na pokusnim životinjama, �ime se zna�ajno smanjuje njihov broj u pokusu. Kako istraživa�i u�e o mehanizmima bolesti iz animalnih modela, uloga sustava in vitro postaje još vrjednija. Na primjer, ako je odre�eni upalni put povezan s autoimunom boleš�u u animalnom modelu (i u ljudskoj bolesti), takav model baziran na stani�noj kulturi može biti najbolji sustav za testiranje novih lijekova.

Tako�er, stanice i tkiva dobiveni iz zdravih dobrovoljaca ili pa-cijenata mogu zamijeniti primjenu laboratorijskih životinja kao izvora materijala za pokuse in vitro. Rezultati pokusa na huma-nim stanicama i tkivima vjerojatno �e biti mnogo relevantniji za zdravlje �ovjeka i procjenu sigurnosti za humanu primjenu u odnosu na one dobivene primjenom drugih vrsta. Razvoj teh-nologije induciranih pluripotentnih mati�nih stanica, kojom se stanice donora poput stanica krvi ili kože, mogu »prisiliti« na povratak u fenotip mati�nih stanica, rezultirala je u još mnogo ve�em rasponu ljudskih stanica dostupnih za istraživanje.

Postoji sve više informacija o postoje�im i potencijalnim metoda-ma in vitro zamjene laboratorijskih životinja u istraživanjima, dostupnih iz nekoliko izvora. Odabrani primjeri uklju�uju pri-mjenu genetski promijenjene humane stani�ne linije u istraživa-njima Parkinsonove bolesti, te kombinirane kulture razli�itih ti-pova stanica za prou�avanje stani�nih interakcija u progresiji karcinoma dojke. Razli�iti in vitro alternativni pristupi istražuju se s ciljem boljeg razumijevanja astme. 3D modeli tkiva huma-nog epitela kolona razvijeni su sa svrhom boljeg razumijevanja

Slika 3. Tehnologija humanog »organa na �ipu« (preuzeto: http://www.zmescience.com/medicine/organ-on-a-chip-animal-testing-04323/

PRIRODA • SRPANJ/KOLOVOZ • 2015.74

D O G A \ A N J A

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016.74

S T A N I � N E K U L T U R E

funkcija crijeva �ovjeka u zdravlju i bolesti. 3D kulture tako�er se koriste da bi se oponašao in vivo mikrookoliš tumora uklju�u-ju�i hipoksi�ne i nekroti�ne regije. Svi ovi stani�ni modeli kori-ste se tako�er i u probiru novih lijekova.

U mnogim zemljama strani�ne kulture zamijenile su testove iritacije kože i o�iju koje su se provodile na kuni�ima i zamor-cima. Razvijen je i tzv. »mikrofluidi�ki �ip« (Hurel Corporation i L’Oréal) koji može zamijeniti testiranje alergija kože na životi-njama, a koji sadržava umjetni limfni �vor u kulturi stanica povezan mikrofluidi�kim sustavom s umjetnim konstruktom kože napravljenim iz humanih stanica. Tehnologija humanog »organa na �ipu« (sl. 3.) ubrzano se razvija kao uzbudljiva nova tehnologija zamjene pokusnih životinja. Primjenjuje se na pri-mjer za modeliranje ljudskih plu�a, prou�avanje plu�nog ede-ma i testiranje potencijalnih novih lijekova.

Me�utim, unato� dosadašnjim primjetnim naporima, daljnji ubrzani razvoj novih zamjenskih metoda u kojem stani�ne kul-ture igraju zna�ajnu ulogu, a s ciljem uspostave integriranog, inovativnog i fleksibilnog pristupa istraživanjima, klju�an je za budu�i napredak znanosti kao i za dobrobit laboratorijskih ži-votinja.

Literatura 1. Baker M. Tissue models: a living system on a chip. Nature, 2011;

471(7340):661–66. 2. Dulbecco R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by

single particles of an animal virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1952; 38:747–75.

