profesor patrocinante dr. rody san martin a
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Profesor Patrocinante Dr. Rody San Martin A. Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias
Profesor Co-Patrocinante Dr. Alejandro Yañez C. Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias PAPEL DE ADENOSINA SOBRE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE LA BARRERA
DE FILTRACIÓN GLOMERULAR: IMPLICANCIAS EN LA NEFROPATÍA
DIABÉTICA
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Titulo Profesional de Bioquímico
CARLOS RODRIGO TEJEDA BARRIENTOS
VALDIVIA-CHILE
2009
Muchas gracias a todos los que
hicieron posible el logro de esta
tesis, en especial a Dios.
Mis agradecimientos A Dios por darme la fortaleza para lograr mis objetivos en la vida y ayudarme en los
momentos difíciles.
Esta tesis esta dedicada a todas las personas que me apoyaron en este trabajo,
especialmente a mis padres Ida y Víctor, y a mi hermana Claudia por todos los
sacrificios y apoyo a lo largo de mi carrera.
Además, quiero agradecer a mi profesor guía, Dr. Rody San Martin por toda su
confianza y comprensión a lo largo de esta tesis, y por las enseñanzas aprendidas en
este periodo. También a los Doctores Alejandro Yáñez, Claudia Quezada e Ilona
Concha por la disponibilidad de sus laboratorios y materiales.
Al Instituto de Bioquímica de nuestra universidad, tanto a los funcionarios como
académicos, ya que siempre me brindaron su ayuda cuando fue necesario y al Instituto
de Histología por sus servicios en los momentos difíciles ocurridos en nuestra facultad.
A todos los compañeros del laboratorio de Patología Molecular, un grupo indispensable
que me ayudo a lograr este trabajo, en especial a Evelyn y Horacio.
A amigos incondicionales, que siempre me han ayudado a lo largo de la tesis, en
especial a Sebastián Alarcón y Marianela Navarro. Muchas gracias por haber estado
ahí en los buenos y malos momentos.
El financiamiento de esta tesis es gracias a los aportes otorgados por el Fondo de
Desarrollo Científico y Tecnológico (proyecto FONDECYT 1070614), Fundación Andes
(proyecto C-14060/50) y la Dirección de Investigación de la Universidad Austral de Chile
(proyecto DIUAChS2006/67).
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Pagina
1. RESUMEN 1
1.1 SUMMARY 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.1 Diabetes Mellitus y sus complicaciones 3
2.2 Nefropatía Diabética 10
2.3 Alteraciones en la barrera de filtración en la
nefropatía diabética 16
2.4 Adenosina y su papel en la nefropatía diabética 22
3. MATERIALES Y MÉTODOS 27
3.1 Materiales 27
3.1.1 Material biológico 27
3.1.2 Reactivos químicos 27
3.1.3 Instrumentos 29
3.1.4 Agonista y antagonistas de los receptores de
adenosina 30
3.2 Métodos 31
3.2.1 Inducción de diabetes en ratas normales 31
3.2.2 Perfusión renal 32
3.2.3 Aislamiento de glomérulos renales 33
3.2.4 Tratamiento con adenosina y moduladores
farmacológicos de los receptores de adenosina 33
3.2.5 Extracción de RNA total 36
3.2.6 Síntesis del cDNA 37
3.2.7 Amplificación de DNA mediante reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) 37
3.2.8 Cuantificación de cDNA mediante PCR cuantitativo
(qPCR) 40
3.2.9 Extracción y cuantificación de proteínas 41
3.2.10 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida 42
3.2.11 Electrotransferencia de proteínas a membranas de
nitrocelulosa 42
3.2.12 Detección inmunológica 43
3.2.13 Inmunohistoquímica 44
3.2.14 Estadística 46
4. RESULTADOS 47
4.1 Purificación de glomérulos desde riñones de rata 47
4.2 Inmunolocalización de las proteínas nefrina y podocina
en cortes de riñones de ratas normales y diabéticas 49
4.3 Efecto de moduladores farmacológicos de los receptores
de adenosina sobre la expresión de nefrina y podocina en
glomérulos renales 55
4.3.1 Cuantificación a través de qPCR del contenido de mRNA
para nefrina y podocina en glomérulos de ratas 55
4.3.2 Efecto de moduladores farmacológicos de los receptores
de adenosina sobre la expresión de nefrina y podocina 64
5. DISCUSIÓN 77
6. BIBLIOGRAFÍA 88
ÍNDICE DE FIGURAS
Pagina
Figura 1: Micrografia electrónica de alta resolución
de la barrera de filtración glomerular 8
Figura 2: Historia natural de la nefropatía diabética 12
Figura 3: Estructura e interacciones de la Nefrina 18
Figura 4: Purificación de glomérulos renales de ratas 48
Figura 5: Localización y expresión de podocina en
glomérulos renales 51
Figura 6: Localización y expresión de nefrina en
glomérulos renales 53
Figura 7: Efecto de los moduladores farmacológicos
de los receptores de adenosina sobre el
contenido de transcritos de podocina en
glomérulos de ratas normales 57
Figura 8: Efecto de los moduladores farmacológicos
de los receptores de adenosina sobre el
contenido de transcritos de podocina en
glomérulos de ratas diabéticas 58
Figura 9: Correlación entre los valores del efecto de
los moduladores farmacológicos de los receptores
de adenosina sobre los transcritos de podocina en
glomérulos de ratas normales y diabéticas 59
Figura 10: Efecto de los moduladores farmacológicos
de los receptores de adenosina sobre el
contenido de transcritos de nefrina en
glomérulos de ratas normales 61
Figura 11: Efecto de los moduladores farmacológicos
de los receptores de adenosina sobre el
contenido de transcritos de nefrina en
glomérulos de ratas diabéticas 62
Figura 12: Correlación entre los valores del efecto de
los moduladores farmacológicos de los receptores
de adenosina sobre los transcritos de nefrina en
glomérulos de ratas normales y diabéticas 63
Figura 13: Efecto de los moduladores farmacológicos de
los receptores de adenosina sobre la expresión
de podocina en glomérulos de ratas normales 66
Figura 14: Efecto de los moduladores farmacológicos de
los receptores de adenosina sobre la expresión
de podocina en glomérulos de ratas diabéticas 68
Figura 15: Correlación entre los valores del efecto de
los moduladores farmacológicos de los receptores
de adenosina sobre la expresión de podocina en
glomérulos de ratas normales y diabéticas 70
Figura 16: Efecto de los moduladores farmacológicos de
los receptores de adenosina sobre la expresión
de nefrina en glomérulos de ratas normales 72
Figura 17: Efecto de los moduladores farmacológicos de
los receptores de adenosina sobre la expresión
de nefrina en glomérulos de ratas diabéticas 74
Figura 18: Correlación entre los valores del efecto de
los moduladores farmacológicos de los receptores
de adenosina sobre la expresión de nefrina en
glomérulos de ratas normales y diabéticas 76
ÍNDICE DE TABLAS
Pagina
Tabla I: Constantes de afinidad de los moduladores
farmacológicos de los receptores de adenosina 35
Tabla II: Partidores y productos de PCR predichos
para la amplificación de los transcritos de los
genes estudiados 39
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA : albúmina sérica de bovino
DAB : 3,3´-diaminobenzidina
DM : diabetes Mellitus
ESRD : enfermedad renal de término
ND : nefropatía diabética
dNTP : desoxinucléotidos 5’-trifosfato
HEPES : [N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-ácido etansulfónico)]
MBG : membrana basal glomerular
PBS : tampón fosfato salino
PCR : reacción en cadena de la polimerasa
qPCR : cuantificacion de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa
PMSF : fenilmetilsulfonil fluoruro
RT-PCR : reacción de la polimerasa en cadena desde RNA total
SDS : dodecilsulfato de sodio
SDS-PAGE : Electroforésis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturantes
STZ : estreptozotocina
TAE : tampón acetato EDTA
TEMED : N,N,N´,N´-tetrametilendiamina
Tris : tris-(hidroximetil)-aminometano
Triton X-100: octil fenoxi polietoxietanol
1. RESUMEN
La nefropatía diabética (ND) es una de las complicaciones de la diabetes, la cual se
caracteriza por un notable deterioro de la calidad de vida de los pacientes, así como
también un alto costo económico y social. Una de las características presente en el
desarrollo de esta enfermedad renal es la podocitopatía, la cual involucra la pérdida de
proteínas de los podocitos que estructuran la barrera de filtración glomerular. Entre
éstas proteínas las mejor caracterizadas son la nefrina y podocina. Previamente, en
nuestro laboratorio se ha determinado que existe un incremento en la biodisponibilidad
extracelular de adenosina en los glomérulos de ratas diabéticas, con lo cual hemos
correlacionado la actividad de los receptores de adenosina con la patogénesis de la
nefropatía diabética. En este estudio se determinó el efecto de moduladores
farmacológicos de los receptores de adenosina sobre el contenido de mRNAs y
proteína de nefrina y podocina. Mediante inmunohistoquímica se observó una
disminución de podocina en los glomérulos de ratas diabéticas después de 21 días de
inducción de la diabetes, lo cual podría preceder a la pérdida de la función normal de la
barrera de filtración glomerular. El análisis farmacológico en glomérulos tratados ex vivo
indica que la actividad del receptor de adenosina A1 resultó en una disminución del
mRNA y de la proteína podocina.
Nosotros concluimos que el aumento de la biodisponibilidad de adenosina en los
glomérulos renales podría favorecer la actividad de los receptores de adenosina A1, con
lo cual se obtendría una disminución de la expresión de podocina y la progresiva
pérdida de la función de la barrera de filtración.
1
2. SUMMARY
The diabetic nephropathy (ND) is one of the complications of diabetes, which is
characterized by a remarkable deterioration of life quality for patients, being also a high
economic burden. One of the characteristics present in the development of this renal
illness is the podocytopathy, which involves the loss of proteins of the podocytes cells
that structured the glomerular filtration barrier. Among these proteins the better
characterized are nephrin and podocin. Previously, in our laboratory it has been
determined that occurs an increase in the extracellular bioavailability of adenosine in the
glomerulus of diabetic rats, which correlated the activity of the adenosine receptors with
the pathogenesis of the diabetic nephropathy. In this study we determined the effects of
pharmacological modulators of the adenosine receptors on the content of mRNAs and
protein nephrin and podocin. By means of inmunohistochemistry we detected a
decrease of podocin in the glomerulus of diabetic rats following 21 days of diabetes,
which might precede the loss of the normal function of the glomerular filtration barrier.
The pharmacological analysis in ex vivo glomeruli indicates that the activity of the
adenosine A1 receptor resulted in a decrease of the mRNA and protein podocin.
We conclude that the increase of the adenosine bioavailability in the diabetic glomerulus
might favor the activity of the adenosine receptors A1, leading to a decrease of the
expression of podocin and progressive loss of the function of the filtration barrier.
2
2. INTRODUCCION
2.1 La diabetes mellitus y sus complicaciones.
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica, de gran impacto a nivel
mundial y para la cual aún no existe cura. Es una enfermedad metabólica caracterizada
por una hiperglicemia causada por fallas en la secreción de insulina, acción de ésta o
ambas por lo cual ha sido clasificada en diversas formas o tipos (A.D.A 2006). Diabetes
se ha transformado en las últimas décadas en un grave problema de salud pública a
nivel mundial (Zimmet 2000). Aunque la prevalencia de diabetes tipo 1 y 2 está
aumentando, se espera que la segunda aumente con mayor rapidez en el futuro por la
creciente obesidad y los menores niveles de actividad física en la población (Alvin.
2002).
Hay dos principales formas de diabetes (World Health Organization 1999).
Diabetes tipo 1 se debe principalmente a una destrucción autoinmune de las células β
pancreáticas, resultando en una absoluta deficiencia de insulina. Este proceso podría
comenzar por una susceptibilidad genética y algunos acontecimientos ambientales que
inician el proceso destructivo de estas células pancreáticas (Foster 1998). La
frecuencia de diabetes tipo 1 es baja relativo a diabetes tipo 2, la cual está por sobre
90% de casos globalmente. Diabetes tipo 2 es caracterizada por resistencia periférica a
insulina y puede o no ser acompañada de secreción anormal de insulina. Esta suele
iniciarse en forma progresiva, después de los 40 años (aunque en obesos puede
desarrollarse anticipadamente), no tiende a la cetoacidosis, frecuentemente cursa con
obesidad y presenta una pronunciada agregación familiar (Figuerola 2003). En este
3
caso, el páncreas secreta cantidades muy variables de insulina, de forma que su
concentración plasmática puede ser normal e incluso superior a la normal, pero
relativamente inefectiva para mantener niveles normales de glicemia (Freijanes et
al.1997). Otros tipos de diabetes incluyen diabetes gestacional que se presenta durante
el embarazo y se define como cualquier grado de intolerancia a la glucosa que se
identifique durante el embarazo (A.D.A 2006). Además, existen diabetes que pueden
ser causadas por defectos genéticos en la función de las células β, enfermedades del
páncreas exocrino, endocrinopatías, diabetes inducida por consumo de drogas o
químicos, por infecciones u otros síndromes genéticos (A.D.A 2006).
El tratamiento que lleva el diabético para lograr a cabo el control metabólico lleva
muchas dificultades. Además de la ingesta de medicamentos, se requieren otras
medidas de control, primordialmente el ajuste de la alimentación, el control del peso en
caso de obesidad, una actividad física adecuada y vigilancia (Gonzalez et al.1994).
