prof. dra. marta ana carballo · 2021. 2. 5. · procesos procesos de reparacion de reparacion...
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BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDAD.
ALCANCES Y LIMITACIONES
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA CLINICA-INFIBIOC.Facultad de Farmacia y Bioquímica.
Universidad de Buenos Aires
CIGETOX- CITOGENETICA HUMANA Y GENETICA TOXICOLOGICA
Prof. Dra. Marta Ana CarballoProf. Dra. Marta Ana Carballo
ENTORNO / AMBIENTE
EVENTOS BIOLÓGICOS TEMPRANOS
EVENTOS BIOLÓGICOS TARDÍOS
ENFERMEDAD CLÍNICA
La Genética Toxicológica es la unión de dos grandes áreas del conocimiento como son la Toxicología y la Genética.
Identifica y analiza la acción de los agentes con toxicidad dirigida hacia los componentes hereditarios de los
organismos vivos.
• 1927 - Muller - radiaciones• 1947 - Auerbach - agentes químicos• 1953 - Watson y Crick - ADN• 1969 - Alexander Hollaender - EMS
••Determina el impacto que los distintos agentes Determina el impacto que los distintos agentes (f(fíísicos, qusicos, quíímicos, biolmicos, biolóógicos) pueden tener sobre gicos) pueden tener sobre
el material genel material genééticotico
••Trata de establecer la relaciTrata de establecer la relacióón entre mutagenesis n entre mutagenesis e iniciacie iniciacióón del proceso neopln del proceso neopláásicosico
Componentes celulares proclives a los Componentes celulares proclives a los procesos mutagprocesos mutagéénicosnicos
Daño severo del ADN
Errores en la reparación del ADN
Arresto del ciclo celular
Si hay una lesión en el ADN …
Reparación del ADN
Proliferación normal
Proliferación anormal Apoptosis Necrosis
MicromutacionesMacromutaciones
Tipos y frecuencias de daño en el ADN
Tipo de daño en ADN(SSB) Ruptura de simple cadena
Metilación de la Guanina N7
Depurinación
Metilación de la Guanina O6
Oxidación del ADN
Depirimidación
Deaminación de la Citosina
(DSB) Rupturas de doble cadena
Tipo de daño en ADN(SSB) Ruptura de simple cadena
Metilación de la Guanina N7
Depurinación
Metilación de la Guanina O6
Oxidación del ADN
Depirimidación
Deaminación de la Citosina
(DSB) Rupturas de doble cadena
Eventos/día/célula120.000
84.000
24.000
3.120
2.880
1.320
360
9
Eventos/día/célula120.000
84.000
24.000
3.120
2.880
1.320
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9
% de daño total diario50,9
35,6
10,2
1,3
1,2
0,5
0,2
0,01
% de daño total diario50,9
35,6
10,2
1,3
1,2
0,5
0,2
0,01
AGENTE GENOTOXICOAGENTE GENOTOXICO
Rayos X ROS
Agentes alquilantes
Rayos X ROS
Agentes alquilantes
LESIONESLESIONES
Luz UV Hidrocarburos
policíclicosaromáticos
Luz UV Hidrocarburos
policíclicosaromáticos
RILuz UVAgentes
antitumorales
RILuz UVAgentes
antitumorales
Errores de replicación Errores de replicación
PROCESOS DE REPARACIONPROCESOS DE REPARACION
8-oxidGRupturas de
simple cadena
8-oxidGRupturas de
simple cadena
FotoproductosAductos
Dímeros de pirimídinas
FotoproductosAductos
Dímeros de pirimídinas
Enlaces cruzados
Rupturas de doble cadena
Enlaces cruzados
Rupturas de doble cadena
Reparación por escisión de
bases(BER)
Reparación por escisión de
bases(BER)
Reparación por escisión de nucleótidos
(NER)
Reparación por escisión de nucleótidos
(NER)
Recombinación Homóloga (HR)
Reunión de extremos no
homólogos (NHEJ)
Recombinación Homóloga (HR)
Reunión de extremos no
homólogos (NHEJ)
Reparación deMal
apareamiento (MMR)
Reparación deMal
apareamiento (MMR)
A-GT-C
Inserciones Deleciones
A-GT-C
Inserciones Deleciones
B
I
O
M
A
R
C
A
D
O
R
E
S
DE EXPOSICIÓN: Señala presencia de sustancia exógena o metabolitos, o producto de interacción entre agente y molécula blanco.
