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Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica
Preparação de Ácidos NucleicosPreparação de Ácidos Nucleicos
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Preparação das células:pulverização pós congelação
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Preparação das células:homogeneização
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MagnaLyser
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Magna Lyser WorkFlow
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FastPrep
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Sonicação
Principio de funcionamento semelhante ao Principio de funcionamento semelhante ao MagnaLyserMagnaLyser
Fonte de agitação são ultrasonsFonte de agitação são ultrasons
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Preparação das células do sangue:Centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll)
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Preparação das células do sangue:Lise dos eritrócitos
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PREPARAÇÃO DE DNA E RNA
DNA e RNA :DNA e RNA : Lise suave e solubilização do DNA/RNALise suave e solubilização do DNA/RNA Destruição enzimática das proteínas (proteases)Destruição enzimática das proteínas (proteases) Destrição e precipitação química das proteínas Destrição e precipitação química das proteínas
(fenol/clorofómio/álcool isoamilico)(fenol/clorofómio/álcool isoamilico) Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de
amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio)amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio) Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia
remoção de sais)remoção de sais)
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Método do fenol/ clorofórmio
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Método do salting-out
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Libertação dos ácidos Nucleicos
Para alguns procedimentos os ácidos Para alguns procedimentos os ácidos nucleicos podem não ser purosnucleicos podem não ser puros Remover a hemoglobina com choque Remover a hemoglobina com choque
osmóticoosmótico Utilizar o pellet celular Utilizar o pellet celular
Libertar ácidos nucleicos com choque Libertar ácidos nucleicos com choque térmico (ex PCR)térmico (ex PCR)
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Adsorpção A Silica
Em 1979 Vogelstein & Em 1979 Vogelstein & Gillespie descobrem que o DNA adsorve a pó de vidro (silica) na presença de NaI
Posteriormente verificou-se que outros agentes caotrópicos como guadinida isotiocianato tem a mesma propriedade que o NaI
Diferentes espécies de Ácidos nucleicos adsorvem diferentemente em função da força iónica e pH
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Separação de ácidos nucleicos por cromatografia de troca iónica
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Eluição dos vários ácidos nucleicos em função do pH
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Colunas de sílica (ex. Qiagen)
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Formato de 96 poços
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Vacuo Versus Centrifugação
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Qiagen Biorobot 9604
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Sample + Lysis buffer GuSCN
Nucleic acid
Proteins and Lipids
Silica
Elution buffer
Centrifugation
Purified Nucleic acid
Wash
processing time10 samples/1.5h
Método de Boom
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Full BloodFull Blood Serum/plasmaSerum/plasma PBMC/PBLPBMC/PBL SputumSputum UrineUrine Brain tissueBrain tissue Spleen tissueSpleen tissue Liver tissueLiver tissue
FaecesFaeces Throat swabsThroat swabs Dermal lesions Dermal lesions
swabsswabs Cerebro spinal Cerebro spinal
fluidsfluids Cervical smearsCervical smears Pus samplesPus samples FoodmatricesFoodmatrices
Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), 495-503, 1990
“Boom” compatible Sample Types
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NuclisensExtractor
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Unidade Principal
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Baía dos reagentes
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Cartridge modules
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As cartridges
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MagnaPure (Roche)
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EZ1
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EZ1
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Magna Compact
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Outros sistemas automáticos