Personas con diabetes tipo 1 son dependientes de insulina exógena para sobrevivir y
evitar el desarrollo de cetoacidosis, en cambio personas con diabetes tipo 2 no son
dependientes de insulina exógena, pero podrían requerir si los niveles de glucosa
sanguínea no son logrados con una dieta o con agentes hipoglicemicos orales. La
insulina es la hormona reguladora más importante del metabolismo orgánico,
principalmente a nivel de carbohidratos, lípidos y proteínas (Kahn et al. 2000; Vander et
al.2001). Esta hormona está constituida por una proteína de alto peso molecular,
formada por dos cadenas de aminoácidos unidas por un puente bisulfuro (Steiner y
Middleton. 1991). La insulina es secretada al torrente sanguíneo por las células β de los
islotes de Langerhans, en el páncreas endocrino, y posee una vida media en el plasma
4
entre 4 a 6 minutos de tal modo que la mayor parte desaparece de la circulación entre
10 a 15 minutos (Guyton & Hall, 2002). Alrededor del 50% del excedente de insulina se
degrada a nivel hepático mediante la acción de la enzima insulinasa, y la cantidad
restante, principalmente en los riñones y músculos, entre otros (Sato et al.1991). Dentro
de las funciones de la insulina destacan principalmente: favorecer el transporte de
glucosa y aminoácidos a través de la membrana celular permitiendo el ingreso de
glucosa a la mayoría de las células, con excepción de los glóbulos rojos, cerebro
(excepto parte del hipotálamo), hígado, riñón, mucosa intestinal y células β del
páncreas (Chastain & Ganjman. 1990; Vander et al.2001; Guyton &Hall, 2002), también
regula la formación de glucógeno en el hígado y músculo esquelético, la conversión de
glucosa en triglicéridos, síntesis de ácidos nucleicos y proteínas y división y
diferenciación celular.
El diagnóstico de diabetes se basa en la detección de valores elevados en la
prueba de glucosa sanguínea en ayunas (FPG >126 mg/dl) o en el test de tolerancia a
glucosa administrada en forma oral (OGTT; >200 mg/dl a 2 horas post carga) al menos
en dos ocasiones independientes (Kuzuya 2000). La falla del organismo para aclarar la
glucosa en la dieta es una indicación de que el metabolismo de glucosa está alterado y
sugiere que se debe a una secreción de insulina deficiente desde el páncreas o una
incapacidad de las células a responder adecuadamente a la insulina que está presente
(Bonora 2008). El monitoreo de los pacientes diabéticos consiste en las
determinaciones de glucosa sanguínea medidas por si mismos (SMBG) para determinar
FPG y aclaramiento de glucosa postprandial, y pruebas de laboratorio para medir
niveles de glicación de hemoglobina A (niveles HbA1c) el cual da referencia de los
5
niveles de glucosa sanguínea en los últimos 120 días (Bennet et al.2007). HbA1c ha
sido considerado históricamente, como el método más eficaz en el monitoreo del control
glicemico a largo plazo (Trevino et al.2007). En general cada porcentaje de punto de
caída en HbA1c reduce el riesgo de complicaciones microvasculares por 40% (LeRoith
et al.2007).
La prevención de complicaciones es un objetivo clave debido a la gran morbilidad
prematura y mortalidad asociada con la diabetes (Zimmet 2000; Songer 1992). Las
complicaciones crónicas de la diabetes mellitus se asocian a disfunción micro y
macrovascular, afectando a distintos órganos y partes del organismo (Brownlee 2005).
Cada año, 7 millones de personas son nuevamente diagnosticadas con diabetes
mellitus y más de 3.8 millones de muertes son atribuidas a complicaciones asociadas
con la enfermedad (International Diabetes Federation 2006). Sus complicaciones
crónicas constituyen una de las principales causas de invalidez y mortalidad prematura
en la mayoría de los países desarrollados, además de afectar a la calidad de vida de las
personas, impone un importante costo económico para los enfermos, familiares y para
la sociedad en conjunto. Dos tercios de personas con diabetes mueren de
enfermedades coronarias o infartos. Diabetes predispone a los pacientes a padecer
disfunción ventricular y el desarrollo de enfermedades arteriales coronarias
concomitantes, disfunción endotelial, hipertensión, hipertrofia ventricular, enfermedad
coronaria microvascular, neuropatías autonómicas y anormalidades metabólicas
(Sowers et al. 2001; Boudina et al. 2007). Sin embargo, diabetes también contribuye
significativamente a ceguera (retinopatía diabética), falla renal (nefropatía diabética),
daño neural (neuropatía diabética) y amputación de las extremidades (Dalla et al.2006;
6
Girach et al.2006). En la década pasada, muchos estudios se han concentrado sobre el
control estricto de glicemia para evitar y/o reducir el riesgo tanto de complicaciones
microvasculares específicas y como de complicaciones macro vasculares menos
específicas (Zimmet 1999).
La diabetes crónica produce daño renal siendo la nefropatía diabética (ND) una
de las enfermedades renales más devastadoras (Bloomgarden 2005). ND es la
complicación microangiopática más frecuente de la diabetes mellitus, presentándose en
el 20-40% de los pacientes luego de 10 años de evolución natural de la enfermedad. A
pesar de los tratamientos actuales, el 20% de los DM2 y el 50% de los DM1 con ND
desarrollan insuficiencia renal. Sin embargo, no todos los diabéticos desarrollan ND, y
sólo un porcentaje de los nefrópatas evolucionan a insuficiencia renal terminal (Rossing
2006; A.D.A. 2004).
Una de las principales funciones del riñón es la selectiva permeabilidad a
proteínas del suero, ocurriendo en una estructura de filtración especializada llamada
barrera de filtración glomerular. La barrera de filtración glomerular consiste de tres
capas en la pared capilar glomerular; que son, una sola capa de células endoteliales
altamente fenestradas, la membrana basal glomerular (MBG), y la capa final de células
epiteliales visceral glomerular conocidas como podocitos (Khoshnoodi et al.2001;
Tryggvason et al.2001). (Fig. 1).
7
Figura 1: Micrografía electrónica de alta resolución de la barrera de filtración
glomerular. Se puede observar la ubicación de las tres fases de la filtración: el
endotelio con fenestraciones (F), membrana basal glomerular (MBG) y epitelio visceral,
formado por los podocitos (P) que dejan ver el diafragma (D) entre los pedicelos.
(Modificado de Brenner 1986).
8
Los componentes del plasma pasan libremente por el endotelio fenestrado el cual está
cargado negativamente por la presencia de una sialoproteína polianiónica, la
podocalixina (Laulajainen et al. 1993). Posteriormente alcanzan la membrana basal
glomerular sin resistencia, pero en esta capa el pasaje de albúmina y otras proteínas
plasmáticas de alto peso molecular es restringido, por lo cual MBG sirve como una
barrera selectiva de carga y tamaño para macromoléculas (Damico et al. 2003). Los
principales componentes de MBG son colágeno tipo IV, laminina y proteoglicanos ricos
en heparán sulfato, estos últimos son responsables de la carga negativa alta de la MBG
(Tryggvason 1999; Raats et al. 2000).
Podocitos son células altamente especializadas y diferenciadas terminalmente
con procesos principales y procesos pedicelares interdigitados formando ranuras del
diafragma ultrafinas (Khoshnoodi et al.2001; Tryggvason et al.2001). Sus procesos
pedicelares interdigitados cubren el exterior de la MBG y por lo tanto estabilizan la
arquitectura glomerular (Pravenstadt 2000).
La superficie del podocito podría ser dividida en tres dominios con diferentes
localizaciones, componentes proteicos y funciones (Nagata et al. 2002). En cada
dominio existen proteínas, que son fundamentales para el mantenimiento y la integridad
del mismo, más aún, para la estabilidad global de la arquitectura del podocito
(Kerjaschki 2001).
Estos dominios son:
Dominio apical: contiene las proteínas podocalixina, ezrina, complejo NHERF-2
(cubren la superficie del podocito).
Dominio del diafragma de filtración: la principal proteína responsable de la propiedad
9
de selectividad del diafragma es la nefrina. A este nivel también encontramos a P-
cadherina, neph-1, podocina, CD2AP, ZO-1, filtrina, etc.
Dominio basal o de anclaje: es el encargado de fijar al pedicelo a la membrana basal
glomerular. Encontramos el complejo distroglicano, el complejo integrina α3β1 y la
megalina (Reiser et al.2000; Kerjaschki 2001).
2.2 La nefropatía diabética. La nefropatía diabética (ND) es la principal causa de insuficiencia renal crónica
en nuestro país y en Estados Unidos. Las alteraciones de las células mesangiales han
sido las principales referentes en la patogenia de la nefropatía diabética, pues en la
etapa preclínica predomina la nefromegalia a expensas de un aumento del volumen
glomerular y tubular (Cusumano 2005). Las alteraciones de los podocitos y la pérdida
de los procesos pedicelares fueron consideradas durante muchos años elementos
secundarios a la proteinuria. Sin embargo, la génesis de la proteinuria en ND no ha sido
suficientemente explicada por la expansión de la matriz mesangial, más bien, debe ser
atribuida a las alteraciones de la barrera de filtración glomerular. (Wolf el al.2005).
La principal característica clínica en ND es proteinuria, el cual es un marcador
de varias enfermedades y es usado clínicamente para el uso de nuevas terapias.
Además es un factor de riesgo independiente para enfermedades cardiovasculares.
(Gerstein et al 2001; Watchtell et al 2003). Proteinuria es considerado jugar un rol
central en la patogénesis de disfunción renal progresiva. Los mecanismos pueden
incluir el aumento de la captación de proteínas en la célula epitelial, seguido de la
10
activación del complemento, inflamación túbulo intersticial e incremento en la filtración
de hemoproteinas, factores de crecimiento y citoquinas inflamatorias (Abatte et al.2006).
La historia natural del desarrollo de la enfermedad renal ha sido mejor definida en
diabetes tipo I que tipo II. La clasificación para la enfermedad renal asociada a la
diabetes más utilizada es la que la divide en cinco etapas (Breyer 1992; Mogensen
1995) (Fig.2).
Etapa I: En la que se demuestra aumento de la excreción de albúmina basal
postejercicio y con un tratamiento optimizado de la diabetes se puede revertir.
Etapa II: Aparecen lesiones histopatológicas mínimas, persiste el aumento del filtrado
glomerular y la micro-albuminuria aparece en forma intermitente. En esta etapa no se
conoce si se pueden revertir estas alteraciones.
Etapa III: (Nefropatía incipiente) se acentúan las lesiones y alteraciones funcionales y
se puede demostrar aumento incipiente de la presión arterial. Hay micro-albuminuria
persistente.
Etapa IV: Corresponde a la nefropatía clínica con el síndrome clínico completo:
macroproteinuria, a veces síndrome nefrótico, hipertensión arterial, retinopatía diabética
y grados variables de insuficiencia renal. Esta etapa es conocida como “nefropatía
manifiesta”
Etapa V: Corresponde a la nefropatía diabética en etapa de insuficiencia renal
avanzada con el cuadro clínico del síndrome urémico, es la etapa conocida como
“enfermedad renal de término”.
11
Fig.2: Historia natural de la nefropatía diabética. (Modificado de Breyer 1992). Se
puede observar el camino progresivo desde las alteraciones estructurales que implican
cambios funcionales hasta la insuficiencia renal terminal, atravesando estadios
intermedios marcados por la aparición de la microalbuminuria y proteinuria.
12
Actualmente no se dispone de un marcador genético o bioquímico para detectar
en forma precoz la predisposición a desarrollar nefropatías y, menos aún, determinar su
evolución posterior. La presencia de microalbuminuria persistente (marcador
bioquímico) es el único parámetro bioquímico disponible en este momento para detectar
la etapa de ND incipiente, sin embargo, en esta etapa el daño renal ya se ha iniciado.
Además, la medición de microalbuminuria no siempre permite predecir la evolución a
insuficiencia renal terminal, ya que no todos los pacientes diabéticos
microalbuminúricos evolucionan a una nefropatía clínica.
Se ha demostrado que la administración de diferentes sustancias químicas en
animales provoca situaciones experimentales similares a la diabetes. En nuestro
laboratorio hemos implementado la inducción de diabetes en ratas mediante la
administración intravenosa de la droga estreptozotocina (STZ) que parece ser el
método más específico y es el más comúnmente utilizado. Esta sustancia actúa
destruyendo las células β-pancreáticas por lo que provocaría diabetes similar a la tipo 1
humana y teóricamente sería esperable una falta total de secreción de insulina y la
necesidad de administrar dicha hormona a estos animales para lograr su supervivencia.
Sin embargo, aunque los niveles de insulina en estos animales son muy bajos, no hay
una ausencia total de la misma y pueden sobrevivir durante meses sin un tratamiento
con insulina (Bell & Hye, 1983).
Los animales tratados con STZ presentan la mayoría de las complicaciones
asociadas a la diabetes como son las cardiomiopatías, las neuropatías, las disfunciones
arteriales coronarias, las alteraciones hepáticas, traqueales, del tejido conectivo,
gastrointestinales, etc. (Öztürk et al. 1996).
13
La progresión de la enfermedad renal en ratas esta muy bien definida. Después
de 48 hrs de administración de STZ, las ratas muestran niveles de glucosa en sangre
>250 MG/dl. Después de aproximadamente 15 días, la eliminación de albúmina en la
orina empieza a aumentar gradualmente (Cadaval et al. 2000). Las alteraciones de la
estructura glomerular comienzan con el ensanchamiento del poro de filtración y pérdida
de carga negativa en la membrana basal, así es como la hipertrofia glomerular empieza
a ser evidente (Ziyadeh & Sharma 1995; Isogai et al. 1999). Después de 4 a 6 semanas,
los cambios estructurales y funcionales son extensos en el glomérulo, incluyendo la
fibrosis intersticial, expansión del mesangio, albuminuria, engrosamiento de la
membrana basal y la creatinina está aumentada en el suero (Awad et al.2006). Después
de tres meses, hay una marcada proteinuria y glomerulosclerosis (Benigni et al. 2003).
