Produc tion of two new quinones, cochlioquinones A and B ,

from Cochliobolus miyabeanus ( Helminthosporium oryzae

Breda de Haau)

]URAI BEL.JAK (*), 0LGA GRIBANOVSKJ-S SSli

/Jrpartmmt of Biolop,icnl Chcrnistry. l.stituto Sup<•riore di Sanitò, Roma

B IANCA. M. RANZI and ANTONIO SCALA

lnstitute of Orgonic Choemistry. Facoltù di Scil'lt.:t', U niuersit,à, .A1ilano

Summary. - Thc production of two ncw y<'Uow pigmcnts, r.ochlioqui­nom· A ancl B. producccl in s u.bmcrged cultttn- br Cochliobolus 1m)•abeanus

(lielmint!tosporium oryzal') ha::; been studierl on laboratory aml pilot-planl sca lt•. 'fhc morphological prupcrlics of the myceliurn lul\·e bcen examinrd. A methuil for tbc isolation and purifìcation of Lht' t'orlùiuquinoues has h ccn stu,licd, togellwr with thcir phy~;i<:o-chcmical prop('ftic·s .

Ria~;s tmto (Produzione lli clml nuovi chi11oni, cocliochinont• A e B , da Ctu·ltlivlwiu." miyalJ<•anu" ( lldmintbosporium oryzat•) Bn>da de Haan ). -l~ stata s tudiata la produzinn<· <li due n.wvi pigml'nt i g ialli. cnd iochinon•· A t' D. ju coltnra somrnl'rtìa di Cochliobolus miy ab<•anus (Jl,•ltuinthosf10rium

Ot:_Y:aP). in una _rala eh <' Yll dalla eo!tura statica, nlln beuta s u agitaton.

al fcrmt·ntatorP da 90 c 500 l. Sono state esaminal<' le proprietà morfolof!i· che rld micdio. l~ s tato messo a punto il metodo per n~olamcnto c la puri· fì <·aziont' d,•i codiochiuuni r1 sono stat~ studiate l l' loto caratteristiche chi· miro-fisiche.

Jl'\TRODUCTJON

Cochliobolus miy ubPanus is tbc perfect s tagc of l/rlmintlwsporium or:r­

:.ae. a species wcll known for it:; morphologicnl aud phys iologica1 variabi­lit-: (Sn oEMAKER, 1959; CmusTE::-;sE~ & DA\' l Es , l9a9) .

. c ,·cral m r taLulites hu' c hc<·u isolatPtl in tlw pa~t ycars from H elmw ­

thr>Sf!Orium ~' pccics : ophiuhulins ( TOZOE et al., 196~; CA"\jONICA et al., 196(1:

(• ) .Fcllow of thc htituto Superiore di Sanità in tllc ycar• 196i-191>ll .

• ·l 1111. 1• 1. SU!a•r . SfJnità (1971) 7, 14-2~

BELJAE., CRIBANOVSE.I ·SASSU, RA:NZl E SC:ALA 15

IsiUBASUl , 1962), s iccanin ( IsotBASD~, 1962a), antitumor s ubstances (GERBER

& 1-E Cu Ev AUER, 1962), anthraquinune derivativcs , i. e. helminthosporin (R.usTIUCK, ROBINSON & TODD 1933), cynodontin and catenarin (ANSLOW

& RAISTRICK l9•l0; 1941). We bave now investignted tbc isolation and purification of two yellow

pigments, for which we propose the namcs of cochlioquinoue A nnd B,

Fig. l. - Structurc of coch.Lioquinoues A and B.

produccd in submerged cultures of Cochliobolus miynbean1~s. They are l[uinones of a novel type, whose str ucture is giveu in Fig. l. (CA.RRUTBERS

ea al. , 1971).

):{ATERIALS AND à'fETHODS

The s train of Cochliobolus mi ·abeanlls was r eceived from the JWyco­theca Universitatis Catholicae Sacri Cordis wh ere it is classifìed as Helmin­thosporiwn ot:yzae Breda de Haao.

Chemicals

f:hcmicals used for fermentations were of pure gra<le; glucosc, for fermen­tations in stirrcd fermentcrs . was of technical grade, cont aining more tban 90 °~ glucose. The yeast cxtract wns an autolysate of hrewcr 's yeast pur­chased from A. Costantino and Co (Favria-To); peptone and suya flour were conun('n·ial produ~ts .

.4 ml. ht. Supe-r. SMtltl). (1971) 1. l <l- 2

.· 16 ESJ•t:IUENZE 1:: IUCF.IICIH:

Cht•mical~.- nscd for quantitative assays and for chemical studics were of analy tical grat.lc. Ali solveu ts were redistilled before use.

For s uumcrg<'d fermcntation 0.05 '~0 of uyu uil contairùog 8 % of Alka· tcrgc G wn;; addC'd to the liqui•l media as antifoam.

CulturP media Solid medium.

Mall-pcptont··agar mcdium: m alt ex trai' t l )if<'o 20 g, peJllone l g, ugar 25 g, dis tilled wntcr l l. pH v.

Liquùl media.

a ) Potato-glucose: potatoes 300 g, (boiled for 30 min, ancl inuncdiu­tt•ly filtcred), with glucosc 30 g, tlistillt..J water l l, pli o.

b) Mcdium Il : peptonc 5 g. KH2PO, 5 g, sucrose 20 g, dis tilled water l l, pH 4.5 (adjusted with o-pbosphoric acid).

c) Mcdium Asada: sucrose 50 g, KN03 10 g. KH1PO. 5 g, MgSO, 0.11 mg. Fe O, 1.5 mg, biotio 1.25 g, d ~stillcd watcr 11, pH •l.G (adjm.tcd with dilutcd Hf.l) .

d) Czapck medium: NaN03 3 g, K21IP04 l g, .MgSO, · 7 II20 0.50 g, :F\! 0 4 • 7 H 20 0.01 g, suc:rose 30 g, agar 15 g, distilled watcr l l , p H 7.

e) Moùi.fic.>d Czapek-Dox medium: NaN03 3 g, 1\IgSO, · 7 lltO 0.50 g, KCl 0.50 g. FeSO,. 7 H10 0.01 g, KH1P04 l g, giocose 40 g, agar 20 g, dis lillPÙ WUler l l , pH 6.

f) Syn thctic Miers m edium.

