producción de ácido fumárico por fermentación

UNIVERSIDAD DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS

TESIS DOCTORAL

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Concepción Llaguno Marchena

DIRECTOR:

José Garrido Márquez

Madrid, 2015

© Concepción Llaguno Marchena, 1959

Producción de ácido fumárico por fermentación

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

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riCC,oI LA

PRODOCOION DE ACIDO HJMARIOO FOR PERMEKI&CIOS

TESIS DOOTORAL

preeeatada por OCSfCSPCICat LLAGURO HARCHSRA.

UNIVERSIDAD COWPIUTEHSE • MADRIDFacultad de Ciencias Quitnicas

B I B L I O T E C A

N -Registre ........

DEPARZAMEHTO DE PERMERSAOZORES ZHDÜSXRIALSS PAÎROHATO JDAH DE DA OIBHVA DE INVESITGACIOR TEOHICA.

- 1.959 -

JLgrftd6sco prol'uad&B«nt« ml Dlreot«p del Inatltnto de Quisiea Aplioadm D« Mmauel IfOra T&mayc, el Interd* desoetrado a lo largo de et!ta Teals, y al Dr# D. Josd Garrido Marques, Director del D&PAmTAMBFTO DE PSE- MEÎTTACICIFS IHDUSTRIlLai, ai slaeero resono- cimiento, pues sin su aoertadm dlrsesida, su ciencia y constante estimais, as hnbier» sido posible la realisasidn de la misas. Al DEPARTAMERTO DE 73RM3HTACI0ÏÏES IHDDSTEIAL^, por su prejtaoidn de material de laboratoris, aparatos y ouanto fud aeoesario para llsvara cabo ol presents ‘Arabajoi

IH22IOE

PaginalOTKOIXJCaïOH# 1BUÏBRIAL, MBTODÛS lE TRABAJO Y AI ALISIS 6OAPIT0LO I*- Influencia de alementos tra%ap.Parte tedrioa 16Parte experimental 23CAPITULO II*- Influenoia de la ooncentracidn de fostato.Parte teorloa 37Peui'te experimental 42OAPITUXiO III,- Influenoia de loe neutrallaantea Parte teérloa 58Parte experimental 63OAPITOIfO IV,- Influenoia de la conoentraci6n de sulfato amonico y otrae aalee nitrogenadas Parte teorioa 85Patte experimental 90CAPIÜÎULO V,- Influenoia de la agitaoién y aireaoiën Peirte teorioa 114Parte experimental 122CâPIKJLO VI,- Formacién de fuaàrioo y metabolites identifioado9 por oromatografia Parte teérlca 140Parte experimental 148üOaciUSIONBS 167BÎBLIOGRAPIA X75

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UrgRQPÜCOIOT#

23. printer doldo Issaturado que se aisld oomo produote del metaboXlsmo hidrooarbosaâo de un saloroorgianlsiitô, fUé *1 dcido fumdrioo y dlcho dasoubrlalento se debe a Srllch que en 1,9X1 (19) y en cultivée de Bb,nigricons (Huocr etoloni- fer) pudo identifioarlo costo principal produc to de dégrada- cidn de la ^uoosa,

Haeta ahora y qulzd por falta de Inveetigaoldn en este sentido, loe raoboe productores de doido fui^rleo perteneoen caei exclusivamente a la fanilia de loe Mucorales y lae majorée oepae productorae al gdnero Rbieopue.

Mo obstante, y por su valor histofioo hmmoe de oitar loe trabajOB de Webmer (92) con un Aepex^llus, al oual por eue extraordinarioe rendlmientos en fimdrioo (70^ de carbohidra- to consumido) se le did el nombre de Aspergillus fumdrioue, Deepuds de diee aSos de cultivo en el laboratorio, mediante conservaoidn en tubes de «mayo, perdid la oapaoidad de trane former la glueoea en fis&àrloo y comenzd a produolr, oomo la mayorfa de loe Aspergillus, doidos oftrioo y gluodmioo. (93),

Seto es un excelente ej«bPlo de la degeneracidn o varia- cidn fieioldgica que un prolon^do almacenamiento, en coadi - ciones de laboratorio, pueden produolr en un mioroorganimmo buen productor del dcido de que se trate,

Los mioroorganismoe productores de doido fumdrioo perte—

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neoen en su gran mayorfa a la claee de loe Fioomloetoe, eub- claee Elgomioetoe, Fazallia Bbicoralea*

Bay pooos mohos, fuera de la Eanllla de loe B&tcoralee que produzcan doldo fumdiioo#

Realmente eeta propiedad de produolr doido fuadrico en cantidad apreclable, es oomdn a varios gdneros de la Faiailia Mucorales I se ha encontrado dcldo fumdrioo en oultlvos de Mu cor, Ounnin fltiamella y Olrolnella, aunque no en todas las es- peciee de estes génères (22).

(Damblén se enoontraron pequeBas oantldades de dlcho do^ do en otros géneros oomo en algunas cepas de Pénicillium gri seofulvum (63), en Aspergillus glaucus (BO), Aspergillus vum, A. oniki y A. wentii (81) y también en Caldarlomyces fu mago (13).

En el génère Idileopus, al que pertenece la oepa ueada por Erlich en sus trabajos de 1911, se enouentran algunos mloroor ganismos cuya oapaoidad para la produoelén de dcido fumdrioo a partir de sustratos hldrocarbonados varia ampllamente. Los investigadores japoneses fWcahashl y ^ikaguohl (83) divldie- ron al génère Rhlsopus, en très oategorfasia) los que forman mds aoido fumdrioo que Idotioob) loe que produo en doido Idotioo en mayor cantidad que doido

fumdrioo yo) los que forman doidos Idotioo y fumdrioo en oantldades va-

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rlabXea*Aün entre oepae productorae de dcido fumdrioo en canti-

dadee importantes, wcieten notables diferencias fieioldgioae que fueron observadas por Poster y Waksman (22) en un eetudio sobre dies cepas de Bb*nigricans.

Esta eepeclficidad de las oepae, es un hecho muy importan te a tener en cuenta eetudiando estes mloroorganismoe, porque explioa la mayor parte de las oontradiocionee y diferencias en au respuesta a la influenoia de elmaentos trasas, concentra - cidn de foefatos, etc. La especifioidad, a^^dn Poster y Waksman, va ligada al sexe de la oepa utilisada. La oepa macho - ( + ) 08 activa productora de dcido fumdrioo, mi entras que la oepa hembra ( - ) no produce ni siquiera tramas.

El dcido fumdrioo tiens interds tanto por sue aplioacio- nes industriales, oomo materia prima de pldsticos, bamicee, tintas de imprenta, etc, oomo por su papel de intermediario en el métabolisme aérobic de los hidratos de carbone, que le da, asifflismo, gran importanoia deade el punto de vieta bioqufmioo.

El trabajo presentado en esta fesis se dirige fundamen- talmente al estudio de la produccidn de doido fumdrioo y en los primeros Gapftulos, ae presentan los ensayos relaoionados con alla que pueden servir de base a su fabricacidn.

En relacidn con la produccidn de doido fumdrioo, nuestros ensayos comensaron en cultivo superficial, variando lae conoen

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traoiones de los dletlntos ocmponeatos del medio original, - empleado por J* M» Garrido (30^ en la producoidn de graeas por mohoe. Sin embargo, el cultivo sumergido es el verdaderamente aplicable en escala industrial y, como en la bibliografla consult ada no se enoontraron rendlmientos interesantes en cuanto a oantidad y duracidn del proceso, ni comparables a los obtenidos en cultivo superficial, reduciëndose segdn Poster (21) toda la informaoidn sobre cultivo sumergido a las patentee de Waksman (90), Kanç, Finlay, Amann (36) a las que deb^noe - agregar los trabaj^« de la escuela de Bemhauer (6, 7, 8, 54), nuestro estudio tuvo por finalidad fi jar las oondioiones dpti- mas del cultivo sumergido, tanto en relacidn a la ooaposicidn qufmloa del medio (oonoentraoidn de hidratos de carbono, de - sulfato amdnico, de fosfato, relacidn C/M, hierro y cine oomo elmentos trasas, etc.) oomo en lo referents a las majores eon diclones ffsioas de aireaoidn, agitaoidn, y sobre todo, por - ser un extremo Importante, la calidad y oantidad del neutralisante usado en este proceso, de tanto interds para la produo - oidn industrial del doido fumdrioo.

Esta serle de ensayos dieron por resultado un medio de - cultivo, en el que la oepa Rhizopus orysae Went y Piinsen Geer lings que utilisâmes en esta Tesis, logrd en el minime tl«&po, la mdxima oonversidn de glucosa en dcido fumdrioo, en las oondioiones propias del cultive sumergido.

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ZfOs Oapftulos I al IT, estdn dedieadoe por oonsiguient#, a detallar las sxpsrlenclas rsallsadas con distlntas ooikcen- traoiones de soifatos fdrrico y de olno, de fosfato monosddl- CO, de sulfato Gmdnlco y otzas sales nltrogenadas, asf cobio la oonoentraoidn y tlpo de los neutralisantes. ^ Capitule V se dedioa al estudio de los problemas planteados por la aireaoidn y agitaoidn del medio de cultivo.

Todos los ensayos se efeotuaron en cultivo superficial y sumergido, empleando material de laboratorio o bien en planta pilote con fermentadores de acero inoxidable de tipo indus - trial.

En el Capitule VI, después de revisar las aotuales teo- rias de formacidn de dcido fumdrioo, se llevan a oabo diverses ensayos en les que tratwaoe de poner de maaifiesto las posi - bles vias de fomacidn del dcido fumdrioo, estudiando mediante técMcas cromatogrdficas f algunos produc tos iatermedios de estos mécanismes metabdlicos.

MATERIAL, MSTODOS DE IRABAJO Y AKAltlSIS SM CULTIVO SOPBRFIQIAL Y SDMERGIPO

Morfologfa de la oepa utiligada.- Los mohoa de la familla de los Sbicorales, a que pertenece la oepa usada en los estudlos que se detallan a contlnuacldn, tlenen mlcello unloelular aunque contiene varios nilcleos, las hlfas antlguas y las hlfas portadoras de los drganos de reproduce!dn, eetdn a aenudo sep- tadas. Este mloeHo, creoe parcialmente sumergido en el medio de cultivo y cuando empieza a dlferenoiarse, produce tree tipos de hifas: los rizoidee, que dan nombre al gënero, los es— tolones, que crecen horiaontalmente y sujetan haoes de ri soldes y finalmente, los esporangioforos que crecen a i^rtir de los estdlones en el lugar en que se forman también los risoldes. Las hifas aéreas dan a estos mlcelios aspeoto blanoo al- godonoso. Las esporas, diminutas, son negras.

Ouando se oultivan en oondioiones anaerobiæ, se observan formas eeferoi dales s erne jantes a levaduras, produciéndose en estos casos alcohol etflico y 9

La reproducoién asexual tiens lugar per medio de endospo— ras formadas en los esporangios. En el génère Rhiaopus, los es porangioforoB (portadores de esporas), son caracterlsticamea- te alargados.

La reproduo ci én sexual, se vezlfica mediante zigosporas. Esto ocurre frecuentwiente en cultives de laboratorio aunque también ae observa a veoes en espeoies naturales.

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Los mucorales estàn ampllamente distrlbuldos y aparecea oMKunmente en el aire, el suelo y clertas partes de los végétales# SI géneru Bhlmopus es uno de los mds estudiados, exis— ten ceroa de 35 espeoies, todas saprofitas#

La oepa que empleamos, es la Rhizopus Oryzae Went y Pria sen Geerllgf, utllizada por Butkeulstch, precedents del Cea- traalbureau vor Schlamelcultures, de Baam (Holanda)# Es may seme jante al Rhizopus nigricans, del que difiere en esporaa- gios de mener tamaflo y la frecuente formacidn de olamidospo- ras. Orece bien entre 30-40&C, convier te fdcllmeate el alml- ddn en glucosa por hldrdllsis. Fermenta la fruotwosa, galactose nia no sa, maltosa y rafinosa en poca oantidad* Su poder para hidrolizar almiddn se emplea en la fabricacidn de aguar diente*

Se subcultiva en tubos de agar-malta (2 ^ de agar-agar y 6 # de mal ta) dispuestos en pico de flauta* i^ra provenir de- generaciones se mantienen esporas en tierra estdril*

—» 0 «*#

Composloidn del medio original *P0^Bgm.2H 0.. ...........0,018 grsAoo cc*

SO^BÎg.TH^O . . . . . . . 0,006 id.

SO^I^ ............ 0,0055 id.

S0^2n.7H^0 ......... 0,0013 id.Gl^Fe.6HgO .......... 0,0040 id.

80^(m^)g..... ..... ..... 0,20 Id.gluooaa . . . . . . . . 9,0 id.

Condioionee de cultivo.— Los mdtodoe de cultivo que se oonocen ccmo superficial y sis&ergido, tienen respectlvamente, las slguientes particularidadesi

Se entlends por cultivo superficial cuando el moho creoe sobre la superficie del medio de cultivo, desarrollstndo un micelle que cubre dicha superficie y establéee oondioiones dl- ferentes para leis oélulas superfiolaies, hifas aéreas y las oé lulas que estdn en contacto con el medio de cultive. Este tlpo de cultivo de mioroorganismos, llamado también estacionarlo, supone que el moho cresca exclusivamente en la zona superior del medio y créa por tanto, problemas de difusién de los produc toa excretados por la actividad celular, de émoesle segdn la oonoentraoidn de sales y azjjbar que llegan a oada oapa de oélulas, de transporte de oxigeno, por la reeplracién celular

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deade la atmdsfera haata laa capaa profunâaa de oélulas, etc.Los sulcrbôrganisi&os oultlvados en las oondioiones ante-

riormente desoritos, presentan también aspeoto dlferente segdn la edad, el medio de cultivo, traperatura, p&L La esporulaoién, un fendmeno que no se da en cultive sumergido, Woe oambiar el color del micelle y detiene en muohos oasos, la produccidn de ciertas sustanolas.

Los valores de las tablas oorrespondientes a oultivos su- perfioiales que apareoen en esta Tesla, resultan de les dates conjuntos de cuatro matraces, vidrlo Belgor, de 100 ce de oapaoidad, oon 25 co de medio de cultivo, oada uno.

La adicidn de agente neutralisante, que se detalla en oada caso, se haoe bien en el memento de la inoculaoidn, o a los très dfas de desarrollo, cuando el micelio oomlensa a cubrir - la superficie. Los matraces se agi tan deade entonnes, dos voces al dfa suavwaente, para poner en contacto el neutralisante con todo el medio, ya que de lo contrario, se deposits ensegui- da, en el fonde del matras. En esta suave agit%oién bay que - cuidar, no hundir ni estropear la oapa mlceliar.

Los matraces, tapados oon algodén estéril, se mantienen en una cémara estufa durante el perfodo de inoubaoién, que se seâala en oada ensayo y que varia entre 10 y 12 dlas, a una t^peratura de 34*0.Oondioiones de cultivo. sumergido. - En el cultivo simergido.

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todas las oélulas del micelio estéu en eetreoho contacto com el medio de cultivo | esto favoMoe la utiliaacidn del sustrato per que actua toda la oapaoidad enzlmdtica de la masa miceliar pro- ducida, pero crea probleoms de aireetcidn j agitaoidn que, en oa da caso, ban de resolverse para que la fermentacidn en estas oondioiones, no sea absolutamente anaerobia. El cultivo simergido tiene muchas ventajas sobre el cultivo superficial, porque mientras éste ha de verifioarse en bandejas de gran superficie y que contienen pooo volumen de medio a fermentar, condicldn necesaria para que todo el medio sufra la acoidn enzimética del micelio, en el cultivo sumergido con agitqcidn, grandes voltme- nes de medio se ponen constantemente, en contacte con las oélulas del moho y, de esta manera, pueden fermentarse oantldades mayores de sustrato en un tiempo mucho stés breve. La agitaoidn puede hacerse mediante paletas rotatories o procurando que la corriente de aire introduoida en el medio, provoque un movimleg to adeouado» Otro procedimiento consiste, en acoplar los reoipientes con el medio de cultivo, en bandejas rotatorias que im- primen movimiento circular al liquide, facilitando la aireaoidn del mismo a travée de algoddn que sirve de tapod#

Los valors presentados en las Tablas, corresponden a très tipos de reoipientess

Se utilizaron, como se detalla en oada ensayo, matraoes de vidrlo Pyrex de 500 co de oapaoidad, oon 100 cc de medio de

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cultivo t tapados con algoddn estdrll y colocados m un agitador-bandeja que ùâ 72 r.p.m. # roolplentes do vidrlo ospooial- mwÉto disoSados por nosotros (vdsuse fig 1) qi% tapados oon os- peciales tapas do vidrlo, psrgamim) o algoddn so oolocaron asi mismo en el citado agi tador-bande j a.

En planta-piloto, fermentadores de acero inoxidable, de 30 y 100 litres de oapaoidad total, que van dotados de un dispositive de agitaoidn mecdnioa y aireaoidn mediante pass de - 13T1Q. corriente de aire estdril, a rasdn de 0,25 litres de aire por minute y litre de medio.

En cultivo sumergido, la t^peratura interior de los fermentadores y del agitador-bandeja, se mantuvo en todos los casos a 34*0.

Meutraligantes♦- Un extreme Importante para la producoidn de dcido fumdrioo, se refiere al pH del medio, que ha de nan- tenerse durante todo el proceso de consume y transformacldn de glucosa, en valores comprendldos entre 4 y €«

En efecto, al comenzar la producoidn de doido, el pE des- oiende y asf inhibe la producoidn desviando el métabolisme de la glucosa e impidlendo el desarrollo normal del moho. La eleo oidn del neutralizante es de capital importanoia. Debe tener un limite de Impurezas que no influyan notablemente en la com^ posicidn dptima del medio de cultivo, no conviene que suba el pH a valores superiores a los establacidoa oomo dptimos, su

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solubllidad tlene que mer euflelemte para Ir naatralisando el doido eegdn se forma y sostraerlo de este modo a una posterior descoaposioldn, debe tener, en fin una o<mq>osioidn quEmioa que no alters oondioionmB es^bleeidas suites de adadirlo.

La influenoia de estas oondioiones en la producoidn de dcido fumdrioo y el desarrollo del moho, forman un Capitule de esta Tesis, en que hemos conseguido un tipo de neutralizante que satisface todas ellas y oon el que se han logrado sa- tisfactorlos rendlmientos.Aadlisis Quantitative del doido fumdrioo*- El doido fumdrlce se détermina cuantitativamente por el mdtodo de Hahn y Haeünaan modificado por Ame dander (59) y que consiste en una gravl- metrla del precipitado de fumarato merourioso obtenido mediante el réactive de nitrate merourioso*Andlisis cualitativo de doido fumdrioo y otros doidos présentes*- Los doidos producidos en el métabolisme del moho se de- terminan cuali ta t ivament e mediante oromatografla en papel.

Se han usado distintas tdonicas para la detexminaeidn de dcido* libres, la de Lugg y Overell )51), despuds de eliminar loe oationes por colmsnas de résinas cambiadoras de ion, Z^ro— lit 225^>Amberlita IR 120 ;>Bo%m 50. EL revelado de estes oro— matogramas se lleva a cabo con azdl de bromofenol y ouando se trata de ccmprobar la presencia de oetoacidoa se utilisa el revelado oon 2-4-dinitrofenilhidrazina ( 2 grs. de 2-4-DFHH

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en 1 litro de HCl 2H).Lob métodoe reeeSadoe en el trabajo de Wood y Bender

(98) ae emplearon asi mismo para la orma$ograffa de deidœ libres. El de Oheftel, Manier y Ma<^eboenf (16) con papel Whatmann n* 4, ascendent e, etanol-solucidn acacia de amoniaoo (d»0,880)-agua, 80-5-15 à n-butanol-aoétioo-egus, 60-15-25.

Para la especffloa determinaoîdn de cotodcidoa se «oplea— ron loe de Zwx y Garcfa-Hemdndez (46) sobre papel Whatmann n* 1, previamente tratado con buffer de fosfato 0,1 M. p5»7,3 des oendente, con etanol-agua, 83-17, en atmdafera de etanol al - 95 ÿ.

El Bamry y Thtmson (18) con n-batanol-etanol-asx>niaco 5 ÿ 70-10—20, ascendents, sobre papel Whatmann n*. 4#

Oavallini y Frtotali (12) con n^butanol-atanol-agua, 40- 10-50, descendente, sobre papel Schleider-Sohnll n* 2043.

Sykera y Prohaaka (82) con Whatmann n* 1, descendente, eter de petroleo-etanol 95^, 20-80, que permit e distingoir las 2—4-dinitrofenilhidrazonas de cetodoidos y oompuestos aldehi- diooB o cetdnioos de carde ter neutre.

Estos mdtodos de andlisis de oatodcidos suponen pre- cipitacidn previa de las oorrespondi ent es 2-4-dini trcfenilhi— drazonas.Andlisis de materia redvfôtora.- Las concentraciones iniciales y finales de sustancias reductoras en el medio de cultivo se

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deteralnan por el aétodo de Si^iaffer-Swaegfl (69)#Materia seca.- Loe raioelios en amboe tlpoe de cultivo, ee oa- lientan haeta ebullioidn con una oonoentraoidn de dcido nftri CO sttficiente paia liberar el fumdrioo que hubiera oombinado como sal odlcica. SI ftodrlco que précipita se disuelve al oa lentar# Se lavan varias veoes dlchos mioelioe con agoa callente y se filtra el medio de cultive aâadiendo las aguas de lava do. Se completan a un voldmen determinado para loe andlisis é desoritos y los mlcelios ee secan en estufa a 80*0. y después se pesan.Nitrdgeno-fonaol.- A 20 oc. de medio de cultivo neutralisados con soaa 0,1 M con Indicador de fenolftaleina, ee agregan 5 oc. de formol al 40 ^ diluîdo dos vecee y convenient «mente neutra- llzado. Ambas porclones se mezclan y se valora la acidez reeiü, tante en la reaccidn con NaCH 0,1H en presencia de fenolftalei na.

Los cc. de NaOH 0,111 gastadoe en esta segunda neutralisa- cidn, indican el ndmero N/formol y con ello la ooncentracldn en sales amonfacales del medio de cultivo.Reouperacidn.- La recuperacidn del dcido formado en los medics de cultivo, después del desarrollo del moho, se haoe con mucha facilidad. El fumarato cdHco llega a preoipitar, porque eu solubilidad es aproxlmadamente 2,5 por ciento a 30*0, y en nuestros oultivos se produce en mayores oantldades. SI dcido fu

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mdrloo es bastante insoluble (0,7 grs/lOO a 25*0) y ae sépara faoilmente al aBadir dcido olorbfdrico o nftrico que forman sales cdlcicas solubles. EL dcido libre se cristal!ma a partir de las soluoiones acuosas calientes. Funds a 288*0 y crista- lima en prismas monoolfnicos inooloros.

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O A P i m o I Parte tedzica.

imUEMCIA DE LOS mEMENTOS TRA2A3

Olertae sales metdllcas tienen gran iiBportancia en la na- tricidn de los mohos, tanta oomo los hidratos de carbono, las sales nltrogenadas o los fosfatoa. Sin embargo, son necesarias en tan pequenas oantldades que, on el lenguaje microbioldgico 80 les denomina ^elementoe trasa** y entre ellos suelen ser los major estudiados los cat1ones de Fe y Zn.

En medics sintétlcos es donde pueden observarse oon éxlto las influencias que los catlones de metalea pesados tienen en el crecimiento y desarrollo de distlntas espeoies de Fungi.Los primeros estudlos en este sentldo ee deben a Haulin (64) qua en 1869, demos trd que el Aspergillus ni gar necesitaba para 8u compléta nutricidn, ademds de las sales habitualmente su ministradas, las que apareclan en las cenizas de su propio micelio «3 declr, hierro, clnc, siliolo y posiblemente manganese.