En el origen de ND intervienen factores genéticos, metabólicos y hemodinámicos
(Mogensen et al.1988). Hallazgos desde varios estudios sostienen una asociación entre
el incremento de la secreción de moléculas, tal como citoquinas, factores de crecimiento
y metaloproteinasas en el desarrollo de nefropatía diabética (Raptis et al.2001; Ichinose
et al.2007). Vías metabólicas envueltas, siguen a la glicosilacion no enzimática y al
incremento en la actividad de la proteína quinasa C (PKC). Además, contribuyen los
efectos de factores metabólicos tales como la vía aldosa reductasa/polioles (Dunlop et
al.2000; Zhao et al. 2004) y productos de avanzada glicosilación (AGE) (Forbes et al.
2003; Wendt et al. 2003; Bohlender et al. 2005). Hiperglicemia e incremento del estrés
oxidativo, disminución en la tasa de filtración glomerular parecen ser importantes
contribuyentes en la acumulación de productos de avanzada glicosilacion (AGEs).
Además, nefropatía diabética con función renal disminuida es asociada con incremento
14
en la acumulación de AGEs (Thomas et al.2005).
Entre los factores hemodinámicos que influyen está la activación de los sistemas
renina-angiotensina-aldosterona y endotelina. En respuesta, la secreción de citoquinas
profibróticas, tal como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1), es
incrementado y adicionalmente ocurren cambios hemodinámicos, tal como incremento
en la presión intraglomerular y sistémica. Previos estudios han sugerido que el sistema
renina–angiotensina (RAS) es el principal mediador de insuficiencia renal progresiva en
nefropatía diabética (Chan et al.2000). Se ha demostrado que la administración de
inhibidores de la enzima convertidora a angiotensina y bloqueadores del receptor de
angiotensina II, retardan la progresión de nefropatía diabética (Brenner et al.2001) y el
desarrollo de proteinuria (Parving et al.2001).
Otros mecanismos hemodinámicos que inducen nefropatía diabética son factores
de crecimiento tales como el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF)
(Schrijvers et al. 2004), la hormona de crecimiento (GH)/factores de crecimiento tipo
insulina (IGFs) (Flyvbjerg et al. 2004) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF) (Abboud 1995; Uehara et al. 2004). Finalmente, también se ha sugerido que la
producción de factores pro inflamatorios y adhesión de monocitos/macrófagos a las
células endoteliales contribuyen a la patogénesis de ND. La respuesta inmune lleva a la
fibrosis y deposición de matriz extracelular y a la insuficiencia renal (Furuta et al.1993;
Mezzano et al. 2004).
15
2.3 Alteraciones en la barrera de filtración en la nefropatía diabética. En los recientes años, alteraciones en las proteínas de los podocitos, tal como
nefrina, podocina y α-actina-4, han sido identificadas en tres tipos de síndrome nefrótico
congénito/hereditario (Kestila et al.1998; Boute et al. 2000; Kaplan et al.2000). Además,
nefrina y podocina forman parte del complejo de adhesión (“slit diaphragm”) junto a un
creciente número de otras proteínas que han sido recientemente identificadas, tales
como CD2AP, ZO-1, FAT1, entre otras (Shankland, 2006). En conjunto tienen un papel
fundamental en la funcionalidad de la barrera de filtración del riñón (Routsalainen et
al.1996). Esta barrera es crucial para mantener el balance de agua y electrolitos sin
perder las proteínas circulantes a través de la orina (Fig. 3A y B).
La nefrina es una proteína identificada recientemente (1998), cuyo gen está
mutado en el síndrome nefrótico congénito del tipo finlandés, que se manifiesta por
pérdida de los procesos pedicelares y proteinuria (Kestila et al.1998), Además, fue la
primera molécula localizada en la ranura del diafragma (Routsalainen et al.1999;
Holzman et al.1999). Recientemente, en diversos modelos experimentales también se
ha evidenciado la existencia de una alterada expresión de nefrina, tal como en ratas con
diabetes inducida por estreptozotocina y ratones diabéticos no obesos (Kim. 2005;
Forbes et al.2002).
Estudios hechos en riñones de fetos humanos han mostrado que durante la
glomerulogénesis, la maduración final de la ranura del diafragma no ocurre en ausencia
de nefrina (Routsalainen et al.2000), ratones que carecen de nefrina nacen sin una
ranura del diafragma típica y exhiben anormalidades del podocito y proteinuria severa
(Putaala et al.2001).
16
En ratas se ha observado que inyecciones de anticuerpos contra nefrina inducen
una alta proteinuria en pocas horas (Orikasa et al.1988). Además, en estos animales se
ha mostrado una disminución en la expresión de nefrina en enfermedades como:
nefrosis por puromicina, nefritis pasiva de Heymann’s, y diabetes inducida por
estreptozotocina (Luimula et al.2000; Kelly et al.2002). También, la reducción de la
proteína nefrina y su RNA mensajero ha sido detectada en pacientes con diabetes y
proteinuria (Langham et al.2002).
17
Figura 3. Estructura e interacciones de la nefrina.
A. Estructura de la proteína nefrina: Proteína estructural de la membrana de filtración
glomerular de 1241 aminoácidos. Posee un extremo intracelular (C Terminal), un
dominio íntermembrana y una región extracelular (N Terminal).
B. Interacciones que presenta la nefrina: Se muestran las interacciones con distintas
proteínas intracelulares y con proteínas extracelulares.
(Modificado de Routsalainen.1996)
18
Nefrina ha sido propuesta además, como un marcador temprano de daño al podocito
(Patari et al.2003). Los pacientes DM1 con nefropatía pueden presentar nefrina en la
orina, comprobándose una relación entre la presencia de nefrinuria y daño renal,
independiente del grado de severidad (Toyoda et al.2004). Reportes recientes indican
que la nefrinuria o alteraciones en el metabolismo de la nefrina es un buen indicador de
enfermedades renales genéticas y adquiridas (Lenkkeri et al.1999; Koop et al.2003). Se
ha observado una redistribución de la nefrina en riñón, asociado a proteinuria,
independiente del origen de la enfermedad (Doublier et al.2001).
La nefrina es una proteína de adhesión celular que participa en la formación del filtrado
glomerular vía interacciones homofílicas envolviendo su dominio extracelular y
pertenece a la familia de las inmunoglobulinas (Kestila et al.1998; Routsalainen et
al.1999). El gen que la codifica (NPHS1) se encuentra en el cromosoma 19,
específicamente en la región 19q13.1. La nefrina posee un dominio de transmembrana,
en su porción extracelular posee 8 módulos semejantes a inmunoglobulinas y 1 módulo
semejante a fibronectina III. El gen de nefrina se expresa en riñón, páncreas, cerebro y
médula ósea (Kestila et al.1998; Petterson-Fernholm et al.2003).
La nefrina consta de 1241 aminoácidos y posee una masa molecular de 132.52
KDa, sin embargo, debido a la glicosilacion post-traduccional, migra como una proteína
de 180 KDa al ser analizada por (SDS-PAGE) (Yan et al.2002).
Nefrina también participa en la transducción de señales intracelulares,
importantes para la funcionalidad y supervivencia del podocito (Huber et al.2003). Se ha
demostrado que la cola citoplasmática de nefrina contiene una tirosina fosforilada y
recluta intermediarios de señalización que se unen a los residuos de tirosina
19
fosforilados (Huber et al.2001; Huber et al.2003). Además, se ha mostrado que las
tirosina kinasas de la familia-Src: Fyn, Src y Yes son expresadas en podocitos (Verma
et al.2003) y son conocidas por fosforilar el extremo C-terminal de nefrina, el cual está
compuesto de 3 sitios de fosforilación para tirosina: Tyr1176, Tyr1193, and Tyr1217 (Li
et al.2004), las últimas dos conservadas en nefrina de ratón y rata. Estudios recientes
han revelado que la fosforilación de nefrina es envuelta directamente en la homeostasis
del Calcio vía el reclutamiento y activación de la fosfolipasa C-γ1 (Harita et al.2009).
Además, se ha propuesto que nefrina interactúa directamente con podocina y
CD2AP, a través de su dominio intracelular C-terminal, y que junto a estas proteínas
puede ser aislada como componente asociado a balsas lipídicas (Saleem et al.2002;
Schwarz et al.2001), y que podocina y nefrina cooperativamente envían transducción de
señales al compartimiento intracelular (Huber et al.2001), y están asociadas al
citoesqueleto de actina junto a CD2AP en el podocito (Saleem et al.2002). Nefrina ha
sido mostrada de ser capaz de regular el citoesqueleto de actina a través de proteínas
adaptadoras Nck (Jones et al.2006; Verma et al.2006).
Se ha mostrado que podocina es una proteína asociada a balsas lipídicas en la ranura
de filtración, este dato sugiere que podocina puede ser requerida para la organización
estructural de la ranura del diafragma y la regulación de su función de filtración
(Schwarz et al.2001). Podocina es estructuralmente relacionada a proteínas de la
familia de estomatina (Boute et al.2000), las cuales son proteínas de transmembrana,
implicadas en el andamiaje del citoesqueleto (Salzer et al.2001). Podocina es una
proteína integral de membrana de 383 aminoácidos, con un solo dominio de membrana
formando una estructura como horquilla y con ambos dominios C- y N-terminal en el
20
citosol (Huber et al.2001; Schwarz et al.2001), y interactúa con el dominio intracelular de
NEPH1, NEPH2 y filtrina (Sellin et al.2003), sugiriendo que es un enlazador compartido
para algunas de las moléculas esenciales de la ranura del diafragma.
Se ha demostrado un involucramiento de podocina en la patogénesis del
síndrome nefrótico (Shih et al.2001; Roselli et al.2004). Homólogos de ratón y ratas de
podocina fueron clonados. La identidad entre ratón y humano, rata y humano, ratón y
rata son 86%, 84.3% y 92.7%, respectivamente (Kawachi et al.2003). Mutación de
podocina en ratones muestra aumento de proteinuria, pérdida de los procesos
pedicelares y reducida expresión de nefrina (Roselli et al.2004). Las mutaciones pueden
afectar las regiones intracitoplasmáticas C- y N-terminal de la proteína (Weber et
al.2004), la más común encontrada es la mutación p.R138Q, observada en 32% de
todos los alelos afectados (Hinkes et al.2007).
Podocina aumenta además la cascada de señalización de la proteína quinasa
activadora de mitógeno por reclutamiento de nefrina hacia las balsas lipídicas (Huber et
al.2001; Huber et al.2003). Variantes de podocina, debido a mutaciones sin sentido,
difieren en su habilidad para regular el tráfico de nefrina a balsas lipídicas y membrana
plasmática (Huber et al.2003; Nishibori et al.2004).
El gen alterado en el síndrome nefrótico hereditario resistente a esteroides:
NPHS2, codifica la proteína podocina, la cual tiene un peso molecular de 42 KDa y es
expresada solamente en el desarrollo y maduración del podocito glomerular (Boute et
al.2000; Miner et al.2002). También se han identificado mutaciones del gen en casos
esporádicos de glomerulosis focal segméntal (Tsukaguchi et al.2002) y sorpresivamente
21
en algunos pacientes con recurrencia de proteinuria después de la transplantación renal
(Bertelli et al.2003).
2.4 Adenosina y su papel en la nefropatía diabética.
El nucleósido adenosina ha sido reconocido como un autacoide vasoactivo que
induce relajación de arterias coronarias y pulmonares vía producción endotelial de óxido
nítrico (Vials et al.1993; Steinhorn et al.1994). Adenosina en el riñón juega un amplio rol
regulatorio incluyendo: la modulación del flujo sanguíneo renal; tasa de filtración
glomerular; liberación de hormonas y neurotransmisores; transporte, función y flujo
urinario (Mccoy et al.1993).
La diabetes o altas concentraciones de D-glucosa alteran la captación de
adenosina en el endotelio y otros tipos celulares. Esto produce aumento en la
concentración extracelular de este nucleósido y en la biodisponibilidad para activar vía
autocrina o paracrina los receptores de adenosina (San Martín & Sobrevia. 2006;
Vásquez et al. 2004).
Evidencias funcionales y bioquímicas indican que el ATP extracelular y
adenosina ejercen influencia substancial sobre la función renal vía receptores P1 y P2
(Inscho et al.2001; Nishiyama et al.1986). Adenosina es un inmunomodulador endógeno
que exhibe efectos inmunosupresivos y antiinflamatorios, estos efectos antiinflamatorios
dependen principalmente sobre la unión a los receptores P1, de los cuales cuatro
subtipos (A1, A2A, A2B y A3) han sido identificados y son proteínas N-glicosiladas que
22
presentan siete dominios transmembrana y se acoplan a diferentes tipos de proteína G
(Burnstock. 1978; San Martin & Sobrevia. 2006). Los receptores A1 y A2A son activados
a concentraciones nanomolar mientras que los receptores A2B y A3 requieren
concentraciones cercanas al rango micromolar para su activación.
Muchos estudios han direccionado previamente aspectos parciales de la
localización intrarenal de los receptores de adenosina. Estos estudios agregan que
receptores A1 son expresados en los vasos preglomerulares, en el aparato
yuxtaglomerular, en los ductos colectores medulares y en el asa descendente de la
médula externa (Smith et al.2001; Kreisberg et al.1979), el receptor A2A esta asociado
principalmente con vasos sanguíneos renales (Nishiyama et al.2001; Kreisberg et
al.1979), el receptor A2B es encontrado en vasos preglomerulares y en el asa
descendente (Kreisberg et al.1979; Jackson et al.2002), mientras que el receptor A3 se
encuentra apenas detectable en el riñón (Zou et al.1999; Jackson et al.2002).
