produkcija citokina
TRANSCRIPT
Metode za selektivno izdvajanje i ispitivanje
funkcija ćelija prirodnog i adaptivnog imuniteta
U istraživačkom i kliničkom radu najčešće se koriste prečišćene populacije odgovarajućih
ćelija
Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija:
1.Na osnovu različitih fizičkih osobina
2.Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula
Izdvajanje ćelija
1. Na osnovu fizičkih osobina (gustina,
adhezivnost)a) Izdvajanje ćelija na gustinskom gradijentu
b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti
a) Izdvanaje ćelija na gustinskom gradijentu
Različita gustina i težina ćelija
Uzorak: periferna krv, tkivni homogenat...
Grdaijenti: Ficol, Perkol, Opti prep, Nyco prep...
Uslovi razdvajanja: temperatura, rpm, odnos zapremine gradijenta i uzorka
(prema preporuci
proizvodjača)
Izolacija mononuklearnih ćelija na gustinskom
gradijentu
https://www.youtube.com/watch?v=6lsldFFMEhE
Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija poreklom od monocita
(kultivacija, 6 dana)
(10%FCS/RPMI + GM-CSF i IL-4)
stimulacijarazličitim
Imunomodulatorima, kultivacija
Ispitivanje fenotpiskih i funkcionalnih
karakteristika MoDC
-Ekspresija površinskih markera (protočna citometrija)-Procena alostimulatorne sposobnosti MoDC-Produkcija citokina od strane MoDC-Produkcija citokina od strane T-limfocita u ko-kulturi
b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti
Adherencija za plastiku ili staklo
Adherentne ćelije – makrofagi, DĆ
Neadherentne ćelije – T limfociti
2. Na osnovu ekspresije različitih
površinskih molekula Ćelijski markeri: CD3, CD21, CD11c, CD11b...
Antitela specifična za ćelijske markere
Izvor ćelija: periferna krv, ćelije kosne srži, limfnih čvorova,slezine
2. Na osnovu ekspresije različitih
površinskih molekula
a) Metod paninga
b) Imunomagnetno sortiranje
a) Metod paninga Adherencija za plastične površine obložene
antitelima Direktan paning Indirektan paning
b) Imunomagnetno sortiranje
Magnetne kuglice obložene antitelima
Direktno imunomagnetno sortiranje
Indirektno imunomagnetno sortiranje
antigen
antitetlo
magnetnačestica
Magnet
ćelija koja ne iskazuje antigen
ćelija koja iskazuje antigen
suspenzija ćelija izlaganje magnetu razdvojene populacije ćelija
https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg
Testovi za ispitivanje funkcija imunskih ćelija
Određivanje broja i vijabilnosti ćelija
Testovi za ispitivanje funkcija ćelija prirodnog imuniteta
Testovi za ispitivanje funkcija ćelija adaptivnog imuniteta
ODREĐIVANJE BROJA I VIJABILNOSTI ĆELIJA
Brojanje ćelija na hemocitometru/
elektronski brojačTripan plavoMetilensko plavoKristal-violet testPropidijum jodidMTT test
MTT TEST Vijabilnost ćelija odgovara
aktivnosti mitohondrija Kolorimetrijski test: MTT žute
boje se u živim ćelijama redukuje u crveno mrki nesolubilni formazan; rastvaranje kristala formazana→ oslobađanje boje, merenje apsorbance
TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA PRIRODNOG IMUNITETA
FAGOCITI (MAKROFAGI i NEUTROFILI)
NK ĆELIJE
FAGOCITIMAKROFAGI - Produkcija citokina (IL-12, TNFα...)- Fagocitoza- Produkcija NO i ROS
NEUTROFILI- Produkti granula (MPO, elastaza, katepsin G...)- Fagocitoza- Produkcija NO, ROS- Produkcija citokina (IL-1, IL-6...)
1. Određivanje sposobnosti adhezije
Ispitivanje adhezije granulocita periferne krvi sa i bez prisustva ConA
Kratak opsi procedure:- kultivisati ćelije u mikrotitarskoj ploči (5x106 ćelija/bunariću) u četveroplikatima- dodati PMA (samo u polovinu bunarića)-ostaviti da se inkubira 60 minuta pa potom ispranjem toplim PBSom ukloniti neadherentne ćelije- fiksirati adherentne ćelije metil-alkoholom (5-7 min)- obojiti ćelije rastvorom metilenskog plavog (10 min)- isprati boju 3x česmenskom vodom- dodati HCl (200μl, 0,1N HCl)- očitati apsorbancu na 650nm
2.TEST FAGOCITOZE
čestice obeležene fluorohromom,fagocitoza se detektuje fluorescentnim mikroskopom/FACS
3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA
Vanjćelijska/unutarćelijska detekcija citokina;
ELISA testovi, ELISPOT...
4.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE ROS-NBT test
FORMAZAN (redukovana forma,
plav→ sivo-crn)
NADPH oksidaza NBT
(oksidovana forma žuta)
Kolorimetrijski test
Intenzitet redukcije NBT-a srazmeran produkciji ROS
5. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO
Griess-ova reakcija(merenje neorganskog nitratakoji je krajnji produkt oksidacije
kratkoživećeg NO)
6. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE MIJELOPEROKSIDAZE
• 7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)
7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)
NK ĆELIJETestovi za funkcionalno ispitivanje NK ćelija:1. Citotoksičnost
( korišćenje tumorskih ćelijskih linija npr. K562 i radioaktivnog 51Cr)2. Produkcija citokina (INF-γ)
ELISA, ELISPOT
T limfociti• test proliferacije T limfocita in vitro• detekcija produkcije citokina• test citotoksičnosti
TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA ADAPTIVNOG IMUNITETA
B limfociti• test proliferacije B limfocita in vitro• detekcija produkcije antitela
T LIMFOCITITest proliferacije
• Proliferacija stimulisana različitim poliklonskim aktivatorima ili mitogenima limfocita (con A, fitohemaglutimin-PHA,anti-CD3, PMA...) ili specifinim antigenom
• Proliferativni odgovor se može meriti MTT testom, na osnovu inkorporacije 3H timidina u DNK...
-Izolacija mononuklearnih ćelija-Kultivacija ćelija sa stimulatorom/antigenom 3-5 dana-Pred kraj kultivacije dodavanje radioaktivnog 3H timidina-Merenje radioaktivnosti na sintilacionom brojaču β zračenja
MEŠANA LEUKOCITNA
REAKCIJA (MLR)
Transplantaciona reakcija
Limfociti donora i recipijenta
Dvosmerna i jednosmerna MLR
Produkcija citokina (ELISA, RIA, PCR...)
ELISPOT
Određivanje citotoksične aktivnosti T limfocita• Kokultivacija citotoksičnih T ly sa ciljnim
ćelijama (tumorske ćelije,ćelije inficirane virusom itd) koje su obeležene radioizotopom (npr. 51Cr)
• Nivo oslobođenog radioizotopa je srazmeran citotoksičnom potencijalu ćelija
B LIMFOCITITest proliferacije
• Isti kao i kod T limfocita (kao mitogen se može koristiti stafilokokni protein A)
Produkcija antitela• ELISA, RIA, ELISPOT