produtos não estéreis 2011 2 -...
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Controle Biológico e Microbiológico de Qualidade de Medicamentos (FFI 402)
CONTROLE MICROBIOLÓGICO DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS
Profas Yraima Cordeiro e Ana Luisa P. Miranda
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Produtos nãoProdutos não--estestééreisreis
Conceito:Admite-se carga microbiana limitada;(cosméticos, formulações de uso tópico e orais). Determinar a carga microbiana presente no produto;(qualitativo/quantitativo).
Objetivos: Comprovar a ausência de m.o patogênicos e determinar o número de m.o viáveis em funçãodo tipo de utilização.
Agentes infectantes oportunistas (m.o saprófitas);Cepas patogênicas (proibitivos);Pessoas imunossuprimidas;Comprometer a estabilidade do produto, perda da eficácia terapêutica.
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Fatores necessFatores necessáários rios àà adequaadequaçção dos não dos nííveis de m.o veis de m.o no produto terminadono produto terminado
Fatores diretos de contaminação: água, matérias-primas e material de acondicionamento.Fatores indiretos: limpeza, instalações inadequadas, pessoal não paramentado ou submetido a exames periódicos…
Fatores que contribuem para ↑ ou ↓ da carga microbiana:
a) Fórmula: ptn e carboidratos ↑sacarose, sorbitol, propilenoglicol ↓
b) pH: Neutro (↑ m.o), ácidos e alcalinos (↓m.o)
b) Atividade da água: incorporação de conservantes
c) Processo: Temperatura elevadas ↓
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Padrões microbianos em produtos não estPadrões microbianos em produtos não estééreisreis
Primeiro insumo farmacêutico com especificação relativa à qualidade microbiológica: gelatina, USP XII 1942 (104 bactérias totais por grama);
Hoje: 103/g e ausência de patógenos específicos em 10g (USP XVIII).
Variações em função da origem da matéria prima, uso final, via de administração.
No Brasil: limite para levedura seca (2ª Edição), 7,5 x 103 bct/g e 50 fungos/g
Fitoterápicos: (Portaria 123, 1994) Especificação para matérias primas vegetais: < 105/g do total de viáveis; < 104/g fungos; < 103/g enterobactérias; ausência de Salmonella sp., S. aureus, P. aeruginosa, E. coli e Aspergillus. Atualmente (outubro 2009): orientações aplicáveis a quaisquer formas farmacêuticas; presença de mos totais e patogênicos.
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Para cosméticos, CTFA: seus padrões são referência internacional:
- Tolerância de não mais que 500 UFC/g em produtos para bebês e para a área dos olhos e < 103
UFC/g para todos os outros. E nenhum produto deve conter conteúdo microbiano nocivo para o usuário.
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Produtos cosmProdutos cosmééticosticos
Tipo I: < 102 UFC/g de mo totais aeróbios, ausência de Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus, coliformes totais e fecais em 1g(mL); ausência de clostrídios sulfito-redutorestambém em 1g (talco);
Tipo II: difere do acima no limite de aeróbios, < 103 UFC/g.
Tipo I: produtos para uso infantil, para área dos olhos, e para os que entram em contato com mucosa;Tipo II: demais produtos susceptíveis à contaminação.
(ANVISA 1997, padrão proposto Grupo de Microbiologia da Associação Brasileira de Cosmetologia)
Resolução Nº 481, de 23 de setembro de 1999 (ANVISA)
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a.Contagem de microorganismos mesófilos totais aeróbios, não mais que 103 UFC/g ou ml; Limite máximo: 5 x 103 UFC/g ou mlb.Ausência de Pseudomonas aeruginosa em 1g ou 1ml; c.Ausência de Staphylococcus aureus em 1g ou 1ml; d.Ausência de Coliformes totais e fecais em 1g ou 1ml; e.Ausência de Clostrídios sulfito redutores em 1g (exclusivamente para talcos).
�DEMAIS PRODUTOS COSMÉTICOS SUSCEPTÍVEIS A CONTAMINAÇÃO MICROBIOLÓGICA
TIPO – II
a.Contagem de microorganismos mesófilos totais aeróbios, não mais que 102 UFC/g ou ml Limite máximo: 5 x 102 UFC/g ou mlb.Ausência de Pseudomonas aeruginosa em 1g ou 1ml; c.Ausência de Staphylococcus aureus em 1g ou 1ml; d.Ausência de Coliformes totais e fecais em 1g ou 1ml; e.Ausência de Clostrídios sulfito redutores em 1g (exclusivamente para talcos).
