prof. adjunto ary fernandes junior departamento de ... · b. linhagem mucóide isolada de paciente...
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PseudomonasPseudomonas aeruginosaaeruginosa
Prof. Adjunto Ary Fernandes JuniorProf. Adjunto Ary Fernandes JuniorDepartamento de Microbiologia e Imunologia
Instituto de Biociências - UNESPDistrito de Rubião Júnior s/n
CEP 18618-000/ Botucatu/ SP /BrasilTel. 14 [email protected]
Pseudomonas
� Gessard (1882) - Bacillus pyocyaneus
� Migula (1894) - Pseudomonas
� Dispostas em pares de células que lembram uma
única célula
� Em 1992, esse gênero foi subdividido em vários
novos gêneros (ex. Burkholderia e Stenotrophomonas)
CLASSIFICAÇÃO
Família Pseudomonadaceae
Pseudomonas (P. aeruginosa e outras), Stenotrophomonas (S. maltophilia), Stenotrophomonas (S. maltophilia),
Burkholderia (B. cepacia, B. pseudomallei), Acinetobacter, Xanthomonas, Frateuria,
Zoogloea, etc.
CLASSIFICAÇÃO
Gênero Pseudomonas
200 espécies e 18 subespécies
� Pouco exigentes nutricionalmente (Inúmeros compostos orgânicos como fonte de
C) � Ampla distribuição na natureza � Grande versatililidade
P. aeruginosa PAO1 � 6,3 milhões de pares de base; 5.570 genes (open reading frames - ORFs); 8,4% dos genes são de regulação
(Stover et al., 2000)
Taxonomia � Similaridades RNAr e relacionamentos filogenéticos
Grupo I:- Pseudomonas “verdadeiras”
- Subdivisão γ das Proteobactérias- Exemplos: P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida
– espécies relacionadas
Grupo II:- Subdivisão β das Proteobactérias- P. cepacia, P. mallei Burkholderia
- P. solanacearum, P. picketti Ralstonia
Grupo III:- Subdivisão β das Proteobacérias- P. testosteroni Comamonas
- P. acidovorans Comamonas Delftia
- P. facilis Acidovorax
- P. palleronii Hydrogenophaga
- P. saccharophila
Grupo IV:Grupo IV:- Subdivisão α das Proteobactérias- P. diminuta, P. vesicularis Brevundimonas
Grupo V:- Subdivisão γ das Proteobactérias- P. maltophilia Xanthomonas Stenotrophomonas
Pertence ao grupo I ���� homologia de rRNA
Grupo Fluorescente (Pigmento pioverdina = fluoresceína � Difusível) � P. aeruginosa,
P. fluorescens, P. putida)
Pseudomonas
Grupo Não Fluorescente���� P. stutizeri, P. mendocina)
� Bacilos Gram-negativos pertencentes ao grupo de não-fermentadores (Aeróbios)
� Ubíquos: Solo, matéria orgânica em decomposição, vegetação, água, ambiente
Pseudomonas
decomposição, vegetação, água, ambiente hospitalar em reservatórios úmidos
� Exigências nutricionais míninas: Acetato e amônia como fontes de carbono e de nitrogênio
(Biorremediação)
� É incomum a colonização persistente, como parte da microbiota normal humana
Pseudomonas
� Não resistem ao ressecamento e baixas temperaturas
PseudomonasPseudomonas aeruginosaaeruginosa ((±± 70% das 70% das doenças por doenças por PseudomonasPseudomonas))
� Bacilos Gram negativos, retos ou ligeiramente encurvados, isolados ou aos pares, curtos
(≅ cocobacilos) (1,5 a 3,0 µm de comprimento e 0,5 µm de diâmetro)0,5 µm de diâmetro)
PseudomonasPseudomonas aeruginosaaeruginosa
� Móveis (monotríqueas) (as vezes 2 ou 3 flagelos)
�Não esporulada
� Fimbrias - Importante para patogenicidade
� Algumas cepas capsuladas (cápsula de polissacarídeo - Alginato) (liga-se ao ácido siálico da membrana plasmática) (Aspecto mucóide da colônia)
Em P. aeruginosa, os flagelos são necessários para aproximar a bactéria da superfície, enquanto o LPS media as primeiras
interações, havendo talvez a participação de proteínas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fímbrias tipo
IV mediam o movimento pulsante, necessário à formação de microcolônias. A produção destas fímbrias é regulada, em parte,
por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativação de genes envolvidos na síntese de alginato e repressão de genes
flagelares. A formação do biofilme maduro envolve a participação de homoserina lactonas sinalizadoras.