DE SUSCEPTIBILIDAD: Indicador de limitación adquirida o inherente de un organismo para responder a la exposición a un xenobiótico.
DE RESPUESTA BIOLOGICA: representa representa estadestadííosos del proceso de dadel proceso de dañño. Representan o. Representan alteraciones genalteraciones genééticasticas
DE ENFERMEDAD: manifestaciones preclínicas o tempranas de la enfermedad.
DE DAÑO BIOLOGICO EFECTIVO: Indica que el tóxico ha producido algún tipo de daño en el organismo.
INTERNO DE DOSIS : Indica que el tóxico ha entrado al orgsnimo..
DE EFECTO: Indicador de una alteraciIndicador de una alteracióón n bioqubioquíímica, fisiolmica, fisiolóógica o gengica o genéética, resultado de la tica, resultado de la exposiciexposicióón a un xenobin a un xenobióóticotico.
EVALUACION NIVELES DE COMPLEJIDAD
CRECIENTE
PRIMARIO (Bacteriano, Viral) (I)
SECUNDARIO (Cultivo de células) (II)
TERCIARIO (Organismo entero) (III)
CUATERNARIO (Epidemiológico) (IV)
Niveles de EvaluaciNiveles de Evaluacióónn
PRIMER NIVEL (I)PRIMER NIVEL (I) SEGUNDO NIVEL (II)SEGUNDO NIVEL (II)
CUARTO NIVEL (IV)CUARTO NIVEL (IV)TERCER NIVEL (III)TERCER NIVEL (III)
Nivel Molecular o bacterianoNivel Molecular o bacteriano
Ensayos en procariotes o Ensayos en procariotes o eucariotes inferioreseucariotes inferiores
Ejemplo: Test de Ames ; Ejemplo: Test de Ames ; Bacillus subtiliusBacillus subtilius
Nivel Nivel ““In vitroIn vitro””Ensayos en cultivos de cEnsayos en cultivos de céélulas lulas
eucariotaseucariotasEjemplo: LEjemplo: Lííneas celulares CHO, neas celulares CHO,
V79, Hela , Linfocitos de Sangre V79, Hela , Linfocitos de Sangre PerifPerifééricarica
Nivel Nivel ““In vivoIn vivo””
Ensayos organismo enteroEnsayos organismo entero
Ejemplos: Plantas, animales Ejemplos: Plantas, animales (invertebrados o vertebrados) y (invertebrados o vertebrados) y humanos expuestoshumanos expuestos
Nivel EpidemiolNivel Epidemiolóógicogico
Ensayos en poblaciones Ensayos en poblaciones expuestasexpuestas
Ejemplo: exposiciEjemplo: exposicióón n accidental, terapaccidental, terapééutica o laboral utica o laboral de individuos expuestosde individuos expuestos
Principales Ensayos Utilizados en Genética Toxicológica
• Mutaciones GénicasTest de AmesEnsayo de reversión a triptofano en E.coliMutaciones génicas en cultivo de células de mamífero (HPRT o TK)Mutaciones recesivas ligadas al sexo en Drosophila
• Evaluaciones citogenéticas en células de mamíferoEnsayo de aberraciones cromosómicasEnsayo de intercambio de cromátides hermanasEnsayo del micronúcleoEvaluación de Aneuploidías
• Otros ensayosDaño y reparación en células de mamíferoEstudios de recombinación mitótica en levaduras y/o Drosophila
Ensayo del locus específico en ratónEnsayo del letal dominanteAnálisis citogenético y Ensayo de traslocaciones heredablesEnsayo de alteraciones esqueléticas en ratón
ALCANCES
DISEDISEÑÑO DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE O DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y COMPUESTOS QUIMICOS EN GENERALCOMPUESTOS QUIMICOS EN GENERAL
METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA CARACTERIZACION DE DACARACTERIZACION DE DAÑÑO EN SINDROMES DE O EN SINDROMES DE
INESTABILIDAD CROMOSOMICAINESTABILIDAD CROMOSOMICA
MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN FORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICAFORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICA
Las agencias internacionales de regulación han seleccionado grupos de biomarcadores de efecto con el
objeto de lograr la mejor y más segura caracterización del daño,
evaluando tanto “in vitro” como “in vivo” la genotoxicidad potencial.
