pristupnik: mr. sc. marko dražen mimica, dr. med. mentor: prof. dr. sc. snježana tomić, dr. med
DESCRIPTION
JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim prekanceroznim lezijama – usporedba s histološkim nalazom i HPV statusom. Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med. RAK VRATA MATERNICE. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/1.jpg)
JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJEJAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE
Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim prekanceroznim lezijama – usporedba s prekanceroznim lezijama – usporedba s
histološkim nalazom i HPV statusomhistološkim nalazom i HPV statusom
Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med.Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med.
Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.
![Page 2: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/2.jpg)
RAK VRATA MATERNICERAK VRATA MATERNICE
• godišnje 400 000 novooboljelih i 250 000 smrtnih slučajeva
• drugi po učestalosti maligni tumor kod žena
• pojavnost: - razvijene zemlje 10/100 000 (na 10. mjestu kod žena)
- zemlje u razvoju 19/100 000 (najčešći!)
- Hrvatska 13,7/100 000 (na 8. mjestu kod žena)
![Page 3: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/3.jpg)
• poremećaj stanične poremećaj stanične zrelosti i orijentacije i zrelosti i orijentacije i
nuklearne atipijenuklearne atipije
• bojenje H-Ebojenje H-E
• klasifikacija s obzirom na klasifikacija s obzirom na debljinu zahvaćenog epiteladebljinu zahvaćenog epitela
CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA (CIN)(CIN)
CIN 1CIN 1
CIN 2CIN 2
CIN 3CIN 3
![Page 4: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/4.jpg)
NEDOSTACI PATOHISTOLOŠKE KLASIFIKACIJE:NEDOSTACI PATOHISTOLOŠKE KLASIFIKACIJE:
• podložna subjektivnosti patologapodložna subjektivnosti patologa
• ne uzima u obzir dinamiku procesa (progresija, ne uzima u obzir dinamiku procesa (progresija, regresija)regresija)
• razlikovanje reaktivnih promjenarazlikovanje reaktivnih promjena
CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA (CIN)(CIN)
![Page 5: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/5.jpg)
• preinvazivne promjene i invazivni rak vrata preinvazivne promjene i invazivni rak vrata maternice su rezultat infekcije genitalnim humanim maternice su rezultat infekcije genitalnim humanim
papiloma virusompapiloma virusom
• HPV DNA se nalazi u 99,7% karcinoma vrata HPV DNA se nalazi u 99,7% karcinoma vrata maternice maternice
WalboomersWalboomers et al. et al. Human papillomavirus is a necessary cause of Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide.invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999;189:12–9.J Pathol 1999;189:12–9.
HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)
![Page 6: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/6.jpg)
• oko 40 različitih tipova humanog papiloma virusa oko 40 različitih tipova humanog papiloma virusa može inficirati spolni sustav žene može inficirati spolni sustav žene
• tipovi visokog onkogenog rizika su značajno tipovi visokog onkogenog rizika su značajno povezani s progresijom u invazivni rak vrata povezani s progresijom u invazivni rak vrata maternicematernice
• u tipove visokog rizika ubrajaju se HPV 16 i 18 i u tipove visokog rizika ubrajaju se HPV 16 i 18 i filogenetski s njima povezani tipovi: 31, 33, 35, 52, filogenetski s njima povezani tipovi: 31, 33, 35, 52, 58, odnosno 39, 45, 59, 6858, odnosno 39, 45, 59, 68
Bosch Bosch et al. et al. Prevalence of human papilPrevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a lomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. J Natl Cancer Inst 1995;87:796–802.worldwide perspective. J Natl Cancer Inst 1995;87:796–802.
Chan Chan et alet al. Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types: . Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types: uniting typing, phylogeny, and taxonomy. J Virol 1995;69:3074–83.uniting typing, phylogeny, and taxonomy. J Virol 1995;69:3074–83.
HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)
![Page 7: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/7.jpg)
HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)
• cirkularni dvolančani DNA genom od cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza7900 parova baza
![Page 8: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/8.jpg)
HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)
• cirkularni dvolančani DNA genom od cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza7900 parova baza
• 3 regije: - rana regija3 regije: - rana regija - kasna regija - kasna regija - regulatorna regija - regulatorna regija
![Page 9: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/9.jpg)
HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)
• cirkularni dvolančani DNA genom od cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza7900 parova baza
• 3 regije: - rana regija3 regije: - rana regija - kasna regija - kasna regija - regulatorna regija - regulatorna regija
• rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - transkripcijske jedinice koje kodiraju transkripcijske jedinice koje kodiraju sintezu bjelančevina važnih za virusnu sintezu bjelančevina važnih za virusnu replikacijureplikaciju
• E6 i E7 daju šifru za sintezu E6 i E7 daju šifru za sintezu onkoproteina ključnih za kontrolu onkoproteina ključnih za kontrolu staničnog ciklusastaničnog ciklusa
![Page 10: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/10.jpg)
HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)
• cirkularni dvolančani DNA genom od cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza7900 parova baza
• 3 regije: - rana regija3 regije: - rana regija - kasna regija - kasna regija - regulatorna regija - regulatorna regija
• rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - transkripcijske jedinice koje kodiraju transkripcijske jedinice koje kodiraju sintezu bjelančevina važnih za virusnu sintezu bjelančevina važnih za virusnu replikacijureplikaciju
• E6 i E7 daju šifru za sintezu E6 i E7 daju šifru za sintezu onkoproteina ključnih za kontrolu onkoproteina ključnih za kontrolu staničnog ciklusa staničnog ciklusa
• kasna regija: L1 i L2 - daju kod za kasna regija: L1 i L2 - daju kod za bjelančevine virusne kapsidebjelančevine virusne kapside
![Page 11: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/11.jpg)
HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)
• HPV stimulira proliferaciju oslobađanjem E6 i E7 onkoproteina, koji se vezuju na p53 i pRb
• vezanjem E7 bjelančevine za pRb oslobađa se transkripcijski faktor E2F i ubrzava stanična replikacija
![Page 12: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/12.jpg)
HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)
• HPV stimulira proliferaciju oslobađanjem E6 i E7 onkoproteina, koji se vezuju na p53 i pRb
• vezanjem E7 bjelančevine za pRb oslobađa se transkripcijski faktor E2F i ubrzava stanična replikacija
• hipofosforilirani pRb vezujući E2F ne dozvoljava prijelaz stanice iz G1 u S fazu i staničnu replikaciju• hiperfosforilirani pRb oslobađa E2F
![Page 13: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/13.jpg)
HPV HPV p16 p16 INK4aINK4a
fosforilacija se događa tako da se na pRb veže kompleks ciklina i ciklin ovisnih kinaza
• aktivnost ciklin ovisnih kinaza (CDK) reguliraju njihovi inhibitori – CDK inhibitori
• p16INK4a - ekspresija je regulirana negativnom povratnom spregom od strane pRb
• inaktivacija pRb preko HPV E7 negativnom povratnom spregom dovodi do pojačanja djelovanja p16INK4a biomarker ekspresije HPV onkogena u stanicama
Agoff et al. Mod Pathol. 2003;16:665-73.Wang et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004;13:1355-60.
![Page 14: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/14.jpg)
CIN CIN Ki-67 Ki-67
• životni vijek normalnih stanica cervikalnog epitela: četiri do pet dana
• u displastičnom epitelu je izmjena stanica ubrzana (CIN 3 - 12 sati)
• Ki-67 antigen je biomarker stanične proliferacije
• stupanj proliferacije cervikalnog epitela određen imunohistokemijskim bojanjem s Ki-67 protutijelom korelira sa stupnjem cervikalne displazije
Kruse et al. J Pathol 2001;193:48-54. Agoff et al. Mod Pathol. 2003;16:665-73.