Los receptores A1 y A2 median muchos efectos vasoactivos de adenosina dentro
de la vasculatura. Activación del receptor A1 estimula Gi, el cual inhibe directamente la
adenilato ciclasa o reduce la efectividad de Gs, y resulta en una falla en los niveles de
cAMP en tejidos. (Van Calker et al.1979; Linden et al.1991). En contraste, estimulación
del receptor A2 resulta en la activación de Gs, el cual tiene un efecto estimulatorio sobre
adenilato ciclasa, siguiendo a un aumento en los niveles de cAMP en los tejidos.
Células vasculares del músculo liso poseen receptores A2 capaces de estimular la
adenilato ciclasa (Silver et al.1984; Jonzon et al.1985).
23
Estudios animales han documentado la presencia de vasoconstricción renal
después de inyección de adenosina exógena (Spielman et al.1978; Spielman et
al.1982). Este efecto se debe a una selectividad sobre la arteriola aferente y mediada
por la activación del receptor A1 (Rossi et al.1988; Spielman et al.1991). Esto trae como
consecuencia disminución de la tasa de filtración glomerular y del flujo sanguíneo renal.
Además, algunos datos funcionales sugieren que antagonistas del receptor A1 inhiben
el transporte del túbulo proximal (Wilcox et al. 1999).
La estimulación del receptor A2 produce vasodilatación (Spielman et al.1991).
Receptores A2A en el riñón han sido detectados en la microvasculatura renal (Okusa et
al.2002), así como también sobre células epiteliales tubulares y mesangiales (Scholz-
Pedretti et al.2001; Lee et al.2002). Se ha mostrado que agonistas del receptor A2A
previenen inflamaciones y lesiones del tejido renal en nefropatía diabética (Awad et al.
2006). Activación de los receptores A2A por agonistas exógenos o adenosina endógena
produce una reducción dramática en lesiones renales seguidas por reperfusión-
isquemia en ratas (Okusa et al. 1999; Okusa et al. 2000). Los subtipos de receptores A3
han sido implicados en producir apoptosis en células mesangiales (Duann et al. 2005),
pero mucho menos se conoce acerca del papel del receptor A2B en el riñón.
Se ha demostrado que la adenosina aumenta la producción de VEGF y sus
receptores en glomérulos renales lo cual podría tener importantes repercusiones en la
génesis de la nefropatía asociada a la diabetes (Valladares et al. 2006).
A la fecha, no se conocen totalmente los componentes que a nivel celular y
molecular están involucrados en la patogénesis de la nefropatía diabética, ni el papel
que la adenosina cumple en la función de los tipos celulares que componen el
24
glomérulo en condiciones normales y patológicas.
Recientemente se informó que las alteraciones tanto funcionales como histológicas que
aparecen en los glomérulos renales producto de la diabetes fueron bloqueadas
utilizando un agonista de los receptores de adenosina (ATL146e), proponiendo el uso
de estas moléculas como una nueva herramienta farmacológica para el tratamiento de
la nefropatía diabética (Awad et al. 2006). Por lo tanto, nos parece relevante estudiar el
papel que la señalización de adenosina y sus receptores tendría sobre la producción de
nefrina y podocina en glomérulos renales. Esto estaría asociado a la disfunción
glomerular en eventos tempranos de la nefropatía inducida por diabetes.
25
HIPOTESIS
En diabetes el aumento de la biodisponibilidad de adenosina señaliza una
disminución de la expresión de nefrina y podocina en los glomérulos renales, lo cual se
asocia con el establecimiento de la nefropatía diabética.
OBJETIVOS GENERALES
• Determinar el papel de los receptores de adenosina sobre la expresión de
proteínas del complejo de unión que conforma la barrera de filtración en
glomérulos renales.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Inducir diabetes en ratas de experimentación.
• Cultivo primario de glomérulos renales.
• Cuantificar el contenido de mRNA de nefrina y podocina en respuesta a
agonistas y antagonistas P1.
• Cuantificar el contenido de proteína nefrina y podocina en respuesta a agonistas
y antagonistas P1.
26
3. MATERIALES Y METODOS.
3.1 MATERIALES.
3.1.1 Material biológico.
En este estudio se utilizaron riñones de ratas (Rattus norvegicus) cepa Sprague-
Dawley, las cuales fueron mantenidas en condiciones estándares de luz, temperatura y
alimentación en el vivero del Instituto de Fisiología de la Facultad de Medicina de la
Universidad Austral de Chile. Las ratas utilizadas fueron machos con pesos en el rango
de 250-300 gramos.
3.1.2 Reactivos.
Bayer HealthCare: Sistema medición de glucosa en sangre: Ascencia Entrust.
Bio Rad: Membranas de nitrocelulosa.
Bio Spec Products: Silica Beads 0.5mm.
Calbiochem: Estreptozotocina.
Dako: Biotina-streptavidina (LSAB+System-HRP), diaminobenzidina (liquid DAB
substrate cromogen system), medio de montaje para fluorescencia.
GE HealthCare Limited: Material fotografico; Films (Amersham Hyperfilm MB).
Gibco Laboratories Life Technologies, Inc.: Medio con mezcla de nutrientes F-10
(HAM F-10), suero bovino fetal (SBF), penicilina/estreptomicina 100x (10.000 unidades
de penicilina, 10.000 gr de estreptomicina, 29.2 mg de L-glutamina por ml de solución
salina), persulfato de amonio.
27
Invitrogen: Set de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) 100 mM, inhibidor de
ribonucleasas (RNaseOUT) (40 U/μl), transcriptasa reversa M-MLV (Moloney Murine
Leukemia Virus)(200 U/μl), 0.1 M DTT, Taq DNA polimerasa (5 U/ul), 10x tampón PCR
(200 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8.4), MgCl2 (50 mM), Marcador preteñido de
proteínas para geles de poliacrilamida.
Kodak: Revelador D72 y fijador U3.
Merck & Co., Inc.: ácido clorhídrico, ácido acético, xilol, azul de bromofenol, citrato de
sodio dihidratado, HEPES sal sódica, PMSF, isopropanol, formaldehído, formamida y
Ponceau-S red.
Molecular Probes: Anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a Alexa fluor 594 (rojo).
Newark: mallas de filtración tamaño de poro 220 µm, 150 µm, 106 µm y 75 µm.
Promega: partidores para los genes a estudiar, GoTaq® Green Master Mix.
Roche: Lightcycler® FastStart DNAMasterSYB®Green.
Rockland: Anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa anti-IgG de ratón, Anticuerpo
secundario conjugado a peroxidasa anti-IgG de conejo.
Santa Cruz Biotechnologies: Reactivo quimioluminiscente (Western blotting luminol
reagent), Anticuerpo policlonal anti-nefrina de cabra (N-20), Anticuerpo policlonal anti-
podocina de conejo (H-130), anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa anti-IgG de
cabra (SC-2020).
Sigma Chemical Co: Gelatina, 2-mercaptoetanol, glicina, azul de Coomassie G-250,
Tritón X-100, albúmina de suero de bovino (BSA), ortovanadato de sodio. Anticuerpo
monoclonal Anti-β-Actina de ratón.
Thermo Scientific: ECL Western Blotting Substrate, BCA Protein Assay Kit.
28
Winkler: Solución de Chomczynsky con fenol, Acrilamida:bisacrilamida 29:1, reactivo
de Bradford 5x, PBS 10x (NaCl 1.36 M, KCl 0.007 M, NaHPO4-7H2O 0.199 M, KH2PO4
0.066 M, pH 7.4), TBE 10x (Tris 0.29 M, ácido bórico 0.89 M, EDTA 0.01 M, pH 8.3),
TG-SDS 10x (Tris 0.08 M, Glicina 2.5 M, SDS 0.03 M, pH 8.3), Alcohol metílico, etílico
y amílico, Agua libre de nucleasa, cloroformo, tampón de carga 6x azul-celeste (glicina
30%, azul de bromofenol 0.25%, xilen-cianol FF 0.25%), marcador de DNA escala de
100pb, TEMED, agarosa, dodecil sulfato de sodio (SDS), tampón de carga 2x EF
Proteínas, Tween 20.
3.1.3 Instrumentos.
Agitador Mini Bead-Beater BIOSPEC Products.
Agitador magnético IKAMAG® RCT.
Agitador orbital IKA VIBRA VXR.
Balanza precisa 180A.
Balanza analítica precisa 405M-200A.
Baño termorregulador MEMMERT.
Centrífuga Heraeus: Biofugue pico.
Centrífuga Eppendorf Mini Spin 22331 Hamburg.
Centrífuga refrigerada Hettich Zentrifugen; MIKRI 200R.
Espectrofotómetro UV-Vis Thermo SCIENTIFIC; Evolution 60.
Espectrofotómetro Shimadzu UV-120-12
Fuente de poder PowerPac Basic, Bio Rad
Freezer a -70ºC Forma Scientific Bio-Freezer 8425
29
Gabinete de flujo laminar Nuaire™ Class II
Incubador para cultivo celular Nuaire™DH Autoflow
Lector de Elisa STAT FAX 3200
Lector de Elisa Thermo; MULTISKAN Ex.
Microcentrífuga refrigerada eppendorf 5417R
Microondas, LG interwave.
Microondas Daewoo; KOR-63FB.
Microscopio invertido NOVA IN833
Microscopio de fluorescencia Zeiss modelo AXIOSKOP HB50 acoplado a una cámara
digital ZEISS modelo AxioCam Mrc.
pHmetro Radiometer Copenhagen PHM 83 Autocal
Refrigerardor y congelador Whirlpool
Set de Micropipetas Gilson
Sistema de Electroforesis Mini Protean® III, Bio Rad
Sistema de transferencia Mini Trans Blot, Bio Rad
Sonicador Ultrasonic Homogenizer 4710 Cole Parmer Intruments Co.
Termociclador ThermoHybad PX2.
Termociclador Eppendorf Mastercycler Personal.
Termociclador LIGHT CYCLER®1.5
Transiluminador UVP.
Vortex Barnstead / Thermolyne: Maxi Mix II.
30
3.1.4 Agonistas y antagonistas de los receptores de adenosina.
Para los experimentos se utilizó el agonista no selectivo de los receptores de
adenosina NECA (5'-(N-ethylcarboxamido)adenosine), el agonista CGS21680 (2-[p-(2-
carbonyl-ethyl)-phenylethylamino]-5’-N-ethylcarboxamidoadenosine) de alta selectividad
para el subtipo de receptor de adenosina A2A, el agonista CPA (N6-
cyclopentyladenosine) para el receptor A1 y el agonista MECA (5'-(M-
ethylcarboxamido)adenosine) para el receptor A3. También los antagonistas DPCPX (8-
cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine) para el receptor A1, ZM241385 (4-(2-[7-amino-2-[2-
furyl][1,2,4]triazolo[2,3-a][1,3,5]triazin-5ylamino]ethyl)phenol) para el receptor A2A,
MRS1754 (8-[4-[((4-cyanophenyl)carbamoylmethyl)oxy]phenyl]- 1,3-di(n-ropyl)xanthine)
para el receptor A2B y MRS1220 (8-[4-[((4-cyanophenyl)carbamoylmethyl)oxy]phenyl]-
1,3-di(n-ropyl)xanthine) para el receptor A3. Las constantes de afinidad de estas
moléculas por los receptores de adenosina de rata han sido previamente establecidos
(Tabla I) (Fredholm et al. 2001).
3.2 MÉTODOS.
3.2.1 Inducción de diabetes en ratas.
Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de peso entre 200-250 gramos
mantenidas en ayuno durante un mínimo de 12 horas. Cada rata recibió una dosis de
estreptozotocina (STZ) equivalente a 60 mg/kg vía intravenosa en la vena de la cola. La
STZ fue disuelta en 500 μl de tampón citrato 50mM pH 4.5 autoclavado y filtrado. A las
ratas controles se les inyectó el volumen equivalente de tampón citrato. Para el
31
procedimiento las ratas fueron anestesiadas con éter etílico en una cámara, se lavó la
cola con agua tibia y etanol para finalmente administrar la dosis de STZ. En los días 1, 5
y 10 después de la inyección y en el día del experimento (21 días post inducción) se
midieron los niveles de glucosa en la sangre de las ratas ayunadas. La determinación
se realizó usando el medidor de glucosa en sangre Ascensia Entrust. En los
experimentos se utilizaron ratas con niveles de glucosa en la sangre mayores a 450
mg/dl. Los experimentos utilizaron riñones de ratas diabéticas transcurridas dos
semanas desde la inyección con STZ o tampón citrato.
Las ratas proporcionadas por el vivero del Instituto de Fisiología de la Facultad
de Medicina de la Universidad Austral de Chile fueron mantenidas de acuerdo a la
normativa vigente según las medidas de bioseguridad del “Manual de Normas de
Bioseguridad” de CONICYT de 2008. Los restos orgánicos fueron enviados al
incinerador del Fundo Teja Norte de la Universidad Austral de Chile, donde se
descartan los desechos biológicos de acuerdo al “Manual de Procedimiento para el
Manejo de Residuos” de la Universidad Austral de Chile.
3.2.2 Perfusión renal.
Las ratas fueron anestesiadas con éter etílico y sacrificadas por dislocación
cervical, posteriormente la cavidad abdominal fue expuesta mediante disección con
material quirúrgico, se despejó la cavidad removiendo los intestinos, se amarró con hilo
quirúrgico la arteria hepática, mesentérica y las arterias ilíacas. En la aorta abdominal
se insertó una bránula por la cual se dejó difundir aproximadamente 30 ml de PBS 1X
estéril hasta que los riñones cambiaron de color rojo a café claro. Posteriormente,
32
ambos riñones fueron extraídos.