Fermrntation methods

Statir culture.

Surface growth was carriecl out in H , Asada and potnto-glucose m edia . 300 ml of tbc culture mrdium in u rouud bottom flask wcre inoculated with an aqueous suRpension of myceliwn grown on agar siant for 40 duys at 24/1C.

Culture in sllake flasks.

Cotton wool plugged 500 mi Erienmcyer fiasks containing 100 ml of cultu1 e mcdium were put on a rotary shakcr , opera~ing at 180 rev/min v.·ith an eccentricity of 5 cm, at 240(:. The aeratiou rate in tbc abseuce of myce· liuru v. as about 25 mi of Oa per 100 ml of mcdium per hour. The shake fiusks

4 nn. h t . Supn. St1nità (1911) 1, 14- !2

81>L1Ait. GRlBA:'òOVSiti·SASSli, RANZI E SC.U .A 17

were inoculated with vegetative myceliu.m froru an agar slant, as conidia a re not produced by Cochlioboll1s miyabeanus in surface culture, in a suspen· sion of lO mJ watcr.

A first incuhation was carried out for ~ - :3 days a t 240C, then the secood s tage started '\ith a lO % vfv inoculum, prcparcd from the 6rst stage cul­tu_re, and the incubation was extended to 3-9 days under the same condi­tiou.s as r eported above. During this period pii, mycelial dry weight, car ­hohydrates and some metabolites were measurcd every 24 hr.

Culture in stirred fermenters.

Fermentations b.ave becn carried out in j ucke ted stainless steel fermen· tcrs of 90 and 500 l total capacity, with 50 anù 300 l of culture m edium r espectivcly . Aeration was effccted eitber through a ring sparger with a flow ranging from 40 to 50 l per min at l a tm, or wilh vortex.

F ermenters were inoculated ~ith 800 mJ of a mycelial suspension grown in shake flask s and fe rmcntation carried oo for 70 hr at ~4oc.

A nalytical methorls Glucose.

Glucose was measured by the metbod of SoMOGYI ( 1952) .

. \llycelial dr_y weight.

100 ml of the lllycelial suspension were filtered through paper on a Bucbner funnel, wa!lhed with three volumes of water , and the remainder was then dried at 900C for 24 hr.

Cochlioquirtones.

The routine quantitative determinations were car ried ont as fo llows: LOO mJ suspens ion of mycelium were filterec-1 and extracted with hexane until the extracts were colourlcss . The filtrate was aL~o extracted with he­xane. The hexane extracts wer e pooled and thcir volume det ermined . The cochlioquinones conccutration was estimated colorir.netrically in a Dausb & Lomb Spectronic 20 colorimeter at 39S nm by comparison with a calibra· tion curve preparetl with a cristallised samplc of cochlioquinone A aud B.

Pu.rification of cochlioquinone B was accompli~hcrl ou Floris il co lumn by elution with benzenc-cbloroform 4:L (vfv) .

·l"'' · Tlt . .'ìiiDt'r . Scn otà 1197l) 7, U 22

18 UPEIIIENZE E aJCEilCHE

RESULTS

Morplwlogical obseroa.tions

The mycelial layer of Cochliobolus miy abean."s from surface culture i s very woolish, light·greyish colored and exudnted (Fig. 2). Hyphae are thi­eker, septated , with less pigment localjzed near celi walls than when grown in ahake 6ask or fermenter. The niycelium is filamentous and uniformly distrihuted in the dark. opalescent liquid . Pigmentation ia rclath·ely more inteme than in a ehake 6ask or fermenteJ". Microscopic analysis reveals mu.ch pigment in the cell.

When grown in fermenter ·with sparger the mycelium becomes darkcr and forms amaD peUets of 1-2 mm of diameter. Young hyphae are hyaline, whereas mature ones, after 120-140 hr of growth (Fig. 3), ue full of pigment which diffuaes Utto the medium where it ftoates as a yellow powder.

With vortex, mycelial growth is more rapid, with formation of long. elightly umified hyphae, due to the mechaniCIÙ effect of agitation which causes fragmentation of the yellow-hrown myceJ:iwn anrl the formation of new growth centers (Fig. 4) (CARILLJ u al. , 1961; CBAIN, GUALANDI & MoRISI, 1966; Cum.u, IU.Nz1 & TRECCA.Nl, 1967).

Cultural obseroations Static culture.

The beat development was obtained on agar-mnlt medium. Cultures were t.ranaferred every three weeks, aince after 30-40 days

etozage at soc, a decrease in the development was noticed. The atrwn was normally maintained under minerai oil.

Growth in potato-glueose medium is more uniform and the amount of cochlioquinones much higher than in other media (Tab. l).

In Asada medium only cochlioquinones A has been observed, but two red pigments wer e also present in the culture fluid.

T.usu: l

Surface culture pwth o( mycelium &om Belm.tnthosporlum orpae in three cultnze mecl.ia

p H Ciuco .. Mycdlal c..dùloqulo-CULTURE KEDIUM dry weiJbt

inlliaJ . , oad iuidal l ead (""1/100 mi) (•sfiOO 1111)

.Aaada . , . 5.7 8.2 3 0.67 496 60

Potato-Glucoae 5.7 8.1 3 0. 10 292 125

B 5.7 8.7 3 0.00 272 55

Ann. bt. Svp~. SanitA (1971) l , 14-%!!

BELlA.:, GR.IBANO\ISltl-!IA!SU, 8ANZJ FJ SCALA 19

Fig. 3.- Filamentous rny­celium from Hel­minrlaoJporium ory:sae grown in

a SO l fermenter with sparger.

Fig. 2. - Mycelium from static culture grown HPlmin­tlw~porfum ory­

:ae.