3. Eagle H., Amino acid metabolism in mammalian cell cultures. Sci-ence, 1959;130:432–43.

4. Edlinger E. J. The mammal cell as a micro-organism. J Physiol (Pa-ris), 1960;52:631–64.

5. Holliday D. L. i sur. Novel multicellular organotypic models of nor-mal and malignant breast: tools for dissecting the role of the micro-environment in breast cancer progression. Breast Cancer Res, 2009; 11(1):R.

6. Huh D. i sur. A human disease model of drug toxicity-induced pul-monary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Sci Transl Med, 2012;4(159):159ra14.

7. Morris G.E. i sur. A novel electrospun biphasic scaffold provides op-timal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication, 2014;6(3):03501.

8. Reynolds A i sur. Dynamic and differential regulation of NKCC1 by calcium and cAMP in the native human colonic epithelium. J Physi-ol, 2007;582(Pt 2):507–52.

9. Scholz D. i sur. Rapid, complete and large-scale generation of post-mitotic neurons from the human LUHMES cell line. J Neurochem, 2011;119(5):957–97.

10. Scobioala-Laker N. i sur. A novel 3D ex vivo model of native human barrett’s oesophagus. In: Digestive Disease Week/110th Annual Meet ing of the American-Gastroenterological-Association, Chica-go, 2009;136,A-596-A59.

11. Vinci M. i sur. Advances in establishment and analysis of threedi-mensional tumor spheroid-based functional assays for target valida-tion and drug evaluation. BMC Biol, 2012;10:2.

12. Xu K.P. i sur. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol Sci, 2000;58(2):306–31.

TKO SU AUTORI OVOG �LANKA?

Dr. sc. Dubravka Švob Štrac znanstvena je suradnica u Zavodu za mole-kularnu medicinu Instituta Ru�er Boškovi�, Zagreb. Bavi se istraživanji-ma molekularne podloge neuropsihijatrijskih poreme�aja kao i moleku-larnih mehanizma djelovanja neuropsihoaktivnih lijekova i tvari. Istraživanja provodi in vitro na modelima u kulturi stanica, in vivo u ani-malnim modelima te na oboljelim osobama.

Dr. sc. Branko Brdar, znanstveni savjetnik Instituta Ru�er Boškovi� (u mirovini), �lan interdisciplinarnog istraživa�kog tima koji je nedvojbeno ustanovio da je uzro�nik desetlje�ima misteriozne endemske (balkan-ske) nefropatije i s njom povezanog karcinoma bubrega karcinogen aristolohi�na kiselina – aktivna komponenta biljke Aristolochia clemati-tis (Grollman A. i sur. PNAS 104 (2007) 12129). U svojem radu koristio je stani�ne kulture za istraživanje: mehanizma onkogene transformacije Rousovim virusom sarkoma, antivirusnog djelovanja nukleozidnih ana-logona, genske terapije humanog virusa imunodeficijencije, kemotera-pije tumora mozga, strukture i funkcije mikrourokinaze i mikroplazmi-nogena te stani�nog starenja.

KAKO ]ETE POSTATI PRETPLATNIK »PRIRODE«?

1. Po{aljite nam svoju adresu obi~nom po{tom (̂ asopis Priroda, Hrvatsko prirodoslovno dru{tvo, Trg žrtava fašizma 10, 10000 Zagreb), telefo-nom (01-468-0240) ili elektroničkom po{tom (priroda hpd.hr).

2. ̂ ekajte da vam do|e prvi broj Prirode s uplatnicom. Kada je uplatite, postali ste na{ pretplatnik!

ŽELITE LI KUPITI OVAJ BROJ »PRIRODE« JAVITE NAM SE TELEFONOM (01-468-0240)

ILI ELEKTRONIČKOM POŠTOM (priroda hpd.hr). POŽURITE BROJ PRIMJERAKA JE OGRANIČEN.

ŽELITE LI PODRŽATI ČASOPIS »PRIRODA«, JEDAN OD STARIJIH ČASOPISA ZA POPULARIZACIJU

ZNANOSTI U SVIJETU, POSTANITE NAŠ PRETPLATNIK!