Estas ideas de Raulin fueron refutadas posteriormente por Coupin (15), Lepierre (47), Wehmer (94), pero sirvieron entonces para estimular los estudlos de la escuela de Pf offer, quien en 1895 impresionado por las mfnimas oantldades necesarias para provooar un gran desarrollo en el crecimiento de los fUngi, com parados con los oultivos con sales standard empleadas coman — mente por los Investi^^dores de la fisiologfa de las plantas, llegd a la conclusidn de que las sales de me tales pesados eran

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activas a travée de lo que él llamé estjDsulo qujtmlco (ohemlcal stimulation). Esta idea tenfa relaoién con ol efecto estimulan te ejeroido sobre oélulas azdmales por venwws ogénicos (56) y también con el "efecto oligodinémico" que estableoe cémo ve- nenOB muy activos pueden actuar oomo estimulantes si se suai— nistran al organismo en pequeSlaimas dosis* Pfeffer suponla que al efecto estiamlante era la respuesta del organiSBK) al efecto venenoso de los me taies pesados.

Pero las ideas de Pfeffer partfan de un supuesto faleo, oreer que solamente liabfa metales pesados (Pe, Zn, Ou, etc.) en los oultivos preparados oon dichas sales y suponer libres de ellos otros cultives usados como testigos. Pero es fécil comprender que aiîn en réactives baetante pures existe un grq— do de impurezas que basta para conseguir un determinado ore— cimiento y este no era tenido an cuenta por Pfeffer )61).

Steinberg (76), Bortels (9), y Roberg (65) confirmaron las id^s de Haulin en lo referent e a las neoesidades de Zn y Fe para el desarrollo de los mohoe estudiados y hallaron que si algunos de estos dos elementos desapareofa totalmente del medio de cultivo, no se pro duc fa ningdn desarrollo. Desde 1919 Steinberg comensé a perfeccionar una téonica de purificaciéa de medics de cultivo en orden a suprimir por completo las impu rezas de oationes pesados, como ilnioo método posible para eetu diar oon certeza su verdadera influenoia respecto a su exacte—

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monte oonoclda cencentraoldn. Este método de puiificacldn consiste en calentar en autoclave durente veinte minntos a la pre sldn de una atmdsfera (120,5*0) la solucldn ooü^leta, con 15 gramos de carbonate cdlolcoy jb .

Despué8 se deja reposer durante toda una noche, se decanta para separar el sedlmento donde se han precipitado los ca— tionee pesados y el filtrado, libre por tanto de diohos oatlo- ncp se dlstrlbuye en los erlenmeyor destinados al cultivo del moho. En su estudio (T7) Indica también la utilizacldn de carbonato raagnésico y carbdn activo como agentes précipitantes de metales pesados. Sus ensayos sobre Aspergillus niger (76) con- tindan en al trabajo anteriormente citado, por la extraecidn de las esporas con élcali dilufdo ya que el plgaento negro (aspcrgllina) contiene Fe y es soluble en dloali dilufdo. Con estas precauciones y el uso de material de ouarso en algunos ensayos, Steinberg pudo refutar las ideas de Pfeffer y defi- nié la acoidn del Fe y el Zn, oomo la de cualquier neoesaric nutriente y no como un estlmulante qufmioo.

Exlsten otrae técnicas de purifioaoidn como la usoda per Molliard (55) hacîendo creoer A.niger sobre el medio a purifl— car.

Actualncnto oo considéra a loe oationes pesados solamem- te como nutrlentes, pero de su sorprendente influenoia sobre el desarrollo de los mohos, algas y otros mioroorganismos es—

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tudiadoB (35) puede deduclrse una aooidn particular y ©spaol- floa. La mcderua bioqufmlca permit© establacer relacioaes entre 68© ©fecto y su preeenoia en ©naliias y oeenalma© que ao- tdan en dlverBoe tipos de metabollsmo» Es deolr, poede supo— nerse con raadn que deben su ©xoepolonal ©fecto a la oondlcidB de blocatallzadorôs Indlreotos aotuando a travds de dlstlntas ©nzlmas* Per ©jemplo; las engimas conteniendo hlerro son entre otras las slgulentest oatalasasy peroxldaaast oltocroaOB entre las mds Importantes*Las enzlmas que oontlenen 2n, entre otras son las anbldramas oarbdnloas*

La mayorfa de los trabajos aparecidos sobre la Influenola de los elementos trazas se ban efeotuado sobre oepas de A*nl— ger (91) donde se eomprobd que el efecto del Zn no es el mis— mo Bobre diferentes oepas d© A.nlger y eugirid Incloso un më- todo de oaraoterlzaoldn de oepas basado en esta peculiar reao— tlvldad frente al Zn.

Unos de los prlmeros en ocuparse de la accldn de los elementos trazas sobre el creolmlento de los mohos del gdnero Rhiaopues, fueron Mo Hargue y Oalfes (53) que (xmprobaron el aumento del creolmlento en cultlvos de % nigricans en que se abadfa Zn asoclado a Gy Mn.

En 1936, Lockwood, Ward y May (50) ensayando oepas de Rhizopus cryzae productorae de dcido Idotloo* comprobaron asl-

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mlsmo la Influenola del Zn en la fieloXogfa de dlohae eepae*Waksman y Poster (89) fljan au atenoidn aobre loa oatio-

nes Pe y Zn y deducen de sua enaayos que el efeoto de Zn aobre el desarrollo y producoidn del ISilaopua es de tlpo netamente funclonal y oatalftloo* 21 consume de gXucosa es mda oompleto en presencla de Zn, pero en oamblo dlsminuye la produceldn de dcldo fumdrlco. For tanto, la mayor parte de la gluooaa oonau- mi da se emplea an la sfntesis de materia celular y an la produce Idn de energla* Al mlsmo tiempo apsureoe eu sus oultlvos un nuevo dcldo que parece debldo a la aooidn del Zn y que haoe pensar en una alteracldn de los procesos metabdllooa* fOdo lo anterior haoe afirmar a dlchos autores que el Zn es un oatall- zador bloldglco, el mds active entre todos los metales pesadoe ensayados, (Pe, Ou, Mb, Ma, etc*)

o21 papel del Pe en el metabollsmo de Rhizopus nigtrcans se describe por Poster y Waksman (23) oomo totalmente opueste al del Zn, slendo las oonoentraclones de gluoosa del medio de cultive, las que prdoticamente gobleman la Influenola mdtua de ambos catlones*

Las oonoentraclones de glucosa del 10 por clento son las mds favorables para observer la mdxlma respuesta a la aooidn del Zn* Oonoentraclones has ta el 20 por o lento conducen a efee- tos antagdnlcoB entre Pe y Zn, ml entres que oonoentraolones au— perloreo dan lugar a un efecto asoclatlvo*

-21

Sin embargo las expsrlenclas de Benabauer y Qiole (5) »on contradictorias respecto a las anteriores, en cuanto al efeoto del Zn para la produccidn de fumdrico por su oepa Rh* nigricans La adicidn de 0,005 grs/lOO de SO^Zn atunenta el rendlmiento en fimdrloo has ta el 41,6 por cl onto#

Bn el trabajo de I#ksch, Rauch, Mlelke—Jîiksch y Bemhauer (54) sobre la Influenola de Zn, Pe, Eïn y Ou las concentraolo- nee utillzadas son:

1 mgrAoo de SO^Zn.TH^O, 1 a 4 mgrsAOO de SO i’e.THgO y 0,3 a 1,2 îûgrsAOO de S0^Cu.5H2Û y 1 a 5 mgrsAOO de SO^Mn*

La dptima produccidn de fumdrloo (60,8 por clento) se Gonbigue oon una concentracidn de 0,6 mgrsAoO de sulfato od- prlco Bin adioidn de Zn, porque la presencia de 1 mgrAOO de sulfato de cinc rebaja el rendlmiento a 34,8 por clento. El efecto Inhlbltorlo de al tas oonoentraolones de sal de oobre (l,2mgrs* por clento) se ejeroe on ausenoia de cinc, porqne cuando se ahade sulfato de cinc en oonoentraolones de 1 mgrsAOO se amorglgua el efecto inhlbltorlo y los rendlmlentos se aie- van desde 13,1 ^ en ausenoia de Zn a 40,6 si el Zn estd presents en la concentracldn Indlcada.

Coa objeto de aportar nuevae observaciones a la Influen— cia de las sales Zn y iPe. en el desarrollo de îdiiaopus orysae •Vent et Pilnaen Geerllngs y a la obcencidn de fœoârlco en cul— tlvos de dloho mloroorgEinismo, se plantearon los ensayos de es

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ta teals que ae present an en el Capitule 1&*Las oondiolones varlan notablemente entre cultive auperfl

clal y suaergldo, advlrtlëndose en dete dltlmo la Importancia de la agltacldn y la conslgul«ite alreaoldn d el medlo de cultive.

Hemos oomprobado en nuestra ïeeia el efeoto tdxlco de allas conoentraclones de sales de Fe» y Zn., su antagonisme, la especial resistencla de nuestra cepa a altas conoentraclones de dichoe catlones y au influjo sobre la producoldn de fumdrlco.

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PARTE mimimmTAL.

Ift» serle experimentalVariaciones en le ooncentraoldn de sa] de hierro. (1) •

Bl medlo Inioial utillzado por José M* Gerrldo (30), se m difloa sustituyendo el oloruro férrico por una concentraclén équivalente de sulfate férrico (0,20 grs/lltro) mantenlendo - oonstantemente todas lag sales restantes.

cultive superficial se ensayan seis oonoentraolones dlstlntas de sulfato férrico oon objeto de fijar la concentra— oién c on vendante para la produccidn de fumérlco.

Los resultados de este ensayo se enouentran en la Tabla I. Laa oonoentraolones enseyadFs son: 0, 0,025, 0,05, 01, 0,4

y 0,8 grs./litro.A los très dlas de inoculado ae aRaden 5 gramos de carbo

nate céüco estéril por cada 100 oo. de medlo en ma traces Bel— gor de 100 oo. de capacidad oon 25 oo. de medlo de cultive.

Temperatura de Incubacién 3020.

(1) Las conoentraclones de las sales de hlerro y cinc que se utilizan. en los ensayos de este Oapltulo y siguientes, no son valores absolûtes ya que en el medlo existen trazas de dichas sales aportadas por las Impurezas de los reactivos de andlisisen oantidad impendarable.

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Oomentarlo.- S© observa quo la concantraoldn de 0,05 grs/lltro y le de 0,1 grs/lltro son las mës favorables a la producoidn de dcido fumârioo alcanzando un rendlmiento del 52 por clento sobre la gluooaa oonsuxnida* Ooncentreeiones superlores a las indicadas sèn porjudioiales, retrasan el desarrollo mlceliar y el rendlmiento desciende al 47 por oiento 0(m la oon centraoidn de 0,4 grs/lltro y a 37 por clento oon la de 0,8 gre/lltro.28. aerle experimental#- Varied ones en la concentraoldn de sal de clno#

Oon el medlo Inicial de Garrido (30) modliloado oomo se detalla en le anterior serle experimental, se ensayan en cul— tivo superficial olnco conoentraclones de sulfato de cinc, mantenlendo constantes todos los oomponentes ciel medlo base*

Las conoentraclones ensayadas son:0, 0,0035, 0,006, 0,025, 0,05, y 2,0 grs/lltro.Los resultados ae este ensayo, cuyas oondiciones expéri

mentales de temperatura, pH y adioiôn de carbonate câlloo es- téril son idéntloas a las de la primera serle experimental d© este Capitule, ae recogen en la Tabla II.

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- 27 -

Comentarlos*- La produooiÔn de doldo tuaiârloo es m&s elevads «b presenola de la mmior oantidad de sulfato de oiso, e isoluso cuando no se ahadid oino las ln^urMas de los reao ti vos utill- zados bastaron para oonseguir rmidimlentos del 49 por olmito. Esta aflrmaoidn de la presenola de ispurezas se ha o<^robado oon un medlo de eultivo purlficado segdn Steinberg (78) (cal«a- tando en autoclave el medlo cos^leto durante 15 minât os a la presidn de una a^g^sfera, oon un exceso de carbonate odllco y flltrando en oaHente) * En esta ooasldn el desarrollo del - moho fué preoario.

G on la n^xlma oono entraol dn de 2 grs/lltro no se observé desarrollo, con^robando el efecto inhlbltorlo de las altas oonoentraclones de sulfato de clno*3* * serle experimental *

Les oonoentraolones de sulfato férrioo y sulfato de olnc que resultan las mds oonvenientes para la produccidn de âôldo fumârioo segdn se deduce de las dos series expérimentales precedent es, se han utillzado en la preparacldn de un medlo de — eultivo que contlene 0,05 grsAltro de sulfato férrico y 0,0035 grs/lltro de milfato de cinc mantenlendo constante el reste de las sales que oon^onen el medlo de Garrido (30) * Dloho medlo de cultive oon les conoentraclones resefiadas de hlerro y clno, se denomina para slnqpllfloar MEDIO D*

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En la Tabla III se reoogen los remiltados de OMaparar el MEDIO D con el medlo c(^leto en el que las oonoentraelones de sulfato férrico y sulfato de olno son reapectlvamente 0,20 y 0,013 grs/lltro* Esta oos^araoldn se efeotua tante m cultive superficial como sumergldo*Oomentarlo *- En eultivo superficial el MEDIO D produce majores resultados que el medlo coc^leto sin modlfloaol&i en la oonoentracidn de hlerro y olno, denomlnado para mayor sen^ cillez mZDIO B.

En cultive sumergldo no existe notable diferenois. Los rendlmlentos son superlores en cultive superficial al ooxo* pararlos con el eultivo sumergldo que se lleva a cabo en matraces erlenmeyer de 500 oc* de capacidad oon lüO cc* de medlo* En el agitador-bandeja se oonsiguo en estos reolplentes una aireacidn precaria oomo se demuestra en los ensayos 52 y 6fi* del présente Oapltulo, al utilizer nuevo s reolp lentes (véase Fig* 1)*

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40$ eerie expérimentalVariaclones aimulténeas en las con— oentraciones de hlerro y cinc.

8# ha observado quo altas conoentraclones de sulfato férrioo y sulfato de olnc, resultan nooivaa para la produccidn de âoido fumdrico y el desarrollo del moho.

En esta aerie se ha sustituldo el sulfato férrico por sulfato férrioo aménico con 12 moléculas de egua en cantldad équivalente al medlo original (0,07 grs/lltro).

Para conocer el limite mdxino compatible con el desarrollo y en qué medlda influer en las concentre clones de ambos ca— tiones, se preparan 32 medios distintog con conoentraclones del sulfato de cinc intermedlas entre 0,05 grs./litro y 2,0 grs/lltro ya que en la Tabh II se comprobé la Inhibiolôn prove cada por esta, dltima concentracién de sal de olnc.

È1 catién férrico se anade en forma de (SO.).FeRH..124 2 4HgO en ôuatro conoentraclones distintas que son:

0,014, 0,026, 0,042 y 0,056 grs/litrc.En oada ensayo se mantlene fija una determinada concen-

traciôn de sulfato de cinc frente a 4 concrnitraclcmes dife - rentes de sulfato férrioo aménlco en eultivo superficial.

Los resultados se detallan en la Tabla IV.

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OomentarloLos majores rmidlmlentos se produoen en cada serle cuando las oonoentraolones de sulfato férzdoo aimSnloo son de 0,014 y 0,028 grs/lltro. Desolendmi los rendlmlentos al aumentar las c<mcentraolones de ambas sales y se observa un efecto favorable, en que se neutral!zan los efectos tdxlcos, cuando la ooncentracidn de sulfato de olnc es de 1,5 greyfll- tro y las de sulfato férrioo amdnlco alcanzan los valores de 0,042 y 0,056 grs/lltro.

5ft« serle exnerliwnt&lVarlaclones en la conoentraoldn de hlerro en eultivo sumergldo con nuevos reolplentes.

oultlvo sumergldo y para oomgprobar el efeoto de la aireaolfe frwite a altas oonoentraclones de sulfato férrioo, se preparan sels medios de cultive con las sigulentes oon- centraclonea de (30^)^Feg6HQ0 ;0, 0,025, 0,050, 0,1, 0,5, y 1,0 grs/lltro frente a0,006 grs/lltro de sulfato de oino.

La oaicentraoidn de sulfato amânloo debe ser de 1,5 grs/ 11 tro para cultive sumergldo como se demostrard en el slgulente Oapltulo de esta Tesia. Tamblén conviene para dloho tlpo de oultlvo que la otmoentra cl dn de sacarosa invert Ida sea del 6 por olmito. Bl pH en el medlo Imlolal es Igual a 6yla tem - peratura de Incubacldn 34^0. al tiempo de Inoculer se ahaden 4 grs. por clento de polvo de marmol estérll (carboneto odl- oloo crlstallsado).

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En este ensayo se estudian en distintos tiempos de incu— baciôn el efeoto do las conoentraclones de sulfate férrico de- tallades al prlncipio.

En la Tabla V se observa los dates obtenidos en esta aerl^ experimental empleando nuevos reolplentes que aumentan notablemente la agitacién y aireacidn del medlo de cultive (véase Flg. 1).OomentarloLos rendlmlentos se elevan al 60 por clento sobre el azdcar consumido cuando la aireacidn es apropiada slendo el tienô dptlmo de cultive el de 4 dlas.

En la serle ouyo medlo de cultive no se adiclond oon sul-fato férrico se advlerten los majores rendlmlentos en dloho tienô de eultivo, alcan§ândose el 65 por clento sobre azdcar consumido# fh eultivo sumergiao los rendlmlentos mejoran si la ooncentraclén Iniolal de azdcar es de 6 grs. por clento acor- tdndose ademds el tiempo de oultlvo.

Las conoentraclones de 0,5 y 1,0 grs/lltro son desfavora—bles para el desarrollo y oonslguientemente para la producoléa de dcido fumdrico como puede observarse en la falta de oonstt— mo de azdcar en los dates correspond! ont es a los dos dîas de Incubacldn, cuando el resto de la serle oon mener concentra - cldn de sulfato férrico lia consumido totalmente el azdcar dls- pcHoible.

Los rendlmlentos disminuên al prolonger el tiempo de

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eultivo, lo que parece indîcar un métabolisme Œâs complato al agotarse la fuonte de carbono que proporciona la glucosa.8e%ta serle experimental*- Tarlaclones en la concentracldn de cinc en oultlvo sumergldo en nuevo reclpiente.

2X1 la serle experimental anterior pudo coniprobarse que el medlo mâa favorable a la rdplda produccidn de doldo fumâ— ri 00 era pre cl sèment e equél en que solamento oxistîa sulfato de olnc en la concentraolén de 0,006 grs/lltro j que carecia por tante de hlerro adiolonado por nosotros. Esta serle experimental se prépara por tante sln adicidn de sulfato férrioo y probando en eultivo sumergldo las slgulentes ooncentraclo- nes de sulfato de olno:

C, 0,013, 0,025, 0,05 y 0,25 grs/lltro.Les oondiciones de agltacldn y aireacidn son ldénti«is

a las de la 5^* serle expérimental de este Oapltulo* Los dates obtenidos en este.s oondiciones se recogen en la Tabla VI* Oomentarlo*- En el medlo de oultlvo sin mds aporte de hlerro que el proporcionado por lus impurezas de los ac tivo s de ané- 11sis, puede observarse la Influenola de altas concentraclo - nés de clno. Estas retrasan la produccidn de âcido fujaiSrioo y no permitœi alcanzar los rendimientos conslgnados en la Tabla V cuando frente a distintas conoentraclones de sulfato férrioo ae mantlene constante la oonomitraolén de sulfato de olno de

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0,0% grs/Htre.Â los dos diâs de Incabaeidn los rendlmlentos son medio

cre s y se consome pooa azdcar, sobre todo si oos^areaos oon losresultados de la Tabla T en el mlsmo perfodo de tlesapo» Tarn -blén aquf apareee oomo période de Incubacldn ads favorable elde ouatro dlas. Oonoenti%olones superlores a 0,05 grs/lltrono son omivmilentes en oultlvo sumergldo.

Los datos aportados sobre cultive superficial (véase Tabla IX del pre smite Oapltulo) conouerdan notablemente ocm los aqul anotados de cultive sumergldo*

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Farte tedrioa.IBFmmOIA DE LA QQHQiglTRAOION DE F08FAT0

El papel del P* oomo nutriente eaenolal para organlsmoe vivo3, ha sldo reoonoolâo haoe aoichos ados* Su relacldn oon los meoanlsmoe de transporte de energla se desoahrid (mande los henaanos Snohner intentaron obtener oon fines terapéuti- 0081 proteinaa a partir de levaduras*

Harden y Young en 1905 (32) observaron que la fermenta- cldn del asdoar por extraotos de levaduras se aoeleraba gran- demente efLadlendo doldo fosfdrloo y pudlercm ooa^robar que el

Vfosfato Inorg^loo se esterlficaba con los aadoaler*Algunos de estos esteras tlenen por mlsidn fundamental el

acuBBilar la energfa résultants de la oxidacldn del carbohldra- to. Esta parece ser la funoldn principal de los ésteres fosfdricos taies fosfoenolplrdvlco, ATP, aoetllfosfato, eto.

La fosforilacldn afeota a la dlfuslôn de las sustaaclas a travée de las membranae y parades oelulares, un aspeoto - dlgno de tenerse en cuenta en los prooesos metabélloos. Tam- blén se aumenta la solubllidad en agua para los o^spueetoa que oontlenen P.

Dado que los ésteres fosférleos son todos âoldos ads fuer tes que el ortofosfato de que procédai, la lonlzaclén de estos co2Ç)uestos puede tener slgnlflcaolén en su atraooién eleo- trostdtioa para grupos cargados posltlvamente• Asl, la presen-

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cia de fosfato es probable que Imfluyan en la unldn de los ésteres fosférloos a las protelnas enslmâtloas *

Las conalderaolones energétioas sobre el papel del V en el metabollemo s<m Inawbables. El margnifloo estudlo de Llp- mann (48) abarca imohas de las Interpretaoiones que se aceptan ya Qcm> cldsicas*

por nuestra parte hemos de referimos m&& oonoretamente a las observaoiones de la Influenola que los fosfatos Inorgd- nloos ejeroen sobre el desarrollo y el metabollsmo de levadu- rasf baoterlas y sobre todo mohos*

Los mohos oonvlerten el fosfato Inorgdnlco en oospueotos orgdnloos y asl pueden utilizer la glucose y fonmr el adce- üo* Estas consldez%clone8 se desprenden de los trabajos de Vorbrodt en 1919, uno de los prlmeros que estudlé este suspecte, y mâs redmitemente en los de Semenluk (68) y Itann (52) *

Oonvlene haoer noter que existen hlpétesls contrarias al papel esenoial que se atrlbuye al P ^ la glucoUsls* Rord y MuH (57) sostlenen que en la fermentaoldn de azdcsures por Fusarla no se d^mestra la fase prevla de fosforllaoi^ y dle- Guten que ésta sea preolem en todos los prooesos de detpada- ol6n de azdcares por mioroorgaaisznos*

La Teals Doctoral de Gayet (31) comprends un detallado estudlo de las dlstlntas fonaas de aoumulaclôn de fésforo en A.nlger, V^n Tle^em, estudlando las varlaclones que en dichas

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fracciones lipldioae &a. forma a# éateres, fdmforo proteioo o nuclei CO, se producea durante el creolmlento del moho. Una con clusidn Importante es la relacldn entre la conooatraoldn Inioial de fosfato y la velooldad de oonsum) de azdcar. En medios desequillbrados respecto al fdsforo om^rueba un eaoaso oreol- mlento ml cellar y un ccmsumo lento de gldoldos en los medios hlpofosforad os, mi entras que la velooldad aumenta y existe pa- ralelamente un buen desarrollo y rndximo utlllzaoldn del nltrdgeno cuando el fdsforo se enouantra en may ores oonomitraclones.

En la produool^ de grasas por mohos se ha evidenolado tambl&i la Importanola de una adecuada conoentraoldn de fdsforo en el medlo y segdn loa estudios de Garrido, Woodbine y Walker (29| A. nldulans précisa 355 mg/ÏOO oo de medlo de fdsforo para dar rendlmiento en grasa en su mlcello del 49,8 por clento, ml entras que P. javanicum y P* i^lnolosum requleren 15,4 mg y 7,74 agrs/100 oc de medlo para consegulr, respeo tlvamen t e 23,8 por clento y 24,8 por clento #e grasa en mlcello seco.