Fig. 4. - Filnmentous rny­celium with long, olightly rnmi6ed hypbae from Hel­rni ntho8por i um

ory::ae grown in a 50 l fermenLer with vortex .

.. trw. lst, S uver. Sa•li l1l. (1971 ) 7,14 -22

20

C rowth 111 sftahP .fl<tsks.

I Il Czap(·k. c/.a ,wk-Dox. a nel H media only a Rmall amount of pigtncnl " 1s found ancl ophiobilin A (Ts t DA et al., 1967) i s present.

Th c b;o!' t production of cochlioquinone:; (more t han 30 °11 of th•· JUyc·e· li al dry \vt:igbt) ha~o~ bt·cu m casurl'd tn jJOtato-gluC'O!'t' 2 °,. meclium or in synthctic Miers medium, a t pH 6 with 2 % g1ueose, inoculated with 10 '~ 0 cultures previous ly grown in potuto-glu cose 2 ~~-

w,. ha v<' ob,;en cd that glucosi' , a;: carhon source, ~ivl's the b c$t r N,ults; light significantly s timulatcs pigmentation; the optimum growth tempe· rat ure is about 2·1.°C. The following conditions h av•· hcen thercfort> chosen: growtb at 2-t o(; in shake flasks on a rotary sh aker running at 220 rcdmin. unfl f• r continuous iUutni nation at 1800 lux hy fiuorcscent lamps, iu p otato· glur:osc· 2 ~ 'J medium. In Tabl e 2 inOuence of illuminaliou o n gro'' tb an d pigmentation is shown.

TAHLE 2

Inftueoce of illumioation ou growth and pigmentation of mycelium from Helminthosporium oryzae

--- - -DAYS pii

OF C R0 \1\'TII li l'hl J darkn.etl!

o 6.0 6.0

3 7.3 6. 9 5 7.9 7.5 7 8.2 8 . 5

IO 8.2 8 .5 l l ____ _

C rowth i Il f erml'n tl!rs.

\Vhrn acrated wilh spar· gcr pigments ari' synthetised after 70-80 br of ::trowth and the ma.ximum arnollnt is r ea cb cd a ftcr ahout l 60 br. As showu iu Fig. 5 glucos~'

is not completcly uAerl up.

F ig. S. - Gro" tb of thr mycelium from Helminrhosporium or.vzac in fermcnter with 8purgcr.

l

- - - -Clueo'llr MiceHal dry weit;bt

Coc.·hlinquinunellio o (ms/100 rnl) ,.

lij;b• l dukuen u8bt t tlarlr.11Ct'!O lì~ht 1 darknes"

l 2.00 2. 00 - - - -1.34 1.81 321 268 - -1.04 1.41 392 253 25.9 7 .6

1.00 0.47 375 305 l ;i.S 2. l

0.17 0.40 340 23 ~ 13.9 l 2.5 -

I I I I

/

8

l o

/- ~7 IOOt / ~

o .x ~a 7z 96 ·2o ,.:~ .,. ti cultur• ( nr)

A nn. lst. Su per. Sanità (1971 1 7, 14-:!:1

BF..LIAK , CRIBANOVSKI·SASS\1, RANZI & SCALA

\Vith vortex the myce­Jium devclop~s much faster , glucosc is userl to a grenter extcnt and co<·hlioquinones are ulready pr••sent aftcr 70 hr and in larger amuunt

(Fig. 6)·

Fig. fl.- Growth of the myc~lium from flelmin1hosporium ory:oe in fermenter with vortex.

I I

4 72 96 12D 144 164 ~ AtJo d ctAture (hr)

Chemical studiu

21

I I

Bolh mycelium aml fìl t rnte contru n cochlioquinoncs. Neutrul non­chlorinated orgonic solvents have been founò to be the most suitable for enractioo of (•ochlio<tuinones . The procedure to extract the pigment from wct mycelium und from the culture fi ltrate is the samc.

Thc myc<:lium fro m a 50 l f••rmentcr (upproximately l kg) is rcntrifu­gefl. wasbed with 20 l of water and thcn extract ed in u Turmix blcnclor for 10 min, wi Lh l l of hexane .lkg of wet 'H~ight. Tne ycllow 61tratr is scpa­ratcd an1l the mycelium residue e:~.-tractcd again twice with bexanf!. The combincù fi ltratrs are dried with N~S04 , and the hl'xane evaporuterl in nilrogen atmosf!hcre at retlucecl pressure at :JOOC. 1'he rcsiclue is di~:~solvcd in 500 mJ of diethy l ether and after 48 hr storage n t - 200C, ophiobi lin A is separate~ by fìltration. The fil trate is 1lried at reduced pressure io nitrogen atmosphcre and the residue •li solved in 1.5 l of a hexane-ether 9:1 (v/v) m bete tre. Vter 24 hr a t 5°C cochlioquinoncs • L an d B n re separa teti by fil trution. Tbc crystals, flr ied in uacuo, are dissolved in 3 l of hcxune. On ~:~t anding ovt>rnight at room temperate.tre cocb.lioqulnonc A prrripitates and is ]>urifierl hy r epeat ed crystallisations from hexanc and from dicthyl cther-hexane m. p. 130-13~0C. Coch.Lioquinone A ·hows [Cl]~ = + 1800;

U.Y. (methanol) Àm.,. 270 WfL, & 9140, Àmo:c 388, & l060; LR. (chloroform) 3575, 3515. 1740, Lo73, 1645, 1620 cm - 1 ;

analy is found % : C: 68.00 i Jl 8.20 ;

cale. 67.66; 8.33.

Ann , Jd. Su!lor . Sanitd (1 971 ) 7. 14 ~2

22 t:st•t.Kif~ZF: E KICEIIf.tH:

'l' lw ruother liquor r ich in coehlio')~tinont' B il> dri.·d a t 3()o(. in ni­

trogo' ll atmos ph1·r t< at n •duced pro~:;<.; ur•· and th<· r <·sitlut •li s~<tllvr•d in ben· zoont· i-. ch r<omatograplh·d on a F l11ri:.il ( 100-~()() m csh) t·oluom. (10 rm hi~.dt x l ent diam) usin~ lwn zt·lle-rhlurofor.m 4 :1 (vl,·) a :- .-lurul. CorhlillquiutJIII ' B ul,taincol i11 l bi,- \l'a) o·r rf.talli zr!-l in long n cNIIt· >' frorn rlit·Lh~·l e tlll'r.