�PRODUTOS PARA USO INFANTIL �PRODUTOS PARA ÁREA DOS OLHOS �PRODUTOS QUE ENTRAM EM CONTATO COM MUCOSAS
TIPO – I
LIMITES DE ACEITABILIDADE ÁREA DE APLICAÇÃO E FAIXA ETÁRIA
Resolução Nº 481, de 23 de setembro de 1999
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MMéétodostodos de de ananááliselise
2. Transporte e preparo da amostra para análise;
Envolvem tanto os medicamentos não estéreis quanto os cosméticos, abrangem três etapas fundamentais:
1. Amostragem, englobando coleta;
3. Determinação numérica ou contagem das formas viáveis.
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1. Amostragem:1. Amostragem:
Deve ser representativa
Critérios para obtenção da amostra:
• Sacos e barricas (pulverizados) fração da parte superior, inferior e mediana.
•Assepsia na área próxima, vedação, líquidos
Coleta e TransporteTemperatura adequada, material limpo, recipiente de boca larga (capacidade para 100g(mL).
Quantidade a ser analisada 10g(ml) – 1g(ml)
√N ou √N +1, N = no total recipientes
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Preparo da amostraPreparo da amostra
�Presença de conservante Inativação do conservante;
�Ajuste do pH;
�Homogeneização da amostra;
�Sabonetes e supositórios (fragmentação e aquecimento).
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2. M2. Méétodos de Contagem Microbianatodos de Contagem Microbiana
• Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade (pour plate);
• Em meio sólido, com semeadura da amostra em superfície;
• Membrana filtrante;
• Número mais provável.
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2. 2. MMéétodostodos de de ContagemContagem MicrobianaMicrobiana
10 g (mL)
(Tampão fosfato ou NaCl-
peptona pH 7,2) 1:10
3-5 dias (30-35°C, bactérias)
5-7 dias (20-25°C, fungos)
Meio sólido com semeadura da amostragem em profundidade (pourplate) ou em superfície (spread plate)
1 - 2 mL
1 - 2 mL
Limitação (Pour Plate): amostras q conferem opacidade ao meio, UFC/mL < 1Limitação (Spread Plate): carga microbiana < 2 UFC/mL(g)
Ágar caseína-soja/ágar nutriente
Ágar Sabouraud-dextrose/ágar batata
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Método spread plate harmonizado
• Adicionar em duplicata 0,1 ml no TSA e SDA e espalhar nas superfícies dos meios prontos.
• Contar as placas com crescimento com menos 250 colônias para TAMC e menos que 50 colônias para TYMC.
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Método pour plate harmonizado
• Adicionar 1 ml da diluição na placa (90 mm) e adicionar 15 a 20 ml de meio TSA e SDA em duplicata.
• Incubar TSA 30-35oC por 3 a 5 dias.
• Incubar SDA 20-25oC por 5 a 7 dias
• Contar as placas com crescimento com menos 250 colônias para TAMC e menos que 50 colônias para TYMC.
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Membrana filtrante:Membrana filtrante:
Alíquotas (líquida), filtração através de membranas.
Depositadas nas placas
1. Filtração (membrana nitrato ou acetato de celulose 0,45 µm)
� 10mL ou 1g amostra (passagem membrana).� Diluir se necessário contagem entre 10 e 100 colônias.� Lavar;� 1 membrana (para cada meio) Bactérias
Leveduras/Fungos� n° colônias desenvolvidas;� Cálculo UFC/g ou mL da amostra.
� Permite avaliar volumes elevados, amostras contendo agentes antimicrobianos.
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Método harmonizado
• Transferir quantidade validada para dois filtros.
• Lavar cada filtro com método validado;
• Depositar um filtro em TSA e outro em SDA;
• Incubar TSA 30-35oC por 3 a 5 dias.
• Incubar SDA 20-25oC por 5 a 7 dias.