3.2.3 Aislamiento de glomérulos renales.
Los riñones fueron mantenidos en PBS 1x (136.89 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10.14
mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4, pH 7.4) frío hasta la remoción total de la cápsula que
los recubre. Luego se procedió a efectuar finos cortes de los riñones de
aproximadamente dos milímetros. Los glomérulos fueron purificados empleando un
sistema de filtración diferencial (Salant et al. 1980; Holzman et al. 1999). En este
sistema los trozos de riñones fueron presionados sobre un tamiz con tamaño de poro
212 µm y lavados secuencialmente con PBS 1X por tamices de tamaños 150 µm, 106
µm y 75 µm. Los glomérulos presentaron un tamaño de aproximadamente 90-100 µm,
por lo cual corresponden al material retenido y recolectado desde la malla de 75 µm.
3.2.4 Tratamiento con adenosina y moduladores farmacológicos de los receptores
de adenosina.
Para determinar el efecto de adenosina o moduladores farmacológicos de
sus receptores, los glomérulos renales purificados (~104 glomérulos por placa) fueron
incubados en 2 ml de medio HAM-F10 suplementado con adenosina a una
concentración 10 μM en condiciones estándares a 37°C y 5% de CO2 por 24 horas.
Luego los glomérulos se sedimentaron por centrifugación a 1500xg por 3 minutos y se
almacenaron los sobrenadantes a -70ºC. Para la obtención de proteínas totales los
glomérulos fueron resuspendidos en 100 μl de tampón RIPA (1% Triton-X-100, 0.5%
33
desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.2)
más los inhibidores de proteasas (1 mM PMSF, 2 µM aprotinina, 1 µg/µl leupeptina y
pepstatina) y procesados según el punto 3.2.9. Para la preparación de RNA total se
adiciono 1 ml de solución de Chomczynski con fenol y se realizó la extracción según el
punto 3.2.5. También el medio se suplementó con agonistas y antagonistas de alta
selectividad para los receptores de adenosina. Las concentraciones empleadas se
determinaron según la constante de afinidad de cada modulador por su receptor
específico como se muestra en la Tabla I.
34
Tabla I: Constantes de afinidad de los moduladores farmacológicos de los
receptores de adenosina.
Constante de afinidad receptores de adenosina (nM)
A1 AR A2A AR A2B AR A3 AR
Concentración
utilizada
Adenosina 3-30 1-20 5000-20000 > 1000 10 μM
Agonistas
NECA 14 20 140 25 1 μM
CPA 2.3 794 18600 72 30 nM
CGS21680 289 27 >10000 67 100 nM
Antagonistas
ZM241385 774 1.6 75 743 10 nM
DPCPX 3.9 129 56 3980 30 nM
MRS1754 403 503 2.0 570 50 nM
Datos obtenidos de San Martín & Sobrevia 2006; Jacobson & Gao 2006.
35
3.2.5 Extracción de RNA total.
El RNA total se extrajo desde cultivos de glomérulos utilizando solución de
Chomczynski con fenol (Chomczynski & Sacchi 1987). Se recolectó en un tubo
Eppendorf los glomérulos a partir del cultivo y fueron sedimentados por centrifugación a
2000xg por 3 minutos. Se almacenó el sobrenadante, se adicionó 1 ml de la solución
de Chomczynski por cada tubo y 100 μl de SDS 10% y se incubó por 5 minutos a
temperatura ambiente. Se adicionó 0.2 ml de cloroformo por cada ml de solución
utilizada, se agitó vigorosamente por 15 segundos y se incubó por 3 minutos a
temperatura ambiente. Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se precipitó el
RNA con 0.5 ml de alcohol isopropílico mezclando e incubando por 10 minutos a
temperatura ambiente. En seguida se centrifugó a 12.000xg por 15 minutos a 4°C. Se
eliminó el sobrenadante y se lavó el precipitado con 500 μl de alcohol etílico (75%) frío.
Se mezclo suavemente y se centrífugó a 7.500xg por 5 minutos a 4°C. Se eliminó el
sobrenadante cuidadosamente y se dejó secar brevemente el precipitado hasta que se
evapore todo el alcohol. Finalmente se resuspendió el pellet obtenido en 10 μl de agua
libre de nucleasas. Para determinar la concentración y pureza del RNA se tomó una
alícuota de la muestra, se diluyó 150 veces y se leyó la absorbancia a 260nm/280nm
contra un blanco de agua. Para el cálculo de la concentración se asumió que una
unidad de absorbancia a 260nm es equivalente a 40 μg/ml de RNA.
36
3.2.6 Síntesis de cDNA.
La reacción de transcripción reversa fue realizada mediante una preincubación
de 1.0 μg de RNA total de cada muestra con 1 mM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP) y 0.5 µg de oligo dT12-18 por 1 minuto a 80°C. Inmediatamente se transfirieron los
tubos al hielo y se adicionaron tampón de reacción (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM
MgCl2, pH 8.3), 0.01 M DTT, 40 unidades de inhibidor de ribonucleasa recombinante
(RNAsaOUT) y 200 unidades de transcriptasa reversa (M-MLV) en un volumen total de
reacción de 20 μl y se incubó por 1 hora a 37°C. Finalmente para la inactivación de la
transcriptasa reversa la mezcla de reacción se calentó a 70ºC por 15 minutos. El cDNA
sintetizado fue almacenado a -20ºC para su posterior amplificación por PCR.
3.2.7 Amplificación de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Cada reacción de amplificación se realizó empleando como templado 1 µl del
cDNA diluído 1:10 en agua libre de nucleasa, partidores específicos (0.2 µM), dNTPs
(0.2 mM de cada uno), 1 unidad de Taq Polimerasa, 5 µl del tampón de PCR (20 mM
Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.4), 1.5 µl MgCl2 (1.5 mM) en un volumen de 50µl. El
programa utilizado consta de los siguientes pasos: desnaturación inicial a 94ºC por 2
minutos, seguido de 40 ciclos cada uno compuesto de desnaturación a 94ºC por 30
segundos, apareamiento 55ºC por 30 segundos y extensión a 72ºC por 30 segundos.
Por último, se realizó una extensión final a 72ºC por 15 minutos. Para el control de la
eficiencia de la transcripción reversa se realizaron reacciones de amplificación del
cDNA del gen β-actina. Los productos de amplificación se fraccionaron en geles de
agarosa al 1.5 % y fueron visualizados por tinción con bromuro de etidio en un
37
transiluminador de luz ultravioleta. Las imágenes fueron capturadas utilizando un
sistema digital. Los partidores utilizados en este estudio fueron derivados desde las
secuencias de los mensajeros de rata anotados en la base de datos GenBank® del
Instituto Nacional de Salud de U.S. (NIH). En la Tabla II se indican las secuencias de
cada par de partidores utilizados.
38
Tabla II: Partidores y productos de PCR predichos para la amplificación de los
transcritos de los genes estudiados.
Gen
Número de
acceso a GenBank®
Secuencia oligonucleótidos
Tamaño
producto
β-Actina EF156276 5’ AGC CTT CCT TCC TGG GTA TG 3’ 213 pb
5’ CAG GAG GAG CAA TGA TCT TG 3’ Nefrina AF125521 5’ GCA TGA TGA AGT GGA GAG AG 3’ 160 pb
5’ TTC CAC AGC ATC CAT GTC TG 3’ Podocina BC098649 5’ TCT CCT CCC TGA TCT TCA TC 3’ 340 pb
5’ GTT TGC ACC AGG AAC TGG AT 3’
39
3.2.8 Cuantificación de cDNA mediante PCR cuantitativo (qPCR).
Cada reacción de amplificación se realizó empleando como templado 2 µl del
cDNA diluído 1:10 en agua libre de nucleasas, partidores específicos 0,2 µM, 0,8 µl
MgCl2 (25 mM), 1 µl de mezcla de amplificación Lightcycler® Fast Start
DNAMasterSYB®Green en un volumen de 10µl. La reacción se llevó a cabo en un
termociclador Lightcycler®1.5. El programa utilizado consta de los siguientes pasos:
desnaturación inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido de 40 ciclos cada uno compuesto
de desnaturación a 95ºC por 30 segundos, apareamiento 60ºC por 30 segundos y
extensión a 72ºC por 10 segundos. Posteriormente un ciclo para la curva de melting por
15 segundos a 60 ºC, y por último el enfriamiento a 40ºC por 30 segundos. La
cuantificación absoluta necesitó de una curva estándar, que consiste en reacciones que
contienen en diluciones del templado de concentración conocida para el gen de interés.
Para esto se realizó un PCR convencional para el gen en estudio, descrito en la sección
3.2.7, el producto de PCR se purificó desde el gel de agarosa utilizando el sistema
E.Z.N.A® para extracción desde geles. Se determinó la concentración del fragmento de
DNA purificado midiendo la A260nm. A continuación se realizaron diluciones sucesivas en
un rango de 109 a 100 números de copias/μl. Para el control de la eficiencia de la
transcripción reversa se realizó reacciones de amplificación del cDNA del gen β-actina
en cada muestra. Los partidores utilizados en este estudio fueron derivados desde las
secuencias de los cDNAs de rata anotados en la base de datos GenBank® del Instituto
Nacional de Salud de U.S. (NIH). En la Tabla II se indican las secuencias de cada par
de partidores utilizados.
40
3.2.9 Extracción y cuantificación de proteínas.
Los glomérulos fueron lisados utilizando 100 µl de tampón RIPA mas
inhibidores de proteasas. Luego las muestras se sonicaron tres veces por 5 segundos a
una amplitud máxima de 100. Se sedimentaron los restos celulares por centrifugación a
3500xg por 1 minuto y los sobrenadantes fueron rescatados y transferidos a un tubo
nuevo. Las proteínas se cuantificaron utilizando el método del acido bicinconínico (BCA)
(Smith et al. 1985). Se construyó una curva de calibración entre 0 y 2 μg/ml de proteína
en un volumen final de 225 μl. Se utilizó como estándar BSA (2 mg/ml) diluido en agua
desionizada. Para todas las lecturas se utilizó un blanco de agua desionizada, la misma
usada para las diluciones. Se adicionó a cada tubo de la curva una mezcla de reactivo
de trabajo A y B (50:1, reactivo A:B) y se incubó por 30 minutos a 37º C. Finalmente se
realizó la lectura de absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de
570 nm. Para la cuantificación de las muestras se tomó una alícuota de 1 μl de cada
una y se diluyó hasta completar un volumen final de 25 μl con agua desionizada, se
utilizo un blanco con 1 μl de tampón RIPA y 24 μl de agua desionizada. En seguida se
adicionó 200 μl de reactivo de trabajo.
Luego de esperar el tiempo correspondiente se leyó las absorbancia a 570
nm. Los resultados obtenidos de absorbancia para las muestras fueron interpolados en
la curva de calibración para determinar cada una de las concentraciones.
3.2.10 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida.
Para el fraccionamiento de proteínas totales se utilizaron geles de poliacrilamida
al 10% en condiciones desnaturantes basado en el procedimiento de Laemmli (1970).
41
En el montaje de los geles se utilizó el sistema de Electroforesis Mini Protean® III de la
compañía BIORAD y separadores de 1.5 mm de espesor. El gel separador se preparó
a una concentración al 10% de poliacrilamida a partir de una solución de
acrilamida:bisacrilamida 29:1. Además contenía 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% SDS,
0,04% persulfato de amonio y 0,03% TEMED. El gel espaciador se preparó al 3.8% de
poliacrilamida incluyendo 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% SDS y 0,04% TEMED.
Ambos geles fueron polimerizados utilizando persulfato de amonio al 1% y TEMED al
0.03%. Se agregó tampón de muestra (0.3125 M Tris-HCl, pH 6.8, 10% SDS, 50%
sacarosa, 0.010% azul de bromofenol) a 100 μg de proteínas totales, se incubaron por
2 minutos a 90°C y fueron transferidas inmediatamente a hielo. Finalmente las muestras
fueron cargadas en los pocillos del gel el cual estaba contenido en un sistema
sumergido en tampón de corrida TG-SDS 1x (8 mM Tris, 250 mM glicina, 3 mM SDS,
pH 8.3) y se aplicó una corriente de 25 mA. Se realizó la corrida electroforética hasta
que el frente iónico alcance el borde inferior del gel.
3.2.11 Electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa.
Finalizada la separación electroforética, las proteínas se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema de BioRad Mini Trans Blot. El
procedimiento se inició apilando secuencialmente sobre una esponja embebida en
tampón de transferencia (8 mM Tris, 250 mM glicina, 3 mM SDS, 20% metanol, pH 8.3)
un trozo de papel filtro, el gel a transferir, la membrana de nitrocelulosa en contacto
directo con el gel, papel filtro y finalmente otra esponja también embebida en el mismo
tampón. Este conjunto se colocó en una cámara de electrotransferencia repleto en el
42
mismo tampón. Se usó de forma que el gel quede hacia el cátodo y la membrana hacia
el ánodo. Se realizó la transferencia a una intensidad de 400 mA por 1 hora.
Transcurrido el tiempo necesario la membrana está lista para utilizarse en la
inmunodetección. Para corroborar que la transferencia se realizó satisfactoriamente se
tiñó la membrana con rojo Ponceau (0.5% Ponceau-S red, 1% acido acético) por 5
minutos y se observó el patrón de transferencia de las proteínas. Luego se eliminó la
tinción con lavados sucesivos con tampón PBS 1X hasta el descoloramiento.