C:orhliuqtùnont· B ~ tun'·" : m.p. 1Ml-Jo9u : fal~~~ = l;)Ju: l'.\. (m"· Lhanol ì À,..,,, :!(i(l lll!L. e l 01.')(); Àwox .~93 ffi !J.. e: Rl\2 ; i.nes ~!()1 lll!J.· e: 19~1() : T.ll . (11ujul ) 3.>~0, 17()f.! . JC,7:3. Ht30. J(i:IO. }(;10 t: lll l·

analysi:< fnu n li n 11 : C 7 LO !l ; Il 8 .89 ;

7o.s:;; 11 .9~ .

CIJr h.lioquiuull<'l! l ancl B havt- lwen al ..,o tr. t f' Ò fnr autihiotk ;aett\'l t y

<l!!ain,t St. ((III'BIIS ox.forrl, I:. coli :md n. t:(•reus an d fur phytotnxic aetivit y

on ~O da~ tlld tornato plant" '' ith n r!!ali vt· r~:~ltltf, .

Arkumdrd!.("mt'IIIS. Tbc· uutbor" are iudchted ICI prof. tlr. C. B. J\larini - Bettoìlo f ur

bi~ ~UJI<'n :~icm . Tlu:y thank dr. C. U i Giacumo for prt'parÌIIjt tbt' Slraioo< of Cvrltliobolus mÌ)IIbc•cln/IS unoJ Ùlt·y \\Ì~h w exrrc-.~ ÙU!,i r fce liu~s flf gratilude lO'•Md!' Anita Conll'U i

aruJ G. J\usdodi fnr skill•lrl cheuoica l t ccltoical u~si stuu ct'. G. Galli . E. Orlaml:ni. G. \ ' :,o ll' n tini unti il. \ ' olpi for thei r vulunhlt• help \\Ìth tlte ft'rmrututiou.

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A nn. h t . Su.vcr. Sanit.d (1971) 7, U-2':!

l

3-a-( 2-0-~-D-glucopiranosil) -D-glucofuranoside della quer· cetina: nuovo glucoside fiavonico della Vestia lycioides

SILVIA ERAZO GIU.FF RA (*), CoRRADO GALEFFI, M. A.'IALJA CIASCA RENDINA e ELISABETTA MIRANDA DELLE MONACHE

Laboratori di Chimica Biologica

Riassunto. - Dalle foglie di Vestia ly cioides è s tato isolato, accanto a lla isoquercitrina, un nuovo glucos ide Aavonico. il quercetin-3-a-(2-0-/3-D­ghwopiranosil)-D·glucofuranos ide. Il punto di attacco tra i due r esidui di glucosi è stato dedotto daU'ottenimento per idrolisi di soforosio \2-0-/3-D· glucopiranosil-D-glucosio) , m entre la natura furanica ed il tipo di legame a del glucosio legato alla quercetina è stato dedotto dalle caratteristiche RMN dell' idrogeno anomerico corrispondente e dal comportamento verso gli enzimi.

Summary ( Quercetin-3-a- ( 2 -0·/3· D-glucopyranQsyl)· D-glucofuranoside, a lti'W glycoside of V estia l ycioides). - A n ew Aavonol glycoside, the querce· ti n-3-oc-(2-0-~-D-glucopyranosyl)-D-glucofuranoside, has been isolated from the leaves of Ve.stia ly cioides.

By the NMR spectrum of the corresponding acetate the a furanos ydic strncturc of the ghtcos P. hound to <1uercetin has heen determined. By partial hydrolys is sophorose, (2 -0-P·D-glucopyranosyl)-D-glucose, has h een obtainc(l.

Dalle foglie di Sorhus aucup.uia edulis Dieck tNiiRNBERG, 1964). dai fiori di Hibisws ( M A KHS UDOVA, P<\K UDINA & SADYKOV, 1967) e dai fiori di Solanum tu.buosum (1-Io RUAMl\I .F.R et al. , 1968) è s tato isolato il 3-~·(2-0-

~-D-glucopiranosil)-D-gluropiranoside della quercetina (l) del quale è s tata effettuata la sintesi ( WAGNFR 1 t td., L968) a partire dalla 7,.i'-dihenzil·quer· retina e dall'acetohromo-soforosio .

(*) Borsista dell'Istituto Superio.·e di Sanità dall' Universidad Tecnica «.Federico Santa 2\faria », V al parai so (Cilile).

A nn. I st. Suve.,. Sanitl\ (1971) 7, 23-30

\ ori \ \. { RtnKOFER &. KAtSER. 1%2: P AKl' DI "'A & SA.OYh. O\' . 19M: o A &. P ERCIJEROJ\ . l 9(15) inoltre. de..,cri ' ono il ritro' a rm·ntn in , ·ari•·

piante c.J ,.J 3-~·!!-oforo.;id" della quercet ina SPn za prt'CÌ~<an· .. ,. il ghwo.,iv

lrgat u alla qul'r rr tina (TT) prt'wnt i struttura fu Hmica o pirunit·a.

,.

~ HO

OH R = ~H H HO u

H t

OH H

~ ~ II R ~H H ~H H = - H HO H HO H l H OH H OH

HOCH2

~ Ili R = ~H H HO H

H OH

Da uno Solanacea sudam <'r ieana, la Ve~tin lycioidPs. alla q ualt· .. i a tlri­bulscuuo propriet à antipiret ichl'. febbrifughe e verm ifuglw (Mu.S oz PJZARKO.