Zanotti et al. Gynecol Oncol 2003;89:376-84.
![Page 15: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/15.jpg)
HPV HPV DNA DNA
onkogeni HPV tipovi
regulatorne i replikatorne promjene staničnog ciklusa
+genetska nestabilnost
DNA oštećenja aneuploidija
Hanselaar et al. DNA changes in progressive cervical intraepithelial neoplasia. Anal Cell Pathol 1992;4:315-24.
![Page 16: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/16.jpg)
CIN CIN aneuploidija aneuploidija
• aneuploidije su povezane sa skvamoznim intraepitelnim lezijama (SIL) visokog stupnja i s integracijom HPV genoma
Rihet et al. J Clin Pathol 1996;49:892-6.
• aneuploidija se javlja u visokorizičnih HPV pozitivnih skvamoznih intraepitelnih lezija, dok se u niskorizičnih HPV pozitivnih SIL i u HPV negativnih SIL ne javlja
Bollmann et al. Cancer 2003;99:57-62.
• aneuploidija je rizični čimbenik za progresiju CIN-a 1 i 2 u CIN 3
Melsheimer et al. Cytometry 2001;46:166-71.
![Page 17: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/17.jpg)
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
• patohistološka analiza cervikalne biopsije ovisi o subjektivnoj procjeni patologa i zbog toga je podložna greškama
• različiti imunohistokemijski biljezi bili su istraživani s obzirom na njihovu specifičnost da označe displastične ili neoplastične stanice
- proliferacijski antigen Ki-67 - inhibitor ciklin ovisnih kinaza p16INK4a
• aneuploidija se povezuje sa CIN-om visokog stupnja i progresijom intraepitelne lezije
![Page 18: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/18.jpg)
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
• u nijednom dosadašnjem istraživanju nije istražena moguća korist od istovremenog određivanja Ki-67, p16INK4a i DNA aneuploidije
• u većini dosadašnjih istraživanja registrirana je samo prisutnost Ki-67 pozitivnih stanica u gornje 2/3 epitela točnije je kvantitativno određivanje tih stanica u odnosu na visinu epitela
Kruse et al. Ki-67 immunoquantitation in cervical intraepithelial neoplasia (CIN): a sensitive marker for grading. J Pathol 2001;193:48-54.
![Page 19: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/19.jpg)
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
Preliminarni rezultati našeg istraživanja:
- značajne razlike u broju Ki-67 pozitivnih stanica izmeđurazličitih stupnjeva cervikalne displazije
0
10
20
30
40
50
60
70
UKUPNO/100 mikrometara
normalniCIN 1CIN 2CIN 3
![Page 20: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/20.jpg)
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
Preliminarni rezultati našeg istraživanja:
- značajne razlike u učestalosti Ki-67 pozitivnih stanica u pojedinim trećinama cervikalnog epitela kod različitih stupnjeva displazije
0102030405060708090
100
% donja trećina % srednja trećina % gornja trećina
normalniCIN 1CIN 2CIN 3
![Page 21: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/21.jpg)
2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJAMorfologija:
- normalno tkivo cerviksa- cervikalna intraepitelna neoplazija
- invazivni karcinom cerviksa
DNA ploidija
Humani papiloma virus:- niskog onkogenog rizika- visokog onkogenog rizika
Imunohistokemija:- Ki-67
- p16INK4a
![Page 22: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/22.jpg)
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
![Page 23: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/23.jpg)
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika
![Page 24: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/24.jpg)
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika
3. Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije.
![Page 25: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/25.jpg)
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika
3. Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije.
4. Utvrditi koji je nabolji pokazatelj prisustva CIN-a visokog stupnja.
![Page 26: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/26.jpg)
3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA
1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju
2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika
3. Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije.
