Prof. Dr. Nilgün ÇerikçioğluMarmara Üniversitesi Tıp Fakültesi

Tıbbi Mikrobiyoloji AD, 2016

Antifungaller Direnç gelişimi

Geniş spektrumlu antifungaller

Tedavi için antifungal seçiminde karmaşa

•Tür düzeyinde tanımlama•Antifungal Duyarlılık Testi (AFDT)

• uygun• doğru tedavi

Comparative Evaluation of a New Commercial Colorimetric Microdilution Assay (SensiQuattro Candida EU) with MIC Test Strip and EUCAST Broth Microdilution Methods for Susceptibility Testing of Invasive Candida IsolatesJCM, 53, 255- 261 , 2015

STANDART REFERANS YÖNTEMLERİ

Buyyon Mikrodilüsyon (BMD) [CLSI - EUCAST]

Zaman alıcı

İş yoğunluğu

Rutin laboratuvarlar için uygun değil

SEÇENEK - YÖNTEMLER

Uygulaması

Ticari olarak elde edilebilir

Maliyet – etkin

Manuel

Yarı otomatize Seçenek Yöntemler Otomatize

Kolay

Kısa süreli

Seçenek Yöntemlerden Beklenenler (İ)1. CLSI ya da EUCAST BMD ile kıyaslanabilir

sonuçlar :

2. Esas uyum (EU): ±2 kat sulandırımı aşmayan

MİK sonuçları

3. Kategorik Uyum (KU):

Yorumlanabilir MİK sonuçları arası uyum [Hassas (H), Intermediate (I) (Orta) , Dirençli (D)] ≥ %90)

Seçenek Yöntemlerden Beklenenler (İİ)

4. Çok Büyük Hata (ÇBH): Yalancı duyarlılık(<%1.5)

5. Büyük Hata (BH): Yalancı dirençlilik

6. Küçük Hata (KH): Dirençli/duyarlı ↔Orta (I)

7. Reproducibility: Tekrarlanabilirlik

8. Değişikliklere uygunluk (İlaç ekleme / çıkarma, son noktada değişiklik…..)

FDA ONAYLI TESTLER

SYO ( Sensitre Yeast One) (TREK

Diagnostic systems, Inc., Cleveland, ABD)

Vitek 2 (bioMérieux, Fransa)

E test (AB Biodisk İsveç--bioMérieux, Fransa)

Antifungal Susceptibilities of Candida Isolates Causing Bloodstream Infections at a Medical Center in Taiwan, 2009-2010; AAC, 58, 3814 – 3819, 2014

SYO Kolorimetrik Buyyon Mikrodilusyon

CLSI uyumlu

1998 (5 antifungal) → 2012 (9 antifungal)

Dehidrate iki kat seri sulandırımlar( SYO-YO10)

Alamar mavisi

Kolorimetrik okuma

Kırmızı: üreme + Mavi:üreme –

MİK:Üremenin olmadığı en düşük ilaç [C]

Candida türleri

Cryptococcus türleri

Hızlı çoğalan mayalar

Aspergillus türleri

Üretici firmanın önerileri

doğrultusunda test hazırlanır.

Posakonazol C.albicans Vorikonazol C.glabrata Flukonazol C.tropicalis Itrakonazol

Trailing (Hafif mor renk)

VİTEK 2 Tam otomatize

9-24 saat içerisinde (ortalama 15 saat)

Spektrofotometrik okuma

VİTEK 2 AF03 IUO Güncelleştirilmiş Form FCZ son konsantrasyon 1→ 0.5

Yeni CLSI CBP leri ile uyumlu

Dirençli kökenleri saptayabiliyor.

E test

Kullanıma hazır

MİK

Antifungalin gradient

konsantrasyonlarını içeren şerit

Amfoterisin B

Anidulafungin

Kaspofungin

Mikafungin

Flukonazol

Itrakonazol

Posakonazol

Vorikonazol

Flusitozin

RPMI 1640AM3 besiyerleri

Flukonazol

Üremenin %80 inhibisyonu

Küçük kolonilerin dışlanması

Büyük kolonilerin kestiği nokta

VOR Üremenin %80 inhibisyonu Büyük kolonilerin kestiği nokta

RPMI-1640

AM3

C. lusitaniae – Amfoterisin B

ÇALIŞMALARDAN ÖRNEKLERVİTEK 2 (AST-YS01 kart) – SYO (Y08 formatı)

UYUMU / Candida türleri

(CLSI M27 A3 S3 Temelli KIYASLAMA !)