OPPTS: OFFICE OF PREVENTION, PESTICIDES AND TOXIC SUBSTANCES (EPA)
OECD: ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT (FDA)
Guidelines Guidelines
S2A: Aspectos específicos de regulación de Ensayos de genotoxicidad
S2B: Genotoxicidad: Una batería standard para el ensayo de genotoxicidad de productos farmacéuticos
Los Comité Internacionales de Armonización (ICH) sugieren la realización de baterías de ensayos constituidas por:
◊ un ensayo de reversión en bacterias◊ un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de
aberraciones cromosómicas) o un estudio in vitro para mutaciones génicas)
◊ un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas o test de micronúcleo en ratón)
Desarrollo de cepas de S.typhimurium auxótrofas para histidina que permiten evaluar la retromutación de este organismo a histidina (+ ).
Es decir que una especie que ha perdido una característica, vuelve a adquirirla en base a otra mutación.
TA100, TA98, TA1535, TA1537, TA102, TA104
rfa, ∆uvr B, plásmido pKM101, plásmido pAQ1
Test de Salmonella o Test de Ames
UN ESTUDIO CITOGENETICO PARAUN ESTUDIO CITOGENETICO PARADETECTAR DADETECTAR DAÑÑO CROMOSOMICOO CROMOSOMICO
(TEST DE ABERRACIONES (TEST DE ABERRACIONES CROMOSOMICAS )CROMOSOMICAS )
O O UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR
MUTACIONES GENICASMUTACIONES GENICAS(MOUSE LYMPHOMA ASSAY)(MOUSE LYMPHOMA ASSAY)
ABERRACIONES CROMOSÓMICAS
• Detecta alteraciones numérica y estructurales.
• Se basa en evidenciar cambios en la morfología de los cromosomas o en su número pudiendo detectar modificaciones de ploidía.
• Se utiliza para determinar el efecto clastogénico y/o aneunógeno de las drogas en estudio.
• Es el test más utilizado históricamente para evaluación de drogas.
Metafase Parcial de Linfocitos de Sangre Periférica con Aberraciones Cromosómicas
Metafase Parcial de línea celular CHO con Aberraciones Cromosómicas
IM =IM =NNººcelcel en en estadestadííosos de mitosis/de mitosis/NNºº total total celcel interfaseinterfase
Técnica de coloración diferencial de cromátideo FPG- fluorescencia plus giemsa
IR= Nº cél. M1+2 Nº cél. M2 + 3 Nº cél. M3/100
Se puede realizar en distintas líneas celulares
L5178Y linfoma de ratón (TK)TK6 línea linfoblastoide humana (HGPRT)
Ambos ensayos se basan en la adquisición de resistencia a un producto. Línea normal→no crece en presencia del producto.Línea mutada→ crece en presencia del producto.
Para TK se seleccionan por resistencia a Trifluorotimidina.Las células deficientes en HPRT son seleccionadas por resistencia a la 6-tioguanina u 8 azaguanina.
Ensayo de Mutaciones Génicas en Células de Mamífero
UN TEST IN VIVO PARA UN TEST IN VIVO PARA GENOTOXICIDAD QUE DETECTE GENOTOXICIDAD QUE DETECTE
DADAÑÑO CROMOSOMICOO CROMOSOMICO
(ABERRACIONES CROMOSOMICAS (ABERRACIONES CROMOSOMICAS O TEST DE MICRONUCLEO EN O TEST DE MICRONUCLEO EN
RATON)RATON)
Evento Genotóxico
MN MN
Mala segregación Daño al ADN
Defectos en:• Huso mitótico• Centrómero• Mala condensación cromosómica
• Roturas de ADN• Errores de reparación
GuidelinesGuidelines
S2 R1: Ensayos de genotoxicidad e Interpretación de datos para Productos farmacéuticos de uso Humano
◊ un ensayo de reversión en bacterias◊ un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de aberraciones cromosómicas o , o TEST DEL MICRONÚCLEO in vitro o ensayo de mutaciones génicas)◊un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón, TEST DEL COMETA)
◊ un ensayo de reversión en bacterias◊ un test in vivo para genotoxicidad UTILIZANDO DOS TEJIDOS , uno que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón) Y OTRO ENSAYO IN VIVO COMO TEST DEL COMETA, UDS, TRANSGENIC MOUSE MUTATION ASSAY)
Célula Binucleada con MN
BLOQUEODE LA
CITOCINESIS
AGENTES GENOTÓXICOS
CITOCALASINA B
Inhibe la polimerización
de actina
No se forma el anillo
contráctil
Ensayo de MNCB
MICRONÚCLEOS
CARACTERÍSTICAS
Redondo u oval
Borde liso y uniforme
Igual plano focal que núcleo
No ser refringente
1/16 y 1/3 del diámetro del núcleo
Igual coloración y textura que núcleo
No superpuesto ni conectado
Se analizan 1000 células BN
Expresión de resultados:• Nº MN/1000 células BN
• Frec. células BN con MN en 1000 BN
DETECTA
• Roturas de ADN simple cadena.