3.2.12 Detección inmunológica.
Las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas por 1 hora en 5 ml de
solución de bloqueo (5% leche descremada, PBS 1X, 0.1% Tween20) a temperatura
ambiente. Luego, se incubó con anticuerpo primario anti-podocina (dilucion 1:1000) o
anti-nefrina (dilución 1:500) en solución de bloqueo toda la noche y 4 horas,
respectivamente con agitación suave. Finalizado este tiempo las membranas se lavaron
5 veces por 5 minutos con PBS1X/Tween20 (0.1%) con agitación moderada y
constante. En seguida, se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario
conjugado a peroxidasa anti-IgG de conejo (1:2000 diluido en PBS/Tween 20) para la
detección de podocina y con anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa anti-IgG de
cabra (1:5000 diluido en PBS/Tween 20) para la detección de nefrina. Finalmente, se
lavó 5 veces con PBS1X/Tween20 por 5 minutos. El revelado se realizó utilizando el
sistema de quimioluminiscencia (ECL) en donde se mezclaron partes iguales del
reactivo peróxido de hidrógeno y luminol, se colocó sobre la membrana y se incubó por
1 minuto. Se eliminó el exceso de reactivo y se expone a un film fotográfico por 20
43
minutos. Se retiró el film y se reveló utilizando la solución D72 y finalmente se fijó con el
reactivo U3.
Para la normalización de la concentración de proteínas, se realizó el “stripping”
de las membranas para eliminar los anticuerpos adheridos que puedan interferir con la
nueva detección. Se incubó la nitrocelulosa con la solución de “stripping” (2% SDS, 62.5
mM Tris-HCl, 100 mM β-mercaptoetanol, pH 6.8) por 30 minutos a una temperatura
constante de 55°C. Luego se lavó con PBS/Tween dos veces por 15 minutos. Se
procedió a realizar la inmunodetección anteriormente descrita utilizando una dilución del
anticuerpo primario anti β-actina 1:5000 y una dilución 1:5000 del anticuerpo secundario
anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa. También se reveló el film como se indicó
anteriormente.
3.2.13 Inmunohistoquímica.
Los riñones de ratas normales y diabéticas se fijaron en bouin. Posteriormente,
las muestras fueron incluidas en parafina. Los riñones fijados e incluidos se seccionaron
con un micrótomo, obteniéndose cortes seriados de 5 μm de grosor y fueron montados
en porta objetos de vidrio silanizados.
Los cortes montados fueron pasados por xilol y una batería descendente de
etanol (100%, 95%, 80%, 70%, 50% (v/v)) para desparafinar e hidratar. Luego se lavó
con agua destilada 3 veces por 3 minutos. Posteriormente, los cortes fueron sometidos
a un tratamiento para mejorar la exposición de los antígenos que consistió en incubar la
muestra con citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) en un horno microondas, 5 minutos a 50%
de potencia tres veces, con reposición de tampón citrato de sodio cada vez que este se
44
evaporaba. Para eliminar el exceso de citrato se lavó con agua destilada 2 veces por 5
minutos. Para eliminar la actividad de las peroxidasas endógenas, los cortes se trataron
con peróxido de hidrógeno (metanol 70% (v/v) perhidrol 3% (v/v)) durante 5 minutos.
Seguido de tres lavados con PBS 1X por 5 minutos. Se bloqueó y permeabilizó con
solución de bloqueo (albúmina de suero bovino 1%, Triton X-100 0,3%, leche
descremada 5% en PBS 1X) por 1 hora en cámara húmeda a temperatura ambiente.
Para la incubación con el anticuerpo primario se utilizaron diluciones de 1:500 en
solución de bloqueo. Se incubaron con el anticuerpo primario anti-podocina y anti-
nefrina por toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Posteriormente se lavaron los
cortes tres veces con PBS 1X por 5 minutos. El complejo antígeno-anticuerpo fue
detectado usando el sistema de amplificación biotina/estreptavidina-peroxidasa
utilizando el kit LSAB+System-HRP (DakoCytomation®). Secuencialmente, se incubó
por 30 minutos con anticuerpo secundario conjugado a biotina en cámara húmeda a
temperatura ambiente. Se lavó cinco veces con PBS 1X por 5 minutos. Luego, se
incubó con estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano también por 30 minutos
seguido de cinco lavados con PBS 1X por 5 minutos. Para el revelado se utilizó el
sustrato 3,3´-diaminobenzidina (DAB) cromogénico disponible del mismo kit, incubado
por 10 minutos en oscuridad seguido de tres lavados con PBS 1X por 3 minutos. Para
todos los cortes se realizó una contra tinción con hematoxilina, incubando los cortes con
esta solución por 15 segundos y colocados inmediatamente en borato de sodio por 2
segundos. Finalmente los cortes fueron deshidratados en una batería ascendente de
etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100% (v/v)) y xilol, para luego ser montados utilizando
bálsamo de Canadá. Los cortes fueron observados en un microscopio marca Zeiss
45
acoplado a una cámara digital Nikon DXM1200. Las imágenes fueron procesadas
utilizando el programa Adobe Photoshop 7.0.
3.2.14 Estadística.
Los datos de todas las gráficas fueron presentados como el promedio ±
desviación estándar. Para los análisis estadísticos la significancia fue evaluada
utilizando la prueba t-student o ANOVA (ANOVA seguido de la prueba student-
Newman-Keul) según corresponda. Considerando un valor P< 0.01 para la prueba t-
student y un valor P< 0.05 para ANOVA. Se utilizó el programa SigmaPlot 11.0 para la
obtención de los gráficos y el SigmaStat 3.5 para los análisis estadísticos.
46
4. RESULTADOS
4.1 Purificación de glomérulos desde riñones de rata.
Los glomérulos se extrajeron desde riñones de ratas normales empleando un
sistema de filtración diferencial según se describe en la sección 3.2.3. El sistema de
filtración selecciona estructuras tisulares de acuerdo a su tamaño al tamizarlas
sucesivamente a través de mallas de diferentes tamaños de poro (220, 150, 106 y 75
µm). El tamiz de menor tamaño posee un poro, 75 µm, que permite la retención de los
glomérulos, ya que estos poseen un diámetro de aproximadamente 90 µm. Como se
muestra en la figura 4A los glomérulos purificados poseen un grado de pureza superior
al 95% al considerar como contaminantes a restos de túbulos renales. Además, la
proporción de glomérulos descapsulados versus capsulados es cercana a 90:1, figura
4B. La eficiencia y pureza de los glomérulos fue similar si el material biológico de
partida era el riñón completo o la corteza renal.
47
Figura 4: Purificación de glomérulos renales de ratas. (A) Los glomérulos fueron
purificados desde la corteza renal empleando un método de filtración diferencial el que
utiliza mallas con diferentes tamaños de poro (220,150, 106 y 75μm). (B) La purificación
se obtuvo con un alto grado de pureza, conteniendo un bajo número de glomérulos
capsulados (∗) y ausencia de túbulos. Magnificación total (A) 1000x; (B) 200x.
48
4.2 Inmunolocalización de las proteínas podocina y nefrina en cortes de riñones
de ratas normales y diabéticas.
Debido a la disminución o variación en la expresión a nivel de proteína de
podocina y nefrina en el glomérulo renal durante etapas tempranas de nefropatía
diabética, se realizó la inmunodetección de estas proteínas en cortes renales de ratas
normales y diabéticas, utilizando nuestro modelo de diabetes tipo 1 generado mediante
la inyección intravenosa de estreptozotocina en estos animales.
En riñones de ratas normales y diabéticos se observó inmunotinción positiva
principalmente en la zona cortical del riñón. Cabe mencionar que nuestra atención se
centró en la zona de la corteza debido a que en esa región del riñón se encuentran los
glomérulos. Para cada uno de los distintos ensayos realizados se efectuaron los
respectivos controles negativos mostrando todos ellos inmunotinción negativa. La figura
5 presenta la inmunohistoquímica realizada para la detección de podocina, en esta se
muestran cortes de riñón normal (A) y diabético (B). En la figura 5A se puede observar
la localización de la proteína podocina principalmente en los podocitos y también se
observa en túbulos proximales. En la figura 5B se aprecia claramente una disminución
en la expresión graficado en una disminución en la inmunotinción positiva para
podocina en todas las regiones del glomérulo antes mencionadas con respecto a los
cortes de glomérulo control.
En la inmunohistoquímica contra nefrina presentada en la figura 6, se muestran
cortes de riñón normal (A) y diabético (B). En la figura 6A se aprecia la localización de
nefrina principalmente a nivel de los podocitos, también se observa en túbulos
49
proximales. En la figura 6B que representa a un corte de riñón 21 días post-inducción
de diabetes, se observa que no existen cambios en la expresión de nefrina a nivel de
los podocitos en esta etapa de progresión del daño renal.
50
B A
C D
30 µm 30 µm
30 µm 30 µm
51
Figura 5: Localización y expresión de podocina en glomérulos renales: Los
riñones de ratas normales y diabéticas (21 días post-inducción) fueron fijados en
formalina, incluidos en parafina, seccionados y adheridos al portaobjetos. Los
cortes se incubaron con anticuerpo policlonal anti-podocina (dilución 1:500) y el
complejo antígeno-anticuerpo fue detectado usando el sistema de amplificación
biotina/estreptavidina-peroxidasa, y revelado con el sustrato DAB. Las imágenes
representan la inmunodetección de podocina en cortes renales de ratas normales
(panel A) y ratas diabéticas (panel B). En esta última se aprecia la disminución de
la expresión de podocina en podocitos (cabeza de flechas). Las imágenes de C y
D corresponden a los controles negativos de la inmunodetección tanto de
podocina normal y diabética respectivamente, los cuales carecen de anticuerpo
primario. Las muestras fueron teñidas con hematoxilina. Magnificación total 1000x.
52
A B
C D
30 µm 30 µm
30 µm 30 µm
53
Figura 6: Localización y expresión de nefrina en glomérulos renales:
Los riñones de ratas normales y diabéticas (21 días post-inducción) fueron fijados
en formalina, incluidos en parafina, seccionados y adheridos al portaobjetos. Los
cortes se incubaron con anticuerpo policlonal anti-nefrina (dilución 1:500) y el
complejo antígeno-anticuerpo fue detectado usando el sistema de amplificación
biotina/estreptavidina-peroxidasa, y revelado con el sustrato DAB. Las imágenes
representan la inmunodetección de nefrina en cortes renales de ratas normales
(panel A) y ratas diabéticas (panel B). En esta última se aprecia que no existen
cambios en la expresión de nefrina a nivel de los podocitos. Las imágenes de C y
D corresponden a los controles negativos de la inmunodetección tanto de
podocina normal y diabética respectivamente, los cuales carecen de anticuerpo
primario. Las muestras fueron teñidas con hematoxilina. Magnificación total 1000x.
54
4.3 Efecto de moduladores farmacológicos de los receptores de adenosina
sobre la expresión de podocina y nefrina en glomérulos renales.
4.3.1 Cuantificación a través de qPCR del contenido de mRNA para podocina
y nefrina en glomérulos de ratas.
Con el fin de cuantificar el contenido del mRNA de podocina y nefrina frente
a la exposición de los glomérulos a moduladores farmacológicos de los receptores
de adenosina, se realizó ensayos de PCR de tiempo real. Se comparó la relación
entre los transcritos de podocina y de nefrina versus el gen constitutivo β-actina en
controles y los diversos tratamientos. El tamaño de los transcritos para podocina,
nefrina y β-actina son: 340pb, 160pb y 213pb, respectivamente.
En la figura 7 se evalúa el contenido de transcrito de podocina en
glomérulos renales de ratas normales y el efecto de los moduladores
farmacológicos específicos de estos receptores de adenosina. Se observa que se
produce una disminución con respecto al control en la expresión de podocina al
utilizar el agonista general NECA y selectivo para el receptor A2B en glomérulos
renales de ratas normales el cual disminuye un 48% respecto al control. Sin
embargo, estas diferencias no son estadísticamente significativas debido al bajo
número de muestras.
En la figura 8 se evalúa el contenido de transcrito de podocina en
glomérulos renales de ratas diabéticas y el efecto de los moduladores
farmacológicos específicos de estos receptores de adenosina. Se observa que se
55
produce una disminución con respecto al control en la expresión de podocina al
utilizar el agonista general NECA y el selectivo para el receptor A1 (CPA). Esta
tendencia aunque no es estadísticamente significativa, se correlaciona con el
efecto del receptor A1 en disminuir el contenido de proteína podocina en los
glomérulos de ratas diabéticas. Al contrario, el tratamiento con el agonista del
receptor A3 (MECA) aumenta el contenido de transcritos de podocina un 91% con
respecto al control.
En la figura 9 se observa la correlación entre los valores del contenido del
transcrito de podocina en glomérulos renales de ratas normales y diabéticas y el
efecto de los moduladores farmacológicos específicos de estos receptores de
adenosina.
56
0
50
100
150
200
250
300
350
% c
ontro
l
tratamientos
control neca cgs cpa meca n +1754 cgs+zm meca +1220cpa+ dpcpx
*
Fig. 7: Efecto de los moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina sobre el contenido de transcritos de podocina en glomérulos de
ratas normales. Los glomérulos fueron aislados desde ratas normales y
diabéticas 15 días post-inducción. Luego se amplificó mediante qPCR los
transcritos de podocina y β-actina. El gráfico representa el promedio de la relación
del contenido de cDNA podocina versus β-actina y desviación estándar (n=2). *
P<0.05, existe diferencia significativa según análisis t-student.
57
0
100
200
300
400
500%
con
trol
tratamientos
control neca cgs cpa meca n +1754 cgs+zm meca +1220cpa+ dpcpx
*
Fig. 8: Efecto de los moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina sobre el contenido de transcritos de podocina en glomérulos de
ratas diabéticas. Los glomérulos fueron aislados desde ratas normales y
diabéticas 15 días post-inducción. Luego se amplificó mediante qPCR los
transcritos de podocina y β-actina. El gráfico representa el promedio de la relación
del contenido de cDNA podocina versus β-actina y desviación estándar (n=2). *
P<0.05, existe diferencia significativa según análisis t-student.