La s l n t e s l B de grasas por P.lanosum Westlllng que estudian Porras y Garrido (62) se verlfica en las majores oondiciones cuando l a conoentraoldn de KH^P^es de 0,068 g r s / l l t r o .

ün trabajo de Lockwood, Ward y May (50) mestrsr la Influen cia del PO^HgK en la produocldn de dcido s d—Idotleo y fumdrloo por Rhizopus cryzae. Las concentracl<mes de 0,60 y 1,2 grs/lltro favorecen la producoldn de d—Idotloo que alcanza un rendl-

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alento del 59 por oiento eobre la gluooaa oonaualda. Por el contrario, la W W m a conoentraoldn utiHzada 0,15 grs/Htro consigne el mejor rendlmiento en doldo fumdrloo eon esta oepa.

Estos mlsmos autores oon P,javanloum van Beljaa (49) que produce dcido cltrlco y grasas a partir de glucosa o xllosa adopta oomo dptima la concentraoldn de PO^EgK de 0,3 grs/11— tro. Msyoree oonoentraolones daban peores resultandos an cuanto a peso de mlcello seco.

Ping Shu y Marvin Sohnson (70) oon una oepa de A. nlger estudian la mutua relaoldn existante entre loa oonstltuyentes del medio para la produccidn de dcido cltrlco en eultivo su— mergldo. Prente a los resultados de Karow y Waksman (37) que estiman como dp times las bajas oonoentraclones de fosfato, utlllzan micelles pz^eformados que reemplazan con glucosa purl- floads por oopreclpltacldn con hldrdxldo de alumlnlo y a cuyo medio adlo se aHaden cantldades exaotamente medldaa de los catlones Pe y Zn; entonoes puede comprobarse que las oonoentraclones altas de fosfato son las majores y deducen de estos resultados, adeaés de la interdependencla de las concentraclo— nés de fosfato, hlerro y oino que las bajas conoentraclones de fosfato usadas por otros autores, sdlo son oonvenientes cuando las catlones Pe y Zn estân en exoeso.

PreoisËuaente el estudlo de dloha Interdependencla de los fosfatos con sales de Pe y Zn, junto oon el tlpo de oultlvo

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que se utilize, foroan ocm el estudlo de las dptlaas oonoentraclones de fosfato para produooldn de fumdrloo, el oonteal- do de las series expérimentales del Oapltulo II de esta Tesls.

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PARTE ESPERHiarTAL*

1». serle experimental — Varlaolones ^ la conoentraelén de fosfato aonosddloo*

Oon el slgul ente medlo bâsloosSO^Mg.îHgO .....0,06 grs/lltro.SO^Kg ........ 0,06 Id.(SO^)^Peg ........... . 0.20 Id.

SO^Zn. 71^0 ..... 0,013 id.âO^(RH^)g ........ 2,0 Id.

sacarosa Invertlda .....*110,0 Id.Se ensayan dlstlntas conoentraclones de PO^a2Ra.2EgO.El pH Inlcial es igual a 6. A loa très dlas de inooula-

cldn se ahade 5 grs. por clento de carbonato odico estérll.La temperatura se mantlene a 34® y el cultive es superficial.

Las conoentraclones de fosfato monosddlco que se estudian son: 0,05, 0,09, 0,18, 0,36 y 3,6 grs/lltro.

En la Tabla VII se agrupan les resultados en las condl- oiones expérimentales descrltas a les quince y velnte dlas de incubacldn.Oomentarlo.- La conoentraoldn M s adeouada de fosfato monosd- dioo parece ser por los datos expérimentales, la de 0,18 grs/ 11 tro. El rendlmiento quo se consigne con dloha conoentraoldn (52 por ciento aobre el azdcar oonsuaddo) destaca entre dos rendlmlentos mucho mèneras oorrespondlentes a las oonowitra-

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clones reapectlvaiaente mayor y menor de 0,18 grs/litro# £ato puede Interpretarse suponlendo on equllibrlo entre las concern traciones de fosfato y el resto de les ooapcn^tes del medio de oultivo, que fljan por lo tanto la oonoentraoldn dptima de fosfato monosddico la cual no debe ser alterada para obtener buanoa rendlmlentos.

El tiei#o de oultivo os un factor importante, ya hesoe observa do que al ago tarse la faente de carbone procèdent e de la glucosa ôl nd croorganiamo continua obteniendo energla del âcido famdrioo que previamente habla acumulado* Es neoeaarlo saber con exactitud el perlodo en que termina el consume total de la glucosa para conseguir el mâximo rendimionto en fu— mdrico y no sufrir pérdidas.

En la #abl8 VII puede verse cdmo depende el oonsumo de azdcar de la conoentracidn de fosfato monosddico ya que dicbo consume es mucho menor con peque&as ooncentraoiones de fosfa— to.2*. serie experimental»- Variaclones en la concentraoidn de fosfato monosddico y sulfate de oinc*

Las concentraciones de fosfato monosddico ensayadas ante— rlormente se repi ten de nuevo pero reduoiendo la oonoentraoldn de sulfato de cine al valor de 0,0035 grs/litro. Las ocmdicio- nes de cultlvo son iddnticas a la aerie anterior porque trata— mos de probar la influencia de oinc en cultivo superficial -

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reapeoto a la oonoentraoldn de foef&to monosddico*Los dates de la 5^bla VIII se refieren a dos timnpos de

incubacldn: quince y velnte dfas.La tenperatura es de 342, el pH inicial igual a 6 y la

adicldn de carbonate cdXcico se hace como en la aerie anterior*Qomentarlo *- La concen trad dn menor de sulfato de oinc influyen en el oonsumo de aadcar que se reduce en las muestras de quince dlas coicparadas con las correspondientea de la Tabla VII* Ya que en esta îesis los rendimientos de doido fumdrlcose caloulan sobre azdear consumldo resultan mejores rendimientes a los vein te dlas de incubacldn* Pfeoisamente con una con centracidn de fosfato monosddico de 0,05 grs/Htro llega a al canzarse al 60 por clento de rendlmiento*

Il tlenpo de cultive se prolonga en esta serie respectedel anterior para alcanzar rendimientos iguales* Oon 0,lo grs/ litro de fosfato monosddico se logra un rendlmiento del 48 por oiento a los veinte dlas de cultivo que destaca tambiên entre dos valores mâs bajos y confirma la existencia de un e qui 11- brio entre el fosfato y las restantes sales del medlo*3^# série experimental*— Variaoiones en la oonoentraoldn de fosfato monosddico respecte a las de ( ^FeRE^ *12H20 ySO^Zn.THgO, en cultivo w^erfiolal.

El a^io de cultivo esté constituldo por las sales mine—

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rales cuya oonoentraoldn se Inàioa en la primera serie expe-rimaital, de este Oapltulo* TJnioamente se varlen de la formaque a oontinuaeldn se inàioa las conoentraolones de fosfato # monosddico y sulfato de hierro y oinot

Medlo A: sin adloldn de sulfato de cino*con Of 12 grs/litro de (80 ) gfeŒ^.

Medlo Bî sin adicidn de ( *IBHgOcon 0,0035 grs/litro de sulfato de oinc*

Medlo Ox con 0,12.ggrs/ll tro de ( 30^) # I2E2Ooon 0,013 grs/litro de sulfato de cine*

Medlo D: con 0,12 grs/litro de (30 )2Î*eïïH .12H20 con 0,0035 grs/litro de sulfato de oinc*

Medlo Es oon 0,48 grs/litro de (SO^)^EeNH^*12HgO con 0,0035 grs/litro de sulfato de oinc*

Las variaclones en la concentracidn de P0^IIgNa*2H20 seindioan & continuaoidn:

Medlo 1: 0,09 grs/litro de P0^H2Ka*2H20Medlo 2s 0,18 idem* idem*Medio 3: 0,36 idem* idw*Medic 4s 0,72 idem* idem*Medio 5s 7,2 idem. idem.Por temto en la nomenclatura de este ensayo se oombinan

ambas not a ci one s entendiendo que el medlo 3^ corresponde a la

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oonoentraoldn de fosfato monosddloo del medio $ (7,2 grs/litro^ a las ooncentraoiones de 0,0035 grs/litro y cero de sulfato de oinc y sulfato férrioo aodnioo re^ectivamente.

Sn la presents serie se estudia el efeoto de amboe oatio nés Bn relacidn a la concentracidn de fosfato en cultive superficial, neutralizando el medio de cultivo a los très dias de la inocul^.cidn oon 5 grs por oiento de polvo de mârmol es têril. El pH iaicial es igual a seis y la tenterature de inoubacidn se msntiene a 342 durante dies dlas que dura el — cultivo.

Los resultados de este ensayo aparecen an las figuras nd mer08 2 y 3# si end o la n®* 2 la que corre gronde al efeoto que una detenainada concentracidn de fosfato experimental frente a diverses ooncentraoiones de hierro y oinc. La Pig. n®. 3 naieatra el efeoto de distintaa conoentraciones de fosfato monosddico ante conoentraciones idénticas de hierro y cinv, con ausenola de alguno de dichos cationes.Qomentarlo.- aiguiendo el trazado de las curvas que relacio— nan una deteiminada concentracidn de fosfato monoeddico ccai lèts conoentraciones de sulfato férrico ojsdnico y sulfate de oinc, que se ensayaa, se observa en la Fig. 2 las siguientes parti culax'idade s 8

El medio 1 oon 0,09 grs/litro de P0^H2Ha*2H20, produce los menores rendimientos en dcido fumàrico y sigue la tenden-

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cia de la curva representativa del medlo 5 (7,2 grs/lltro de fosfato monosddico)•

Los restantes medics 2,3 y 4 cuyas ooncentraoiones mi fosfato monosddico son Intermedias entre los anteriormente oltados, presentan un en la produccidn de fuméricociiando el medio contiene 0,0035 grs/Htro de sulfato de oinc y no ha habido adicldn de hierro por nuestra parte*

En. le Flig* 2 que représenta la Influencia que sobre una concentracidn dada de sulfato fêrrico amdnico y sulfato de cinc las conoentraciones de rO^R2Na. 2H2O ensayadas se advier te que el oonsumo de azdcai ea total en todoe los medios que cont!enen 0,36 grs/litro de fosfato monoeddico y que el equl- librio 3?/0 neceaaric para la dptirr»a produccidn de fumârico y el Bprovechasdonto del azdear disponible en el medio, se alto ra cuando las concentracioneo de fosfato son superlores*

El medio B (sin adicidn por miestra parte de sulfato férrioo amdnico y con 0,0035 grs/litro de sulfato de oino), aloanza los valores més altos en la produccidn de ftu^rioo *Le sigue en eficaoia el medio A)(que sdlo contiene el oinc aportado por las iiz purezas y 0,12 grs/litro de sulfato férri— CO amdnico) demostrando que en cultive superficial son convenient ea bajas ooncentraoiones de dichos element os y que bastan las iqpurezas do loo réactives de andlisis para lograr aceptables rendimientos. lài altas conoentraciones de las sa-

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les apareowi edn duàa probleaas de demosle y dlfusidn ouyo eetudlo sale de loe pr<^dsitos de esta Tesls asl oomo la «- explioacldn de todos los factores infloyentes que no seen los ffiodifioados en estes enseyos#4^# serie experimentalVariaoiones en la oonomitraoidn de PO^HgNa.ZHgO en relaoiôn a las de (30^)gPeRH^el^HgO y - SO^Sn.THgO en cultivo mmer&ido en nuevo s reoipi entes.

Este serie experimental se distingue de la que la preoe de dnicamente en que se efectda en oondioiones de oultivo su mergido excpleando los nuevos reoipientes dieefiados por nosotros y cuyo esquema aparece en la figura 1 de los métodos de trabajo y anélisis*

La anotacidn de loe medios de cultivo es por tanto idénti oa ya que se han repetldo las ooncentraoiones indicadas en cada medio de cultivo.

Las condlciones de cultivo en cuanto a pH y teaqperatura son también las mismas y varia naturalmente la agitaoidn, que no existe en cultive superficial, y mayor posiLiUdad de aireacidn debîda precisamente a la agitacldn y a la forma especial de los reoipientes que %oilitan el choque con ambas pared es, la formacidn de espuma, etc.

Los resultados de este ensayo se reflejan en las figuras 4 y 5 que corresponden a la influencia del fosfato frente a distintas conoentraciones de sulfatos de hierro y oinc y la

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ns. 5 al efeoto de una determinada oonoemtraoldn de hierro y oino frente a distintas ocaicentraoicnee de fosfao aonosddi- 00 que se ensayan*ComentarioEn las figuras 4 y 5 ee advierten los sigui ente s detalles:

Las oondioiones de oultivo sumergido, laayor oontaoto entre el mioelio y el sustrato y mayor aireaciÔn, haoen bien distinto este oultivo del llamado estacionario o superficial. En este caso que se efectda oon medios de oultivo idéntioos al ensayo anterior, la obaervacidn de las ourvas correspondientes a una detenainada concentracidn de fosfato monosddico frente a dietintes conoentraciones de sulfato férrioo amdnico y sulfato de oino, nos muestra un valor mdximo para la produccidn de fumdrioo en todos los medios, oualquiere que sea su concentracidn en hierro y oinc, oorrespcaidiente a la concentracidn de fosfato monosddico de 0,72 grs/litro.

La tendenoia de la llnea correspondiente al medio 1, es tambiên notablement© paredda a la obtenida en oultivo superficial.

SI medio 4 con 0,72 grs/litro de P0^H2Na.2H20 résulta mâs favorable y confirma otra vea la existencia de un equili- brio entre la concentracidn de fosfato y el resto de las maies que se altera sensiblement© al aumentar en el medio 5.

La presencia de hierro en el medio résulta favorable en

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cultivo sumergido, c^leando los reoipientes diseUados por nosotros, de tal manera que en el medio B, las impuresas que aportasen hierro en oantidad indeterainada no bastan para oon seguir tan buenos rendimientos oomo en el medio A* La benefi- ûiosa influencia del hierro se manifiesta de nuevo en el medio 0.

En la figura ns 5 résulta que oon todas las concentra—clones ensayadas de fosfato monosddico, el medio A consigueloe majores resultados y el medio B por el contrario los va»

0lores mds exiguos. El medio C coupa una poseçidn intermedia superior al medio B que careoe de la aportacidn de hierro por nuestra parte.

Kl oonsumo de azdear refleja asimismo estas influenoias de los cationes hierro y cinc* Es mâs coa^leto el consume presencia de hierro dnicamente, el oino impide de alguna manera este oonsumo ya que en el medlo 0, con la mmo ocmcex^ traoidn de sulfato férrioo am^ico que el medlo A, tien# oino en la concentracidn de 0,013 grs/litro y el oonsumo de azdear es tambiên menor*

Las anterior es observaciones se refiermi a concentra - clones de fosfato monosddico de 0,09 grs/litro, porque con mayores conoentraciones el oonsumo de azdear es praotioamn- te conq leto y no pueden hacerse* for este no se advierten ee— tes extremos en los trabajos de Bemhauer y Thole (5) ni en

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los do Foster y Wakaman (23) quo ©n^lean slengpre oonoontra^ clones superiores (0,025 por oiento de y 0,05 poroiento de PO^HKg respeotivamente) y que por tanto, refierensus resultados dnicamente a la oonveraidn de ^luooea a fuadrico favorecida o no por el Sn, ain aclarar si el oonsumo de azdear iniolal es total o inooi3%)leto por la Acoidn del 2n*

Pare advertlr esta influencia ee precise ti'aba#* en medios de oultivo con ooncentraoiones de fosfato inferlores a 0,18 grs/litro, en cultivo sumergldo.

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oAPimo IIIESTODIO BE LA INFLOtSOIA gOfS, SOBRE LA PRODOOOION BE AOIIX) KJMARIOO Y EL BE3ARR0LL0 BEL «mO, TIMES LOS AGMTES HHJÎDRALIEAKÎES.

Parte tedrioa*Los mohos que perteneoen al génère Mucorales no desa-

rrolXan favorablemente en medios de pH dcldo y se ha ooiBpro— bado por distintos au tores que, la produocife de doldo oonai- guiente a un buen desarrollo del mobo, es impedlda cuando los BWloa de cultivo tlenen una alta ooncentraoiôn de hldroge - ni ones,

El use de agentes neutralisantes es iDgpresoindlble en la producelén de doldo fumdrlêo por mohos del génère Rhzo— pus*

Los bajos resultados obtenidos por Erlich (20) pueden atrlbulrse, entre otras cosas, a que no adicioné al medlo de oultivo ninguna oantidad de carbonate odMco que es el agente neutralizante mds oomuniaen te usado*

Sin embargo, hay que precisar en estes aspeotos de la adiolôn o no adieién de agentes neutralisantes, en la oantidad y en el tipo de agente neu^îmlizado, ya que todos estes detalles dan lugar a coaportamientoe muy distintos en ouanto a desarrollo y produccidn* (84) *

Un medio de oultivo Inicialmente alcaline, ejeroe un desfavorable efeoto sobre la germinaoldn de las esporaa de Rhizopus y por esto la Inoculaoidn no oonvlene, sagdn Waks-

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iM>Ti (90) haoerla m medio de pH aloalino* Frmite a esta observacidn nuestros ensayos en oultivo sumergldo son algo oontradictorios•

Cuando las eeporas han genainado, y se ha desarrollado un buen mioelio, oomienza la produooidn de doido fumdrioo y tiende a ha jar el pH del medlo, de manera que entcmces con— viene para mantener la produccidn adicionar un agente neutrallzante que vaya oombindndose con el doido foimado y axxB trayôndole al medio. Los dates de algunos autores (10) son may ilustrativos en este aspeoto, por ej«aploi

Cultives son sustrato hidrocarbonado neutralizados oon carbonate cdlclco dan un rendlmiento en doldo I'umdrloo sobre la glucosa oonsumida del 30 al 40 por oiento mientras que en las mismas condlciones pero sin adicionar carbonate cdlolco, el rendlmiento sdlo llega a 0,5 por ciento. Butkewistch y Fedoroff afirman en dicho trabajo citado que la mayor aoldez del medlo retrasa la produccidn y el oonsumo de azdear y que la velocidad del oonsumo se acelera en px^esencla de carbons^ to câHoo*

Pero existe tambiên la adicidn de neutrallzante en cultl* vos oon mioelio preformedo, es decir, con un micelio formado en un medio de cultivo determinado que cuando aleanza su mdximo desarrollo, se lava con ague estdni para desalojar todas las sales y product os de su anterior métabolisme y se -

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reenç)laaa (esto3 tlpos de cultivo se llaman por esto culti— vos de reemplazamiento) con otra soluciôn nutritive que, a efectoe del estudio que nos ocupa, suele ser dnicamente de con o sin agente neutralizante. El mlceUo formado ya, se conduce de otra manera ante neutralisante y asi tenemos que uns oepta de Rh•nigricans nS 45 aislada por Foster y Wakamann (22) actufindo eobi’e una solucidn de glucose al 10 ^ ain car- bona.to cdloico, produce un rendlmiento en éoido fumârioo del 22 El pH del liquide de cultivo era en esta ooaaiôn del 2,4 e incluse llegô a cristalizar en el medio el àcido libre#

Tambiên en cultivos de reemplazamlento, Butkewitsch y Pedoroff (10), observer on la misir . conducts ante el carbons- to cêloico que hemos reseîîado para oultivos iniciales y advierten uns gran diferencia de rendimientos : 20 ^ en presencia de oarbonato cdlclco y solamente el 2 ^ cuando esté aus% te y no se usa otro tipo de neutrallzante*

Encontramos en la literatura consultada el empleo de distintos neutralizantes, sêlidos y en 11quidos.

Frente a la mayor insolubilldad del carbonato cêlcico, que permits aHadirlo al medio de una vez y que 1entamente se disuelva en contacto con el êoido produoido, se observa por V/aksmann (90) que la relativa insolubilidad del fuomrato cêl- Gico formado y que provoca su rdpida orlstallzaoiên dentro del medio de cultivo hace césar completamente la oonversiên

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de azdoar en âcldo y que séria convenient© suatituir dioho carbonato por carbonato sddioo o sosa que vaya anadiéndose al oultivo conforme ae va produciendo el àcido mantenlendo el i-H entre loo dptimos valores de 5,0 y 6,5#

En este sentido el trabajo de Rauch, Miksch, Miel^»- Elsoh y Konrad Bernhauer (6) es muy sugestivo. Bmplean el carbonato addico 4K como agente neutralisante frente a un indice.dor nue puede ser rojo de metilo (que vira entre rojo y amarillo a pH 5,2) o pdrpura de bromocrCsol (de amarl- 110 a pdrpura a pH 5,3) afLadidos en el medlo de cultivo en la concentracidn de 0,01 y sin teiaor a interferenoias* De este modo se evitan las dificultades de la oristalizaoidn de fumarato célcico y por las sucosivas adioiones de carb<mato sddico 4H puede irss valorando la ooncentraoiôn en àoldo del medio. En su experioncia ^ara un cultivo que dura de 15 a 18 dlas necesitan 15 a 20 cc# de carbonato sôdico 4N que correspond en a 600-920 cc. de àcido, en este tipo de oultivo sumergldo con una cepa de Rh. Eelemar, es del 40-60 ^ de gluoosa Inicial se produce el 10-15 ^ de àcido làotico y el 10-15 de etanol.

Tambiên pueden usarse en este eentido las soluclones de hidrôxido sôdico o potésico*

Y finalmenle un aspecto importante y que hemos tenido ocasiôn de comprobeir en nues tro propi o trabajo es el que se

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ref iere a la oantidad de GOÔa ahadldo, a su grade d e pureaa y a su insolubilidad* Cuando se empl^ marmol influye tarn - bién su grado de pulverizaoidn.

Las diferenoiao observadas en todos los ensayos entre los oultivos sumergldos y suporficiales vuolvon a coigjro- barse a qui y se detallan en las experiencias que siguen, del Capltulo 111 de esta Tesis, en que se han utilizado oomo neutralizantes @1 GO^Ga amorfo, réactive de anâllsis y otro de menor pureza, adicionado al tiesô de inoculer o cuando el mioelio ya ha comenzado a fozmarse, asî como polvo de mirmol (cOÔa cristalisado) y CO^Kag 4H* La fuente de nitrôgeno es un factor interssanté en este sentido oomo hemos observado utilizando urea en los medios de oultivo*

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PARTS EKPERIMMTAL.

1». serie experlimntQl.- Adiolôn de dis tintas oantidades de OO^Ca amorfo oomo neutrallzante, en cultivo superficial*

El medio original utilizado por Garrido (30- se ha modificado 3U3tiuy«ido el oloruro fôrrico (que interfiere el mô- todo de andlisls de fumdrico empleado) por sulfato férrioo amônioo (3Û^)2feNH^*12H20) en oantidad equivelente a (0,07 gre litro) siendo la ooncentraoiôn de de 0,0035 grs/litro.

Las restantes sales del medio citado se conoervan en la oonoentr*aciôjti original.

En este ensayo observaremos cômo modi f ica el rendlmiento en àcido fumdrico la oantidad de carbonato cdlcico amôrfo anadida al medio de cultivo para mantener cl pH en los limites prooisoe para el desarrollo del mobo.

En oultivo superficial, matraces de 100 oc# de capacidad, vidrio Belgor, con 25 cc. de medio cada uno. La duraoiôn del cultive es de catorce dlas y el 00^Oa se adioiona a los cuatro dias de la inoculaciôn cuando el medio oomienza a ser àcido y existe una ligera capa mioelier en la superficie.

Las oantidades de OO^Oa abadidae sons 3, 5, 7, 8 y 12 grs/lOO cc. de medio de cultiva. La temperatura se mantlmie en 32&0. y el pK inicial es igual a 6.