1959) abbiamo isolato. accanto a.lla i oqucrcitrina ( fll ), u na so~tnnut isnrnet <~

dcUa (I ) n ella quale ahbianw dimostrnt•• rhc il gl ucosio l c~att) alla 'JII<' rcctinu presc>nta In l.' lrutt ura a-furano idica (I V) anzicht~ (3-piranosidicn. L'e~trattu

mc•tanolico delle foglie di qu<'o;tn pian ta . dop o separazilanì' rld ln fra"iont· alcaloidica. rivela la presenza di c.Jm• g luco!'idi fla ,·on.ici {R f l).(,'j r O.IR in n-tmtanolo-acido acet ico-acqua ..J : l : :>, <'art a Whatman l, rcattÌ\ o rtife>nil­borato d i ~-amminoé•tile) cht• c; j St'para.no facilment e pl·r r ipnrt izionf' in con ­

l rocor rentc tra a cetato di etile -n-llu Lanolo-acqua. Il piia mohilt· (Hf 0,67) forni ce, per idrolis i evo ~-glucoshlasi, quer rct ina e gluto,.io <·d ì· :.l a to idt> n­ti6calo, in hast> agli sp ettri PV cd agl i sp ettri RM'\ de ll 'acetato. com{' quercetina-3-0-~- 0-glucopirano ide o i.;oquercitrina ( Ill ).

Tl s rcondo (Rf 0 ,48) cristallizza du ucqua (p.f. 201-2°), c·d hu una for­mula rhc cor risponde abbastan?.ll b eni' a quella di un di~lucoside idrato 4 Hao0 17 . a, o ; forni cc an cb 'c>sso per irlrolit>i acida ( H,so. '\) tJUercet io a t: glucosio: p~>r idrolis i con a cid i mvlto diluiti (H 2 0 4 0,025 ~) fornisce. accanto a 4ucrcetina e piccole quant iuì rl i g luco.-io. un bio ·o (Rf O.l in n-hu­l anolo-ncido aretico-acqua 4 : l : 5. carta Wbatman l) ch c> r<'agil'e•· \'On clo­ruro eli tr ift."niJt etrazolio ( WALLEì."'TELS. 1950) e c-on fosfato di d ife nilammina pitt anilina lBUCBA~ & SA V AGE . 1952). ma non con ftala to di anilina . Questo compor tamento, come pure il confronto del punto d i f u ione e dvi p ot er i!

A nn . 1~1. Su p~ r . Sa nole) 11971) 7, 23-3D

ERAZO CIUFI'RA, CALEPPI , CIASCA RENDI:oiA E :\IIIUNDA DEI.tE MONACHE 2$

rotatorio del bioso in esame e dei corrispondenti «- e {3-ottoacetati, per­mette di identificare lo zucchero come soforos io (2-0-{3-D-glucopiranosil-0-glucosio) ~RABATÈ, 1940). Il soforosio f. unito all'ossidrile in 3 della quer­t"etina come ri"ulta dalle modificaziooi deUo spettro UV in e tanolo con AIC13 ,

CH3C00Na, H 3B03 e C2H 50 Na (GEISSMAN~, 1962). ll glucos ide della Ve.qtia lycioides è però, come abbiamo già detto, diverso

da quello natruale s inora isolato in altre piante, come risulta da l compor ta­m ento enzimatico e dagli sp ettri RM 1 degli acetati corrispondenti t •) che presentano identica la parte aromatica, ma nettamente diversa la :~.ona

dci protoni glucidici e d~gli acetili. Infatti, mentre in (l ) il glucosio legato alla quercetina ha la struttura {3 p er la facile idrolis i con emulsina (NURNBERG,

1964), in (IV) il comportamento rispeuo agli enzimi (formazione di querce­tina con «·e non con (3-glucosidasi) da un lato e lo spo .. tamento chimico e la costante di accoppiamento dell'idrogeno anomerico corrispondent*' dall' al­tro (vedi appresso), fanno ammettere che il glucosio legato alla quercetina abbia la s truttura oc-furanosidica.

L'esame dettagliato dello spettro RMN dell'acetato di (I V) conferma la struttura di quercetin-3-soforoside. Infatti la zona aromatica é identil'a a quella della quercetina acetato (v~di parte sp erimentale) (TtRA, G ALEFFI

& MIRANDA DELLE MONACHE, 1969) sal vo il deshielding dei protoni in 2' e 6' dell 'anello B (ò 7,91 e 7,80 contro 7,60 e 7,o2 ppm rispettivamente). Questo feno meno, come pure la for ma netta di doppietto (vedi appres!'o) del protone anomerico del glucosio legato alla q11e rcetina causato dalla limitata rotazione clcllo 1.ucchero (lliBRY, MARKHAN & THOMAS, 1970), confermano l'unione (lei soforos io con l'ossidrile in 3 nella quercetina. Dei protoni della parte glucidica della moleeola il preciso doppietto che compare a campi minori a 5,85 ppm (J = 7,5 cps .) spetta a l protone anomerico del glucosio legato alla querc('tina. Il s uo accoppiaJnento con un prot<me s u tm carbonio senza acetossili a 3,93 ppm eonferma il legame 1-2 tra le due molecole di glucosio.

Rispetto al segnale RMN del protone anomerico degli acetati di alcuni 3-~-D-glucopiranosidi della quercetina (acetii (l) ~ 5,35 ppm, J = 8 cps e acetilrutina 5,37 ppm, J = 8 cps) il segnale corri"~pondente dell' acetato J i (IV) è da campi minori (S,RS ppm). Si deve qwndi ~sclllderc per esso la s truttuu {3-piranos idica compatibile con la costante eli accoppiamento osser vata (J = 7,5 cps) e con la conformazione Cl comune ai glucopiranos idi ( lùo & F'osTER, 1%3; 1965) come pure al (.t-ottoacetato •le! soforosio

l (0-C-!!OAc 6,30 ppm, J = 4,5 cps, accoppiamento equatoriale-assiale) e

( ") R ingraziumo il prof. L. F'arkas per averci fornito il campione di 3- ~·(2-0-~-D­

glucopiraoosil·) 0 -glucopiranoEide della quercetina naturale. Lo spettro R~fN dell'acetato corri~vundeute è stato registrato con il timer trveraging su mg 0,8 di sostanza.