Nature Reviews Microbiology 8, 623-633 (September 2010)
a | A model of a bacterial biofilm attached to a solid surface. Biofilm formation starts with the attachment of a cell to a surface. A microcolony forms
through division of the bacterium, and production of the biofilm matrix is initiated. Other bacteria can then be recruited as the biofilm expands owing to cell
division and the further production of matrix components. b | The major matrix components — polysaccharides, proteins and DNA — are distributed
between the cells in a non-homogeneous pattern, setting up differences between regions of the matrix. c | The classes of weak physicochemical interactions
and the entanglement of biopolymers that dominate the stability of the EPS matrix47. d | A molecular modelling simulation of the interaction between the
exopolysaccharide alginate (right) and the extracellular enzyme lipase (left) of Pseudomonas aeruginosa in aqueous solution. The starting structure for the
simulation of the lipase protein was obtained from the Protein Data Bank117. The coloured spheres represent 1,2-dioctylcarbamoyl-glycero-3-O-
octylphosphonate in the lipase active site (which was present as part of the crystal structure), except for the green sphere, which represents a Ca2+ ion. The
aggregate is stabilized by the interaction of the positively charged amino acids arginine and histidine (indicated in blue) with the polyanionic alginate.
Water molecules are not shown. Image courtesy of H. Kuhn, CAM-D Technologies, Essen, Germany.
� Catalase positiva (Aeróbias estritas) (algumas crescem anaerobicamente na presença de Nitrato-
receptor de elétrons, sendo o nitrato reduzido a nitrito).
O teste é revelado através da adição
de 3 gotas do reativo de Griess A
com 3 gotas do
Redução do nitrato a nitrito e nitrito a gás (após a adição de zinco
� Não fermentam carboidratos (BGNNF)(utilizam poucos carboidratos (glicose, ribose e gluconato),
com 3 gotas do reativo de Griss B no caldo nitrato
a adição de zinco em pó)
?
�Oxidam glicose � pequena quantidade de ácidos, citocromo oxidase positiva (Diferenciar
das enterobactérias)
Escherichia coli. (Ann C. Smith, University of Maryland, College Park, MD)
Pseudomonas aeruginosa (Ann C. Smith, University of Maryland, College Park, MD)
Oxidação do Citocromo C pelo O2
Para fenilenodiamina é oxidado pela enzima adquirindo cor
vermelha
Pseudomonas (+), Enterobactérias (-)
� Não exigentes nutricionalmente (cepas multiplicam em água destilada e algumas podem
utilizar mais de 30 compostos orgânicos como fonte de C e N)
� Em Ágar Sangue � β hemólise
� Produção de pigmentos difusíveis (hidrosolúveis - Piocianina - Azul, e Fluresceina (Pioverdina)
(algumas produzem também Piorrubina-vermelho)
�Patógeno oportunista � Introduzida em áreas desprovidas de defesas normais (mucosa ou pele rompidas por lesões teciduais diretas; cateteres
intravenosos ou urinários, neutropenia quando na quimioterapia de tratamento de câncer)
�Resistente a corantes, muitos anti-sépticos e drogas antimicrobianas (comum nos hospitais)
�Cresce bem entre 37oC e 42oC
Quege GE, Bachion MM, Lino Junior RS, Lima ABM, Ferreira PS, Santos QR, Pimenta FC. Comparação da atividade de ácidos graxos essenciais
e biomembrana na microbiota de feridas crônicas infectadas. Rev. Eletr. Enf. [Internet]. 2008;10(4):890-905