Los resultados de este ensayo aparecen en la Tabla xittt-T- Oomentario.— El oonsumo de azdear y el mioelio produoido, que

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muestra el desarrollo del moho, no son afectados de manera notable por oantidades de OOÔa hasts del 12 por clento. m la Tabla IX se observa que el oonsumo de azdear es total eacœpto en el dltimo dato y que los pesos de materla seca s<m sensiblement e igualos.

En ouanto a la produccidn de àcido fuatàrico se alcanza el rendlmiento del 45 por ciento, si la concentracidn de carbonato càlclco es del 3 por oiento* Este rendlmiento va des- oendlendo parai element e al aumento de neutralizante en el medio y se reduce al 25 por clento cuando la oantidad de oarbo— nato càlclco aRadlda os de 12 gramos por oada 100 co de medlo do cultivo*28. 8prie experimental*- Influencia de la oantidad de OOÔa aSadldo como non trail zante en oultivo sumergldo, en ma traces.

Teniendo en cuanta las oantidades afiadidas en oultivo superficial, en este enseyo efectuado en ma traces pyrex de 500 cc de capacidad mantenldos en agitador-bandeja a la tem- per ituru de 3260, ensayan las conoentraciones de 2, 4, 6, y 8 grs de COÔa por oada 100 cc de medio oultivo.Jomentarlo *- Se oog^robd que oantidades de carbonato oàloioo supericroa de los 2 grs/lOO cc. inhiblan totalmente la produo Gidn de fumlrico, @1 deso>rrollo aunque precorlo se lograba. Unicamente con la concentracidn de 2 grs/lOO co* se obtenîa àcido fumàrleo. (2,4 grs/100 co* de medio).

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En los îaatraces adicionado s con 4, 6 y 8 grs de carbonate célcico por lOÜ cc. de medio, no hubo ninguna produccidn de fumàrico.

En iu£itx*aoes que contonlan el nis;:.o medio de oultivo re- Benaao i epe ciaaaiento que los anterioros, y que se mantuvieron on igualdad de condlciones poro sin adiolôn de neutralizante, aunque se produjo ur' ligaro desarrollo mlocliar no hubo ni sdn trazas de àcido fumdrico. x.sto demucstia le aflrmaci6n de que en ausenola de neutrlvantas que meuitengan en los limites adecuados el pïï, el medlo de cultivo, a lo laxgo del desarro— llo del moho, no ae produce àcido fuimlrico ni tampooo un nor- Dial desarrollo del inicroorganiamo.

Esta observaoiôn es vàlide. asi mi uio para cultivo superficial*3@. serie experimental.- Influencia de oantidades superiores a los 2 grs por ciento de carbonate célcico en cultives sumergldos en matraces*

de trata de astudiar el efeoto de oantidades de oarbonato célcico superiores a los 2 grs/lÜO. Para ello se afladexi a lo largo del perlodo do desarrollo en fracoionee suces!vas, oantidades que completen estes valores superiores, ya que la adicidn de una sôla vez hasts, de 8 grs por ciento fué objeto del ensayo preoedente.

Los matraces que siempre hemos utilizado en oultivo su-

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mergido scm de vidrio pyrex de 500 oo. de oapaoldad, oon 100 0 0. de medio de oultivo. Se adaptan a un agitador-bandeja ya deeorlto y se deearrollan durante dies dîas a la tei^eratura de 32 a.

Oon Intervalos de dos a seis dlas se afiaden a los matraoes de esta seriez 0,15, 0,75, 1,0 y 2,0 grs de oarbonato càl- cico amorfo previamente ©sterilizado, hasta eon^letar las oan# tldades de: 2,4 2,5, 3,3, y 4,0 gra* de oarbonato oàloioopor cada 100 co. de medio de oultivo.

En la Tabla % aparecen loe resultados oorreepcmdientea. Qomentarlo.— En estas condlciones es decir, cuando el oultivo sumerfrido se lleva a oabo en a^traces sobre agitador-bandeja tapados con algoddn estéril, la adicidn de carbonato célcico en oantidades superiores a los 2 grs por 100 cc. provoca un brusco descenso en la produccidn de àcido fumàrico y llega a inhlblr ésta totalmente.

Hay que hacer notar que la segunda adicidn de 2 grs de carbonato oàloioo se hlao a los seis dîas cuando los primeros 2 grs. efîadldos ya eataban disueltos. Oomo puede observarse en la Tabla X, la segunda adicidn de 2 grs. de oarbonato càlclco eupïdme la produccidn de àcido, mientras que en un matraz testlgo al que se mantuvo dnicamente con 2 grs. de carbonato càlclco amorfo aHadido a loe tree dîas de desarrollo se consiguid un rendlmiento del 12 por ciento de àcido fu

«• 68 “

igâx oo*4#» aerie ezperimwital#— afaoto qu.e produce la adiciôn al — Ineeular o a los très dlas de âesarrollo de cartonato odlcioo amorfo en oultivo sumergldo en matraces.

£îl medlo de oultivo do J. .'ûrrldo (30) modlfioado respeoto a laa concen1;raciono3 de üulfato f&rrlco y sulfate de Qlnc oomo desoribimos en la priuora 3orie experimental de este Oapltulo, varia en cuanto a lu concent rue i(5n de sulfato magnéeioo que en esta serle toma ol valui- de 0,01 grs/litro en lugar de 0,06 grs/litro del citudc mcdio de cultive.

Al pareoer el magiieslo tient un efecto acelerador en el consume cte azdcar en cultive superficial (22) • I ru evitar la répide pérdida de azdcai- y conse<fair de este modo aumentar el rendimiento, se redujo la concentraoidn de sulfate magnésieo observando ademds la influenoia que ejeroe ol carbonate câl— cico aüadldo al a© inoculai'» o cuando el laolio llevatrès dlas de desarrollo en un modio de oultivo con pH inicial igual a seic.

Los dates conseguldos ©n estas oondioiones se detaHen en la îabla XI.QomentarioLos primei'os dates de la Tabla XI corresponden a matraoes que durante très dlas se desarrollaron en un medio de oultivo sin la presencia del agente neutraliaante, oomo puede oon^robarse no se logx'a obtener dcido fuimli'ico en eeas

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condlciones y el eonsumo de asdoar es también reduaidlslmo si se coïâra con el del aatraz que durante esos très primeros dlas de desarrollo estuvo m. presencia de carbonate odX- cioo amorfo, produeiendo una cantidad apreclable de doido fumdrico.

don ésto se comprueba una vea M s que sin agente neutxa lizante no se produce fumdrloo en cultive somcrgido, y que en très dlas puede alcanaars© un rendimlento del 11 por olento si se adiciona el neutralizante en cantidad ddecoada. Eo- tos rendimlentos han sido ampliamento superados utllizando otro reoipiente dlseBado especiaimente con este objeto, (vêa se Pig. 1)•

vê el mol 10 metaboliza el azdcar disponible en todos loa casos, es evident© 3 por tante se produoen otroe coapuestos derivados de la degradaoiôn el carbohidrato que han podido coi25)robarse mediant© croma tografla en papal y que se deta - llan en la segunda part© de esta Teeis/Cbj^ \f| ]

Los resultados Je la. tabla XI evidencion la marcha del pi'oceso metabdlico y aunûe se haya aumentado el tieô de oultivo, sdlo 8t consigne reducir con elle los rmidlmlentoe ya que en un medio de .ptovisto de azdcar el fumdrico es me- tabolizado por el microorganismo*

Los rendimlentos que no exceden del 20 poi ciento son debidos a le ialta de c.:d©cu.ada aireacldn oomo se ha obscr-

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vado sienpro en el oultivo sumergido en matraoes•serie experimental.— OoBg>aracidn de dos tipos de carbo-

nato câloioo amorfo de distiata pureza qulmlca*jjn la tcrceiYi serie experimental de este Oapîtulo, ob—

servamoo cdmo oantidades de earbonato odlcico super!ores a los 2 gre. per oiento, iniiiblan la produccidn de doido fuM rioo "cotaiment 6.

juponiondo que ol oarbonato cdlclco aporta al medio de oultivo una exceaiva cantidad de inQ>urezas, utilizamos para comprobarlo con este enaayo oomo téiToaino de comparaoidn, oan tidades igu{ las do carbonate câlcioo Merok, reaotivo do and— lisis, lorTftEndo do3 series simultdneas que con el medio de oultivo habitual se diferencian por la adicidn al ties^o de inoculai* de 2 grs. por ci en üo de carbonate câlcioo Merck en un caso y en la otra jei*i© ue la mlsma cantidad de carbonate câlcico reaotivo de anélisis de mener pureza*

hn estos medics de cultive en que se mantienen las oon- oentracionos de todas las sales que integran el medio de Ga— rrido, no se diciona ni sulfato férrlco ni sulfate de oinc— con objotü de comprobar la influenoia de los elementos tra - zas que se Inoorporan con el neutralizante.

Lob datos de la Tabla XII permiten observar la influa— cia de amba© calidadss de carbcaiato oâlcico en oultivo eumer- gido. Las condioiones de oultivo sumergido r^etldamente des-

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~ 73 ~

cri tas son: matraoes vidrio Pyrex de 500 co. an agitador- bande ja a 72 r.r.m. tes^ratura 34® pH iniolal 6. La dura— oidn total del cultive es de veinte dlas tooando muestraacada cuatro dlas.Qomentarioün los datos de la Tabla XII se observa un oon tinuo eumento de la produc oidn de fuMrico en las mue stras su cesivae. 11 consume de azdcar es muy râpido y en los datos oo rrespondientes a cuatro dlas de incubaoidn, se advierte que el consume es mâa oongîleto en la serie neutralizada con car- bona/t'o cdlcico de mener puî*eza»

Ya que los majores rend ind ente s no ao obtienen con el producto Merck, puede suponorse que laa iapurezas aportadas al medio de oultivo por el neutralizanüe xavorecen el desarro lie del mloroorganlsao y la pioduooidn de àoldo*6*. serie experimental.- Ap3âcaüi6n del polvo de marmol {carbonate câloioo oris'Galizado) oomo neutralisante*

En las series anteriores que se refieren a oultivo su— mergido, oomprobamos las ventajas y de&ventajas del eag>leo en nuestros msdios do oultivo de carbonate câloioo aa^rfo con pureaa qulmica inferior a la del producto Merck.

En este ensayo aplicamoa coiao neutralizante polvo de marmol fin amante dividido.

de em^lean mtraces de vidrio lyrex en las oondiciones Jaabituales de oultivo sumergido y a üescrito.

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- 75 ~

El medio de oultivo de Garrido se modifioa reapeoto a las conoentraoiones de hierro y olnc que son 0,07 grs/litro de sulfato féridco amônlco y 0,00)5 grs/litro de sulfato de cino.

A les dos àfc3 de Inoubacidn se aîiade e oada pareja de Eoatiacos las siguientes oantidades de polvo de mérmol esté- ril: 2,0, 2,5, 3,C, 4,0 y 5,0 grs/100 oo. de medio.Qomentario.- A los dies dfan de oultivo el consume de azdcar invortido fué comploto en todos les casos.

î21 randimlcnto en âcido fumfrlco calculado sobre azdoar coneuiBldo aloansa el valor medio de 23 por ciento.

3ü pudo oomprober ein embargo un extreme muy interesan- te pai-n la apllopcldn oomo neutralizante del polvo de i Lriaol, porque adi! on cantidades del 5 por ciento no inhibla el - desarrollo oomo en las mismas oondiciones suoede oon el carbonate câlcico amorfo. Todavîa no consegulmos aumentar los rendl:leatos de cultive sumergido a los vslores aXoanzados en oultivo superficial, pero este nuevo tipo de neutralizante — reune las caractorîfjtioas de purega sufidente y mayor einao- lubilidau y reactividad que le hacen particularmente apte para su use en oultivo sumergido. Otra von ta j a muy digna de ten erse en cuenta dosde el punto de vis ta industrial es la baraturu del polvo de mdrmol y su fdcil zoanipulaoldn petra - aîîadirlo a grandes fenaentadores, etc.

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7®. eerie experlg^ntaX.— Bstudio de Is Influenoia del neix— trallzante (polvo de mârmol o oarbonato sddloo 4H), respec- to al tiesq>o y a la fuente de nitrdgeno en oultivo superficial.

El medio de oultivo eiopleado on. este ensayo es el si— gulentes

P0âgNa.2B20 0,18 grs/Htro.SO^Mg.YHgO 0,06 Id.SOÊg 0,06 id.(S0^)2EeNH^.12E20 0,12 Id.SOÎn.THaO 0,0035 Id.saoaroea inverti daneutralizada .........130,00 Id.

Las fuentes de nitrdgeno ensayadas en esta serie sons nitrato amdnico y urea en oantidades équivalentes a la con— centraoidn de sulfato am&aioo que figura en el medio original.

Una eerie de matraoes de 100 oo de capaoldad con 25 oo de medio cada imo, se neutralisa a los tres dlas de la Inoou- lacidn oon polvo de mdrmol (OOÔa oristalizado) estérll a rasdn de 5 grs por cada 100 oo de medio. Otra serie idéntloa se neutrallza diarlamente oon la cantidad de G0â24N précisa para mantener el pH en los limites adeouados (entre 5 y 6). Este pH dptimo se evldencia por el indicador rojo de metilo (6). Pinalmente una teroera serie se mantiene oomo testigo sin

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adiciôn de neutralizante durante todo el preeeeo #La temperature es de 32®C« Tieopo de incubacidn di«s

dlas tommdo muestras (dos matraoes que se analizan oon junta mente) cada dos dlas de cada una de las series descri tas.

Los resultados del ensayo oon nitrato asdnioo oomo fuen te de nitrdgmo se miestran en la Tabla XIII oorrespondlendo los datos a matraoes que se analizan antes de afiadir nlngdn neutralizante, esto es a los tres dlas de oultivo.

Ândlc^^mante los datos de la Tabla XIV oorresponden al medio de oultivo o<m urea, en sustituoi&i del sulfato amônl- 00 •

La notaeito engpleada en diobas Tablas consiste eni Medlos lA, 2a y 3A correspondientes al ensayo con nitra

te amônico pero neutralizados con, respeotlvamente%El nfi 1 oon polvo de mârmol estéril*El nfi 2 con carbonate sôdloo 4 normal, usando rojo de

metiâo oomo indicador.El ns 3 signifloa la serie mantenlda sin adicién de nin-

gdn tipo de neutralizante.Del ficLsmo moào la notaoiôn IB, 2B y 3B que aparece en la

Tabla XIV signifioa medics de oultivo oon urea y neutralizados oon polvo de mârmol, OO^Eag 4N o sin neu trail zar.Qomentario.- Los valores de la Tabla XIII que corresponde a

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medlos con nitrato aaénloo en sustitucidn del sulfato asadni—00, muestran los rendimlentos m&e elevados ouando se neu trail zan oon polvo de mdrmol estéril* La neutralizaoidn con GO^Rag 4N en presenoia de un indloador oomo rojo de metilo, no résulta muy eficaz y solamente a los ooho dlas de oultivo puede logrars© un mediocre rendimiento (15 por ciento) • El consume de azdcar es reduoido en la serie sin neutrallzar*Esto révéla que para poderse efectuar con^letamonte, necesi- ta la presencia de un neutralizante y que la clase de éste es un extreme importante, ya que la neu trail zacidn pauletina oon 0 0 4N adioionado siempro que el indloador mostraba un pH âoido, no bas ta para mantener el pH en oondiciones favorables a la producoidn de fumârieo. Sin embargo en inatala— clones industriales de grandes feimentadores existen diapositives que eu tomé ti oament e adiclonan el carbonate sddlco siempre que el pH se desplaza haoia la zona âcida y entonces este neutralizante puede ser de utilidad industrial y fdcil manejo*

El polvo de mérmol permanece en el medio durante todo el proceso, se va disolviendo conforme se produce fuaârioo para convertirse en fumarato câloioo y en este ensayo résulta M e oonveniente que los otros neutralisantes probados*

La influenoia de la fuente de nitrdgeno se advierte en el bajo rendimiento (del 31 por ciento)} oomo se observé en el Capîtulo III de esta Tesis, no résulta tan favorable a

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la producoidn de fuaârioo el nitrato amônico o<m> la urea o el sulfato amAoloo.

En la Table XIV aparecen loe datos que corresponde a la serie paralela en que se usa la urea ccnao fuente de ni— trôgeno y en presencia de los neutrallzaates citados (polvo de mdrmol y carbonate BÔdlco 4H). La influenoia del tipo de neutralizante ae observa también con oaracterfsticae anâ- logas a las que comentamos en la Tabla XIII es decir, b^s fa vorable al ©npleo de polvo de mârzriol que el oarbonato sôdico 4N.

En ambas Tablas la serie que se mantiene sin neutrallzar a lo largo del desarrollo del moho, no produce âcido fuunârioo en cantidad apreciable comprobândose que si en el medio de oultivo durant© el proceso de fermentacidn no existe un neutralizante que se combine con el éoido conforme se va produ— ciendo a partir de la glucosa, los valores âcidoo del pH in— hiben el proceso metabôlico, el desarrollo del oloroorganis- mo, etc* Tante en oultivo mimergido, vednse series anteriores, oomo en oultivo mperficial de la de que es prueba la presents eerie experimental, es necesario afiadir al medio de cultive durante el desarrollo del moho, un neutralizante que man- tengo el pH en el valor convenient© al proceso de la feraen- tacîôn fumârica.

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8## aerie expérimental •— ESTIJDIO DE LA XHFI0MOXA DEL NHJTHALI2AHÎE (polvo de mârmol o carbonate sddlco 4H) HEaPBOTO AL TIEMPO Y LA EDmiE DE HITROaSIÏO. OTLTXYO smmRGiDO m MATRAjOMS*

El medio de cultive utiUzado ee detalla en la serie anterior (7* serie experimaital del Ctep. IV de esta Tesis) • •

Las fuentes de nitrdgeno utilizadas son la urea y el n nitrato amdnico, en cantidades équivalentes a la conoentracidn del sulfato amdnioo que figura en el medio original, (30).

A una serie de matraoes de 500 co. de vidrio Pyrex, con 100 0 0. de medio de oultivo se afiade para la neutralizaoidn a los tres dlas de oultivo, 5 grs. por oada 100 oo. de medio de polvo de mdrmol estéril, mlmitras que otra serie idéntloa se neutralisa con OO^agéN en presenoia de rojo de metilo, mediants adioiones sucesivas del âlcali. Pinalmente una serie preparada en las mismas oondiciones se mantiene sin neutrali- aar y sirve de testigo para los efeotos de ambos neutralisantes .

La testeratura se mantiene en 3290. El ties >o de oultivo total son dies dlas, tomando muestras oada dos dlas pH. inicial del medio»6.

La notacidn de los medios es la siguientei lA, 2A y 3A

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para los medlos oon nitrato amdnioo signlfioando los ooeflolra tes el tipo de neutralizante usado que es reepeotivamente : el 1 mdrmol, el 2 y el 3 ein neutrallzar. En la serieoon urea se mantisne la mlsma notaoidn signifioando en este caso la le tra B, el tipo de fuente de nitrdgeno.

Los remiltados del medio oon nitrato amdnioo pued«ot observarse en la Tabla IV los oorre^ondientes al medio oon urea en la Tabla XVI.

Este oultivo sumergido se verifioa en matraoes, tapedos con algoddn estérll y agitados en el agitador—bandeja repeti- damente oltado.Qomentario.- En las Tablas XV y XVI, se observa de nuevo que el efecto del polvo de mdrmol estéril es mds favorable a la producoidn de dcido fumârico oultivo sumergido, que el del oarbonato sddico # adicionado sucesivamente fronte a un indicador oomo rojo de metilo y mucho mâs que ouando al medio de oultivo no se afîade ningdn neutralizante a lo largo de todo el proceso.

La serie con urea demueetra que este o(Nmpuesto nitroge— nado mantiene el pH en valores Bids adeouados durante los primer os 3 dîas de desarrollo y permit© por tanto, oomo se obser vd en oultivo superficial, elguna producoidn de fumârioo antes de afiadir al agent© neutralizante y en la serie sin neutraliser. No obstente, el intense consume de azdcar impid© que el

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rendimiento aloanoe valores omii^derables.El consuffio de azdcar es %%mnor en laa serlee nwitrallza-

das con carbonate sddlco 4H, pero es mucho mener todavla — ouando no se afiade ningdn nwtrallzante. Esto pareoe indicar que las enzimas neoesarias para la degradaol&i del azdcar en el moho Hh.cryzae, no aotuan a pH dcidos y que el mantenerle m los limites dptlmos de manera constante, es fundamental para la producoidn del dcido fuiaârlco por este ndcroorganls— mo.

Los valores resefiados en las Tableis y que no superan al 23 ^ en el rendimiento, valor que no se pudo elevar en las oondiciones de trabajo hasta aqul descritas, se deben sin duda a la falta de aireaci6n y a la carencia del sisterna en- zimdtloo apto para metabolizar oorreotamente el azdoar en oondiciones prôximas a la anaerobiosis, ya que en cultive su perfioial los valores con el aismo medio y la misma oepa llegan hasta el 46

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OAPIÎTOLO IV.

BSTUDIO DE LA IHFLDMCIA DE LA OCWOEirmAOIOB DE SULFATO AMOltlOO Y DE OTRâS 4$ALE3 SIOmOGEBADAS.

Parte teérlca.Las pretelsas tienen vital iiqportanoia en el manteaiidLen

to d© la e structura y la integridad funoional de todas las for mas bioldgioas. Todos los datos sobre la formaoidn de protef- nas en slstemas biolôgicos indioan que los aminoécidoa y sus derivados sirven oomo preoursores de las protelnas, pero la slntesis de proteinas a partir de aminoâoidos es un prooeso endergdnioo y debe tomar la energla requerida de los pro ce—SOS productores de la misma en la degracidn oxidativa de oarbohidratos y grasas.

Refiriêndonos al métabolisme nitrogenado en aioroorge- nismos conviene observar que el amoniaco es también coaq ues- to clave en su metabolismo y que ouando dispone de coapuestos de carbone, azdfre y fdsforo, ademés de otros indispensables nutrientes, pueden utilizar fâcllmente el amoniaco como principal fuente de nitrdgeno protelnioo.

A.oryzee transforma el gnipo amdnico en grupo emino ré- pi dament ej en un medio oon glucosa y sulfato amdnioo produce alanine, serina, écido aspartico, icido glutémioo, glioo— cola y srginina.

La slntesis de proteînas en mioroorganiemos (28) parte de los andnoéeidos prsviamente suxninistrados o sintetizados

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a espensas del amonlaoo, sales nltrogenadas y o^apuestes hldrocarbonados del medio de oultivo. J^tre las baoteriae es ourioao scalar que las Gram-negativas# pueden utlllear el amimiaoo oomo dnioa fuente de nitrdgeno y en c&mbio la mayo- rla de las GraBv-positivas requieren la presencia de aminoâ- cidos preforaados*

Se sup one que el nitrdgeno debe es tar en foima aawmia- cal para ser ab sorti do por las plantas y que las otras series nitrogenadas que pueden suminiatrase lian de convertirse para su asimilacidn en amoniccelcs y dai* asî lugar a los oompuestos orgânioos oon nitrdgeno necesarios para la formaoidn del mloelio, etc.

Los compuestoa nitrogenados demostradoo en los mohoa se refieren a amindécidos y proteînas, dcidoo nucleicos y otros mâs complicados.

En el Hdcelio de Rh .nigricans, A. niger, p. nota turn, Stokes y Guimess (79) conprobaron la presencia de histirl- na, arginina, Usina, leucina, isoleucina, valina, metioni- na# treonina, fenilalanina y triptdfano.

La slntesis de proteinas por la masa mioeliar de los mohos sugirid la posibilidad de utiliaarlos oomo fuentes de proteinas de manera anéloga a las levaduras pienso y sobre la toxieidad de estos micelios y su poder nutritivo existen verios trabajos (85, 73, 88).

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Otros oosspuestos oomo dcldoe micXelooa han sldo esta— diados en P. glaucua y A. cryzae (86, 2) y sustanoiae aitro- geaadas oomo la betaina y su derivado n-metilprolina metll- betaina, se han alslado da alcelios de mohos*

En ensayo s con ml or oorganl s nos productores de âoido oltrico, lâctico y grasa la influenoia de la fuente de nltrÔ geno usada asl oomio su c<moen tra oidn, es objeto de interesan tes ©studios.