58
0
100
200
300
400
500
normalesdiabeticos
% c
ontro
l
tratamientos
control neca cgs cpa meca n +1754 cgs+zm meca +1220cpa+ dpcpx
* *
FIG 9: Correlación entre los valores del efecto de los moduladores
farmacológicos de los receptores de adenosina sobre los transcritos de
podocina en glomérulos de ratas normales y diabéticas.
59
En la figura 10 se evalúa el contenido de transcrito de nefrina en
glomérulos renales de ratas normales y el efecto de los moduladores
farmacológicos específicos de estos receptores de adenosina. Se observa que no
se produce una variación significativa con respecto al control en la expresión de
nefrina al utilizar los moduladores farmacológicos para los receptores de
adenosina en glomérulos renales de ratas normales, sin embargo, la variación no
significativa más evidente es el aumento del contenido de nefrina al utilizar el
agonista selectivo del receptor A3 (MECA).
En la figura 11 se evalúa el contenido de transcrito de nefrina en
glomérulos renales de ratas diabéticas y el efecto de los moduladores
farmacológicos específicos de estos receptores de adenosina. Se observa que no
se produce una variación significativa con respecto al control. Sin embargo, la
variación no significativa más evidente es el fuerte aumento en el contenido del
transcrito de nefrina al utilizar moduladores farmacológicos para el receptor A3. El
tratamiento con el agonista MECA aumenta sobre un 794% respecto al control.
En la figura 12 se observa la correlación entre los valores del contenido del
transcrito de nefrina en glomérulos renales de ratas normales y diabéticas y el
efecto de los moduladores farmacológicos específicos de estos receptores de
adenosina.
60
tratamientos
% c
ontro
l
0
200
400
600
800
1000
1200
control neca cgs cpa meca n +1754 cgs+zm cpa+ dpcpx meca +1220
Fig. 10: Efecto de los moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina sobre el contenido de transcritos de nefrina en glomérulos de
ratas normales. Los glomérulos fueron aislados desde ratas normales y
diabéticas 15 días post-inducción. Luego se amplificó mediante qPCR los
transcritos de nefrina y β-actina. El gráfico representa el promedio de la relación
del contenido de cDNA nefrina versus β-actina y desviación estándar (n=2). P
valor = 0,1, no existe diferencia significativa según análisis t-student.
61
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
% c
ontro
l
control neca cgs cpa meca n +1754 cgs+zm cpa+ dpcpx meca +1220
tratamientos Fig. 11: Efecto de los moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina sobre el contenido de transcritos de nefrina en glomérulos de
ratas diabéticas. Los glomérulos fueron aislados desde ratas normales y
diabéticas 15 días post-inducción. Luego se amplificó mediante qPCR los
transcritos de nefrina y β-actina. El gráfico representa el promedio de la relación
del contenido de cDNA nefrina versus β-actina y desviación estándar (n=2). P
valor = 0,1, no existe diferencia significativa según análisis t-student.
62
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
normalesdiabeticos
% c
ontro
l
tratamientos
control neca cgs cpa meca n +1754 cgs+zm cpa+ dpcpx meca +1220
FIG 12: Correlación entre los valores del efecto de los moduladores
farmacológicos de los receptores de adenosina sobre los transcritos de
nefrina en glomérulos de ratas normales y diabéticas.
63
4.3.2 Efecto de moduladores farmacológicos de los receptores de adenosina
sobre la expresión de podocina y nefrina.
Para determinar si el contenido de proteína podocina y nefrina es
modificado por la actividad de algún subtipo de los receptores de adenosina, se
realizaron semicuantificaciones de la expresión de nefrina y podocina en
glomérulos purificados desde ratas normales y diabéticas. Los glomérulos fueron
incubados en medio HAM-F10 suplementado con NECA, CGS21680 o CPA y con
los antagonistas MRS1754, ZM241385 y DPCPX. Las concentraciones utilizadas
para este experimento son las descritas en la Tabla I. Luego de 24 horas de
tratamiento se extrajeron las proteínas totales de cada experimento y fueron
cuantificadas con el método descrito en la sección 3.2.9. Posteriormente las
proteínas fueron separadas por electroforesis SDS-PAGE en gel de poliacrilamida
al 10% y electrotransferidas a membranas de nitrocelulosa, según lo descrito en la
sección 3.2.11.
Las membranas fueron procesadas para la detección inmunológica
utilizando anticuerpo policlonal anti-podocina (dilución 1:1000) y anticuerpo
policlonal anti- nefrina (dilución 1:500) como se describe en la sección 3.2.12,
esperando un tamaño de 42 kDa para podocina, 180 kDa para nefrina y un
tamaño de 42 kDa para β-actina. La semicuantificación consistió en comparar la
señal de podocina y nefrina en los diferentes tratamientos con la señal de los
controles. Como referencia de carga y de expresión constitutiva se utilizó la señal
de β actina.
64
En la figura 13 se evalúa el contenido de podocina en glomérulos renales
de ratas normales y el efecto de los moduladores farmacológicos específicos de
estos receptores de adenosina. Se observa que no se produce una variación
significativa con respecto al control en la expresión de podocina al utilizar los
moduladores farmacológicos para los receptores de adenosina en glomérulos
renales de ratas normales. Sin embargo, hubo una variación no significativa
evidente del 87% con respecto al control, que se produjo en el tratamiento con
NECA, agonista no selectivo de los receptores de adenosina.
En la figura 14 se evalúa el contenido de podocina en glomérulos renales
de ratas diabéticas y el efecto de los moduladores farmacológicos específicos de
estos receptores de adenosina. Se observa que se produce una variación
estadísticamente significativa con respecto al control en la expresión de podocina
al utilizar los moduladores farmacológicos para los receptores de adenosina. En el
caso del receptor A1 provoca una disminución significativa al utilizar el agonista
selectivo de este receptor. Este efecto parece ser revertido al utilizar en forma
conjunta el agonista y el antagonista del receptor A1. También, hubo una
disminución de la expresión de podocina al utilizar un agonista del receptor A2A
pero no fue estadísticamente significativa. El bloqueo del receptor A2B utilizando
un antagonista de alta selectividad (MRS1754) no recuperó la inhibición de la
expresión de podocina mediada por el agonista general NECA.
En la figura 15 se observa la correlación entre los valores del contenido de
podocina en glomérulos renales de ratas normales y diabéticas y el efecto de los
moduladores farmacológicos específicos de estos receptores de adenosina.
65
Podocina
Actina
0
100
200
300
400
Tratamientos
% C
ontr
ol
Control NECA CGS CPA N+MRS1754 CGS+ZM CPA+DPCPX
66
Figura 13: Efecto de los moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina sobre la expresión de podocina en glomérulos de ratas normales.
Los glomérulos (∼104) fueron incubados en medio HAM-F10 suplementado con
NECA (1 μM), CGS21680 (10 nM), CPA (30 nM), MRS1754 (50 nM), ZM241385
(10 nM) y DPCPX (30 nM) por 24 horas. Los extractos proteicos fueron
fraccionados electroforéticamente en SDS-PAGE al 10% y transferidas a
membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo anti-
podocina (1:1000) y reveladas por el método ECL. El gráfico representa el
promedio de la relación podocina/β-actina y la desviación estándar (n=4). P valor =
0.1, no existe diferencia significativa según análisis t-student.
67
Podocina
Actina
0
20
40
60
80
100
120
Tratamientos
Control NECA CGS CPA N+MRS1754 CGS+ZM CPA+DPCPX
% C
ontrol
***** ***
68
Figura 14: Efecto de los moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina sobre la expresión de podocina en glomérulos de ratas
diabéticas. Los glomérulos (∼104) fueron incubados en medio HAM-F10
suplementado con NECA (1 μM), CGS21680 (10 nM), CPA (30 nM), MRS1754 (50
nM), ZM241385 (10 nM) y DPCPX (30 nM) por 24 horas. Los extractos proteicos
fueron fraccionados electroforéticamente en SDS-PAGE al 10% y transferidas a
membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo anti-
podocina (1:1000) y reveladas por el método ECL. El gráfico representa el
promedio de la relación podocina/β-actina y la desviación estándar (n=4). ***
P<0.01 y * P<0.05, existe diferencia significativa según análisis t-student.
69
Tratamientos
% C
ontr
ol
0
100
200
300
400
Normal Diabético
Control NECA CGS CPA N+MRS1754 CGS+ZM CPA+DPCPX
* **** ***
FIG 15: Correlación entre los valores del efecto de los moduladores
farmacológicos de los receptores de adenosina sobre la expresión de
podocina en glomérulos de ratas normales y diabéticas.
70
En la figura 16 se evalúa el contenido de nefrina en glomérulos renales de
ratas normales y el efecto de los moduladores farmacológicos específicos de estos
receptores de adenosina. Se observa que se produce una disminución significativa
con respecto al control en la expresión de nefrina al utilizar los moduladores
farmacológicos para los receptores de adenosina en glomérulos renales de ratas
normales. Aparentemente, los receptores de adenosina A1 y A2A serían
responsables de disminuir la expresión de nefrina ya que se observa un claro
efecto al utilizar los agonistas de alta selectividad CPA y CGS21680,
respectivamente. Debido a que el agonista general NECA no provoca una
disminución en la expresión de nefrina, nos sugiere que también habría receptores
de adenosina que mantienen los niveles de esta proteína. Tal caso podría ser el
receptor A2B, ya que al bloquearlo con una antagonista de alta selectividad se
potencia el efecto de NECA sobre los receptores de adenosina que disminuyen la
expresión de nefrina.
En la figura 17 se evalúa el contenido de nefrina en glomérulos renales de
ratas diabéticas y el efecto de los moduladores farmacológicos específicos de
estos receptores de adenosina. Aparentemente, no existe un efecto significativo
de los receptores de adenosina sobre la expresión de nefrina.
En la figura 18 se observa la correlación entre los valores del contenido de
nefrina en glomérulos renales de ratas normales y diabéticas y el efecto de los
moduladores farmacológicos específicos de estos receptores de adenosina.
71
Nefrina
Actina
0
20
40
60
80
100
120
Tratamientos
Control NECA CGS CPA N+MRS1754 CGS+ZM CPA+DPCPX
% C
ontr
ol
*
***
****
72
Figura 16: Efecto de los moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina sobre la expresión de nefrina en glomérulos de ratas normales.
Los glomérulos (∼104) fueron incubados en medio HAM-F10 suplementado con
NECA (1 μM), CGS21680 (10 nM), CPA (30 nM), MRS1754 (50 nM), ZM241385
(10 nM) y DPCPX (30 nM) por 24 horas. Los extractos proteicos fueron
fraccionados electroforéticamente en SDS-PAGE al 10% y transferidas a
membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo anti-
nefrina (1:500) y reveladas por el método ECL. El gráfico representa el promedio
de la relación nefrina/β-actina y la desviación estándar (n=4). *** P<0.01 y *
P<0.05, existe diferencia significativa según análisis t-student.
73
Nefrina
Actina
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Tratamientos
Control NECA CGS CPA N+MRS1754 CGS+ZM CPA+DPCPX
% C
ontr
ol
**
74
Figura 17: Efecto de los moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina sobre la expresión de nefrina en glomérulos de ratas diabéticas.
Los glomérulos (∼104) fueron incubados en medio HAM-F10 suplementado con
NECA (1 μM), CGS21680 (10 nM), CPA (30 nM), MRS1754 (50 nM), ZM241385
(10 nM) y DPCPX (30 nM) por 24 horas. Los extractos proteicos fueron
fraccionados electroforéticamente en SDS-PAGE al 10% y transferidas a
membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo anti-
nefrina (1:500) y reveladas por el método ECL. El gráfico representa el promedio
de la relación nefrina/β-actina y la desviación estándar (n=4). * P<0.05, existe
diferencia significativa según análisis t-student.
75
0
20
40
60
80
100
120
140
160
NormalDiabético
Tratamientos
Control NECA CGS CPA N+MRS1754 CGS+ZM CPA+DPCPX
% C
ontr
ol
* * ****
****
FIG 18: Correlación entre los valores del efecto de los moduladores
farmacológicos de los receptores de adenosina sobre la expresión de nefrina
en glomérulos de ratas normales y diabéticas.
76
5. Discusión.
La diabetes fue por mucho tiempo considerada como una enfermedad poco
relevante para la salud mundial, pero que actualmente se está transformando en
un grave problema de salud y socioeconómico (Zimmet 2000). La diabetes mellitus
(DM) es un grupo heterogéneo de desórdenes caracterizada por altos niveles de
glucosa sanguínea (WHO 1999). La célula β del páncreas y su producto de
secreción insulina son los factores centrales en la patofisiología de la DM. En Chile
es de alta prevalencia, alrededor de un 5-6% y de creciente incidencia por los
cambios de hábitos de vida de nuestra sociedad, que llevan a mayor sedentarismo
y obesidad (García de los Ríos et al.2002; Mella et al.1981).
Las complicaciones crónicas de la DM se asocian a disfunción micro y
macrovascular, afectando a distintos órganos y partes del organismo (Brownlee
2005). La diabetes crónica produce daño renal, siendo la nefropatía diabética (ND)
una de las enfermedades renales más devastadoras (Bloomgarden 2005).
Microalbuminuria es el principal factor de riesgo e indicador del declinamiento de
la función renal en nefropatía diabética (Mogensen et al.1984) y se ha pensado en
ser el primer paso de una progresión inevitable a proteinuria progresiva y falla
renal (Viberti et al.1982; Mogensen et al.1984).