FCZ için EU düşük bulunan türler

C.albicans → %70±10

C.parapsilosis → %71.4±12

C.kefyr → %50

Toplamda → %81.4±4.6 EU Interlaboratory evaluation of VITEK2 system and Sensititre YeastOne© for antifungal susceptibility testing of yeasts isolated from blood cultures against four antifungal agentsNEWMICROBIOLOGICA, 34, 195-201, 2011

Amfoterisin B için EU düşük bulunan türler C.krusei %60 C.kefyr %50 Toplamda → %84.3±4.3 EU

Flusitozin için EU düşük bulunan türler C.guilliermondii, C.tropicalis %66 C.lusitaniae %50 Toplamda → %81.4±4.6 EU

Vorikonazol için EU düşük bulunan türler C.guilliermondii %16.6 C.tropicalis, C.lipolytica %50 Toplamda → %88,6±3.4 EU

SONUÇ: VİTEK 2 daha güvenilir / 13 saatte sonuç !!

SYO-CLSI M27 A3-S4SYO MİK yorumu

474 Kan izolatı Candida türü

Problemli hastalar(YBÜ, Cerrahi servisi, Hematoloji

Servisi)

Türe özgül revize CBP lere göre ya da

ECV lere göre

Antifungal Susceptibilities of Candida Isolates Causing Bloodstream Infections at a Medical Center in Taiwan, 2009-2010; AAC, 58, 3814 – 3819, 2014

SYO-CLSI EU ORANLARI

C.albicans → >%95 FCZ (H) C.parapsilosis C.krusei

C.glabrata → C.tropicalis → %78.6 VOR (H)

%100 VOR (H)

%90.9 FCZ (DBD)

Tüm izolatlar >%97 MİKA,ANİDİLA

Tüm izolatlar %100 Amfo B (WT)

(MİK<1)

SYO-CLSI UYUMU

24 saatte sonuç

C.tropicalis VOR «duyarlı değil»

C.tropicalis POS «WT dışı» izolatlarda

SYO-CLSI UYUMU

24 saat

Uyum %95-99

ECV → SYO da 1 dilüsyon değişiyor.

CLSI – CBP → SYO için uygun mu?

SYO ya özgül CBP ler belirlenmeli?

E test-SYO-CLSI M38 A2Aspergillus/Aspergillus dışı küfler

AMFOTERİSİN B YÖNTEMLER ARASI UYUM

± 2 DİLÜSYONDA GÖRECE

VORİKONAZOL

İTRAKONAZOL

In Vitro Susceptibility Testing of Aspergillus and Non-Aspergillus Filamentous Moulds to Antifungal Agents: Evaluation of Three Different MethodsMacedonian Journal of Medical Sciences. 15; 5(3):280-287, 2012

E test CLSI ile uyumlu Zon içi mikrokoloniler DEĞERLENDİRME

DIŞI

Kaspofunginde rezidüel üreme (okuma zorluğu)

Amfoterisin B ve ITR direncini saptamada SYO’dan üstün !!!!

Besiyeri hazırlığında üretici firma önerilerine %100 uyulmalı!!!

SYO Aspergillus / Aspergillus dışı kökenlerde /

Amfoterisin B dirençli kökenleri saptayamıyor !!!!!

Kaspofungin → yalancı yüksek MİK değeri

ITR, VOR, POS

Tüm küf cinsleri için için uygun

CLSI SYO

Farklı antifungal ajanlar için E test sonuçları

SYO-CLSI EKİNOKANDİN / CANDIDA KÖKENLERİ

AND %98.3CAS %93.6MİKA %99.6CAS - C.glabrata %89.7

C.krusei %69.1SonuçEkinokandin, CLSI YENİ CBP ve ECV

SYO için uygun

Toplamda KU

Comparison of the Sensititre YeastOne colorimetric antifungal panel with CLSI microdilution for antifungal susceptibilitytesting of the echinocandins against Candidaspp., using new clinical breakpoints and epidemiological cutoff valuesDiagnostic Microbiology and Infectious Disease 73, 365-368, 2012

MALDI TOF MS / CLSI

CASCandida albicans

Rapid Antifungal Susceptibility Testing by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry Analysis; Journal of Clinical Microbiology, 51, 9, 2964 –2969, 2013

YÖNTEM C.albicans klinik izolat n=65

Fks1 mutant(+) kontrol kökenleri

MALDİ TOF MS-CLSI (revize CBP)

CAS RPMI da 9 farklı ilaç konsantrasyonu+

C.albicans kökenleri

37 °C, 15 saat-3 saat inkübasyon

Toplanan Maya Hücreleri Steril su ile yıkama Formik asit ile süspansiyon (1 er µl)

Etanol + Sinnamik asit Bruker Daltonik Biotyper(3,0 yazılım)

Spektraların Toplanması- Veri Tabanı Eldesi

65 C.albicans spektraları / veritabanı ile kıyaslama

CCI (Composite Correlation Index)

MPCC (Minimal Profile Change Concentration)

saptanması

MALDİ TOF MS Spektra ve rölatif jel MALDI

a. WT C. albicans izolatı

b. Fks1 mutant C.albicans izolatı

WT ve fks1→ 0, 0.03 ve 32 µg/ml CAS ile muamele sonucu

her iki izolat için minimal değişiklikler görülmektedir.