Cápsula Polissacaridica(Alginato)
Endotoxina (LPS)
Fímbrias
Flagelo
Principais fatores de virulência de P. aeruginosa
Outros produtos
-Proteases:Elastases (LasA, LasB) Protease Alcalina
-Hemolisinas: Fosfolipase CRamnolipídio
-Exotoxina A-Exoenzima S-Piocianina
Fator de virulência Efeito biológico
Fímbrias(Neuraminidase)
Aderência ao epitélio respiratório(Melhora adesão das fímbrias)
Cápsulas de polissacarídios(Polimeros de ácido manurônico e gulurônico) = Alginato ou alginolato
Aderência ao epitélio traqueal (receptor ácido siálico da MP), anti -fagocitose
Endotoxina (LPS) (lipídeo A) Febre, oligúria, leucopenia ou leucocitose,
Fatores de Virulência associados à P. aeruginosa
Endotoxina (LPS) (lipídeo A) Febre, oligúria, leucopenia ou leucocitose, coagulação intravascular disseminada (CID),
anormalidades metabólicas, choque
Exotoxina A (mais importante (Termo lábil e imunogênica)
Impede alongamento da cadeia polipeptídica (Inibe síntese protéica) - danos a tecidos e
inibe ação de fagócitos
Exoenzima S (Termo estável e imunogênica)
Ação semelhante da exotoxina A
Fator de virulência Efeito biológicoElastase Lesão do tecido vascular (quebra elastina e
colágeno) - lesões hemorrágicas (=éctimagangrenoso), inibição da função dos
neutrófilos (interfere na resposta inflamatória e imunológica)
Protease alcalina (atividade em pH alcalino)
Lesão tecidual, anticomplementar, inativação da IgG, inibição da função dos
neutrófilos (interfere na resposta inflamatória e imunológica)e imunológica)
Fosfolipase C Hemolisina termo lábil, ação necrosante(degradação de lipídeos e lecitina) (fosfatidil
colina da membrana de eritrócitos)
Leucocidina Inibe ação de neutrófilos e linfócitos (capaz de matar o fagócito mesmo após a bactéria
ter sido fagocitada)
Bacteriocinas (Piocinas) Matar bactérias (microbiota normal)
Fímbrias do tipo IV
Receptor: Gangliosídeo GM1 quando desprovido de ácido siálico
Fatores de virulência
Sialidase (Neuraminidase)
Flagelo ����Tipo “b” flagelina peso molecular de 53KDa
Tipo “a” pertence a um grupo heterogêneo PM 45 a 52 Kda
Fatores de virulência
Lipopolissacarídeo (LPS) ���� Liberação de citocinasLipopolissacarídeo (LPS) ���� Liberação de citocinas
Obs. LPS � adesão ao tecido pulmonar e às células
da córnea
Febre, oligúria, leucopenia ou leucocitose, coagulação intravascular
disseminada (CID), anormalidades metabólicas, choque
Alginato ���� Polímero de ácido α-L- gulurônico e β-D-manurônico) � Antifagocítico e de adesão
Produção de alginato (gene alg) - mutação gene muc –
condições normais inibe a expressão do gen alg
Fatores de virulência
Produção de alginato em meio Luria-Bertani (LB) Agar sem NaCl e incubados a 37°C durante 12 h,
e, a 25°C durante 24 h para melhorar a pigmentação.
A. tipo selvagem (linhagem PAO1). B. linhagem mucóide
isolada de paciente com fibrose cística (FRD1 (mucA22).
Microscopia eletrônica de P. aeruginosa em superfícies de vidro. Fracamente aderentes formando uma monocamada
(B e D) e moderada e fortemente aderente (A e C). (A e B; 7 e 14 h após a inoculação, respectivamente) e com o
biofilme (C e D; 20 e 40 h, respectivamente, após a inoculação) .
Deligianni et al. BMC Microbiology 2010 10:38
a) biofilme sobre a superfície de granito. Barra de escala, 10 mícrons.