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2. 2. MMéétodostodos de de ContagemContagem MicrobianaMicrobiana
Incubação Contagem das colônias CálculosTAMC
2/4
4/2 = 2Fator de
Diluição: 1020UFC/mL
Contador / Lupa / Iluminaçãoartificial/ Contador /
Registrador
TYMC
1/2 = 0,5Fator de
Diluição: 10<10UFC/mL
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Contagem
� Spiral plate
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NNúúmero mais Provmero mais Prováávelvel
� Estimativa fundamentada em probabilidade;� Diluição seriada em tubos contendo meio de cultura e observação� do crescimento.
Diluição do ensaio
Amostra inoculada
Tubos com todos
9ml 9ml9ml 9ml 9ml
100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
1ml 1ml1ml 1ml 1ml 1ml
Crescimento depois da incubação Sem crescimento
Inóculosem diluição
1ml1ml1ml1ml 1ml
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+
+
-
1ml 1ml1ml 1ml 1ml 1ml
9ml 9ml9ml 9ml 9ml
100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Inóculosem diluição
1ml1ml1ml1ml 1ml
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
--
3 3 [3 2 0] 0
Confrontar dados com tabelas estatísticas específicas
• Imprecisão maior que os outros métodos;• Permitir maior revitalização dos mais debilitados;• Práticas para amostras pouco solúveis e translúcidas;• Útil quando se espera valores baixos de contagem.
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� Preparar pelo menos 3 séries com 3 tubos.
� 3 alíquotas de 1 g ou 1 ml são inoculados em 3 tubos com 9 a 10 ml de TSB.
� O mesmo para outras diluições.
� Incubar todos os tubos não mais do que 3 dias.
� Determinar o NMP na tabela (só TAMC).
Método harmonizado, NMP
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Determinar a adequaDeterminar a adequaçção do mão do méétodo de contagemtodo de contagem
Determinar se o método permite a detecção de mos na presença do produto.
Usar <100 UFC do organismo a ser inoculado;Recuperação deve estar dentro de 50%;
TAMC = Total aerobic microbial count (no TSA, incluindo fungos)TYMC = Total combined yeast/mould count (no Sab.4%-Dextrose Agar, incl. bactérias)
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CritCritéérios de aceitarios de aceitaçção de qualidade ão de qualidade microbiolmicrobiolóógica para formulagica para formulaçções não estões não estééreisreis
S. aureus/ P. aeruginosa/ BG (-) bile-tolerante
101102Uso inalatório (prep. Líquidas para nebulização)
E. coli101102Preparações aquosas de uso oral
E. coli102103Preparações não aquosas de uso oral
Organismos especificados:
Ausência em 1g ou mL
TYMC
UFC/g
TAMC
UFC/g
Via de administração
*BP 2008 harmonizado
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Pesquisa de Pesquisa de PatPatóógenosgenos EspecEspecííficosficos
Principais patógenos pesquisados (devido a sua presença indesejada)nas formulações farmacêuticas.
� Pseudomonas aeruginosa (prep. tópicas, colírios, regiões próximas aos olhos)
� Staphylococcus aureus (tópicos em geral)
� E. coli (orais)
� Salmonella sp (orais)
� Coliformes
Antes da harmonização
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Harmonização
� Escherichia coli
� Salmonella spp
� Pseudomonas aeruginosa
� Staphylococcus aureus
� Clostridium sp.� Gram (-) bile-tolerantes� Candida albicans
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Testes de promoTestes de promoçção de crescimentoão de crescimento
� Validação de meios de cultura;� Utilizar cepas referência de coleções de culturas;� Níveis de inóculo < 100 UFC. � Recuperação deve ser com um fator de 2 do controle
(95% limite de confiança para NMP).� Controle negativo (condições de esterilidade).
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Procedimento Procedimento –– Meios de EnriquecimentoMeios de EnriquecimentoProdutividade x Especificidade
10 g (mL)
Caldo caseína-soja (S. aureus e P. aeruginosa).
Caldo lactose (Salmonella sp. e E. coli)
Incubação a 36 ± 1oC de 24 a 48h.
100 mL
Diferenciação: identificação do microorganismo
Transferir alíquotas dos meios de enriquecimento para meios de cultura de isolamento e diferenciação.