4. Utvrditi koji je nabolji pokazatelj prisustva CIN-a visokog stupnja.
5. Utvrditi da li se istovremenim određivanjem i kombinacijom različitih biljega mogu postići točniji rezultati u dijagnostici cervikalne intraepitelne neoplazije, odnosno u razdvajanju CIN-a 1 od CIN-a 2 i CIN-a 3
![Page 27: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/27.jpg)
4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA
očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1
![Page 28: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/28.jpg)
4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA
očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1
imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa
![Page 29: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/29.jpg)
4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA
očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1
imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa
u aneuploidnim i tetraploidnim uzorcima očekujemo nalaz HPV-a visokog rizika i morfološku dijagnozu CIN-a
![Page 30: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/30.jpg)
4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA
očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1
imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa
u aneuploidnim i tetraploidnim uzorcima očekujemo nalaz HPV-a visokog rizika i morfološku dijagnozu CIN-a
kombinacija više parametara (Ki-67, p16INK4a, DNA ploidija) bi trebala imati veću osjetljivost i specifičnost u odvajanju kako cervikalnih intraepitelnih neoplazija od normalnog nalaza, tako i unutar skupine CIN-a na CIN 1, CIN 2 i CIN 3
![Page 31: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/31.jpg)
5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA
Uzorci tkiva s potvrđenom patohistološkom dijagnozom:
- CIN 1 - normalno tkivo- CIN 2- CIN 3 - karcinom cerviksa
Postupci:- grupna tipizacija na HPV visokog i niskog rizika lančanom reakcijom
polimeraze- imunohistokemijska analiza upotrebom protutijela na antigen Ki-67- imunohistokemijska analiza upotrebom protutijela na protein p16INK4a - protočna citometrija i određivanje DNA ploidije
Patolog koji vrši analizu nije upoznat kojoj skupini pripada pojedini uzorak
![Page 32: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/32.jpg)
5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA
Analizom uzoraka bojanih na Ki-67 antigen odrediti će se:- ukupan broj Ki-67 pozitivnih jezgara na 100 m bazalne
membrane- postotak Ki-67 pozitivnih jezgara u svakoj trećini epitela
Analizom na p16INK4a smatrati će se pozitivnima uzorci sa više od 5% nuklearno ili citoplazmatski obojanih stanica
Protočnom citometrijom uzorci će se razvrstati u 3 skupine: 1.diploidni 2. aneuploidni3. poliploidni
![Page 33: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/33.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.1. ISPITANICI
30 uzoraka tkiva cerviksa za svaku dijagnostičku skupinu CIN-a
Kontrolne skupine:- normalno tkivo cerviksa pacijentica operiranih zbog drugih
bolesti- uzorci tkiva invazivnog karcinoma cerviksa
Kriterij uključenja u istraživanje: patohistološka dijagnoza jasno definirana od strane patologa eksperta za ginekološku patologiju
![Page 34: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/34.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.1. HISTOLOŠKA ANALIZA
fiksacija tkiva 24 h u 4% puferiranom formalinu uklapanje u parafin rezovi debljine 4 m bojanje hemalaun-eozinom
![Page 35: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/35.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA
6.2.2.1. Bojanje na Ki-67 antigen
protutijela na ljudski Ki-67 (mišje protutijelo M7240, DAKO, Glostrup, Danska)
obojanost staničnih jezgara Ki-67 antigenom kvantitativno će se odrediti koristeći Analysis Soft Imaging System, GmbH, Muenster, Germany
u svakom uzorku izabrati će se najreprezentivnije područje (s najvećim stupnjem CIN-a) izbjegavajući tangencijalno rezana područja
