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Aplicações tecnológicas de Celulases no aproveitamento da biomassa
Luzia T.A.S.Semêdo, DSc.
IV SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE TECNOLOGIAS E TRATAMENTO DE RESÍDUOS - ECOS DE VENEZA 09 Novembro 2011 Casa da Ciência – UFRJ - RJ
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Razões ambientais
açúcares
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Evolução da produção da cana-de-açúcar etanol e cana-de açúcar
UNICA e MAPA, 2011 Projeto Pró alcool – Inicio em 1975
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Produção mundial de bioetanol combustível em 2008 Elaborado com base em RFA (2010)
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Uso da Terra no Brasil
ICONE, ESALQ e IBGE.
Área referente ao ano de 2009
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Recursos nacionais
• 44% da matriz energética do Brasil é renovável e 13,5% é derivada da cana-de-açúcar; • O Brasil gera aproximadamente 600 milhões de toneladas de resíduos agroindustriais e florestais por ano.
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Xarope rico em glicose
Biomassa
Coleta e redução de tamanho
Pré-tratamento
Hidrólise enzimática
Fermentação
Destilação
ETANOL
Leveduras
Pentoses Mecânicos Térmicos Ácidos Álcalis Oxidação
Lignina
Caldeiras
Produção de enzimas
Micro-organismos
Visão Geral do Processo
Paredes, 2011
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Biomassa lignocelulósica
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Estrutura da Biomassa
Parveen Kumar et al. 2009.
Hemicelulose
Lignina
Celulose Celulose
Hemicelulose
Lignina
Pré-tratamento
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Estrutura da celulose homopolissacarídeo de β-1,4 glicose
(forma linear)
β-1,4 Celobiose
Ghosh & Ghosh, 1993
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Níveis de organização da celulose cristalina
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Hidrólise Enzimática da Celulose
Enzimas do complexo celulásico são inibidas por celobiose e glicose
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Fermentação alcóolica
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Métodos de trabalho com celulases Fontes de
nutrientes: vantagem dos resíduos agro-
industriais
milhocina Farelo de trigo Dresh cervejeiro
Bagaço de cana de açúcar
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Discos de papel enterrados
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Meio seletivo de celulose azure 1 2 3 4 5 6 7 8 9
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Fermentações submersas (exemplo)
100mL de meio
1mL da suspensao de esporos
incubação: 4 dias, 30 C, 200 rpm
suspensão de esporos ou
pré-inóculo
300 mL de meio
Retirada de alíquotas diárias para realização de dosagens da concentração de açúcares redutores, celulases e pH
Incubação: 200 rpm, 30 C
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Medida da atividade enzimática
1. Atividade endoglucanase / CMCase
3,0 mL CMC 4%, tampão citrato de sódio, pH 4,8
+ 3,0 mL sobrenadante
50 C, até
10 min
Retirada de alíquotas a cada 2 minutos
0,5ml DNS
Dosagem da concentração de açúcares redutores
Mistura reacional
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Medida da atividade enzimática
2. Atividade exoglucanase / FPase
1,0 mL tampão citrato de sódio pH 4,8, 50mM
+ 0,5 mL sobrenadante
+
1 tira de papel de
filtro 1,0 X 6,0 cm
(~50mg)
0,5ml DNS
50 C, 60 minutos,
sob agitação
Mistura reacional
Dosagem da concentração de açúcares redutores
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1,0 mL solução de celobiose 15mM
+
1,0 mL sobrenadante
3. Atividade β-glicosidase
50 C, 30 minutos,
sob agitação
Dosagem da concentração de glicose
Medida da atividade enzimática
Kit de glicose oxidase P-nitro-fenil-glicosídeo
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Métodos analíticos
•Dosagem da concentração de proteína total solúvel (Método de Lowry et al. (1951) ou Bradford (1976)
•Dosagem da concentração de açúcares redutores (Miller, 1959)
redução de 3,5-dinitrosalicitato (de cor amarelo forte) a 3-amino-5-nitro-salicilato (de cor laranja-marrom) f
Leitura a 540nm
DNS
•Dosagem da concentração de glicose
Glicose + ½ O2 + H2O Ácido Glucónico + H2O2
2 H2O2 + 4-Aminoantotipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O
Glicose oxidase
peroxidase
Leitura a 500nm
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•Determinação da atividade específica (UI/ mg de proteína)
• Gel de atividade enzimática (zimogramas)
Gel de poliacrilamida com ou sem SDS (0,2% CMC)
130V, 1h
Incubação à 50 C, pH 4,8 durante 1h
Revelação com Vermelho do Congo
Outras análises
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Determinação do efeito da temperatura
Podem ser testadas temperaturas na faixa de 30 C a 100 C.
Determinação do efeito do pH Podem ser testados valores de pH na faixa de 3,0 a 10,0.
Estabilidade da enzima ao pH A enzima podrá ser incubada na temperatura ótima, e nos valores de pH de 3,0 a 10,0, durante um período de tempo variado, de horas até dias.
Estabilidade da enzima a íons metálicos, e outros compostos (EDTA, etc)
Termoestabilidade da enzima
A enzima poderá ser incubada no pH ótimo, e nas temperaturas de 40 C, 50 ºC , 60 ºC, etc, durante um período de tempo variado, de horas até dias.
Caracterização das celulases
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