Procesamiento de muestras para

estudio inmunohistoquímic

o cromogénicoSantiago Sepúlveda

Jorge Gatica

Objetivos Conservar la inmunorreactividad de

células y tejidos Conservar la localización antigénica. No provocar interferencia con los

procedimientos inmunohistoquímica (IHQ)

Preservar la morfología del tejido

Tipos de muestras para estudio IHQ

CÉLULAS DE CULTIVO CÉLULAS EN SUSPENSIÓN FROTIS CITOLÓGICOS FROTIS SANGUÍNEOS CORTES EN CRIÓSTATO CORTES EN PARAFINA CORTES ULTRAMICRÓTOMO

Procesamiento de muestras incluidas en parafina para IHQ cromogénica

ETAPAS A CONSIDERAR: FIJACIÓN IMPREGNACIÓN / INCLUSIÓN CORTE Y MONTAJE RECUPERACION DE INMUNOREACTIVIDAD BLOQUEO DE PEROXIDASA ENDOGENA Y

REACTIVIDAD INESPECIFICA INCUBACION CON ANTICUERPOS Y SISTEMA

DE DETECCIÓN

Fijación Detener los procesos de autólisis.

Especialmente la acción de proteasas y nucleasas

Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.

Preparar al tejido para los procedimientos posteriores

Anti-microbiano

Fijación con formaldehido Fijador más utilizado Formalina neutra

10% pH 7,0 La fijación involucra una interacción con

proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes metilénicos.

Provoca enmascaramiento de antígenos (Ag.), perjudicando la inmunotinción.

Requiere de recuperación antigénica.

Aclaramiento e impregnación en parafina

Agente “aclarante” en buen estado Temperatura de las parafinas de

impregnación entre 56 -62°C. Tiempo de impregnación entre 30 –45

minutos en cada parafina.

Corte y montaje. Grosor recomendado:4 –5 µm. Montaje en portaobjetos previamente

silanizados. Evitar cortes con melladuras,

irregularidades, gruesos o desgarrados.

Recuperación de inmunoreactividad

El formaldehido y otros reactivos forman enlaces cruzados intra e inter-proteicos que enmascaran a los epítopos originando falsos negativos.

Los métodos de recuperación están designados para romper lo enlaces cruzados, desenmascarando los epítopos y aumentando la intensidad de las inmunotinciones.

Recuperación antigénica mediante calor (HIER)

El más utilizado Incubación de placas en buffer (citrato

pH 6,0 o EDTA pH 8,0) Llevar a temperatura de 90°C aprox.

con fuente de calor (sea vaporera, olla a presión o microondas) por un tiempo aprox. de 25 min.

Bloqueo de peroxidasa endógena y de reactividad inespecífica

Necesarios para resultados óptimos en IHQ cromogénica. Evitan falsos positivos.

Bloqueo de peroxidasa endógena 3% H₂O₂

NECESARIA SI SE USA HRP COMO ENZIMA EN LA REACCIÓN CROMOGÉNICA. Bloqueo de reactividad inespecífica

PBS/BSA al 2,5%.

Incubación con Ac. primario Anticuerpo (Ac.) especifico para el

antígeno a estudiar. Debe ser compatible con el sistema de

detección a utilizar posteriormente. En ocasiones, puede tener conjugado el

sistema de detección.

Demostración de reacción Ag-Ac mediante uso de enzimas

La enzima está activa Va conjugada al componente del

penúltimo paso de la inmunotinción La actividad de la enzima se revela

mediante un sustrato y un cromógeno.

Incubación con anticuerpo secundario

Reconoce al anticuerpo primario Suele estar conjugado con biotina, con

el sistema de detección o utilizarse como puente.

Sistema de amplificación Amplifica la señal de la reacción ag.-ac.

Algunos ejemplos…

Pleural based thymoma - Cytokeratin AE1/AE3 immunostain - Case 282, by Yale Rosen bajo la licencia CC BY-SA. Parámetros de contraste y brillo modificados del original.

Lymphangioleiomyomatosis (LAM) - HMB45 immunostain - Case 261,by Yael Rosen, bajo la licencia CC BY-SA 4.0. Parámetros de brillo, contraste y saturación modificados del original.