![Page 36: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/36.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA
6.2.2.1. Bojanje na Ki-67 antigen
Kvantitativna analiza: - ukupan broj Ki-67 pozitivnih jezgara na 100 m bazalne membrane - postotak Ki-67 pozitivnih jezgara posebno u donjoj, srednjoj i gornjoj trećini epitela
![Page 37: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/37.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA
6.2.2.2. Bojanje na protein p16INK4a
monoklonsko protutijelo za protein p16INK4a (CINtecTM p16INK4a citology kit, DAKO, Glostrup, Danska)
imunoreaktivnost na p16INK4a:- nalaz smeđe obojanosti jezgara
i/ili citoplazmi, pri čemu će se pozitivnim nalazom smatra obojanost u više od 5% epitelnih stanica
![Page 38: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/38.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.3. HPV TIPIZACIJA LANČANOM REAKCIJOM POLIMERAZE
deparafinizacija tkivnih blokova - trostepeni postupak sa ksilolom i apsolutnim etanolom
izolacija DNA iz tkivnih blokova koristeći Nucleo Spin Tissue reagense (Machery-Nagel, Düren, Njemačka)
grupna tipizacija HPV-a u dvije posebne reakcije s dva para početnica, koristeći PCR Human Papilloma Virus Typing Set (TaKaRa, Shiga, Japan)
tipizacija na slijedeće genotipove: - 6, 11 - 16, 18, 31, 33, 52, 58
![Page 39: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/39.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.4. PROTOČNA CITOMETRIJA
suspenzija stanica tumorskog tkiva za DNA analizu protočnom citometrijom pripremiti će se modificiranom metodom Hedley-a i sur.
DNA histogrami se analiziraju u računalnom programu Modfit 3.0 (Verity Software House, Inc.).
tumori s jednim G0/G1 vrškom se klasificiraju kao diploidni tumori koji imaju i dodatni odvojeni G0/G1 vršak (s više od 10% jezgara) kao
aneuplodni tumori s tri ili više odvojena G0/G1 vrška su multiploidni
![Page 40: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/40.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.4. PROTOČNA CITOMETRIJA
stupanj aneuploidije se izražava DNA indeksom koji predstavlja omjer relativnog G0/G1 DNA sadržaja populacije uzorka i referentnih diploidnih stanica
DNA indeks diploidnih stanica iznosi 0,95-1,05
kod multiploidnih tumora koristit će se aneuploidna subpopulacija sa najvećim DNA indeksom
tetraploidni tumori su oni čiji DNA indeks iznosi 1,9-2,1
![Page 41: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/41.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.5. STATISTIČKI POSTUPCI
Statistica 7.1 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA)
χ2 test za nominalne podatke
Kolmogorov-Smirnov test za provjeru normalnosti raspodjele intervalnih vrijednosti
za intervalna mjerenja: - t-test i analiza varijance- neparametrijski testovi (Mann-Whitney U-test i Kruskal-Wallis test)
![Page 42: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/42.jpg)
6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA
6.2. POSTUPCI
6.2.5. STATISTIČKI POSTUPCI
prognostička vrijednost pojedinih varijabli u odnosu na patohistološku dijagnozu ispitati će se logističkom regresijom
značajnom će se smatrati P < 0,050
30 uzoraka tkiva u svakoj ispitivanoj skupini (CIN 1, CIN 2 i CIN 3):- razina značajnosti od 0,050 - snaga istraživanja od 90%
![Page 43: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/43.jpg)
7. ZNANSTVENI DOPRINOS7. ZNANSTVENI DOPRINOS
razlikovanje reaktivnih atipija cervikalnog epitela od cervikalnih intraepitelnih neoplazija
preciznije svrstavanje u podgrupe unutar skupine cervikalnih intraepitelnih neoplazija
![Page 44: Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061604/56815d72550346895dcb7b60/html5/thumbnails/44.jpg)
8. KLINIČKI DOPRINOS8. KLINIČKI DOPRINOS
definiranje promjena s većim rizikom progresije
u invazivni karcinom
razdvajanje blage od umjerene i
teške displazije
• klinički nadzor• kirurško liječenje