Resultados de las experienoias oon produotos de reduce oidn del dcido Iqftrico indioan (78) que el A. niger dnioamen te utilize los grupo s amAclcos para la formaoidn de oos^uestos orgdnicos nitrogenados. Otras fuaates de nitrdgeno se convlerten ©n nitrdgeno amdnioo antes de ser asintlladas y su valor nutritivo ©e proporciitoal a la cantidad y a la velooi- dad con que se verifique esta oonversidn.

la producoidn de écido citrico en oultivo sumergido (70) se establée© que el nitrato amdnico es la mejor fuente de nitrdgeno para 3.a mâxima producoidn de âcido oftrico. Su concentracldn dptljaa es de 2,5 grs/Htro.

Tambifei en la producoidn de grasas por P. javanioum van Beijma, (49) se ooD^rueba oomo dptlma la concentracldn de nitrato aWnioo de 2,25 grs/litro y los mimios au tores (50) trabajando oon una oepa de Idi. crusae produotora de âcidos lâcticoa y fumârioo, el primero en mayor cantidad,

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ooaprueban que las concentraoloaes superiores a 6 grs/litro de nitrato amdnioo lnW.be la producoidn de fumârioo, si endo Bâs favorable la de 0.75 grs/litro. En el mismo trabajo se ensaya también el efecto de distintas fuœites nitrogenatee taies oomo nitrato sddico, nitrito sddico, sulfato amdnioo, d-1-alanlns, âcido d-glutâmico, urea glicocola y peptona.Sus observaciones miestran una vez aâs que este or^mimao usa amoniaco y nitrdgmio amXnico pero no el nitrdgeno de los nitrates, asimllando esoasamente el procèdent© de los nitrites.

Las cepas de Hbizopus desarrollan râpldamente sobre medios oon glucosa y sales nitrogenadas Inorgânicas. Sin eWiargo, oomo mucho s mlembros de loa Mucorales, estos mi— oroorganismos no pueden utilizar el nltz^dgeno de los nitrates sine el suminlstrado en forma de sales amdnioas. También utllizan otras formas de nitrdgeno de coapuestos orgânicos taies oomo urea, pero se supone que estas sustanoias libersn amemîaoo en cuya forma es asimilable el nltrdgmio. Ordinaria meats para el cultive de Rhizopus y la producoidn de âcido fuMrico se utilisa el cloruro o sulfato amdnioo oomo fuentes de nitrdgeno.

Wakmman (90) estableoe la conveniencia del sulfato amd- nieo como fuente de nitrdgeno y laarca los amplios limites de 200 a 500mgrs/litro ouando la concentraoidn de oarbohidrato

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08 de 50 a 150 grs/litro. Sa «ao de los medios detalledos en su patMto estableoe la oonoeatraoidn de sulfato amdnioode 0,2 grs/litro.

La relaoidn O/S del Mdio de oultivo tiens una li#ortancia crucial en la formaoidn de âcido fumârioo* Ouando el varier de esta relaoidn es bajo, las oondiciones son favorables y Waksman estableoe la zona dptima de producoidn entre los valores del O/S de 25/1 y 300/1, advirtiendo la influenoia que sobre la producoidn tiene en todos los casos la conoen*» tracidn de Zn cuya influenoia se reduce notablemaote ouando la relaoidn O/R es al ta*

En nuestro estudio hemos investigado la concentracldn dptima para el adoroorganismo usado de nitrdgeno, en forma de sulfato amdnioo dnicamente, ya que el cloruro asdnioo perturbarfe el método de anâlisis cuantitativo de âcido fUa^ rico (nitrato mercurioso al 10 por oiento en âcido nftrioo al 5 por ciento) • Hemos coaprobado también la relaoidn O/ïï tanto en cultive superficial oomo sumergido, observando notables diferenoias e intervinlendo en esto la aireaoidn del medio.

Asimismo hemos estudiado distintas fuentes de nitrdgeno, coi^robando on la Parte Experimental de este Oapftulo, las observaciones anteriores en cuanto a la ineficacia de los nitrates oomo sumlnistradores de nitrdgeno al organisme ensayado y la utilidad de las sales amoniaoales y la urea*

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PARTE mPmiMmTAL*

1». eerie experimentalVariaciones en la ooneentraoi^ de sulfato amdnioo en oultivo superficial*

Para estableœr la relaoi&o aâs favoMible entre las oon oentraciones de oarbohidrato y sulfato amdnioo, que parmi tan obtener el mâxlmo rendimiento en doido fumârioo, tanto el oui tivo superficial oo^w en oultivo sumergido; se eneayan en esta serie y dnicamente en oultivo superficial las concentraoio nés siguientes de 3 0 g*

0,5, 1, 2,3 y 5 grs/litro, mant eni endo constante todaslaa ooncentraciones del resto de las sales que forman el medio original*

Las ooncentraciones de oarbohidrato (sacarosa invertida) son las siguientes:

6, 8, 10 y 12, 14 grs/100 oo*Por tanto, se estudian veinticinoo medios de oultivo que

resultan de la combinaoidn de ambas ooncentraciones, reuni endo en las Tablas IX al XIII los resultados f rente a cada concentracidn de sacarosa por una determinada concentraoidn de

El tiempo de cultive es el mismo para todas las muestras y se realiza en dies dlas. El pR inicial igual a 6 y la tem%)eratura se mantiene a 34®C* La âdicidn de polvo de mârmol,(CO^Ca cristalizado) se efectde a los tres dlas de desarrollo y en la concentraoidn del 5 por ciento (5 grs* por oada 100 oo

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de s^dlo de ouXtlvo) •Gomentarlo.- En la Tabla XVII se advlerte que la oenoeatraoida de ailfato asdnico de 0,5 gra/Htro, résulta tasufloleate para que el readlalento cttpre al 33 por oleato* Las cenoeatra- olones de sacai*osa lavertlda superiores o iaferiores a las del 10 por oieato oonsiguen menores readlmleatos en âoido fumdrl— 0 0. Existe pues como en el caso de les fosfatos, un equlllbrlo O/N y en la concentraoldn de 0,5 grs/lltro no se obtiens dleho equlllbrlo favorable a la produooldn de dcido fradnoo oon — nlnguna de las conoentraclones de amdoar ensayadas. Como vers- aoB en series posterlores la ocmoentraclôn de gluoosa oorrea- pondlente a la de sulfato amdnlco que oomentemos ha de ser manor del 6 por oleato.

Los valores que aparecen en la Tabla XVIII y que corresponds a medlos de cultive oon 1,0 grs/lltro de sulfate am6- nloo frente a las ooncentraolonee cltadas de assdoar invertldo, xQuestran un mdxlmo eai el rendlmlento de doldo fumdrloo (45 por olento) que oorresp<mde al 8 por olmito de asdcar Invertldo. Mayores oonoentraelones de azdoar no aummitan el rendlmlento y la Influanola de la oonoentracldn de sulfato amdnlco se advlerte oomparando con la Tabla XVII, en que el consume total de asdcar es moho mayor. En la ooncentracldn de 14 por clen- to de azdcar invertldo, oo2xq>robasos que el consume al final del ensayo es casi el doble del que aparece para la mi «m» oon-

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contracldn iniclal en la Tabla XVII es deolr, cuando la o»-centracidn de aulfato amdnlco es de 0,5 gre/lltro.

En la Tabla XTX hay un desplanamlento del «âxlmo rendlmlento haoia la ooncentracldn de aasdcar Invertldo correspond diente al 10 por ciento. Llega a alcanaarse el mayor rendl - nient o de esta serle experimental es deolr, el 47 por ciento de dcido fumdrioo sobre azdoar consumldo. El oonsumo de azd— car es bastante ooiapleto par?i todas las conoentraclones ensam yadas, demostrando que las concentraoiones de sulfato aaiftilco mds convenient es para la produooldn de dcido fumdrloo en lascondiclones que tratamos estdn comprandldas entre 1 y 3litro, y la ooncentracldn de azdcar invertldo entre los limites del 8 al 12 por ciento.

Estas conclueiones se desprenden tamblén del estudlo de las Tablas 'KJL y XXI donde puede obeervarse un desoenso en les rendlmlentos al aumentar la ooncentracldn de sulfato amdnlco frente a todas las concentraoiones probadas de azdcar Invertldo. ïïnlcamente los pesos de materla seca que revelan el desarrollo sdcellar aummitan conslderablemente en relaoldn & las otras Tablas, en esta ocaaldn tamblén se replte la obser- vaoldn de que un desarrollo mloellar exubérante no se traduce en zmobos caeos &a, una mejor produooldn de âcldo fumdrlco y que el cociente G/N es deolslvo para obtener buenos rendl— mlentos del dcido.

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2t. serle experlmmital#- Varlaclones en la eonoentraoidn de ^ilfato amdnloo en oultlvo eumergldo en ma traces*

Sobre el i& ilo base mxQpleado en todos los ensayos précédantes, se ensayan las siguientes conoentracl<mes do enl- fato amdnlco* 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 y 4,0 grs/lltro.

Oada una de allas se prueba frmite a las slgulentes — concentraoiones de asdcar invertldo: 6, 8, 10, 12 y 14 gr#/ 160 0 0. de medlo de cultive.

De la oomblnaoidn do estas dos series de ooncentraolo- nes se produces velnticinoo medlos distlntos, nue se estndlan en oultivo sumergido enqpleando ma traces de vldrlo Pyrex de 500 0 0. de oapacldad, con 100 cc. de medlo oada une.

Como en la serle anterior de este Oapltulo la temperatura se mantiene en 34& durante los dies dias de ln<mbacl<hi en el agltador-bandeja. El polvo de mdrmol estéril a razdn de 5 grs por cada 100 cc. de medlo se a&ade al Inocolar.

Los reeultadoB obtenldos en las anterlores condlclones se miestran en las Tablas XXII al XXVI.Oomentarlo.- la Tabla XXII oorrespondlente a la concentra oidn de 0,5 gres/lltro de sulfato amdnlco, se advlerte frente a las diatlntas conoentraclones de asdcar Invertldo una regularldad en los rendlmlento s de doldo fumârloo. El date de mds valor absoluto oorre^onde a la ooncentracldn de aad— car invertldo del 8 por ciento,aunque caloulando el rendlmlen

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to oobre eusdoar oonsumida aea ads elevado el que se obtlwe oon la oonoentraci&i del 14 por olento# Las dlfermiolas entre oultivo fiBipepflolal y mmergldo en ma traces, se apreclan olarammite si oom#aramos estoe rendlsdentos (Basta del 34 por olaito), con 1)8 obtenldos en las Ciblas XXII al XXVI.

fi&tntener un equlllbrlo entre las conoentraclones de saX fato amdnlco y asdcar invertldo en el medlo Inlolal y a lo largo del proceso de fermentaol&i, apareoe en oultivo sumergido 00200 de capital liE|)ortencla. La Inhlblcldn ejerclda por el milfato amdnlco en concentraoiones snpmrlores a 1 gra/11— tro cuando el azdoar disponible no excede del 10 por ciento, as verdaderamente notable. En la %ibla XXIV se coaprueba la falta de produooldn de dcido fumdrioo en medlos de cultive que ootttienen 6 y 8 gres por ciento de asdcar Invertldo y 2 grs/lltro de sulfate amdnlco. Esta Inhlblcldn que afecta declalvomente a la produooldn de fimdrlco signe ejercléndose con mâa intensidad si la ooncentracldn de sulfato amdnlco es de 3 grs/lltro. En este caso aunque la ooncentracldn de and— car invertlda inioialmente del 10 por ciento taagpoco se produce dcido fmndrico como puede observarse en la Tabla XXV.

Y en la Tabla XXVT se replte el heoho observado con me— nores concentraoiones de sulfato amdnlco ya que en eea Tabla se recogen los resultados obtenldos con medlos de cultive que contienen 4 grs/lltro de sulfato amdnlco. La Inhlblcl^ aloan

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sa en este caso hasta oonowtraeiones de asdcar invertldo m el medlo Inlclal del 12 por clrato*

£àa oultivo ÊRiperficlal esta IzddLb^ldn por accldn de ele vadas conoentraclones de milfato amdnlco, sdlc se muestra en la Tabla XYf cuando la ooncentracldn de sulfato amdnlco es de 4 grs/lltro y la de asdcar Invertlda de 6 por ciento* Los rendlmiontos son Incomparables en ambos tlpos de cultlvo.

Estoe hechos se explloan cuando adc^tamoa otros reel- plantes para oultivo sumergido (véase flj. 1) dmaostrando odmo la falta de adecuada aireeoldn en los ma traces do 500 oc do capaoldad, con 100 cc de medlo de oultivo, es la causa de los bajos rendimlentos obtenldos en oultivo sumergido* Consetïtilda une agitacîdn ^tlma y la oonvenlente aireaoldn, los rendlmlento8 en cultlvo superficial pueden aloansars^ y 8iîn superarse en oultivo sumergido, oon todas las ventajas que el sumergido tiens sobre el superficial en cuanto a bre- vedad del tlempo de oultivo, mayor volumen foraentado y fd?- cil manipulGcidn de los reoipientee que le posibllltan para su aplicGoidn a la produooldn Industrial.

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2#. eeide expert e l Variaoiones en la ooncentracldn de sulfato amdnlco en oultivo sumergido en nuevos reclplentes*

Para conprobar la Influanola que la agltaolôn y la alrea oidn del medlo de cultlvo consegulda en los nuevos reolplentes, pueda tener sobre la Inhlblcldn ejerclda por al tes oon- oentraoionee de sulfato amdnlco como se observé en las Ta - bias que recogen los reeultados de anterlores series expérimentales, se preparan los siguientes medlos de cultlvo*

Medlos 1, 2, 3 y 4 oon 0,5 grs/lltro de sulfato. amdnlco frente a 3,5 5,4, 9,6 y 14,6 por ciento, de aadcar invertlda respeotlvamente*Medlos 5, 6, 7 y 8 con 1,5 grs/lltro de sulfato. amdnlco frente a 3,5, 5,4, 9,6 y 14,6 grs por ciento de azdoar invertldo respeotivomonte.Medlos 9, 10, 11 y 12 con 3,0 grs/lltro de sulfato amdnlco frente a las mismcs concentraoiones de azdcar invertldo cltadas mda arrlba. îîedios 13, 14, 15 y 16 con 4 grs/lltro de sulfato amdnlco frente a las conoentraclones de azilcar invert Ido detaHadas anteriormente.Es deolr, cada ooncentracldn de azdcar invertldo se esta

dia en medlos de oultivo con 0,5, 1,5, 3,0 y 4,0 grs/lltro de sulfato amdnico, repitiendo oon elle los medlos de cultlvo eatudiados en superficial y oultivo sumergido en matraces.

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La teniperatura se mantiene en 34fi, el pH inicial es Iguûl a 6 y el période de incubacidn en agltador^bendeja se reduce a oinoo dias.

Los resultadoe del presents ensayo pueden observarse enlas Tablas XIVII y XXVIII que contienen los dates de medlos de oultivo con 0,5 y 1,5 grs/lltro de sulfato amdnlco, (Tabla XXVII) y con 3,0 y 4,0 grs/lltro la Tabla XXVIII frente a las concentrecionec de assiîoar invertldo que se citan al oomlenzo de esta série experimental.QomentarloHemos podldo demostrar en esta serle «sperlmen- tal cdmo la aireaoldn Influye de modo deolslvo en oultivo su— moroido. Adn con le concentre cldn de 4,0 grs/lltro de sulfato amdnlco, la inhlblcldn sobre la produccidn de fumdrico se oon- aigue ïïnlcamente frente a la ooncentracldn de 3,5 grs por clan to de aadoar invertldo.

Lofî mojore^ rendimientos se obtienen con las concentra- olonefî de 0,5 y 1,5 grs/litro de sulfato amdnico frente a 6 por ciento de azdcar invertldo.

El equlllbrlo O/R depende por tanto de la alzwcldn y es notable la ser^anza de loe valores de rendimientos que epa — recen en la Tabla XXVIII oon loe de las Tablas XX y XXI de e^te Mümo Oapltulo referentes a cultlvo superficial.

A lo largo de esta Pesis se ha adoptado c<Hao mâa convenient e para cultlvo sumergido la ooncentracl^ de 1,5 grs/11-

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tro de sulfato amdnico con 6 por ciento de asdoar invertldo en el medlo.4>. serle experimental»- Influenola de la call dad de las sales nitrogenadas, en cultlvo superfiolal.

Estudlamos en esta serle la Influenola que tiene en el desarrollo del Rîrilzopus oiyzae y en la produooldn de doldo fuumlrico en oultivo superficial, la utllisaoldn de sales nltrogenadas distintas del sulfato amdnico empleado en las anteriores series, tales como nitrato amdnioo, nitrate potdal- 00, nitrato sddico, oarbonato as^ilco y urea.

Oomo agentos neutralisantes ee utiliaan mdrmol estéril en polvo (OUjCa ciistallzado) y 00^Oa emorfo, en oantldad del 5 por ciento.

Lo3 resultados de esta serle se detallan @n la Tabla XXI. Las condioiones de cultive consister en amtntener la tern peratura a 3490 durante los dies dlas de Inoubaoldn y en que el medlo bâsioo habitualmente usado en esta Tesls y ouyas a» dificaclones se advlerten en cada ensayo, tenga el pH inl - cial igual a 6.Cornentarlo.- En cultive superficial es menos notable que en sumergido la influoncia de los agentes neutralisantes. Sstose comprend© fâcllmente por las condlclones del primer tlpo de oultivo que facilita el dep-dsito del neutralisante en el fondo del matraz, mi entras que en sumergido, debldo a la -

- Ill -

agltaoldn os constante el contact© c<m el medlo*Lea sales amdnloas son las mds eflcaoea para la produo-

cl&i de dcldo fumdrioo y de esta efloaola participa tamblén la urea debldo a sus grupos amfnlooa* El grupo nitrato, como aseguran much os autores, no es utilizabl© (50) oomo fuente de nitrdgeno por este género de mohos*

En nuestro caso no ae consigulé desarrollo apreolable en los medics de cultive con nitrato potésioo y nitrato sddico.5^. serle experimental.- înfluencia de la calidad de sales nitrogenadas en oultivo sumergido, en matraces*

Anâlogamente a la serle anterior se estudia ahora la influencip. de distintas sales nitrogenadas aüadidas al medlo de cultive en sustituoidn de sulfato amdnico y en cantldadee équivalentes. Estas sales son: nitrato y carbonate aménicoe, urea, nitrato sddioo y nitrato potdsico.

Oomo agentes neutralisantes se utllizan en dos series simultdneps el carbonate cdlcico amorfo o polvo de mdrmcl (OO^Oa cristalizado) a razdn de 5 por ciento*

Las condlclones de temp©ratura, pH inlclal, etc* son Idénticas al anterior onssyo.

Los resultadoe se encuentran en la Tabla XXX*QomentarloSegdn los dstos obtenldos, la influanola decisive en la produooldn de fuma rico y desarrollo del Sb,

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oryaae se debe a la sal fuente de nitrdgeno empleada* En cultlvo sumergido los neutralisantes, en estas condlclones, no aportan dlferenclas Intere^mtes sobre los rendimientos# Las majores fuentes de nltrôgeno son el nitrato amteloo y la urea* Tanto en nitrato sddico como el potâslco no prc^orolo- nan el nltrdgeno en condlclones asimllables por el Moroor% nlcno. El carb<mato amdnico que en superiiclal oonslgue un discrète rmidimiento y algdn desarrollo mloellar, no produce âcldo fumârlco a pesar de oonsomlr abondante azdoar del medlo. En este caso la alcallnidad del medlo de oultivo serà pues la responsable de esta lalta de produooldn y oonflroa la hlpdtesis sobre el eteoto de los neutralisantes que las observaoiones recogldas en el Oapltulo IV nos euglrleron, es dec 11", que mantener en loe limites justos el pH a lo lar go de tüdo el proceso de iementaciôn es la olave para la afcundante prouuccldn de fun^rico y el desarrollo del sloroor ganismo*

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ESTUDIO DE LA AIREAOIOH Y AGITAOION DM»MSDIO DE OULTIVO.Pairfce tedrloa.

Las ideae de aireaoldn y agltaeidn estén întlœuaente llgados porque no ee poelble alrear debidaaiente todas las porciones de un medlo de cultlvo sin une adecuada agltaeidn. En 1933 Xluyver y Perquin (36) coaenzaron a utlllzar para cultlvo eumer; Ido de mohos las tôcnlcas del **Sohutterkultur**

.yque fueron laâs tarde adaptadas a la esoala Industrial por Herrick, Hellbach y May (33) mediante fermentadores rotate- rios oonstruldoG en alurainio, métal que se probd no era td— xico ni 30 ataoaba por el dcido Élucdnico formado en su Interior por la accldn del A. fumarious. astos principles de»~ cubiertos por îCluyver y Perquin en sus prliaeros ensayo s con los "cul iivok- ogitados" tambidn fueron apHoedos a la cons- truccidn de fomnontadores en forma de depdsitos verticales con un agit ad or mecdnioo y entrada del aire a presidn a travds del ’’sparger” quo lo dispersa a travéa do todo el medlo an formi do finas barbu J as.

La agltaeidn puede sfoctuaroe de distintas rmneras, to— das proourandû conseguir la mâ-cima alreacidn:

a) sin agltaeidn meodnioa se puede alrear el liquide y mantencrlû an moviiidento para que no uo for ne un mi oeil o superficial dnicornante por la introduooidn de barbujas de aire

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estérll*b) 0<m egltaol&i meoénloa que puede oonslatir en el mo—

vlmiento de un eje p 'ovisto de paletas en el seno del medle de cultive, introduciendo a la vœs aire a preel&i a travée del aperger (éete es el método de agitaeldn ecmdnmente usado en les grandes fenaentadores industriales) # La agitaeldn de traces u otros recipientes de laboratorlo se haoe per vaiven con le que se oonsigue un deaplazaal en to alternative de la mass mi cellar y el liquide de cultive haola una y otra de las paredes del reoipiente, con formacidn de eepuma y grsn aireacidn, o bien oolocando les ma traces en bande jas rotate-* rias con un movimiento de excéntrica, que per la fuerza cen— trlfuga coffiunioada, deeliza el medio de cultive en fina oepa sobre las paredes del matraz y le expoae per elle a un mayor contacte con el aire del interior de la vaeija.