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Staphylococcus aureus (método harmonizado, 2008):
Caldo caseína-soja (TSB)
30-35oC, 18-24h
Subculturas em ágar Manitol (colônias amarelas, halo amarelo). 30-35oC, 18-72h
Confirmar por identificação.
Meios de diferenciaMeios de diferenciaççãoãoMeios de enriquecimento e seleção
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Pseudomonas aeruginosa(HARMONIZADO)
TSB, 18-24h;
Subculturas em Ágar Cetrimida – colônias esverdeadas com fluorescência (18-72h);
Ensaio de oxidase;
Confirmar por identificação.
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Escherichia coli (HARMONIZADO):
Diluição do produto (≥1g ou 1mL) em TSB (30-35oC, 18-24h);Transferir 1,0mL do TSB para 100mL de Caldo MacConkey(42-44oC, 24-48h);Subcultivo em placa com ágar MacConkey (30-35oC, 18-72h);
Confirmar por identificação.
Fermentadores x não fermentadores de lactose
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Salmonella sp(HARMONIZADO):
Diluição do produto (≥10g ou 10mL) em TSB (30-35oC, 18-24h);Transferir 0,1mL do TSB para 10mL de RVSEB (30-35oC, 18-24h);Subcultivo em meio ágar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) (30-35oC, 18-48h) - colônias vermelhas, núcleo negro.Confirmar por identificação.
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Clostridium sp (HARMONIZADO):
Diluição do produto (≥1g ou 1mL) em TSB (20-25oC, 2-5h);Usar o volume de TSB correspondente a 1g do produto em 2 porções iguais;Aquecer 1 parte a 80oC por 10min;Transferir 10mL das alíquotas para 2 frascos com meio reforçado para Clostridia (crescimento em anaerobiose de 30 a 35oC, 48h);Subcultivo de cada tubo em ágar Columbia (anaerobiose de 30 a 35oC, 48h);Teste da catalase (é catalase -), e só pode apresentar crescimento anaeróbico.
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Candida albicans (HARMONIZADO):
Inocular 10mL de uma diluição 1:10 do produto (≥1g ou 1mL) em 100mL SDB, (30-35oC, 3-5 dias);
Subcultivo em placa SDA (30-35oC, 24-48h);
Confirmar por identificação.
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Provas adicionaisProvas adicionais
� Capacidade de fermentação de diferentes açúcares;
� Aproveitamento de sais amoniacais como única fonte de nitrogênio;
� Uso do citrato como única fonte de carbono (Ágar Citrato);
� Formação de acetoína (reação de Voges-Proskauer);
� Reação da peroxidase, coagulase, etc;
� Detecção de micoplasma, micotoxinas.
Uso de métodos automatizados e miniaturizados para identificação.
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FEuropeia – limite de ação para AP (100mos/100mL) e ApI (10mos/100mL)
USP, água bulk ou acondicionada como produto.
Limites de alerta e de ação.
Padrões microbianos: os níveis de carga microbiana para água de uso industrial (bulk) inexistem, exceto ao se referir à água estéril. Situação contornada por cada empresa pela adoção do seu próprio padrão interno.
Potabilidade: legislações e pré-requisitos variados nos diversos países.
Água na Indústria
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Água na Indústria
• Água Purificada – limite de ação 100UFC/mL
• Água Purificada Estéril – água purificada esterilizada em embalagem apropriada.
• Água Estéril para Injeção – água para injeção acondicionada e esterilizada. Diluente para produtos parenterais;
• Água Estéril para Irrigação ~AEI, especificação não inclui material particulado;
• Água Estéril para Inalação – Água para injeção esterilizada em embalagem apropriada. Cumpre com os requisitos da APE, exceto quanto ao pH, que deve estar entre 4,5 e 7,5.
• Água Bacteriostática para Injeção – reconstituição de injetáveis de dose múltipla a partir do mesmo frasco.
• Água para injeção (bulk).
Tipos de água, RDC 17, 2010.
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Análise da água
Potabilidade – característica depende da legislação de cada país.
Principais indicadores de contaminação fecal:
Coliformes totais: bacilos Gram (-) não esporulados, aeróbios ou anaeróbios facultativos, fermentam a lactose a 35 – 37oC de 24 a 48h com produção de gás.
Espécies dos gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella (obs. Enterobacter se multiplica no ambiente livre).