b) ampliação de um biofilme mostrando em a P. aeruginosa e filamentos de matrix
extracelular. Barra de escala, 1 mícron. (Whiteley et al, 2001)
Elastase A (LasA) – serina protease
Elastase B (LasB) –metaloprotease –Zinco
Protease Alcalina
Fatores de virulência
Proteases
Elastina LasA
Lesão do tecido vascular (quebra elastina e colágeno) - lesões
hemorrágicas (=éctima
lesões de pele e tecidos hemorragia e necrose
Elastina
Parede vascular e tecido
pulmonar
LasA
LasBProtease Alcalina
hemorrágicas (=éctimagangrenoso), inibição da
função dos neutrófilos (interfere na resposta
inflamatória e imunológica)
Fosfolipase C (Plc)
(hemolisina termo lábil)
Ramnolipídeo (Rhl) – Glicolipídeo (ramnose)
Fatores de virulência
Ação necrosante (degradação de lipídeos e lecitina) (fosfatidil
colina da membrana de eritrócitos)
surfactante pulmonar
Ramnolipídeo
Fosfolipase C
Ação sinérgica
Exotoxina A
Exotoxina A (termo lábil e imunogênica) ���� Inibe síntese protéica � Danos a tecidos e inibe ação de fagócitos
Fatores de virulência
EF-2 Fator 2 de elongação
Exotoxinas (ExoS (90% das cepas), ExoT, ExoU, ExoY) (termo estável e imunogênica) ���� Tóxicas para fagócitos (macrófagos), danos teciduais)
Pigmentos Piocianina
Catalisa a produção de superóxido e peróxido de hidrogênio
-Danos aos tecidos endoteliais-Impede o crescimento de outras bactérias
Fatores de virulência
-Impede o crescimento de outras bactérias -Elimina a atividade ciliar respiratória-Produz danos oxidativos nos tecidos oxigenados, como o pulmonar
Pioverdina � Sideróforo que se liga aos íons ferro e pode regular secreção de outros FV (Exotoxina A)
Leucocidina ���� Inibe ação de neutrófilos e linfócitos (capaz de matar o fagócito mesmo após a bactéria ter sido fagocitada)
Fatores de virulência
Paradoxo da P. aeruginosa� Muitos fatores virulência
-Incapacidade de completar os primeiros passo da infecção �Não é capaz de invadi-las
-Não conseguem manter a colonização persistente concomitantemente com a produção de fatores tóxicos que
causariam danos ao indivíduo
Paradoxo da P. aeruginosa� Muitos fatores virulênciaPor que patógeno oportunista???
PACIENTES DE RISCO
-Queimaduras
-Fibrose cística
-Transplante de órgãos
Patogenicidade
-Traqueostomia
-Cateteres permanentes
-Neoplasia hematológica, diabetes, usocorticóides, uso de antibióticos, prótesesintravascular, cateterização, etc.
Manifestações clínicas causadas por Pseudomonas aeruginosa
Manifestação clínica Condições predisponentes
Endocardite Viciados em drogas injetáveis, indivíduo com prótese de válvulas cardíacas, cirúrgias cardíacas (acometimento de valvas
cardíacas)
Sepsis Cirurgias, cateterização, queimaduras graves, leucemia, diabetes mellitus
Infeções pulmonares (Traqueobronquites, Broncopneumonia
necrosante)
Pacientes com fibrose cística , pacientes entubados (lesão do epitélio traqueal)
necrosante)
Infecções de ouvido (otite)
Natação é um importante fator de risco
Infecções de feridas por queimaduras
Infecções das vias urinárias
Normalmente através de sondas vesicais (infecção nosocomial)
SNC - Meningites Via hematogênica, extensão de estruturas contíguas(ouvido, seios paranasais) ou por via direta (punção lombar, traumatismo)
Infecções oculares (ceratite e endoftalmite)
Associado a uso de lentes de contato, após cirurgias no olho
cultura: isolamento e identificação
Material Clínico (lesões cutâneas, pús, urina, fezes, sangue,líquido cefaloraquidiano, escarro, etc)
Gram: BGNÁgar sangue: hemolítica
McConkey: lactose negativa
Diagnóstico
McConkey: lactose negativa
série bioquímica
não fermentador
- oxidase positiva
- movimento positivo
- crescimento a 42º C
- pigmento
Resistência à inúmeras drogas
Imipenem
Tratamento
Imipenem
Aminoglicosídeos (gentamicina)
Fluoroquinolonas (ciprofloxacina)
Polimixinas (caso de multiresistentes)
-Taxa de portadores na comunidade: 0 a 6%
-Taxa de portadores no hospital: 50%
-Fontes de infecção diversificadas: flores, verduras,
equipamentos respiratórios, água, medicamentos,
endoscópios, anti-sépticos, prótese.
Epidemiologia
-Fontes humanas do microrganismo podem ser
pacientes, profissionais de saúde ou visitantes.
-Práticas efetivas de controle de infecção devem ser
concentradas na prevenção da contaminação de
equipamentos estéreis, como equipamento de
ventilação mecânica e máquinas para diálise.