La revisidn que publlca anualmente Industrial an Ingénié ring Ohemistry en enero, rccoge las varlaciones a les métodos fundamentales que arriba reseRamos y que van producléndose - conforme se apUca el cultive sumergido a distintos tipos de fermentaciones industriales*

T es que el estudlo de la aireaoién y de sus efectoa en el desarrollo y métabolisme de los microorganismos se b& heoho Impreacindible pars oontrolar efioazmente oualquier fe3>* mentacién sobre todo en escala industrial y peder lograr los

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majores rendimientos en Industrisa tan Importantes o<mo la produce!6n de antlbidtlcos, vltaminas, âoidos orgénioos, etc*

Oomo ejemplos de la Influenola que una buena aireaoién ejeroe en los prooesos metabdlicos de algunos microorganie-mos citaremos:

iin la produo cl dn de âcido glucdnico en cultive susiergi- do (9d) 36 jBuestran los siguimites resultados: pasando 200 ml/ minute de aire estérll el rendimiento en dcido glucdnico es del 49,6 io sobre la gluoosa utilisada; pasando SoCHol/minuto de aire estérll el rendimiento sube a 79,5 Bn este trabajo se coBoprobd sin embargo que valores superiores a los 1*200 ml/ lainuto de aire no acortaban el période de fermentaol^*

El efecto de la eireacidn sobre la produccién de esporas por Bacillus antîiracis y Bacillus globigi (66) se demostrd en que coriientes de aire estéril del valor de 0,7 a 1,0 32Ü Og/l/ minuto, son oufi ci entes para una congpleta espor^lQacién de cultives de 24 boras de edod iniciados previaaente con esporas* 3in embax'go los subcuit 1 vos iniciados en la fase de iMti mn — desarrollo vegetative, ouando las esporas estân a punto de apareoer, no precisan mds que de 0,1 a 0#2 Og/l/ minuto, para conseguir una total esporulaci<te*

En un reciente trabajo de Pig (71) se estudia con un dispositive ingenioso del autor que permits medir a le largo de toda la fermentacién el consume de Og, el efecto de

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la airwoldn sobre la preéuociAc ée3L âeiâo ns^XAgloe per 0»» tllago aeae, de alfamernilem^ p w A. ai|^, y de éeido oltariw pm? otre oepe de A* iti^r*

m la fomaaoife de éoldo aetlldgloo y de alf^-êe&laa» el respeotivo orgw^mme utlUaa efloleatemeote el 0^ a tmtmXesme bajaa y la produoeite de âoido ftié paralela a la abeorolte de emi&mm. m la f^nsœtaoidn oitricm ee obe«nrd que laproducelén era paralela a la abeorolda de œclgene pero que pa 1% una imjor utllleaclén del oxigmo fscadLuiyfarado ara preiêa una mayor texuddn que en los oasoe auterloree*

yinslmwte (34) se ha ornuprobado que la media de la pro- pegaoldn de alertas levaduraa puede ooneiâerarse etsao la media de la absorolte de oxteem por el medio em. que se oultivan, de tal modo que esté ligada la pr%>agaoldh de eetoe ml— oroor^niams ocn el aporte de oaclgemo al medio.

aie emWrgo miohos de los efeotoa reseUedos mée arriba y otros mchog mie que una Interminable blbll^refla nos muestra, no mn oomqmrables entre porque en diohoe #alm- jos se acusan ii^raotltuâ^, icpiîsioaes freouentes œ la mdls de la àlrîd.db y en la mpresldn de las oomeWnWe mpleadas para jaWlrla. Adeads de que les valeree de la alreg cldn ùopmàmk fUnd<wm%talmm%te de les valores de dlsoluoidsi del osigeno el medio de cultive, dlfusi^ del mismo, tra% porte a travée del sWio y mi oontaoto o&o las «iû»e-

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biâ&8 en el protoplaama aouoso que plantean mxuoho# problmae qulmloo-flaioo dada la ooagplejldad de las fmeea présentes, mlcelio, medio de ooltivo, paso a travéa del tapdn de algoddn» etc»

La medi^^de oxlgeno absorbido por el medio de oultivo oonsiste en determinar alguno de los términos de la eouacidu aiguientes

Valor de absorcidn « Kj^ (0“-0i,)siendo iCj; el valor de la abaorcidn en Sln/hora que depends de a unidad de Area intex facial, 0” concentraoidn en el equlli- brio de oxigeno disueldo en Mn/litro y Oj concentraoidn actual de oxlgeno diauelto también expresada en %%/litro.

ËKlaten très métodos para medir K^a, dos de ellos son polarogréficoB y son descritos por Wise (96) oomo "Métodos de mueatraa" y mâtodo de "Gassingout** • En amboa se détermina el valor de Oj, mediante una célula polarogrAfica*

El tercer œétodo usoalmente empleado mide imdlreo- tamente. Se trata de una oxidaoidn de sulfito en una vaslja de fermentacidn que se utilice en el trabajo normal* En presenoia de sales de cobre o cobalto que aotuan de catalizado- res, la raacciôn con oxlgeno o aire se lleva a cabo râpida e irreversiblemente en la faae liquida. Este sirvid a Oooper Pemstrom y Miller (14) para usar este método para evaluar los contactos gas-llquido* pajra hallar KjB. se valora la eo-

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laoldn de sulfltos con yocto en intervales durante la airea- eidn* El valor de absorolôn hallado de esta manera es ya que ( Gonomitraol&i de oxlgeno dieuelio) es cero en to-das las ssuestras*

Sin embargo la absorcidn del aire per la soluoidn de sulfito no 03 single oomo parece. Hay tambidn oierta confU- sidn en la intorpretaoidn de los resultados obtenidos por este método y la oomplejidad del problema se demuestra en la revisidn que hiao Abel (1) citando sobre el particular eeroa de 100 referenoias*

El método de sulfito modiflcado por Bartholome#, Ka- row, Sfat y Wiljelm (4) tiene la ventaja de no precisar instrument os espéciales, pero deben interpretarse con OEuitela sus resultados ouando se trata de oaldos de cultive de dlferente densidad que la soluoidn del sulfito, con oélulas o hifas sdLceliares en preeencia, etc. que dan Iu^ lt a distintas fases y por tanto dificultan la soluoidn del cndgeno en el medio y la bacon distinta de la disoluoidn de dicho gas œ una sinçlo soluoidn de sulfllx)*

En nuestro trabajo hemos adoptado para la medlda de les VBilores de absorcidn de oxigeno, la fdrmula que apareoe en el trabajo de Auro, Hodge y Rotb (3)* Aplicando el método de Bartholomew y colaboradores y utilizando una méquina de agi- tacidn recfproca o de vaivén, obtienen en el papel s^dlogEb-

— 3JÊ0 —

rf tmloo unas rectas da las que deduoea la aouacidn sigulentet(-1,657)?!

las A» 4- 7,9,10-57% 4,

donde V , slgnlfloa el voldmen de s^dio de ooltlvo o de solucidn 0,5 N de sulfito addioo, Vy es la oapacldad total del ermenmeyer empleado en la deternjinaoidn. Las diferenoias en la determinaoi(5n del valor de la absoroidn expresada en Mm/li t r o/mlnu t o mediante la féimila 0 por su lecture en la ^rdflea corroopondiente son 5,75

De enta manem Bolamente oonociendo la oapaoidad totel del ormeniaeyer y el voldinen del medio de oultivo ensay&do puede predecirse el valor de la aireaoidn en las condicioaes expérimentales de agi ta ci dn que figuran en el citado trabajo (3).

En nuestroe ensayos con ermenmeyer colocados en agitador-bandeja a 72 r.p.m. para la produccidn de Acido fumAri— 00 en oultivo sumergido, no conseguimoa resultados coagieura- bles a los obtenidos en cultive superficial. Suponiendo que lis diferenoias observadas eran debidas a una deficient# - aireacidn en los ma traces diseRamos unos recipientes ouya foi aa puede verse on la Pig. no 1 de la parte experimental que transformaron el movimiento circular del medio en los m& traces en un choque alternative sobre las paredes.

Por tanto, la aireacidn obtenida por este tipo de agit»

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eidn a travée de un tapén especial era mayor y estese aprecié notablement# en los rendimientos en Aoido fumA- rico y en la seyor rapides del prooeso.

- 122 -

fARgE SSfEBIMEaPPAt..

!»♦ eerie — Estudlo de la relaoldn S/V dp timeen oultivo mq>erflolal.

El medio utlUzado en las series expexin^ntales que se agrupan en el presents Oapltulo es el slgulente*

PO.HgKa.2 HgO ..............0,18 grs/litre30 .Mg. 7 HgO....... ............. 0,06 Id.SO^Kg.............. ............. 0,06 Id.(30^)2EeBH^.12H20................ 0,12 Id.30^fc.7H20......... ............. 0,0035 Id.30^(HH^)2.......... ............. 2,0 Id.gecarosa invertidaneutralizada 10 a 12 grs/lOO oe*

Kn las condiciones desoritas para el oultivo superficial en Material, Métodos de Trabajo y Anélisis de esta Tesis, se lleva a cabo el presents ensayo*

a%leamos ma traces de vidrio Belgor de 100, 250 y 300 0 0. de oapaoidad asf oomo matraoes Pyrex de 500 oo. A oada ono de ellos y para obtener la relacidn â/V més favorable se aRaden distintos voldmenes de medio de cultive oomo se aprecia en la Tabla XO.I.

El desarrollo del moiio se efectua en preeencia de ? grm. de polvo de mdmol por eada 100 ce. de medio de oultivo. Oomentarlo.- La relaciôn superficia/volumen influye en la produccién de dcido fumérico de modo decisivo.

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Cuando se desarrolla el mloelio en oultivo superfioial oubre una zona de mayor o manor eztensi<hi segdn s m la altara del medio de oultivo dentro del matras y dependimite de la forma de éste*

En este eneeyo los matx-aoes de tipo Erlenineyer, varfan por tanto dnicamente en oapaoidad total y sin embargo, la superfioie libre donde se desarrolla y extiende el mlcelle varia considerablemente de unos matraces a otros y con el voliîmen del medio* Estas diferenoias se reflejan en los resultados cuando se oomp&ran voldmenes iguales de medio de oultivo contenidos en matraces de distinta oapaoidad aunque tengan igual forma.

Por ejenclos 40 co. de medio en matraces de 100 oo. de oapaoidad déii un rendimiento del 30 por ciento mi entras que el mismo voldmen en matraces de 250 co. de oapaoidad logra un rendimiento del 34 por ciento.

75 0 0. de medio de cultive usado en esta i’esis, dan ren dimientoa del 23 y 37 por ciento respeotivaraente, segdn e&tém contenidos en matraces de 250 o 300 oo.

En general, observando les dates de la Tabla secomprueba que para el mismo tipo de matrea los resultados joran cuando disminuye el volumen del medio, porque existe yor probabilidad de transiormacidn del sustrato cuando mayor contacte tenga con la cape mlcellar; ya que los produotos aei

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mllables se difunden con mayor r a p i d e s en un volummi mener y

porque la capa miceliar es m A s extensa en una forma d e Krlen- meyer determinada, si la altura del smdio d e oultivo o o l n e i d e

con el mdxlmo ensanchamiento del fondo del m a t r a z *

28. séria e^cperimental.- Eatudio de la aireacidn en relaoidn al volumen de medio, en cultive sumergido en matraoee.

El medio de cultive que se detalla al oomienzo d e e s t e

Oapltulo s e modiiica reduciendo la concentraoidn d e s u l f a t e

amônicû a 1,5 grs/litro. El resto de l a s sales se m a n t i w e

oonat&mte y la concentraoidn inicial de sacarosa i n v e r t i d a

es de 10 por ciento.Se eiaplean matraces de vidrio Pprex. de 500 co. d e c a p a -

oidad con 100 y 50 ec. de medio de oultivo, matraces d e v i —

drio Pyrex de 1.000 cc. de oapaoidad con 200 y 100 oo. d e

medio de cultive, matraces vidrio Pyrex de 2.000 co. d e e a p a

cidad con 200 y 100 co. de medio de cultive.El cultive sumergido se efectiia en agitador-bandeja.

Tioffipo de incubaoidn sais dias, pH inicial igual a 6 , t e m p e -

rature 3 4 2, adieiôn al tiaiipo de inocular de 5 por d e n t e d e

polvo de mAnûol estéril (carbonate célcico cristalie^do)•1*03 resultados del presents ensayo se recogen en la Ta

bla XXXII.goaentarieDel mismo modo quo en oultivo superficial,c u a n d o

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se eomparan rendimientos de matraces de la adsma eapacidad conteniendo voldmenes diferentes de medio de oultivo, se oom- prueba que a mono s volumen de medio corresponde mayor rendi— miento. En efecto, con el volumen de 200 oc. en imtraa de2.000 cc. de oapaoidad, el rendimiento es del 19 por ciento y con el mismo volumen de medio pero contenido en matraz de1.000 cc. de oapaoidad el rendimiento desciende a 10 por — ciento.

El volumen de medio de oultivo de 100 cc. se distribu- ye en très loatraoes de distinta oapaoidad, a sabers matraa de 2.000 0 0., matraz de 1.000 co. y finalmente matraa de 500 cc. pues bien, produce rendimientos de 20, 19 y 17 por ciento oonfirmando la observacidn hacha en oultivo superficial de que el rendimiento para el mismo volumen de medio ensâ ’o esta en razén directa de la eapacidad de matraz.

Las anteriores observaciones demuestran que la aireacidn que ae oonsigue al agitar en un matraz amplio un pequefio volumen, es favorable la produocidn de fumérico y que cuando s» yor sea el contacte del medio con el aire se filtra a travée del tapdn de algodôn estéril, hay una transformacife mâs efi— caz del sustrato en el producto que nos interesa, Aoido fumdrioo.

Para conooer el valor de la absorcidn del oxigeno en las condiciones de oultivo expresada mAs arriba, se aplioé

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la fdrmula de mro, Hodge y Rolâi (3) obtwlendo les valores detallados en la Tabla XXXIÎ y que dwmestz^ esta relaci^ entre el volumen de medio y la total oapaoidad del matraz utilizado m de Og abeorbido por litro y minuto. Oorreepoade la mayor absoroidn (1,567 vM gg/litro/minuto) al matra» de2.000 oc. do capeoidad con 100 cc. de medio y la menor abaor ciôn calculada al matraz de 500 cc. de eapacidad con 100 ce. de medio. Los rendimientos coinoiden aproximadamonte con ee- tos valores y el resultado menor corrospondiente al matra» de 500 cc. con 50 co. de medio, debe atribuirse a la evapoz» cidn durante el proceso debido al exiguo volumen ensayado.38. serie experimental.- cîfecto de la forma del reoipiente y del modo de ais3.£irlo del aire exterior. Oultivo sumergido.

Bn la fag. num. 1 de la parte Jiixperimental de esta ïesis se describe la nue va vaslja emp leads en este ensayo, que fué dis^ada por nosotros con cl fin de conseguir las oondicio - nés de agitaeldn y aireacidn que alcanzan los rendimientos de fermentaiore3 de acero inoxidable.

ïïueetras observaciones en cultive sumergido nq$ha becbo suponer que la falta de rendimientos aceptables en cultive sumergido en matraoee, se debla prlncipalmente, adwdés de la oomposicidn del medio de cultive, a la falta de abondante aireacidn, al tipo rie desarrollo mi cellar que ae conssgufa; ^eneralmente en fomm de una masa oelular con malas oaracts-

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rlstloae p&rs un procôso de fermeataolda #n mmergldo.por tanto, en este ensayo utilizando los reoipiente»

utillzamos el tipo de tapôn que ha de aislarloe del polvo atmosférioo y aantenerlos sin oontazdnaoidn de otros mioro- organism)8 adn reoihieg^gLo el witliao aporte de aire.

En la Tabla Toocili pueden eoaprobarse las obaervaeione» relativas a los aigui entes ejes^lost

A una de las nuevas vas!jas se aüaden 300 oo. de medio de cultive habituai, se tapa con algoddn y se esterilisa. A los cuatro dlas de desarrollo en preaenoia de 4 grs/100 oo. de polvo de mdnaol estéril, el rendimiento es del 4 por — ciento, hay un intenso color aloohélioo y el oorrespmidimite anélisia c(^rueba la exlstencia en el medio de 2,6 oo* de alcohol por ciento.

Con otra vasija que s^ tapô i con vasltos de vidrio pe- queRos e^eoialmente adaptados a la booa del reoipiente, lo» resultados fueron adn peores, porque dloha capa iig edla més efioazmente que el algoddn el paso de aire exterior. Se lo- graron solamente 0,2 grs/100 ce. de medio con rendimiento del 3 por ciento. El alcohol produoido en estas condiciones fué 2,5 co/100.

Oomo la agitaeldn era bastante intmisa al transformar el movimiento circular del medio en los matraces, en ehoque violente sobre cada pared del nuevo reoipiente, faûLlaba la

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entrada de aire y por •tente probaros a tepar las vasljaa eoa vasos de vidrio ^Igor de 50 co* que no ajusteban exaotarnenm te a la booa y oscilando ligeramente par la aglteoi&% oontxd Wlan al paso del aire, is^idiendo la wtrada al polvo a tads férico, ya que van rodeados y apoyados sobre algoddn estéril*

En lag condiciones deecritas, es decir con este nuevo tapdn, el rendimiento en oultivo sumergido que en ensayos efectuados en matraces, no habia superado nunoa el 20 y 25 por ciento de rendimiento en âcldo fumdrioo sobre el asdcar oonsumido, se eleva por la mejor agitaeldn y aireacidn omise- guida en estas vas!jas, haste el 49 por ciento al cabo de sels dlas de desarrollo. Estando el sdcelio en forma de diminutas bolitas que favoreoen la buena pSoduccidn* Qomentario*- Los resultados de la Tabla XXXIII s<m bastante eloouentes por si mismos y ooBq>rueban xmestra hipdtesis de que la oepa de Hh* ozyzae que empleamos, no posee un meoa— nismo de transformacidn de azdcar en âoido fumdrioo que — aotde en condiciones anaerobias y que solamente en condiciones aerobias, se oonsigue un rendimiento ao^table *

Mientras se utilizan matraces Erlenmeyer tapados con algoddn, la aireacidn es precarla y el oxlgeno disponible en el interior del recipients puede H e gar a ago tarse, entonoes el consumo de azdoar que suele ser ooa^leto, se des- ▼la por otros caminos metabdlicos anaerobios (produocidn de

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aleehol) sin obtener oantidades apreoiables de âoido fumârieo* Los nuevos recipientes diseflados por noeotros (Fig.l), resuelto el problem de conaeguir en agi tad or-bande j a -

rotatorio, una dptima agitaeldn y aireacl&i que logra rendimientos en âoido fuaârico ooaparables al oultivo superficial con un tienpo de incubacidn naxoho menor, con ésto la produocidn de fumârico en oultivo sumergido alconza Interés industrial .4*. eerie experimentalEstudio del volumen dptimo de medio de oultivo para oultivo sumergido en los nuevos recipientes.

La oapaoidad de dichoa recipientes (vêaae Pig. 1) varia antre 1*700 y 1*800 oc. En oate ensayo eatudiamos el volumen de medio mâs conveniente para la dptlma producoidn de âoido fumârico, que debe cultivarse en diclios recipientes*

Se ensayan les siguiontes voldmenes de medio de (Biltlvo* 150, 250, 300, 350, 400 y 500 cc. del medio de oultivo emplea do en la segunda serie experimental del presents Oapltulo.

Tien^o de cultive sois dlas, a la teji^eratura de 34a* Se arladen al tionpo de inocular 5 grs. de polvo de mârmol estéril por cada 100 oc. de medio* Los resultados de este enseyo ae recogen en la Tabla XXXIV*Qomentario *- En la agitaeldn de estes nuevos recipientes influye el volumen del medio que se agita oontrariamente a lo que sucede en los matraces. En êstos el movimiento circular

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que se lj#rlme al medio haoe més favorable la aireacidn ouan- to més delgada es la capa que recorro el fondo del matraz* Be log nuevos recipientes se lanza el medio contra los dos eztz^ moB prodttoiôndos© uns fina capa de liquide que resbala por la superficie cdnoava de diohos extremoe y oae produciendo aWn- dante espuma* Este choque se repi te cons tant emente porque la longitud del recipients esté calculada de manera que el liquide golpee alternativamente sobre una y otra pared, haoien- do quo la aireacidn ses abundante* Conforme se aumenta el volumen de medio (de acuerdo con la oapaoidad del reoipiente y oomo se obsefva en este ensayo) més fuerte es el cheque, «ég espuma se produce y mejoi es la aireacidn oonseguida*

En la Tabla XKXIV se oompiiieban les detalles ocmentadoe* El rendimiento del 50 por ciento sobre azdcar oonsumido que se obtiene oon el volumen de 400 co* es uno de los majores oonseguidos on la fermentacidn suaergida de fumàrioo, pero no sô continua utilizando porque Hega casi al limite de la capacidad del recipients*

El azdcor ae consume totalmente en todos los casos y nos demueatra que cuando la aireacidn no es suficiente el adcro- organismo consume oarbohidratos por vlas metabdlicas diferentes a cuando existe aireacidn abundante en que el consui^ de azdcar se traduce en produocidn de écido fumérico*

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135 -

58» seiie exnertmontal*- Oultivo mmergldo #n mievoe reoi - pientee* Estudlo del tleaq>o de Imoub&oldn més favorable*

Con el medio de oultivo empleado ea la serie anterior, proourando aoortar el tieiapo de Incubaoidn paira que este proceso de produocidn micoldgioa de éoldo fumérico t@g&a Interés industrial*

En nuevos recipientes oon 350 cc* de medio de oultivo a los que se aüade cuando se inooulan 5 gre de polvo de mér- mol estéril por oada 100 cc* de medio, se toman muestras cada 24 heras*

Las condiciones de tes^erature. y pH inicial s<m re^eo— tivamente 34® y 6*

Los resultados se desoriben en la Tabla XXXV*Qomentario *- La prlBiera muestra corresp<mde a las 48 horaa de oultivo y se observa un consumo reducido de azéoar invertido*

A las 24 lieras més tarde corresponde un Intenso conanmo de aadcar y una icportante produocidn de fumérico* En el in- tervalo entre las dos primems muestras comienza el metabolismo de sustrato hacia la fonaaoidn de fumérico un& constituldo el micello y por tanto su mg eapacidad ensd.- ffiética. A las 72 horas de inoculacidn e incubacidn, el ren- diffiiento ee del 30 por ciento*

Los valores de écido fumérico siguen aumentando pero a

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ritmo més lento y alcanzan el rendimiento del 45 por ciento a loe sels dlas de desarrollo #

iàa posteriores enaayoe hemos consoguido reduoir el tioa - po de oultivo intensif!oando pzinoipalmnte la aireaoite, mediante el eBq)leo de fermantadores de acero inoxidable*68. serie experimentalEstudio de la ferm^taoidn fumérioa en fermentadores de aoeio inoxidable, en escala industrial*

El medio de cultive es el habitualmente empleado en este Oapltulo a partir de la seûnda serie experimental*

de preparan las sales del medio que oorreônden a àooe litros y se esteîàizan dentro del fermentador de treinta litres de oapaoidad, junto oon la oantidad fijada de sacarosa invertida mediante paso de una corrionte de vapor de agua pro oedente de un autoclave. La oondansaoidn del vapor de agua llega a complétai" el voluiuon de dooe litros.

al comenzai' el piocoso y antes de la inoculacidn se analiza el azdoar invertido y el oontenô en sulfate amdnioo, previniendo la exoeaiva diluoidn.

Las muestras se toman a tlompos distintos y on la Pig* nfi ô se sigue la üiarcha del piocoso tanto reapeoto a la pro— duooidn de écido fumérico oomo al consumo de azüoar y de sulfate aradnioo*

La tempo i‘atLU'*a se mantiena a 34s, la corriente de aire estéril pasa oonstanteaiente a razdn de 0,25 litros de aire

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por minuto y Htro de medio*Coaentexio*- La concentraclén Inicial de aadcar invertido ee de 11,5 gre/lOO cc. A lae 88 horas de desarrollo, ouando el mloroorganl smo Heva 12 horas en presenoia de polvo de màrzaol estéril ( carbonate célcico cristalizado) la concentraoidn de écido fumérico se eleva a 4,2 grs/100 co. Oomo el azdcar no se ha agotado totalmente y existe en este momento de prooeso todavîa la cantidad de 2,2 grs/100 cc. el rendimiento se eleva a 45 por ciento del azdcar oonsumido. Este valor se al(»n- za oon este ensayo en un tlempo muoho menor que en la eerle precedent© (88 horas f rente a 148 hoi»e)

Oomo se comprueba por estos dates la agitacién més enéz^ gioa y con constante entrada de aire estéril, son las vmitajas que présenta el fermentador de acero inoxidable f rente al — nuevo reoipiente disenado por nosotros (vease Fig. n® 1) que hacen posible acortar el tiempo de oultivo conaiguiendo un rendimiento del 50 por ciento mediante una incubacidn de 126 horas.

Bn la Pig. nfi 6 se advierte con claridad que existe un tlenpo critico en el cual se consista el consume de sulfate amônico del madio y se aoelera la produocidn de fumérico. Este sucede entre las 40 y 70 horas de desarrollo, o s w a las 24 horas aproxloadamente de aRadir el oarb<mato célcico. La presenoia oomo neutralisante del polvo de mérmol es decisiva

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para que oomlmioe la prcduoei^ de éoldo y ae utilioe efieaa- mente en este sentldo el azdoar invertido preaemte en el medio.