Coliformes fecais ou termotolerantes: fermentam lactose a 44,5 ±0,2oC 24h. Seguramente somente a Escherichia coli.
ICFs: mos presentes nas fezes em quantidade >> q patogênicos.
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Estreptococos fecais: origem da contaminação, predomina nas fezes de animais; distância da fonte de contaminação;
Clostridium perfringens: esporulado, indicador de contaminação fecal muito remota;
Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, C. albicans: indicativos de tratamento não eficiente, pequeno tempo de sobrevida, presença associada à condição de higiene.
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Padrões microbianos
� Água potável: ausência de E. coli ou coliformes termotolerantes em 100mL;
� Água na saída de tratamento: ausência de coliformes totais em 100mL;
� Reservatórios e rede de distribuição: ausência de E. coli ou coliformes termotolerantes em 100mL.
� Quando cianobactérias > 20.000céls/mL: análise semanal de cianotoxinas na água na saída do tratamento, na entrada de clínicas de hemodiálise e indústrias de injetáveis;
� Recomenda-se avaliar heterotróficos – indicativos das condições de higiene.
MS, Portaria 36, 19/01/1990MS, Portaria 518, 25/03/2004
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Análise bacteriológica da água:
determinação quantitativa
Coleta frasco estéril, desprezar a 1ª amostra, e mantê-la a 10oC se não analisar de imediato. Para amostras cloradas, adicionar tiossulfato de sódio (0,1mL de solução a 10% para 100mL de água).
Contagem de viáveis totais valor absoluto sem significado, controle somente sobre variação esperada, índice das condições de higiene.
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Identificação de coliformes totais e fecais:
Teste presuntivo: detecção de microorganismos que fermentem a lactose.
Uso de caldos Lactose ou Lactose-SDS em tubos de Durhaminvertidos. Formação de gás, resultado +
Membrana filtrante (meio Endo), colônias escuras, brilho metálico +.
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Teste confirmatório: há mos que não os coliformes que podem fermentar a lactose como bacilos Gram (+) esporulados e leveduras.
Transferir amostras dos tubos + para tubos contendo meio seletivo Caldo Bile-Verde Brilhante que contém corante que impede proliferação de formas esporuladas e leveduras e componente que favorece proliferação de coliformes. O resultado é também a produção de gás a partir da fermentação da lactose.
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Escherichia coli: caldo EC (lactose, proteases e sais biliares) Incubação a 44,5oC.
Em todas as etapas a contagem é realizada pela técnica de NMP, considerando a resposta positiva a fermentação da lactose.
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Métodos alternativos Custo x benefício
Controle da água na indústria
� Contagem direta de células marcadas com fluoróforos: coloração com marcadores fluorescentes (para ácidos nucleicos). Nível detecção mo (viáveis x não viáveis), 2h.
� ATP, luciferina, luciferase: detecção de qualquer tipo de microorganismo (limitação <102-103 UFC) (MicroCountTM digital, préincubação 24h.)
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Automação e métodos alternativos para enumeração microbiana
� Contadores em espiral (↓ tempo e material) (4 x 102 a 4 x 105 UFC);
� AutoPlate 4000 (Spiral Biotech, USA) e ProtoCOL (Symbiosis, UK);
� Petrifilm e SimPlate, subtituição do crescimento tradicional em placa com ágar sólido;
�Bioluminescência;
� Epifluorescência direta (DAPI ou alaranjado de acridina);
� Impedância: resistência ao fluxo de uma corrente alternada, que passa através de material condutor. Equipamentos disponíveis no mercado: Bactometer (BioMerieux) e Malthus AT – automatizados e avaliam > 100 amostras simultaneamente. Análise de quantidades grandes de amostra (de 10 a 100mL), ↑sensibilidade.
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Métodos rápidos para identificação microbiana
� Sistemas miniaturizados e automatizados (exs. API e Vitek, BioMerieux Inc.).
� Identificação genotípica: PCR, eletroforese de fragmentos de DNA.
� Cromatografia gasosa (Hewllet Packard) esterificação de ácidos graxos produzidos pelo metabolismo de mos. Identificação de cepas microbianas a partir de metabólitos específicos.
� Métodos imunológicos.
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BD BBL™ Crystal™ - Sistema de Identificação de Microorganismos Clinicamente Relevantes
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