: nn. Txt. S ll!l4lr . .'ìnrHtà (1971) 7, 23-30

,•

26 ESI' ERIE!'IZE t: RICERCHE

l

al ~-ottoacetato del soforosio (0-CH-OAc 5,66 ppm, J = 8 cpi', accoppia-

mento ass iale-assiale) . La struttura ~-piranosidira per il glucos io legato alla querc~tina si

dcvf' esclud<'rt' anch1• in base al <'Omportamrnto di (l\") 1 iguardo agli enzimi (formazione di quercf>tina con a:-c non <:on ~-glucosida :; i ). Parim1•nti, per il valore .. levato della costante di acCO(>piamcnto rlell'illrogcno anomerico, si deve escludere p er lo stesso gluco,;io, Sf~IDlHe nella conformazione f.1 • la

struttura a:-piranosidica. Si dev~ quindi ammettcrP p er il glucosio lt•gato alla qncrcetina la strut-

tura furanosidica con legame a:. A conferma di qul'!'to, lo spostamcn to chimico d ell'idrogeno anomerico

dell'acetii (IV) risp!'tto all ' act•Lil (T) (0,50 ppm) è iJentico a quello dt•l metil­a:-furanosirle t ispcttu al mctil-~·piranosid c del D-glucos io (0,50 ppm) (CAPO:\'

& 'fHACKER, 1964.). Il valore della costante di accoppiamento dell ' idrogeno anomcril'o d,·l­

J'acl'til (IV), df'vato come in altr i a:-furanosidi (LEMIEUX, 1961), corri;;p(mdc all 'angolo di edro H-\. 1 .. -C2.,-H (li circa 230 con l' eqnazionf' di Karplu;, modi­

ficata (HALL, 1963). Nulla si può dire della conformazione « envelopl' » o « half chair »

( J ARDETZKY, 1962), dell' anello furan ico per la difficolt:, di determinazione delle altrc costanti di accoppiamento con la doppia risonanza a causa della sonapposizione dei segnali dci due glucosi del !'oforosio.

PARTE SPERnliENTALE

La Vesti a ly cioides è stata raccolta i n Cile nei dintorn i di Valparaiso. Per l'cstrazione dei composti Aavonici sono state util izzate le fogli e perché

più ricche rispetto all e altre pari i della pianta. L e cromatografie su carta 1'ìono s tatf' r ealizzate su carta \Vhatman

N. 1, cluente n-butanolo-acido acetico-acqua 4- : l : 5. Come rivelatore degli zucch eri si è usato, salvo diversa indicazione, ftalato di anilina. Per i composti flavonici, evidenziabili già con luce UV, si (' usato come rivelatore il r eatti,-o di Benedict o il ~-ammino-ctil-difenilhorato Fluka (l% in l\1eOH). Gli ~pettri RMN sono stati registrati con il Varian HA 100 (solvente deuterocloroformio, riferimento interno tetramctilsilano). I poteri rotatori sono s tati dctermù1ati

con l'appar ecchio Cary 60 a ).. 589 nm.

F.strazione e separazione

Le fogli e trituratc sono state esaurite con metanolo p er • .ma notte. L'operazione è stata ripetuta altre due volte e gli estratti metanolici riuniti sono stati concentrati n el vuoto: il residuo ammonta al lO% cir ca delle foglie fresche. lO g di questo materiale è stato r ipartito in controcorrente in

.t nn. Is t. Su.l)eT. Sanità (1971) 7, 23-30

l l l l l l l l l l l l l l l l l l

EBAZO CI U FFllA, CALIWFI, CIASCA RElliDI NA E 1\IIRA;.,DA DELI.K ;\tONACHE 27

apparecchio di Craig (200 s tadi, v 10 : Hì) tr a cloroformio-acetato di t> tile ~7: 3) e tampone fosfato l / 15M a pH 3,5 con un tempo eli decantazione di oltre LO min a causa d elle emlÙsioni.

Dopo 200 trasfeximcnti la frazione aJr aloidica è compr t>sa tra le frazioni 17!l c 198 (rcattivo eli Dragendor fl'). L~: frazioni tra 50 e 170 c.li colore giallo, cm lÙSinnate in parte, e l' h~ contengono pa rzialmente separati due composti flavonir i, sono r iunite, la parte organica (- ><t>parata, menlrt' la fast> a<'q unJOa c\ eHratta t re volte con 500 ml di n-butanolo.

Le fas i organiche :riunite sono concentrat e nel vuoto cd il r csicluo . f' he am mon ta a g 5,5 è frazionato al Crni~ tra acetato di e t ilr (•d acqua.

Dopo ~00 trasferimenti una frazion e crumatografiramente unitaria (Rf 0,67) è raccolta t ra i t ubi 120 e 160 (frazione A) mentre l 'altra frazione llavonica compresa tra i tubi l e IO viene puri fi cata con una di vcr::;a fase superiore (n-butanolo-acetato di Nilc· l : 1 ). Oopo 160 passaggi s i rac:coglie tra i tubi 80 e l 20 la frazione anzidetta cromatografÌI'umente uuitar ia ( Rf 0,48) (Frazione B).

Frazione A.

3-~-D-glucopiranosirle della qut'rcet ina = isoquerc11rma (Hl). Cristal­lizza da acqua ~g 0,3), p.f. 22 l -2o.

Àmnx in EtOH 363 tl 261: + AcONa 37:> e 269; 1- H3 B03 390 e 265; - AIC13 430, 368 e 276; + EtO:'-la 418 e 27H nm.

Idrolisi : 40 mg in ~O m1 di tampone acic.lo <'i trico-fosfato bisodico a p H 5,5 con lO mg di ,8 ·glucosidas i F luka sono t enuti a 300C per 12 h.

Il flavone che precipita viene 1:cntrifugato, lavato con acqua, seccato ed acetilato con pi:ridina ed anidride aceti~'a. L'aceta to, cristallizzato da etanolo, non pn!Senta depressione iu misrda c•on la p<'n laacetilqucrcetiua (p.f. 197-:WOO) . Lo zucchero contenuto nella fast: acquosa, dopo estrazione con acetato eli eti le della quercetina res idua, è iclcntificato per cromatografia su carta come glucosio.