La Fig. afi 6 nos miestra también la lno<mvmilenoia de po prolongar el période de incubaoidn porque ademàa de restar interés industrial al prooeso, no oonduoe a majores resultados ye que, al ego tarse oomple tamente el sustrato hidrooarW nado el moho continda metabollzando los produotos interme - dios que oomo el fumérloo, contienen alguna energla y los ques» ooflpletando el prooeso de degradaoidn de la gluoosa a anhidrldo carbdnioo y agua.

En la misma Fig. ns 6 recogemos el ensayo en el fermentador de aoero Inoxidable de un medio en que la oonowtra - cidn de suif at o férrioo se disminuye a 0,025 grs/litro y la de azdoar invertido tiene el valor de 6 por ciento. El polvo de mérmol se adiciona al tiempo de inocular la pxH^oroidn del 4 por ciento.

Todos los factores oitados que se han modificado ree- pecto al primer ensayo que hemos comentado, influyen en que la produocidn de écido fumérico se acelere notablma@ite y se consiga en 60 horas un rendimiento del 58 por ciento sobre asécar oonsumido.

Oî s /it trégeno/formol

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GAPimm Ti.

wcmhâ DE fOmAOim 3WL AOXDO fOMARXOO T MEÎAB0EI1Î0S IDmHPI0AD03 MEDIAHXB (mmATOGRAFIA.

Part# t#drloa»

En Xa# oondlol<mea experlmantales que se ban detallado en los anteriores Os^ltulosf los rendiialentos de âoldo fumé- rloo en oultivo sumergido* ban alcanaado valor es satlsfaote— rios: sin embargo, un oonocimlento ads oomgpleto del prooee# bioqulmico de formaoidn del âoido fumdrioo a partir de sus- tratoB hldrooaz^onados, fermantados por ooboe, aportard dates y factorea a tener en Quanta en la producoldn de diobo doldo•

Teniendo en ouenta que aXgunos au tores, conslderan les âoldos aoétioo o oitrloo, oomo paso intermedlo en la forma— oldn de âoldo fumârloo por mloroor^mlomos, se ban llevade a oabo algunas experlenolas en las que eatos oompueetos ban servldo de sustrato a la aooidn de un ai cello prevlamen- te desarrollado en un medio de cultive normal» Los Ifquidos résultantes ban sldo estudlados mediante tâonlcas oromato — grâfioas para id@otlfioar loa âoldos formados en estas eon- diciones* Ademâs, diohas técnioas se ban apllcado ta#>len al anâllsla de los âoidoe producidos en medios normales de cultive &a. condioiones aerdbioas y anaerdbicas y en medios desequilibrades en cuanto a la conchatracidn de nitrdgeno.

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con el fin de coxaprolDar los caminos xsetabdlioes segoldos por el ndoroorganlsmo en la degradaoidn de la glucosa a âoldo fuaârloo»

laa té<mloas de onltlvo de remi^lagmmlento ae ban usa-do por Bxtkewlstcb y Fedoroff (11) para estudiar la trane - formaclén de aoetato en âoido fumârloo por eu oepa de Hhlso- pus nigircans* Oomo mietrato se e#>led también etanol, supo- nléndole paso intermedlo en la degradacidn de gluoosa a âel— do fumâriool La ecuaoidn deduoida de sus observaoionesy para la formaoidn de âoido fumârloo a partir de glucosa est

^ Og ----------- O 4 H 4 O 4 *■ 0 0 g I 4 H g Oy de ella se deduce que el rendimiento no sobrepaaarâ en ningdn caso el 64,4 por oient0, del azdoar oonsumido.

Tambiân la escuela polaca de Obrzoaosa (17) y la de Bemhauer (7, 8) estudiaron la aintesis de âoidoe or^bioos a partir de aoetato oomo dnica fuente de carbone» Suponian que en el metabolissK> de Aspergillus y Pénicillium, axis- tlan mécanisme de oondensaciôn de aoetato para dar lu^r a âoidoe orgânicosg oomo sdooinioo, fumârloo, oxâllco, aâlioo y oltrioo, partiendo de moleculas de glucosa que prevlame#- te se degradaban a aoetato*

Nuestros ensayos sobre el citrato sddioo, oon micelios preformados de Rh, cruzae tienden a estudiar la posible to- tervenoidn del ciolo de Krebs, en el prooeso de formaoidn de

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âoido füMrloo por mohoe* Diobo ciolo ouenta al âoldo fuxaârl- oo entre bus ^labones y su acuiaulaoidn ©n algunos oultivos Bupone oarencia o débil aotuaoi6n de la enaima fumarasa* Poe- ter, Waksman y sus colaboradores (24) afirman que los altos rendlmlentos de âoldo fumârloo, obtenldos oon su oepa idilmo- pus nigricans nfi» 45, obligan a exoluir el eiolo de Krebe de la formaoidn de âoido fuioârioo a partir do etanol* Quando las condioiones de oultivo son franoamente aerobias sap<men una conaensacidn de fragmentes de dos carbonos (oo2«> aoetato) ya que los rendiniientos tedrioos do moldoulas tetracarbcmadas a partir de estes fragmentes dicarbonados, por medio del ciolo de Krebs, aloanzarfan solamente el 67 por oiento, mi entras - que los obtenidos en sue ensayos llegan al 80 por oiento* Ade mâs aunque el ciolo tricarbozllioo aotuase oon su ofi«>ciencia produciendo âoldos dicp-rboxîliooe tetmoarbonados, los rendlmlentos nunoa serf an tan altos, ya que algunos de estes oompuestos sufren inevitables desviaciones a aminoâcidos etc*

Las oondiciones de aireacidn del medio de oultivo son de ci si vas, admitiéndose para algunos Pungi la presenoia de dos mécanismes para la slntesia de âoldos dioarboxfllooe de ouatro carbonos:12 • Oondensaoidn de dos fragmentes di carbonados ( Og 4 Gg )2fi. Pijacidn de un fragmente de un carbono sobre otro de très

carbonos ( Gj 4 0% )

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El primer caso se da en condioiones aerobias, preferea- teaaente y se ha cos^robado oon etanol marcado por 0^^ (25),zslentras que el segundo se da en condioiones anaerobias* posible que ambos funoionen en presenoia de aire y bay que sdmi tir que, oepas de Mue orale s producen âoido fumârioo aero— bioanent© y no anaerobicamente y que otras, las o^jores pro- ductoras, poseen un mccanlsmo de fijacidn de OOg que auple- menta el mecanismo mâs regular y frecuente de la oondmsa- ciôn de fragmentes dioarbonados (26).

El âoido pirdvico producido al final de la degrqdaoidn de la glucosa, por carboxilacidn darâ oxalacétioo (0^ 4 0^) por de®arboxilacl6n acetaldehido y etanol, que se ban en- contrcdo en cultives de Rbizopus y en nuestros eniMyos en fermantador de acero inoxidable bemos co&^robado la presen— cia de acetaldehido en los gases de salida, y finalmente la reducoidn del pirdvico previa a la carboxilacldn o desoar- boxilacidn, da lugar a âoido lâotioo tambiâc dwaostrado en nuestros cromatograiLas• Todaa estas hipdtesis se ban aducido sobre la formaoidn de âoido fumârico por Foster y colaboradores (27) *

De aouerdo oon oiertas observaciones (9) y a pesar de haberse encontrado en plantas y ndoroorganismos, las enni— mas que participan en algunas fases del ciolo de Krebs, se créa que dieho ciolo no es el camino principal para la oxi-

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dacldn de fragmentos dioarbonado© (17) * Inoluso ao ba afl3>- nmdo que los âcidosofoetogJ^târloo y ôxalâoetioo présentes en algonos eultivoa, s%i debldoa e la aoeidn de enzizoas laâs relaclcmadaa oon el metabollemo de amlneâeldos y proteinas que oon la oxidaoidn de fragmentes dioarbonados* Sa nuestros croisâtograiaaa, apareoe rel teradamente la manoha Idttitlfieaâa oomo âoido etoglutérloo, que puede Interpretarse segdn las hipdtesis citadae*

Becientes avanoes en el estudio de metaboUsmo Interme- dlarlo de hidratos de carbono, han aclarado el prooeso aegdn el cual, sustanclas de dos carbonos oomo etanol y aoétioo, pueden dar lugar a materia oelular en microorganismos oep#- ces de utilizerlos oomo dnioa fuente de carbono (40, 42, 43, 44, 45 y 67)* Bsto sucode en Pseudomonao, algunas oepBB de E.Ooll y oiertos laohos (60) donde parece darse una modifier cidn 0 paso seoundario del oiclo de Krebs, que produoe un nuevo ciolo.

En experionoias oon oélulao de Pseudom^ias KB, cultiver daa sobre aoetato aadnlco y écido aoétioo maroado oom 0 ^ oomo dnlcas fuentes de carbono, mediante anélisis auteradlo- gi'éflcoB (41), ee mostrd cdmo las células oxidaban el aeéti- co a travée del ciolo de Krebs, pero de la distribucién de la radiaotividad entre los coHÇiuestos marcados que prooeden del aoetato, aef oomo de los cambios que sufren durante el

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oultivo, puede deduoirse que, el âoido aoétioo entama en el ciolo por dos puntoo, forimndo en un caso oitrato y ^ el otro doidos dicarboxllicos (58, 97). M primer© que conduoe a la formaoidn de citrato consiste en la edioidn de aoetatoa oxalacético en presenoia do OoA y AÏP, y el segundo, se- giîn Komberg es la adlcldn de acético a glioxlUco mi pre- Boncip de CoA y ATI por accidn do la malatosintetase (97),La presenoia de glioxllico que hace posible la anterior reeg cidn se debe a una nuova enaima la isocitritasa que actda so bre el âoido isooitrioo y que ee enouentra en beeterias (74) algunos Fungi (60) y en levadums, cuando las condioiones de cultive Bon aerobias y se usan âcidos orgânioos oomo fumites de carbone (75).

Admitiendo el ciolo glioxflico (glyoxylate bypass) existen dos posibilidades del ciolo trioarbozflioo: una la oxida— oiôn del aoetato a través de las conocidas reaociones del eiolo de Krebs, realizdndose la oxidaoidn compléta de una molé— cula de aoetato on cada vuelta del ciolo, la otra posibilldad consiste en sustituir las reaociones oxidativaa (paso de iso— oitrato a malato) por el nuevo ciolo de glioxllico que siate- tiza una moléoula de suocinato a partir de dos de aoetato en ctida vuelta del oiclo. En nuestros anâlisis oromatogrâfico», en condioiones prdxiiaas a la anaerobioeis (cromarograma nfi 8) se advierteh lasoichas oon % same jante al de los isémeros del

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âoldo gHoxlUco quo se puso oomo patrén.Oon todo ello, la ooadenaaoldn de dos moléoulae de aoe%

to que carecla de coa^robaeldn experimental, vuelve a Intere— sar en reclentes estudloe y anaque la reaooldn total sea Igual a la postulada por Themberg y Knoop (87, 39), los pesos renies se Interpre tan asfs

aoetato 4 oxalacetato citratocitrato — isooitratoIsocitrato--------------------- suocinato 4 glioxilateaoetato 4 glioxilato .. .. malatomala to 4 1/2 0^ -------- oxalacetato

reacoidn totül: 2 aoetato 4* 1/2 O2 succinoto.La formaoidn de funârico a partir de sustrato dioarbo

nados oomo etanol y aoético, se interpréta segdn el nuevo eiolo (40) que coiaprende los resultados de Foster y oolaborado— res (24,25,26 y 27) resuitando aegdn las reaociones aiguimi - tea:

isocitratoaoetato 4 glioxilato iüalato 4 1/2 0^ aoetato 4 oxalacetato citrato iccinato 4 1/ 2 Ogsu

suocinato 4 gliQxllato— xaalato

oxalacetato •— citrato— isocitrato— fumarato

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2 aoetato 4 Og ------- fuzmrato.La aouzmlaoldn de âoldo fumârloo en cultlvoa de Eblzo-

pus haoe suponer esoasa activldad de la enzlma fumaraea. Los âoldos oltrioo e Isooltrloo aetuan oomo oatalissadoires en la producoldn micoldgica de âoido finx rioo anâlogamente a lo que micede on la produc ci én de oltrioo por mohos.

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GAPimW II p8%*te experimental.

(mommmmAa de acîdos libres en msOTRTos msayos m cot-Tivo anmOTDO,

1#. eerie experimental#— Ormmttogramaa de medlee de eultive con variaoiones en la oonoentracidn de aolfato amdnlee y eue oorre^ondlentee reaaoplazamientos. Oultire emmergldo en ma— traces.

Demos a oontinaaciôn en el Cuadro I la nomenolatara y oongposiclAi de los medios que se snails an por el m#todo we- matogrâfico de Lugg y Overall (51),

CDADRO I

0o b o.80^(NH^)2 Oofio.aadcar invertido en grs/lOO oe.Grs/lltro 6 Gre/lOO 8 Grs/lW 10 GrsAOO0,5 medio 1 medio 2 medio 31,0 medio 6 B^iO 7 medio 82,0 medio 11 iwdio 12 B^dio 13

Estos medios que indioan la oomposloidn en euanto a la oonoentraoidn de sulfato amdnioo y asdear Invertldo, (el res to de las sales del medio se aastlenen en las oonoentraoio- nes aooatumbradas, as! oomo la adioién al Inooular al 5 por oiento el mdrmol, veanse series expérimentales anteriores)

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iBdloan asl mlamo oan una omsa loa oorreeqpoudlmitea medios de rem^laaamlento, ouya o^mpoaloldn os dmloamaate do aaoaro- sa invertlda a la eonoentracidn del 6 por oiento que se adiei<ms aooB afleda de polvc de mdrmol estéxil (5 por oiento) oomo agente neutralisante, deepués del que primitive mioelio desarrollado an el primer medio de oultivo, ae ha lavado re- petldas veces oon ague estéril para HJbrarle de los rest os del anterior medio.

En los oromaÊograxDas ndmeros 1,2 y 3 se resumen las man ohas oh ten! das en el anâlisis oromatogrdfioo de los anteriores medios de oultivo. Las muestras correspondientes a los medios anteriores el reemplasamimito oorrespondmn a 10 dfas de inouhacidn y se anotan loa tl^mpos de incuhacidn correspondientes a las imestras de los medios de reenplazamiento (6 o 10 dias).Qoaentario ♦- la reproduooidn a esoala reducida que se p3% senta en los citados oroma6)gramas ndmeros 1, 2 y 3, se ohser va que los medios donde se efectud el desarrollo del mioelio antes de reen^lazamiento, aparecen manchas de Rp inferior al âoido tartârioo y ouyos Rp no pueden Identifiwrse por el método en^leado que tlene oomo valor manor Rp el oorregg^on- diente al tartârioo (Hp*0,21).

3e sup one que estas manchas de oorto Hp que deoma a âeidos fosfdricos porque ho apareoen an los medios de ream-

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- 152 -

plaaaflKtôii'to • Bay una eocoepoldn an @1 madl# l'w que d0M.do a la aawsa oonoentraolda de sulfate aiîioo en el medle Iniolal (0,5 grs/Utro) no se debid oonaualr adeenadasente el foefato, lo que suoede oon nonaaltdad mx los medios de oultivo durante la primera fase de oreolmlmito, en que aô- tan el fosfato» 2n el medio 8 apareoen tod os los ormmatogia mas eieotdadOB oon una manoha may intense, de gran tamaflo e Irregular, que llega hasta la zona en que apareoe el âoido oltrioo aln que se logre reduclrla y deteimlnar su vwdade- ro Rp# las man ohas del orlgen pueden ser re&tos de âoldos isorgânloos fuertes.

En todas las muestias de oomprueban manchas a la altu-» ra an que apareoen los âoldos aâlico, lâotioo y fumârloo*El âoido alfacetoglutârioo también en las muestras de me«- dio de oredmlento y reœq>lazRmiento excepte en los medios 1 y 1 %20* serie expeidUmutalMétabolisme del âoido oltrioo por mlcello preformado de Rhlzopue oryzae*

El moho se cultive sobre el medio habituai y en loa - nuevo8 reoipientes diseîiados al efeoto (véase Fig* nfi 1)* A las 48 horas de desarrollo se reen^lazan los oultivoe por un nuevo medio que consiste ea 300 oo* de buffer de oitrato sédloo pH « 6* Las muestraa que reproduolmos en el orosato^ grama n&. 4 oon la letra a correônden a 24 y 72 horas des

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pués del reeaplagasKlmto y a loa 10 dias del mdmmo. Slaal- tdnsamente se llevd a cabo este sdLamo enaayo en matzuess erlenaeyer de 500 oo# de oapacddad ocm 100 oo# de medio oon el fin de oozQmrar los resultados de ambas series# Las imiea*» tras oorrespondiMites a esta dltima tCHsadas an los mlamos périodes de Inoubaciôn (24,72 boras y 10 dlas se disttnguen oon una M#

Los croiBatograïaes nfi# 4, 5 y 6$Gomentario£1 medio de oreoiiKlento que se analiza a las 48 horas de inoubaoidn, antes del reeaplazaalento, produoe tanto en matraoes oomo en los nuevos reoipientes las aanohas atrlbuldas a Wlioo, lâotioo y fumârloo# los matraoes se advierten manchas de oorto Rp y de alfaoetogiitérloo, que inexplicablemente ne areoen en los anâlisis oorrespondientes al medio inoubado en los nuevos reoipientes# 3in embargo oon el método de Gavallini, previa preoipitaoldn de las 2-4^dini trofenilhidrasonas # apareoen las manohas del alfaoe toglutâzioo en diohas muestras#

Los cultives de reen^lazasiento con soluciones de oit» to sddioo no produoen mâe que la manoha atribuîde al oltrioo en las muestras de 24 y 72 horas de inoubaoidn, tanto en matraces oomo on nuevos reoipientes. A los 10 dlas persiste la mancha de oltrioo y ademâs se observan las de alfaoetogluti- rloo y Idctico# Lsto puede deberse a un l^to métabolisme dsl

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oitrloo que ueoeaita aâs tleape de laoubaoidn para dégrader se» también que las oélulas se autoHoen y los aadiioéoidos présentes (gluWW.eo) den lu&ar a alfaoetoglutérloo.IfOB oetoâoidoB pressâtes se eomprueban por el método de El t#Lwary (18) y por el de Gavallini y Prontall (12). las - a^nobas de alfacetoglutârioo apareoen por ambos métodos en las muestras del medio de desarrollo antes de reemplasar y en las correspondi entes a los 10 dlas de reeiaplasaml ento oon citrato sddioo• En muestras de 72 horas» las aanohas de alfacetoglutârioo se perciben dnicamente oon lus ultravlo*- leta y aparecen también manchas de largo (0,94) que no se han identifloado.

los medios de oultivo Inioiales oontienen poslblemente âoido pirdvico (Vease oromatograma nfi 5), pero no se bô su presenoia por el método de lugg y Overall por ooinol"- dir los Rp del lâotioo y el pirdvico.3^* séria expérimental.- Metabolism© del aoetato aédioo por mioelios preformados de Rhieopus ory&ae.

Jîn este ensayo a© prépara una serie oon imevos reoi — plentes tapados con vasos de 50 co. estéril» en que durante dos dies se desarrolla el moho en el medio habituel de oultivo con 4 por oiento de azdcar invertido y la adioién al tienç)0 de inocular de 1 por oiento de polvo de aârmol esté— rll.

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A los 3 diae se adlclona este medio de creoiadento eon los slguientes:

Medio A^* oompuesto por 3 grs/litro de aoetato sddioo que 86 tampona a pH 5 ocsi âoido aodtioo,

Medio A2, contiene 6 grs/litro de aoetato sddioo tarn- ponado a pH » 5 con aoétioo*

Medio A^, contiene 6 grs/litro de acetsto sddioo a pH = 7 sin tang>onar*

Exi otra serie de recipientee en vez de aüadir aoetato sddioo en las condioiones desoritas, se rees^laza el primer medio de oultivo por*

Medio contiene 3 grs/litro de aoetato sddioo tampo-nado a pH 5 con âoido aoétioo.

Medio Bg, contiene 6 grs/litro de aoetato sddioo taaqpo-nado a pK * 5 con aoético.

Medio contiene 6 gra/litro de aoetato sddioo taa^o-nado a pH « 5 con buffer de fosfatos,

Pinaliaente en una teroera serie se intenta desarrollar el Bhizopus oryzae direotamante sobre acetate sddioo omao dnioa fuente de carbono, Los medios de oultivo son los si— guienteBJ

Medio C , oon 3 grs/100 ce, de aoetato sddioo tei%>e— nado a pH = 6 con âoido aoético.

Medic Og, oon 1,5 crs/lCO co, de aoetato sddioo taapo—

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nado a pH « 5 con âoldo aoético*Medio Oj, con 15 gre/100 co. de aoetato sddioo tenpo%

do a pH » 5 oon âoido aoétioo*Medio 0^, oon 3 grs/100 co* de aoetato sddioo a pH * 7

sin tasponar*El tieqpo de cultive varia en cada muestra* las prime

ras se toman a los dos dlas de desarrollo en los medios detallado s anteriormente* Hay miestras que corresponden a 4 y 5 dlas de desarrollo*

los reoipientes se oolooan en agitad02>-bandeja ya des- crito cuya teaperatura se mantiene durante el prooeso a - 342 0.

los ci^matogramas reproducidos por los ndmeros 7 y 9, muestran las laanohas obten!das an cada uno de estos medios bien oomo âoidos libres o en forma de 2-4-dinitrof^lilhi- drazonas*Qoaentario*— En el oroaatogrewaa n2 7 ae observa que los medios A^, Ag y en los que se efeotud una adioidn de aoete to sddioo tamponado al medio de cultive inicial» muestran regulazmente las nmnohas debidas al âoido alfaoetoglutârico y apareoen asimismo manchas de Hp largo no identificadas, en todas las muestraa oorrespondientes a los dos» cuatro y oinoo dlas de cultive* Por tanto, no hay inhibicidn por - parte del acetate sddioo cuando se adioiona a estos medios

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de cultive bien desarrelladoa*Del mismo modo el oroxaatograma nfi 9 en que se anaUzan

los doidos libres gor el aétodo de Lagg y Overall, nos mues tra las manchas oorreapmidimites a los doidos mdlico, Idoti- 00 y fumdrico, aunque no se aprecia la debida al alfaoeto— glutdrioo debido sin duda a la pooa ocmoentraoidn de la m u % tra aplioada al papel, como oabe deduoir de susparieida en el método de las 2-4-dinltrofenilhidramonas, en el que se précipita primero y luego se extras ccai aoetato de etile.