MALDI TOF MS CCI lerin ısı haritasına çevrilmesi

MALDI TOF MS - CLSI UYUMU

65 kökenin 61’i uyumlu sonuç

51 köken HASSAS

11 köken DİRENÇLİ(fks1 mutasyon+)

1 ÇBH (%1.6)

Toplam uyum %98.4

MİKROKALORİMETRİ – CLSI Amfo B, VOR, POS, CAS

Aspergillus türleri

Prensip:

Sabit sıcaklıkta (izotermal / 37 °C)

Mikrobiyal üreme

Artan metabolizmayla birlikte ISI üretimi

Mikrokalorimetri ile ısı üretiminin ölçülmesiIsothermal microcalorimetry: a novel method for real-time determination of antifungal susceptibility of Aspergillus species,; Clinical Microbiology and Infection , 18, 7, E241–E245, 2012

A.fumigatus ATCC 204305 için MHIC saptanması.

Sol panelde «ISI AKIŞI»,

Sağ paneldeANTİFUNGALLERİN varlığında TOPLAM ISI(SDB ‘de inokülüm: 2.5 X10 ⁴ konidia/ ml.)GC: Growth Control (Üreme Kontrol)

Sayılar: Antifungalkonsantrasyonu (mg/L).

NOKTALI YATAY ÇİZGİ: Amfo B ve TRİAZOLLER için: üretilen TOTAL ISININ %50 inhibisyonuEkinokandinler için: ISI AKIŞ PİK’inde %50 azalma.

MHIC = DAİRE içindeki KONSANTRASYONLAR

GC (Growth Control)

(Üreme kontrolü)

Daire içindekiler

Amfoterisin B ve triazoller:GC ye göre toplam ısının %50 inhibisyonuEkinokandinler:GC ye göre toplam ısı akış pikinde %50

Noktalı yatay çizgi

MHIC

o Antifungalsiz ortam Kontrol o Değişik konsantrasyonlarda ilaç varlığında

ISI DEĞİŞİKLİKLERİ

MHIC (Minimal Heat Inhibitory Concentration) ölçümü

CİNS ve TÜRE göre: 5. (Candida türleri) – 22. – 72. saatte sonuç

Mikrokalorimetri –/CLSI M38 A2 Uyumu (± 2 dilüsyon)

Amfo B → %90

VOR → %100

POS → %90

CAS → %70

Mikrokalorimetri - Dezavantajları

Dolaşımda gaz habbecikleri / mikroorganizma

kümeleri → Kanallarda tıkanıklık

Kanaldan kalorimetriye transferde

mikroorganizma miktarında değişiklikler

RUTİN KULLANIMA UYGUN DEĞİL

Yeni üretilen ilaçlar için kullanılabilir.

AKIM SİTOMETRİ

AKIM SİTOMETRİSİ / CLSI C.albicans Amfoterisin B + Maya …..30 dk. FCZ + Maya………………6 saat Vital DNA boyası (FUN-1..)

MİK= (en düşük İlaç [C] Hücreiçi Floresein yoğunluğunda %50

CLSI M27 A2 ile uyum: %96 (amfo B için)-%99 FCZ için Dezavantaj: Özel ekipman gerekliliği

Int J Pharmaceutical & Biological Archives.5, 1-6, 2014.

DİĞER YÖNTEMLER ERGOSTEROL ÖLÇÜMÜ FCZ Farklı [C]+ Maya

Toplam Ergosterol miktarında Değişiklik

o CLSI ile ~ %100 uyumlu«Trailing» sorunu YOK

Küfler için uygun

Dezavantaj: Geliştirilmesi gerekli

Quantitation of Candida albicans Ergosterol Content Improves theCorrelation between In Vitro Antifungal Susceptibility TestResults and In Vivo Outcome after FluconazoleTreatment in a Murine Model ofInvasive Candidiasis. AAC. 44, 2081-2085, 2000.

XTT (Kolorimetrik Yöntem) (XTT) + Mantar (Candida, Cryptococcus, küfler) + Antifungal

( Farklı [C] Biyofilm içinde / planktonik Canlı mantar hücrelerinin varlığında….XTT

indirgenmesi…RENK DEĞİŞİMİ Spektrofotometrik ölçüm

Amfoterisin B, FCZ, ITR, FLC

MİK : Metabolik aktiviteyi %50--%80 azaltan antifungal [C] CLSI ile UYUM→ %90-100 Kısa sürede sonuç

Dezavantajı: Geliştirilmesi gerekli

Biofilm production and evaluation of antifungal susceptibility amongst clinical Candida spp. isolates, including strains of the Candida parapsilosis complex

Med Mycol . 49 , 253-262. , 2011.