' Lc:etilazione della frazione A .

1.00 mg di frazjonc :\ sono acctilati cnn pirirlinét c>d anidride acetica. Dopo 24 ore i r eagenti vengono eliminati nel vuoto spmto ed il residuo è purificato in t:olonna di silit:e, sol v ente cloroformio-acetato di etile 7 : 3. L'acetato cristallizza da etanolo, p.f. l70-l7 ~o .

L'ottoacetato deUa isoquercitrina ha p. f. 170,5-171 ,5oC (W l~ lNGF.S,

DAHR & KLOSS, 1968).

Fra:ione B .

:!-oc-\2-0-(3-D-glucupiranosil)-D-glucofurano!'lidc de lla r1ucm:etina (J V) . Cris tallizza in prismi irrc>golari da etanolo-at'Na to di 1'tilr cnn tlll la rgo intervallo ti c l p. f.; dopo ripf'tute r ristaJlizr.a.t.ioni da acerua ha p.f. 20 l -30~0 .

. ·lll n . ht. SU.fJ 01'. l;tmità (1971) 7, 2:1-30

211

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at•t•la lu di l'lil r·. lu fa ._,. llrj.!ankn , ·io•n•· '-t·parat n. la\aln t•un at'1111a. t' \UI"'ra ta t•d il rc·:-. ithw 'Ìt' llt ' Ul'l'tilu to. J. 'tu•f>t<JW. dopo dut• eri•lltllizznzio11i da t•tanolu. nun pro·..,•·nl;t rlt ·('rt'":'Ìuu•· aUa fu .. ione in rui,;t•t•la t ' llll un c:Hn('Ìout· di l~~'llla ·

8t'I'L!Iqut• rT~tin.t (p.f. 19/-:~00") . \dJa fu ,..•· aetpw, u prct•t•dt·ntt•. n cul.rulillzata

t•un enrhuu atu ti i hari• t. fili r ata t•d o pportuua mt·n t e t'llll t'I'Dlrat u ,..j iùr·ntillea . pt·r rrumullll!ruliu .. u t·urt o. il ~lunt ... iu.

l d ruli l' i pu r:t,iulr : Ili f'n JJullirt• n rit•llfll'rt' u11a , nluz ion •· di 50(1 m~ d,·l ~llll'ù!<oirlr· in l'>-8 11ll' in J()() mi di "~S()-1 o.n~.) \. Duj)O :! h la ... , ... uuzn d i f' lll ·

ll·uza ,-:. qua:-i "''u ntpar~a: lu ;;uluzimw l' i , . .,lrut• e·on tH'i'latu di e tile· c· IH·LLt fa;.t· or~all it•:t ,., ; irlt•ntif i<·;t. come• nel prnet•e limr·uto pre·c·,•d .. lltc·. fu qut·n·t· tiu:c. l.u fa-.<' UPtptO:-u ,. j n~ulralizza r nn carb1•11alo rli hario. ~i filt ra,. ,;j con(·rutra

ttc·l \ llll l ll 11 pic·e·ulot \ olu nlt'. li n • .. itluu .. ; purilwa p<'r •·olunna rli cdi t l' 11 . :;·t;. l'll rhollf' l : l l'(lll Ul'f[Ull a lll'rl't' llliiHit• t' Tr"· l'l'llll' di t'l i llllllll ( Cl •. \ '\C\'. l 1171!). l i lli•r:-c;. f'IH · ... i e·lui ,.,tT tlupu il f!lu c·o~iu. lca Hf ti. l (' 11011 ,., ti\ r- lnbil•• ,.. ., r·arla

<'1111 ftultlrl di an ilinn llll ' llln· ... i ri\t•la t'Oli dtH' III'O di trifo·nilte·lt'a:t.(llin (\\'\! ·

I.I " 'FFL.;. lel:llì) l' t'CIII fcr, fal to <li elift•ni latllll1ÌII:t r•d 1111iliua ( BtiCII '" & :;;\\ \ta:.

IIJ i~). (l •h'~hl "'ll;!!!•'ri ... c·e· l'i4.lr·n tit ,', eol ..,o furu .. in ( R \Il \TÌ. 1910).

Il rt •,.. idnu lf,.JI',., upur·uzinnt· (m~ 1::!11) ,-j,., ... ;t('Ptiluto 1'<111 auitlrillc· ace··

tio·a t d lte'c·tatco :- r1tli c·o "f'l'(lndu il prut•t•t limr·ulu dt•:- t·rittll f ii'T il fj ·utlvac•c•til­"'ufums iu ( H \B.\.'1'~'. l 1) t!l). Il protluuu :-.i purifif' a dul )'O•·n pt•n tunc c •t il~lu c·u:-io

in c·olonna tli ~ ilie ·c· . .... uh l' lllf' clurvf~~rmio-c ·i dtw~lliiO 8 : :.! <' t:: i e·r i,.t::tll il!:zn da ('l Ullulo. l'· f. l Qll- 1'12(1 : l~ m) - ::!.6 in r.nctJ ,. = l.~.

l

Il ~ t '{!II U ir · H~t 1\ dc·ll'iclrogt·IIO anunwrit·o 0 -CtJ·O.\t· ì• u11 duppil'llu a 5/t(J ('(llll . J = 8 l' p :-.

Jl ~-Cillllnri'Li l .. ofuro .. in h a p. f. 19~11 l' L:r.Ji\' = - 2 .H in cnr.ta (TI \DATÈ.

11) 10). Pr•r ""J"miiÌf•atiOIII' d t·i g ruppi at• t•Lilic·i r on l' tilatll :,;odit·o (FtH' L'· n~: ~HI .R<:. I1JM1) ,.j ottii·rw il bi(•••> lihl' r u il cui polt'TC rutoloriu dupo ruu ta·

roro~icm 1· 1«1~ = ~U -l 3. <' - (1.9 (in a('qun) i· in huou n•·•·orclu •·ore

qur llo llc·l ~of'oro~Ì 4 1 L:r.]~' ' 18.(, ( R.\IJ\Tf.. I1Jifl).

triiAZO r.ll: FnlA. GAl.EI'I'I. CIASCA Rt:!\IOI'IA E ~llliANOA Ot.l lf' ~IO'I~I:II E 29

'J.·Ottoau tato ciel hioso.