Los medios 0^, 0^ y 0^ no oonsiguen el desarrollo del moho y demuestran que el aoetato sddioo no sirve m estas condioiones como dnioa fuente de carbono. No hubo consume de aoetato como se oosprobd por el azWHisis de aodtioo residual, mediants el método de determinacidn del mismo oon arraatre de vapor y valoracidn del destilado con NaOE, ni adn después de adicioimr a todos estos medios 1 por oiento de azdcar invertido oon 1 por oiento de polvo de mérmol estéril, Esceptuamos el medio Og en el que al principio taape- 00 se observé desarrollo méa que ligeramente en tozno a la booa del reoipiente, pero que aloanaé normal degmrrollo despues de la adioi&i oitada de 1 por oiento de asdcar invertido y polvo de mârmol, El anâlisis del aoétioo residual dmsos tré en este caso asimilaoién de aoetato, por lo que puede suponer se que en estas oondiciones el mi oroorgani smo es oa-

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p u de Incorporar a su metaboliss^ el aoetato,

N O T A.— El ermnatograma nfi 6 oorreeponde a laa ccmâloiones expérimentales âetalladas en la 3#. sexie experimental del Oapltulo Y de esta Tesis, Puede obeervarse la aperioidn de manchas a la altura de Rj» correspondiente a les dos iedme- ros del âoldo glioxllico cuando el prooeso es anaerobio y que sdlo apareoe el cetoâcido, alfaoetoglutârico, cuando el prooeso llevado en el fermentador oon abondante airea - oidn es franeamente aérobic (42, 43 y 44) #

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Sa loa nuevos reoipientes en los que se sustituyô el medio de creolmiexito por los medios desi gnados como Bg y no pudo advertirse en ningdn ormnatograma efeetuado por los todos de Xugg y Overell 6 Oavalllnl* aanohas signifioa tivas* Unicamente &i las muestras oorre^ondirates 'a oinoo dlas de inwbacidn apareoe en el £^dio deido fumdrico y en el medio Bg âoidos oitrloo y lâotioo# También en el oroisa tograma por el método de Gavallini se advierten manchas no identificadas de largo Rp que ya oitamos al hablar de los me medios A#

En estes medios de reec^lazamiento donde existe un miojB lio preformado que puede retener residues del medio iniolal, que incluse posteriomente puede «xcretar ccHsptxestos endooe- lulares o sufrir una autollsis, las hipdtesis ante la apari— oiôn de conpuestos taies como el alfactoglutârioo, lâotioo, eto, son un tanto aventuradas y por eso nos limitsuaoe a expo ner hechos expérimentales#4## serie expérimentalAnâlisis oromatogrâfîcos de muestras sucesims de un ensayo en el fementador de aoero inmddable#

Este ensayo se refiere al descri to en la 6*# serie experimental del Oapltulo V de esta Tesis y las condioiones de oultivo pueden verse en dicha serie#

Las muestras se toman oomo se describe en los cromto- gramas 7 y 8 a tienpos de incubaoi dn distint os y su anâliàia

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CTOmatogréfloo cualttativo sobre papel ee lleva a cabo por los métodos deeorltos en "Material y Métodos de trabajo en oultivo soperfloiel y sumergido"#

Las figuras nfi 7 y 8 representan en aboisas los valores calculados del Rp de las manohas que apareoen en las muestras anelizadae y en ordenadas las horfis en que se t omar on diohas naiestras* Asimismo se adjunten los valor es de t ides— cri tes en el treha j o de Wood y Bender y que eirven detdnaino de compara oidn para los hallados por nosotros# Oomentarlo#- Los oromatogramaa efeotuados por el método de Lttgg y Overell (1?) para âoidos libres en papel Schleidez^ Sohtill 2043» desoendente y los ascendantes en papel Whatmann nfi 4 se representan en las figuras ndmeros 7 y 8*

Puede observtirse que en las veint loua tro primeras horas de Inoubecién aparecen manchas de oorto Rp que segdn los va— lores que se adjuntan deben atribuirse a éstores o âoidos fosfdiloos* A las cuarenta y ocho horas de incubaoién comlen- aan a apareoer manchas mâs alejadas de la llnea de origen y por tanto con un valor de Rp similar a los de los âoidos oftrico, alfacetoglutârioo, lâotioo, etc. y que persisten durante todo el prooeso de fermentaoidn mien tras siguen spare ci endo manchas de mayor Rp (0,78 y 0,83) en el oromatograma ascendante que corresponden a âoidos sacclnioo y fumârioo* En las muestras finales obtenidas a las 144, 168 y 1^2 horas

•* X63 •"

de wltlvo en el fermentaâor de aoero ImmdLdable# persletea las aanehas atrlbuldas a &oidos fumârloo# léetloo# sacolml- cot aâlioo, oltrloo y elfaoeto&lntârieo y ban deaapareolâo por ooapleto las atrlbuldas a dateras o âoldos fosfdrloos de corto Rp.

Bstos resoltados nos sngleren que el metabollamo de la glucosa por el mlcroorganlsmo utilieado ooadenza en la foe- forilaclôn del hidrato de oarbono por aocidn de loa fosfatos InorgânlGoa y enzlmas, y de a M las manclias de oorto Rg de las muestras primeras, conforme el mWio adqulere la plena capaoidad mrzlmAtlca para contlnuar el métabolisme de la glu cosa no ae obaervan dichos c(m vue8t08 fosfdricos y quedan yX Bibles les doldos orgânicos propios de este prooeso fermentative.

En el easoyo que nos ooupa se anallzaron tamblén oroma- tograficamente les gases que sallan del fermentador arrastra— dos por la oorriente de aire y que se reoogleron en ima sola.- cldn de 2-4-dlnltrofonilhidraoina (1 gr. en el lltro de clorbl drido 2îf) produolendo abundante preclpitado aiaariUo de 2-4- dlnl trof eni Ihl d razona •

Por les mdtodos de Cavalllni (12) El Hawary (18) y Sykô— ra y Proshaska (82) se demostrd la presencia de aoetaldehldo en dichos gases, coBçrobada por el dlotamen del Iiaboratorlo de Mloroandllsls del Institut© de Quîmloa Apllcada en que re-

F ^se mov/L : but<3ncl - acético - agua- SC£f*o£ffT£Û 9

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'’TGURA 8

- 166 -

îlta %m Gomtwldo en 24#77 por eieato sien4^24*99 p w oi«ato el que teWloammto m>rro^p<aido a la 2-4- dinitrofoBllMaraamm del aaotaldîldo* El |»mto do fusite do oste oâüpjkooto os variablo y dopmdo do la forma Qdo%m- Unaf para la forma ••ostablo” ol pun to do fusida es 168,5S0* existe una forma **metastablo^ quo ^mde a 157^0* y flnalaon- te on oiortas ooauloiimea puWe hallai'ae una moacla on oqui— llbrio do las dos fox-mas aitadas quo fumlo & I48&O. Précisa- a^to al deteraiaar el panto ue iusldn do la 2—4-disdtrofe- zillhldrasona del aoiâeato ax'raetrado por los gases de sali— da del fermantador, obeervamoa oataa variaoionea an loa pun4 tos de fualAi ohtmXexido para el produoto do 1& prlmwpa taHaaolda el pun to de £ueXta a y ^ el do la e%ondaoris^Lllaaolda (asbaa an alcohol de 96a) el punto de fa^te es da I63SO#

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1«- m ha la pr^htootte W tmÊeXm p wQS gmm =%$ y Brlmmm («Bmoraêe p w

tanto en œ ltiv e oo#o #% c o lt l-

VO mmer#de#

2#— #% m ltiv o Iw omw#&#ôlmwa de cmtdo-

n#8 y# y âa a la produooi^ ê# ioido f m m W w00*1 0#0^ ms/XXia?Q âm y 0*00»eTm/XXtm a# ^â#7Rgp*

3 « - m l0 3 emmyoe em o a ltiv o em w gldo m ^ U m im aoavc

iKWlplemte, dleeMWe e^pe^Lalamte par mumtroa para eg to tip# a@ oaltlve# qua proaaoe rméjüaâmmtoe cKmsiâ«mble«m» ta aleimâoa (69 par a lea ta eoWe e l « W w r êm m iaa) y

rW uoe matmblemamte e l tia#%a ae imœbaolAm (a om tro a

otnoo âfes) *

4#- ^ c u ltiv a m aw W d# u tlllem W a d l# a s W%

1*m lem Isp u re^ a ê# Iw râotivoe de we&KiWê que 1 # ^ # ^

a l m ^ la de ao ltlve# #um j^p cp w -^m ar iM lawme de ^ jr

&m s u fia iœ te e pare a leero ar e l 90 par o iw t# rm îM eae-

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g— le rSiaaiâR ^ m æ W l M w pai® qa* aa madla a® saltti» vo pxûm® teoaoe «mdamÈemW® an «t tl«»® ^ düMedMtiâa reânaiâe. m aêyea «n «atlvo la oogo«m«melin â® àm &»s7U.tro me le aé» oee>v«Bi«ate la @®n@m*tpaaWa de amber iBvertldo w a®lia âca^tr®.

6«» le istmedepoadeseia ds la emmamArmA&i de îmaSetm jr lae b* (s0^j^m^*lSR^ y m ^ ,7 n ^ 8® ha mmalfaetad®®R dlTareos enaeyaa te«b> en osltlro M#erflelal oomo s w w » (!id®. a* e» par£leiel la pmiaaedém de ielâo £t»Srieo es ai® favwahle en el eodlo oon 0,72 grm/lltr® a# ®âle oonoantrooida d® ma do 0 , % K i^re/lxtpo y neM edielone anlfmW f b n o o mtelee* Sa cultive ameacgia® f^lioae^ loe imevoa reetpientes, las otmdieleass aâe fs«®> mVlae & la prodacaKibt de ûaafcloo a® dan en el aedâo de onl tivo «ton 0,72 üTs/litro de oln adîolin de —»i—feto de oiiM y eea 0,12 â« aal£a®o fdrrioo meWe®.naeoa ohsewnmdo gp® el mnauso de aabter ®e ais eo®c>leto «t QOiteoeia de m» ya que en les medles qu# le offlitlrnsm m eeg tidaâ aepeAer a la# Inparesm®, a® emeim mner eanoae d# estoor. £tsm ^Nmrtlr este iaflaanata dsl Za ae prealso W w mm eenoentra^mea Se ioaBaW aaseaidle» iârierwi a 0,M gra/litr®.

- 3U9-

7«> la. waaalâB S/B ttmm maba an @1 deeerroUode eaeyaee y « le prodaoaldB de Soldo AmSrloe, y»sa tæ««e de «alUve eopwfl^tal o mmwgldo tœienâo an ea- as mao aioMmb» voler* saa. aeltive aoperfiolsl la oonoüntr»- oifo de 304 BB^2 «amsteate eaW eeogirmdMa entre 1,0 y 1,0 gca/%S%so tr m ^ a la ommaST&tOM de la-vertldo de 6 a 10 per cslaeto. m ealtlvo œmer#üo en ma#ra» oao ayloBawyaap, les r^lmlenWe malien entre 30 y 14 por oiento oeeaâe la wneentxaelbt de enlAate em*i1oe esM eom* preadida m tr» 0,9 y 1,0 gn/Utro y la de emSmr InvertÊm de es de 10 8 12 per udanto* îie notable la ifibtbloiâa ej«na» aida sobre la predmetbi de Solde AmSrlee por «moantraeig ma de m$erleree a 1,0 grm/lltro que ae adviortenln«dam maaôa la eemwmtraWLSn de eaSoar Iwrwtlâo ee 12 por elmte*

S*» ÿa enlève ggmse^âo «i les mevoa reoSplmtee, ne ee e^^rva isMI^elâa par altss MBoantraelonee de eoUCal# me#» M m , SMosamte ee de âttâm inMbielte oœmdo la aemmtr»- otSn &a tmSmr Iwwtldo ee do per Mente y la de craUe» to a S M o o m de 4,0 gre/ll#e. la alre&Mdb tiens m emt»

m»o una ta£lnœoia deeladva eemo pneSe m^praberm al ee»* perar Menl#Æag obtenidos en enltive eamrglde an mbeaam oon les de mamoa reeS#em#e. Sa» r^tâaSentm aloenem en

- XTO

ê0%0B el 9# y w Qtmim eeW# a W m r eenmwÉto w ctow 6fee to iMiàbBOâditf ôtiiuïâe la e»ee##mWito to ^ ly5 gr^/Htre y la to @#âmr Immrtlto to 9*4 pq/XOO to#

#*- am ooltiva mêrf l W ^ Ime eal&a astoitoe y la urto pro- pwoâtoea el eltyd^xio eàecmado i cra la fmmaeito to malMto tolalar# W a ^tretoe Wdlto y potâsloo to seatoieUrm nl- tré06m m torm& eiîUUible per el torn haBiûo ocs^roteao per otres em^pee. m cnltlto # m w *gito retolâ» emt lee toôres fUœtto to aitrâgato el eelfam to y eltoeto aatoâoe aaf ecto la El aitoeto toto a^tolahle y ooofpxtoaato qua lea #p«#e@ aatolooe y toi- iêea sea I00 uMllaatoa pmr d mlwtoP#mlato#

10#- Ee li^^tooiaâlde la presctoia to %m aeuttollaeato peam efeetoar $m cmâioitoto favemblee el preoeeo to la eito eto Bhltopua tourne# m medlee to toltovea %%lmto a to #m# to ee müelaW toitmllmat## to to predateimaéttXm ni im aeraal ortoitotote W L erto totototraqto d vmtor toi ha to memttoWEto w # e Itaitoa mtommtoe (9 y 6) a to tor^ to tedo d pi%eee to fermmtadto#

U # — to toUtod y to mmtitod del aeutraMsamte m m e#%toa@mto Impw^meto mmto fermm&todto* ^ oumato a laha to eos^wahmt^ to î^wtoelto de pmmôm (to# m #

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to# to# to âltoo Ototito»toe mtoTtoM® a to# e wita/Xm to w p d m # W m h W kla Mktoadto to ftodrleo #m odtlvo mmmglto œ mptommyw* #& aultlvo «^^arfidd# e m d t o t e (hasto d d 12 p » dwto) a# afecMto to m m m m mewsto #â el to^^Mlto nX #1 to e W o w lavwtlto# «ai^p# droBdtolmto to toâto ftoiriae tomtoato tod%me e m m t a to

to ocrtomto dtoio# mtototo#

12#- to apliawKÈto oaa# aecityalimete toi p d w to a â m d {^jOa WLmtotometo) tlmw evitoetoe vwto## toW# tore#tipto to aau^mltomtee m%pl«#tos por dlvoMo# tommrnt r«mcMvl(Wl y to ratoMm pastmm gdWLoe de âioto protoeto la m re d m to m tome etoauato #eml mll#wm$e j om

e l im m eate preoeae to fe rw a te d to # ^ m to w tra te to m pretod» to toje ouate y ftodl medj^l elto empedetomt# #te pmm u ^ i tatoetrietos#

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te# pero la pw^hwdto to ftoWWLee to totlem eaatot to urea #e ^ m m m e per el toorewmmtoto y toedemde d edto to pB e toto# toito»*

14«- to retodto ato tovertoto m to prtoueslto to Am#-

*172 -

rlto «il odtlTO resaXto caaado «# matrmw# «r-Immayor to I W o«* de wp&dê&d e« ##dwi 29 ee# to media d« odtlYH m, aa^raoto erlemmyw ##l«ato# m eototivd mmw%ido# d ro^mm d« #dio to cultive #e to100 0#* oemtmaldoe «a matres to 2,000 oe to cepeeltod#

19*— maplrnmde mwvee pedplwtee «1 velumm %tlmo pura Qgmfmgulr Xa major agltadto y oon «lia to alreaelto wâm o w v m l œ t e # «e to 400 oo# WL tles^o to tmmtmêJkk mâm mto- ommûo am to 14# h o m e que no dobe protom#*r#o p n m ovltar que# habieodo agotado «1 aedoar disponible del medle# el

ooammi el âdto tmâeXaa ya formato*

16«- to fonamtntor to eom^ Inoxltoble de JO lltroe to oe-psioltod# m ton a l @ & œ W o rendlalentoe del 90 par aXmXo m126 tome to cultive# #1 la eoutontmdto to ewioar lever-tide Inlolalmente ee toi U # $ per doute* Kete tiempe toInmxtoolto ee rWm>e om&ddemblmmite# a 60 tome# m m o m W gto el rendsl^te toete «1 98 p w eloate# d la oonoeoW»-olto tolelel to we&mr Imvwtlto e® to 6 por dmnte# eom0#029 to ( # J.f# y 1»5 gro/lltre to# 1 « 4 4 «17«- En Ito W H i d m <mm&t%rdfl#eo do dlvereee m#dlee to mxltlve ena^gito# ae im c^e^retode la preeeneia to lee d d -

p W v l w # mdlloe, Motloo y ^m6doe#lto

- 1Î3 -

sloaliaa to na matnholXmn m Xao omm-ûXatmrnm Inaieatoa ai si d t m t o ni el acetate etoiec# M a manabea de toitoof^togtotârlôo y tolto lâetioo que se ob- aermn en I00 wmitom de reemplmamalemtc aobr# citrate etoi- ae pnaâm tembito a#r re^ltrito de antollala de laa tolulss d d mato#

18#— Ha a© ©onalf ue ieearrolXcâr el mehe aebre aoetato atoU— 00 e<mo d d ( m txxmïto to (mztKme# en aultivo emmr&lde# parte toi aeeWte æ a d d l a m pream%ela de 1 por almto to @#to ear Invertido oimado la owoea^molto de a œ W t o ee de 1#9 gra/lltro# em medioe taepenados 0 pH 9 ocm aoétlM#

19#— Ba tmxamtruo mxoealvae, obtmaltoe toi fm'mmtator de aeero ImndLtoble a ti^poa dloMntoo to incubaaltot œ ob- a o m m meaohaa atrlWEda# a to tores 6 âddos fosftoieos «a laa oorre^<m lien tes a la# primerma home de mzltlve# que deeâreoen ouando oouimsan m epereoer las tobldaa e les toidoa oltrloo Qf<tetoëlutérleo# mâlloo, aixoefaieo# Metloe y ftodrlto# loa gaaea de m U d a de dlô feramatoâor# rotoé^doa w W e 2-4-dlnltrofm$llMdrmgim%, æ ha pedido câprebe^ la preeenda de aoetmld^do. letos to tes deauee- tran la wmmiônola de vmrioe prooeeoe meWh<Kllooe en la prodaaoito de tolto f%Wrle© por fermmtaolto y, tmiœde

- 174 -

an eudkta 2a# dlveraaa tewto# d# formcito de dloto â^âa# oreeuoB qua maté ém interla el ee^dle âaâ, perem-taje m qoe oada «mo to lee diverge mamsXmoa wmtrlWye el readlmden# total toi âoito tmârXm preduoldo per Miiee- pua oeyeae i?#kt jr Prtomm Gewli%e (mmeymdo p w mtke#lte#i)

at s M eOe » M Cl

B x m o e u n A

(1) K , Big.#)# (XtU)(2) Akut,Sy7.BtmlMa.J»«i 29, 2X-29 (1959)(3) Awo m.A.,B*Ag# H.B., B««i B.a.,Za4.Bac.CBM.49,X297-U9B

(1957)(4) BartBelwew B.0.,Sta2 B.B. mmi WlUtmlm B»H*

%n4.Bm#*mim.42, 1B0WB15 (1950)(5) BsmlMUMV X.,Tkol* B.,Bimlim,Z. 2$7,147-171 (19)4)(4) B«muk«m X., Xtkam J.,Bm«sh 2.,«talk*-«ikam B.

BlMk«a.Z,320,390-397 (1950)(7) BavMmar X,, lBalaa,Bloahaa*S*233,30-34 (1932)(8) Banhaaar X.,SiaBaaaaga» X*,BiaAam»Z*, 240, 232-244 (1931)(9) Ba»Aal#,B.,Bla<&a#.Z, 182,301-398 (1927)(10) ButkaaAtaak B.,ya4a*#*f B.,Blemaai.Z.204, 440-454 (1929)(11) BaAkaelAaah «.,Pa4amff X., Blaaham.Z. 219, 103-121 (19)0)(12) OaallAml B,,?**mt#ll X., Bleekam. anX BAaBkf# AaAa,

15,459 (1954)(13) ClatAavhaak B.f*, XakkaBaXkymy 9.1.,Q#f#a4 A.B. y Xa4#8kAM X

Blaakam J. 34, 444-477 (1940)(14) Caapar C*X«,Banatoaa 8.A., y Killar 8,A., I»8.Xm#«Ckam,

34,504-509 (1944)(15) CaaBla,V.H.,CmB«.yaiiA. 157, 14^ (1913)(14) Chaftal B.I.,Xamiay B.,Xaakakaa#f X«, Bmll,8aa«e&lm.Blal«

Pasta, 34* 380 (1952)(17) Quraaseaa y Timka#, Biaakam*Z, 229, 343*457 (1930)(18) El Bamay X.B.8. y Theayaaa B.X.S., Biaakam J, 53, 340(1953)(19) Balldi,P.Bar.44, 3737-3742 (1911)(20) Erliak,?.,Biaaham.Z. 34, 477 (1911)(21) Featar J«X* "laXmatrial Paraaatattaaa* Vatarkaflar aai

Riekay, Ck#a»Pmklia . Ca« (1954)

(22) fwter» J.W.» aakmtmn 8,1*, J,lm*Ch$m.8««. 127-1)) (1959) (25) ie«ter,J,¥.,feî»»ms 8,i,,J.m#ot. 57, 599-617 (1959)(24) Pomter, J»W*C«rses S.P,,lmth@my D,8,,D»vl« J#B.,

J#ff#reem W.B, j Long M#T.,Proe,¥#t.l##l.#e,55,665(1949)(25) 9m%9T, X,W, y C#r#em 8,F,,Pie#,*mt.l**a*S«,Pro*,**t,lea.

9«,56, 219-229(1950)(2 6) Poster, J.W. y D*vl# J,B*,l,Bsot, )6, 529-55# (194#)(27) Po#t#r,J.W, ,Cmr#om S»F*,Ruben 8, T Esmem M,B,,

?roe.¥mt,lo#d#8e, 27, 590 (1941)(26) 6ele,S,P«**Cheai^ki lotir# of Beet#** ïïalT# T«t#Preo8,Londo

(1950)(2 9) Oe7rido,J#M*,l]iel#R#Soo#Ssf#Fl8#Quiii#,3erie 1, XLIX,

829 (1955)(50) Gorrldo,J.M## Fhesis Flyl. Victoria Bnir #Maiioh es ter (1954)(51) Ooyet,Te#ia Boot,Vniversltd Straaboarg (1949)(52) Harden y Ycnng,J#Chem#8oo# 21, 169 (1905)(55) Herriok#H,T,Helltaoh R# y Moy 0.E#,Ind#Bag,Chem#

27, 681-685 (1955)(54)21x8vm 1,1# y Oadon E#l.,Ind#Eiig#Chea# 42, 1792-1801(1950)(55) Hopkiao S#F. lgr.Frp#8ta#Mem# 151 (1954)(56) lmne,l.H#,Flnl«y l,#laana F,F#,Fatent 081 2527191(1945)(57) Xarav E#0#,Wakomann S#l#,Ind#Eng#Ohem# 621 (1947)(3#) Elayrer 1*1# y Perquia l#E#,Bioohom*Z# 266, 66-61(1955) (59) Knoop. Flln*Woeh#* 2, 6O-65 (1925)(40) Kormberg H#l., Frets E*l#,Hature#179,988-991(1957)(41) Fornberg H#l#,Medsen K#B#,Bloo!iea*J#66,a8 #, 15* (1957)(42) Koraberg H#l#,Beovers H#, Estare,160, 55-56 (1957)(45) Foraberg n.l#,Biochem#J# (en preasa)(4 4) Frets E*l.,Garia 8*,Bggleetoa l#T#,Bio^ea#J#51,614

(1952)

(45) Xr*ta»B«A« y 51# 414 (1952)(44) Bum y e«r«i»4«ai4aX*s» Bi«yhy*A«te* 25#

m (1957)(47) iKVtam e«# ewyt#r#a4« 154, 25$ (1915)(48) M y — , *8v,ia BaayMl. I, 99 (1941)(49) lwlD,#s4,t»S*#WArS, G,2* y Nay 0#E*,m#Ak4*M,98,

411-425 (1954)(58) lasl*oa4#l#S»#Was4 8,2# y Nay 8,2,#2,4xr*2a## 55,

«49-857 (19)4)(51) lag* y Overall,*a#traliaa J#Sa#Sas# 1, 98 (1948)(52) N— ,Bi04haa.J. 58, 559-545 (1944)(55) Nao BBxya y c*iraa,B.B.,y«aa.Ma.91» 185-195 (19)1)(54) NlkaM#J.,aauok J»,Nialka-aikaah a,,Banhaaar X#,

Maahaa.2. )20, 598-401 (1950)(55) Nelliar4,X, Cmyt. raaâ. 189, 417-420 (1929)(54) Sta— wter#A., Bleahaa 2. 164, 570-982 (1927)(57) NavX y Hall, A4v la — yml. 7,145-209 (1945)(59) Oahoa, S, Stasa,J#K« ÿ Salwalttcr N,C«,2*8ial«(awa,

199# 49# (1951)(59) 018M«P, A „ Z,2ky#H.(»a#.A. 144, 49 (1929)(40) 01#y,Ratvra, 174, 495 (1954)(41) Pfairay,*, 2Mrk. «taa.Balaa. 28, #05-248 (1895)(42) Parraa X, y Oarri&a 2«N## Xav Clw,Aylia, 54, 221-228

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producción de ácido fumárico por fermentación

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