• Roturas de ADN doble cadena.
• Sitios Alcali lábiles.
• ADN-ADN y ADN-prot cross linking.
• Roturas simples asociadas con
mecanismos de reparación
incompletos
ANALISIS DE RESULTADOSCONTEO VISUAL
Se deben contar 50 cometas/vidrio. 2 vidrios/muestra. Total: 100 células por
muestra.
Estableciendo Categorias de Daño:1:< 20 micras2: 20-40 micras3: 40-80 micras4: > 80 micras
• ID= n1+2 n2+ 3 n3+4 n4, siendo n la cantidad de células dañadas que se
registraron para cada una de las cuatro categorías.
SINDROMES DE SINDROMES DE INESTABILIDAD INESTABILIDAD CROMOSOMICACROMOSOMICA
Inestabilidad cromosInestabilidad cromosóómica:mica:Rearreglos, comportamiento citogenéticoanormal. Causas:
• Mutaciones de proteínas involucradas en la replicación y reparación del ADN.
• Fallos en puntos de control del ciclo celular.• Anomalías centrosómicas.• Defectos en la segregación.• Mal funcionamiento de los telómeros.• Recombinación homóloga vinculada a la reparación de
roturas de ADN de doble hebra.
ClasificaciClasificacióónnSíndromes clásicos
• Anemia de Fanconi• Síndrome de Bloom• Ataxia Telangiectasia
Síndromes menos frecuentes• Nijmegen breakage• ICF• Cockayne• Xeroderma Pigmentosa
Otros• Riyadh • Rothmund-Thompson• Radial-renal• Craniostenosis-Microcefalia• Dubowitz
factores intrínsecos hereditariosCarcinogénesis Ambiental
exposición a agentes carcinogénicos
Defectos en la replicación o Incremento en el riesgo Reparación del ADN de cáncer
Dependiendo del síndrome, el comportamiento anormal tomará la forma de:
• Frecuencia elevada de aberraciones espontáneas• Niveles elevados de intercambio de cromátides hermanas• Hipersensibilidad cromosómica a Xenobióticos• Rearreglos cromosómicos estables o recurrentes
Predisposición a tumoresCaracterísticas en común Inmunodeficiencia
Retardo en el crecimiento
SINDROMES DE INESTABILIDAD SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICACROMOSOMICA
Es autosómica recesiva.Mayor frecuencia en judíos Askenaziy japoneses. Presentación: microcefalia, alteraciones de piel y deficiencia inmunológicas. Poseen inteligencia normal.Riesgo: desarrollan distintos tipos de cáncer y leucemias agudas.Pronóstico de vida: la edad promedio de vida son los 24 años (14 a 49).
Características citogenéticas::rupturas de cormosomas dando figuras de cuadriradiales e intercambio de cromátides hermanas.El diagnóstico citogenético se hace mediante ICH espontáneo, (90 o más) .El gen afectado es el BLM que se encuentra en 15q26.1
SINDROME DE BLOOMSINDROME DE BLOOM
Autosómica recesiva.Presentación.: retardo mental, malformaciones esqueléticas, anomalías en piel, anemia severa. Riesgo: desarrollan sindromesmielodisplásicos y LMAPronóstico de vida: La edad de sobrevida es hasta los 16 años y la causa de muerte es hemorragia y sepsis asociado a sindromes mielodisplásicos.Tipos: 7 grupos . Los genes involucrados se describen como FANC y se adicionan las letras que van desde A hasta G. Por ahora los de peor pronóstico son los del grupo G.
ANEMIA DE FANCONIANEMIA DE FANCONI
Características citogenéticas: alteraciones estructurales espontáneas que se ven incrementadas cuando se exponen los cultivos a agentes inductores de cross-linking. Para el diagnóstico se utiliza DEB.
Autosómica recesiva, Ataxia cerebelar y telangiectasiaocular, nariz y orejasNo reconocen mecanismos de reparación de DSBPresentación: segundo año de vida con ataxia cerebelar progresiva, disartria y distonía. Riesgo: de leucemia y linfomas y tumores de piel, ovario, mama y estómago.Pronóstico de vida: hasta la 4ªdécada con medicación permanante.