11 hic)sO viene acetilato con anidride acet ica ed aciclo ".olfori!'o MeconJo

quunlo clrscritto per rCl·Ottoacctilsoforosio ( RABATt, 19·\0) ,•d ha p.f. l

I l 0-11 LO. n segnale deU' iùrogeno anomeri co OCHAc r un doppietto a 6.30 ppm, J = ~.5 cps.

rJ punto Ji fus ione dcll ' ottoacetato de) soforo~io Ì' 110-lllO (RABATÈ.

11HO).

Idrolisi con maltasi («·glttcosiclasi).

IO mg di glucoside (IV) sciolti in 5 ml di tampone fosfato a pH 6.5 sono trnuti u 30-35o ron 4 mg di maJtas i di Lievito ( Ligltt). Dopo Mlh l'idrolisi non r ancora completa ma si identificano cromatografìcamente la I)Ucrcetina (ennfcrrnatu clupo estra:r.ione con acetato di etile come pcutaacetato) ed i1 Jo~o fnro~<io ( Rf O, l, r eazione posith a eu n cloruro di trift:nil tctrazolio e negativa con l'tnlnto eli anilina); il glucosio ris tùta totahncnte a~Rcnt t•. Nelle stesse t:ondi~ioni di idroli!>i, ma ;wn~a maltasi. il glucosiJ e resta inalterato. La speci­lì t• itù th•lla maltas i usata come ot·glucos idas i è provata tlallu rnancata iruolis i ,ft•lla Ì '~O fJU f' rritrina (III) l3 ·~-0-gluetlpirano idc tl,·lla qu,•rcctina).

/drnli,~ i rnn ~-.!.!lucosidasi.

L'nn soluzione di 10 mg di gluco ide (IV) e rli .j mg di ~-glucosidasi Fluka in 2 mi di tampone acido citrico-fo -fato bi~òdico a pH 5.5 coperta ron llue gocct> di toluolo è rsaminata cr ornatograficamcote nel gi ro di 15 giorni.

L' idrolisi p roced e lentamente con formazione tli glttcu:;io ma senza alcuna trn~:cia nè di qnercetìna nè di soforosio.

~eU e s tesse condi~ioni la i!'oquercitrinn (3-~- D·glucopirano<~ide della «JUcrcetina) (III) .si idrolizza rapidamente.

LcetilaziOile della fra;; i o ne B ( l V).

250 mg di frazione B sono ucetilati con 6 ml di piridina c 6 ml di anidride acc•tica. Dopo una notte s i f'vaporano i rcatti vi «'oo v•u,to ~pinto n t.a. ed il rrsiduo s i purifica per coloona di s ilice, solwnto rlorofurmio-acetato di t>tilc 7 : 3. L'acetato non cristallizza e si preeipita da acf'tato Ji etile con cicloesano.

\nn lisi trO'\. 0 01 : C 5rt,55 : l I •1-,09

cale. C 54,05 : l{ 4·.81

l x m -- 22.8 in CHC13 (c = l. l). I "''~rtlali JUf~ più "L{!nificati\ i •ti fi ni tle l c·hiu riml' ll lO ch•lla ~truttnra

,.onu i "Cf.tuenti: 86 6.80 {d). Òa i.:!.> ppm (d ) .Jo.a 2.5 c·p,; ~~ 7.91 (J).

i)ç. i.30 (cl). ò6 i.80 {tr) ppm. J z·. 6 2 cps, J s·. «> <) ''P~: ~ aceti li singolctti tlf'Jia parte flavonica tra 2.30 l' 2. ~J ppm t' 7 Ul't' l ili ~ iugult·tli dcUa parte

l'"' · ' ' ' · Mll ll' r . .'l'ullolt\ (197l) 7. ~:m

30 E!WERIEN Zl. E I<I C:•: Rt:H I.

glucidi c-a tra l ,88 (> 2 .08 pptn , doppiettu a 5,8:-i rrm .T = 7,5 cps dovuto al proton e anomcriro ùl'l ~l ucus io lf•ga to aUa quercet inu . NciJa pentaacetiJ 'Juer­c·etin a i i\e~nali aromati1·i sono: òb 6,77 (ò ). Òn 7.23 (d ). ~2 • 7,60 (d), dr, 7,2:i (d). d h· 7.fl2 ppm (q ) (TlRA , GALEFFJ & MrttA"iDA D ELLE M ONACBF.. 19MJ) .

Ar~tiluzio11e dc/3-~ (:?.-0-~·D-,ducopirnnosil)-/J-,!! Ittropiranflsidl• della. qrH'rr••tin!l .

La f,C•s tanza viene at•etila t a COWt' Ùt•:.(·riltO per la frazinn•' n. Data la t•:,i~na f)llant i tìt (li sos t an~:a. Jo illwt tro RMi\T ì· s tato r egis trato con il timer tuwraging :o; u m g 0,8. T lìt'gnal i rtf' lla zonn arnrnati c•a sono irl<'ntici a quelli deU'af' •' lato di (IY) nwnlr•· i scguali dt>i protoni g lu cidici e d egli lll 'f't ili son11

neltamcnle di'' l'rs i. li segnale rld proturw a numcricl) lcgut11 alla qu r. r cc• tin a comp ar{' cOIDl'

doppietto a 5,3.') ppm . .T = 8 Cf'"·

Gli Antori rinjtru7.iauo il SÌJ[. G. Couli p1•r la rt'Jli~truzioue de~o~li bp!'ttri IUf 1 con l'appnreccbio Varian fiA JOO ed il sij!.. G. Del Cucrc i1• per Il' rni~ltrt! d.-i poi cri rotal nri cou

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