Características citogenéticas:Incremento de alteraciones tipo cromátide, roturas cromosómicas, triradiales y cuadriradialesGen ATM 11q22-q23.1Diagnóstico citogenético mediante exposición a rayos X o radiomiméticos (BLM)
ATAXIA TELANGIECTASIAATAXIA TELANGIECTASIA
BIOMONITOREO BIOMONITOREO DE INDIVIDUOS DE INDIVIDUOS
EXPUESTOSEXPUESTOS
MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOSCITOSTATICOS
EdadEdad Tiempo de Tiempo de trabajotrabajo
SexoSexo Manifestaciones clManifestaciones clíínicasnicas
AA 2828 2 a2 aññosos FF Lagrimeo/ Lagrimeo/ rinorrearinorrea y descamaciy descamacióón en pieln en piel
BB 3232 3 a3 aññosos MM Lagrimeo/ fotofobiaLagrimeo/ fotofobia
CC 3232 9 a9 aññosos MM IrritaciIrritacióón visual/sequedad n visual/sequedad nasal/nasal/oligoazoospermiaoligoazoospermia
DD 3333 2 a2 aññosos FF IrritaciIrritacióón visual/sequedad en pien visual/sequedad en pie
EE 5454 9 a9 aññosos FF Sin sSin sííntomas ntomas
FF 4646 25 a25 aññosos FF Sequedad conjuntivalSequedad conjuntival
GG 3636 2 a2 aññosos FF DescamaciDescamacióón/blefaritis/sequedad conjuntivaln/blefaritis/sequedad conjuntival
MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOSCITOSTATICOS
IMIM IRIR ICHICH MNMN
AA 2.52.5 1.61.6 7.37.3±± 0.480.48 3.923.92
BB 2.22.2 1.51.5 5.945.94±± 1.281.28 2.882.88
CC 2.32.3 1.481.48 7.467.46±± 0.650.65 12.6612.66
DD 3.63.6 1.651.65 6.96.9±± 0.980.98 11.9911.99
EE 3.23.2 1.611.61 6.186.18±± 0.640.64 15.2915.29
FF 2.52.5 1.451.45 7.937.93±± 1.131.13 32.5032.50
GG 2.72.7 1.381.38 8.428.42±± 020020 16.2016.20
CONTROL: IM:1.5 CONTROL: IM:1.5 --6.8 IR: 1.36.8 IR: 1.3--2.4 ICH : 22.4 ICH : 2--7.8 MN: 37.8 MN: 3--2323
ESTRATEGIASESTRATEGIAS•• 5 de los individuos presentan valores en el rango de 5 de los individuos presentan valores en el rango de
los controles histlos controles históóricos y de la literaturaricos y de la literatura
•• En tres casos alguno o varios de los biomarcadores En tres casos alguno o varios de los biomarcadores se encuentran modificados con respecto a los se encuentran modificados con respecto a los valores controlvalores control
•• Se sugiere la repeticiSe sugiere la repeticióón luego de pasado un mn luego de pasado un míínimo nimo de 6 meses para analizar comportamiento celular de 6 meses para analizar comportamiento celular con el mismo biomarcador alterado y/o la con el mismo biomarcador alterado y/o la introducciintroduccióón de una nueva metodologn de una nueva metodologíía que aporte a que aporte mayor sensibilidad.mayor sensibilidad.
LIMITACIONES
MOTIVO DE APLICACIMOTIVO DE APLICACIÓÓN DEL ESTUDION DEL ESTUDIO
ELECCION DEL/LOS BIOMARCADORESELECCION DEL/LOS BIOMARCADORESANAMNESISANAMNESIS
INTERPRETACION DEL RESULTADOINTERPRETACION DEL RESULTADOFACTORES CONFUNDENTESFACTORES CONFUNDENTES
Muchas Gracias por su atención !!!
CIGETOX
Prof. Dra. Marta Ana Carballo
Dra. Marcela López Nigro- Bioq. Victoria ArroyoLic. y Ms. Susana Bartolotta
Becarios Doctorado: Bioq. Catalina Cortada; Bioq. Fernanda Simoniello; Bioq. Natalia CasanovaBecarios Iniciación: Med. Gabriel Angeleri- Lic. Erika Portmann
Tesistas de Licenciatura: Estud. Silvana Curieses- Estud. Natalia Balarino