La barrera de filtración glomerular está compuesta por endotelio capilar,
membrana basal glomerular y las células viscerales epiteliales, podocitos, cuyos
77
pedicelos se localizan en la exterior de la barrera de filtración (Pätäri et al. 2003).
Los podocitos son importantes para el mantenimiento de la función de la barrera
de filtración (Mundel & Shankland 2002). Este diafragma de filtración es
responsable de impedir el paso de macromoléculas a través de una estructura que
une la membrana plasmática de los podocitos (Figura 1).
La ranura del diafragma y sus proteínas asociadas son una estructura
compleja y altamente dinámica, formada por diferentes clases de proteínas, que
interactúan unas con otras y con el citoesqueleto del podocito. Evidencias que han
sido presentadas, muestran a la ranura del diafragma no soló como una barrera de
filtración física, si no también participa en algunas vías de señalizaciones
necesarias para el mantenimiento de la integridad funcional del podocito. Se ha
propuesto que nefrina junto con podocina y CD2AP, inducen la activación de AKT,
la cual es asociada con una fuerte inhibición de apoptosis en los podocitos (Huber
et al. 2003).
Moléculas claves de la ranura del diafragma del podocito son críticas en el
mantenimiento de la barrera de filtración del riñón y evitan la pérdida de proteínas
en la orina. Uno de los componentes fundamentales de esta barrera de filtración
glomerular es la nefrina, de manera que si se inhibe su acción mediante
anticuerpos antinefrina, la estructura persiste, pero se altera la filtración (Doublier
et al.2001). Esta parece ser una molécula específica del podocito dentro del riñón,
la cual ha sido localizada en la ranura del diafragma intracelularmente por
microscopia electrónica (Kestila et al.1998; Holzman et al.1999), y la posibilidad de
su expresión extracelular también ha sido postulada (Holthofer et al.1999).
Estudios hechos con análisis de Western blot, demuestran que nefrina posee un
78
peso molecular de aproximadamente 180 Kda (Patari et al.2003).
La nefrina participaría en la patogenia de enfermedades glomerulares
adquiridas que llevan a proteinuria (Doublier et al.2001). Se ha demostrado por
experimentos de Western blot y RT-PCR que existe una disminución en la
expresión de proteína y mRNA de nefrina en ratas diabéticas inducidas por
estreptozotocina (Bonnet et al.2001). Inyección de anticuerpo monoclonal 5-1-6,
actúa contra el dominio extracelular de nefrina de rata, causando proteinuria
severa en los primeros días después de la inyección (Orikasa et al.1988).
Además, ratones deficientes de nefrina desarrollan una dramática
proteinuria (Rantanen et al.2002). Se ha mostrado que la carencia de nefrina guía
a una completa ausencia de una ranura del diafragma normal (Ruotsalainen et
al.1999; Tryggvasonn.1999). Recientemente se ha revelado que la activación de
PKCα puede ser una importante vía de señalización intracelular en la regulación
de la expresión de nefrina y de la permeabilidad glomerular en estados diabéticos
(Menne et al.2006).
Otro componente fundamental en la barrera de filtración glomerular es la
podocina, la cual fue identificada en el síndrome nefrótico autosomal recesivo
resistente a esteroides (Boute et al. 2000). El dominio estructural de podocina es
altamente conservado entre humanos, rata y ratón. Podocina presenta similitudes
con proteínas de la familia estomatinas las cuales son proteínas de
transmembrana, implicadas en el andamiaje del citoesqueleto (Salzer et al.2001) y
es considerada por tener una función molecular similar (Boute et al. 2001).
También una depleción de podocina sigue a una pérdida masiva similar de
proteínas (Boute et al. 2000). Además, se ha mostrado que podocina actúa como
79
marcador del factor de transcripción LMX1B, el cual en el riñón es expresado
exclusivamente en podocitos y es esencial para el desarrollo y diferenciación
glomerular y se une al gen que codifica para podocina (Rohr et al.2002).
Algunos estudios hechos por análisis de pull-down han mostrado que
nefrina interactúa con podocina (Schwarz et al.2001; Huber et al.2001) y CD2AP
(Huber et al.2003), nefrina vía CD2AP interactúa directamente con el citoesqueleto
de actina, y se ha demostrado que un alteración de nefrina resulta en una
alteración concomitante de actina (Saleem et al. 2002). Otros estudios han
mostrado que podocina juega un rol en el reclutamiento de nefrina dentro del poro
de la ranura del podocito (Huber et al.2003; Ohashi et al.2003). También ha sido
reportado que las señalizaciones inducidas por nefrina son aumentadas por
podocina (Huber et al.2001; Ohashi et al.2003). Se ha estudiado que VEGF
estimula la fosforilación de nefrina, y reduce la apoptosis posiblemente por una vía
mediada por nefrina (Foster et al.2004) y últimamente se ha mostrado que
fosforilación de Y1204 en nefrina es ligado directamente a la señalización de Ca2+
vía unión a PLC-y1 (Harita et al.2009). Además, se ha mostrado que nefrina y
podocina se asocian a balsas lipídicas (Schwarz et al.2000). Además, utilizando
knockdown de podocina, se demostró que concomitantemente disminuye la
expresión de nefrina y cambia la redistribución de nefrina y podocina en los
podocitos (Fan et al. 2004). Estos estudios indican que la interacción de estas
moléculas asociadas a la ranura del diafragma es esencial para el mantenimiento
de la barrera.
El modelo utilizado en este trabajo es inducido por inyección intravenosa de
estreptozotocina (STZ), la cual posee efectos tóxicos sobre las células β del
80
páncreas. Este modelo ha sido ampliamente estudiado y muestra la mayoría de
las características funcionales y estructurales de ND (Kelly et al. 2000). Entre
éstas, se incluyen aumento de la tasa de filtración glomerular, albuminuria y
cambios ultraestructurales glomerulares como hipertrofia glomerular, expansión
mesangial y engrosamiento de la membrana basal (Cooper, 2001). En el modelo
de diabetes tipo 1 estandarizada en el laboratorio pudimos demostrar mediante
inmunohistoquímica una disminución de la expresión de podocina a los 21 días
desde la inducción de la diabetes, pero no se evidencia una disminución relevante
de la expresión de nefrina. Esta disminución se produjo principalmente en los
glomérulos. Este resultado es concordante con los obtenidos para podocina en
enfermedades de riñón humanas, donde se observó que la cantidad de estas
proteínas está disminuida en nefropatía de cambios mínimos, esclerosis focal,
nefropatía lúpica clase V, nefropatía membranosa y nefropatía diabética (Koop et
al. 2003). Al contrario, nosotros creemos que el plazo de diabetes experimental
utilizado no fue suficiente para ver disminución en el contenido de nefrina. En base
a esto, postulamos que la diabetes tiene un efecto primario sobre la expresión de
podocina lo cual posteriormente conllevará a la pérdida de nefrina.
En nuestro laboratorio se ha demostrado que el contenido de adenosina
extracelular aumenta, producto de la diabetes experimental. En glomérulos
purificados de ratas diabéticas de 15 días la acumulación de adenosina
extracelular fue seis veces mayor comparado a los glomérulos de ratas normales.
Este efecto se debió a una menor actividad del transportador equilibrativo de
nucleósidos 1 (ENT1), responsable de captar la adenosina para ser metabolizada
intracelularmente. Además, el ATP liberado por las células glomerulares fue
81
metabolizado más eficientemente a adenosina (Roa et al. 2009). Estos hallazgos
proponen un probable papel patogénico de adenosina debido a alteraciones en la
señalización a través de sus receptores.
Se han identificado cuatro subtipos de receptores de adenosina A1, A2A, A2B
y A3 con distintas afinidades por adenosina (Fredholm et al. 2001). Además, los
receptores se pueden diferenciar por su mecanismo de transducción de señales:
los receptores A1 y A3 interactúan con proteína Gi/o y los receptores A2A y A2B
estimulan adenilato ciclasa vía proteína Gs (Fredholm et al. 2000). Se han
diseñados varios moduladores farmacológicos para los receptores de adenosina
que son altamente selectivos y potentes (Fredholm et al. 2001). Estos compuestos
han sido herramientas de gran importancia en la caracterización de los receptores
y las distintas funciones que cumplen. Existe una gran variedad de agonistas para
los subtipos de receptores A1, A2A y A3, pero no se ha podido diseñar un agonista
selectivo para el receptor A2B (Jacobson & Gao 2006). Esto se debe
principalmente a su baja afinidad por adenosina comparado con los otros
receptores (Jacobson & Gao 2006).
Receptores de adenosina A1 son requeridos para efectos diuréticos y
natriuréticos atribuidos a metil xantinas (Rieg et al. 2005). La estimulación del
receptor de adenosina A1 produce la vasoconstricción de la arteriola aferente, esto
en respuesta a un incremento en la entrega de NaCl a la mácula densa (Sun et
al.2001). Bloqueo del receptor de adenosina A1 produce un aumento en la tasa de
filtración glomerular (Brown et al.2001) y ejercen un efecto inhibitorio directo en la
reabsorción de Na+ en el túbulo proximal (Van Buren et al.1993).
Análisis de inmunohistoquimica revelan que los niveles del receptor A2A
82
incrementan significativamente en el glomérulo y en arterias preglomerulares
renales además que en vasos postglomerulares sólo son visibles modestos
incrementos en la densidad del receptor A2A. Se ha demostrado que las potencias
relativas de los agonistas CGS21680 y NECA son usados como referencia para
diferenciar los receptores A2A de A2B (Gurden et al.1993). Previamente, en un
modelo de nefropatía diabética inducida por STZ, se demostró que un agonista del
receptor A2A, ATL146e, sigue a una marcada reversión de la lesión (Awad et
al.2006). La inducción de proteinuria con STZ fue marcadamente reducida por
ATL146e, un efecto que fue asociado con la preservación de la tasa de filtración
glomerular y la estructura glomerular. Asimismo, se ha demostrado que los
reducidos niveles de mRNA de nefrina y podocina después de la inyección de
STZ, es completamente restaurado con el tratamiento de agonistas del receptor
A2A (Awad et al.2006).
Se han encontrado bajos niveles de expresión de mRNA del receptor en
A2B el riñón (Weaver et al.1992). Estudios en nuestro laboratorio relacionan la
localización del receptor de adenosina A2B en podocitos de glomérulos de rata y el
papel funcional que este tiene sobre la producción de VEGF. Se determinó que el
aumento en la expresión de VEGF en glomérulos expuestos a altas
concentraciones de glucosa es completamente dependiente de la actividad del
receptor de adenosina A2B, debido a que el aumento en el contenido de VEGF fue
bloqueado por el tratamiento con un antagonista de este receptor, MRS1754
(Valladares et al. 2008). Además, este mismo receptor parece tener un rol en
favorecer la liberación del factor transformante beta-1 (TGF-β1) en glomérulos de
ratas diabéticas, lo cual podría favorecer el desarrollo de glomeruloesclerosis (Roa
83
et al. 2009).
Se ha demostrado que estimulación del receptor A3 en células musculares
lisas de la vasculatura disminuye los niveles de cAMP (Zhao et al.1997). Se ha
hecho difícil asegurar el impacto de cambios de la distribución del receptor A3
sobre el riñón diabético, ya que la función de este receptor en el riñón no ha sido
bien aclarada.
En el presente trabajo determinamos que la activación de los receptores de
adenosina, mediante moduladores farmacológicos específicos, pueden modificar
la producción de nefrina y podocina en glomérulos renales de ratas, tanto
normales como diabéticas, ex vivo.
En el laboratorio se hicieron experimentos de PCR tiempo real para ver el
contenido de transcrito de podocina y nefrina en ratas normales como diabéticas,
utilizando los diferentes moduladores farmacológicos de los receptores de
adenosina. Evaluamos el contenido del transcrito de podocina en glomérulos
renales de ratas normales y diabéticas y el efecto de los moduladores
farmacológicos específicos de estos receptores de adenosina. En ratas normales
se observó que se produce una disminución con respecto al control en la
expresión de podocina al utilizar el agonista general NECA y selectivo para el
receptor A2B en glomérulos renales de ratas normales el cual disminuye un 48%
respecto al control. Sin embargo, estas diferencias no son estadísticamente
significativas debido al bajo número de muestras. En ratas diabéticas, se observó
que se produce una disminución con respecto al control en la expresión de
podocina al utilizar el agonista general NECA y el selectivo para el receptor A1
(CPA). Esta tendencia aunque no es estadísticamente significativa, se
84
correlaciona con el efecto del receptor A1 en disminuir el contenido de proteína
podocina en los glomérulos de ratas diabéticas. Al contrario, el tratamiento con el
agonista del receptor A3 (MECA) aumenta el contenido de transcritos de podocina
un 91% con respecto al control.
Además, mediante PCR tiempo real evaluamos el contenido del transcrito
de nefrina en glomérulos renales de ratas normales y diabéticas y el efecto que
tendrían los moduladores farmacológicos específicos de estos receptores de
adenosina. En ratas normales, se observó que no se produce una variación
significativa con respecto al control en la expresión de nefrina al utilizar los
moduladores farmacológicos para los receptores de adenosina en glomérulos
renales de ratas normales, sin embargo la variación no significativa más evidente
es el aumento del contenido de nefrina al utilizar el agonista selectivo del receptor
A3 (MECA). En el caso de ratas diabéticas se observó que no se produce una
variación significativa con respecto al control. Sin embargo la variación no
significativa más evidente es el fuerte aumento en el contenido del transcrito de
nefrina al utilizar moduladores farmacológicos para el receptor A3. El tratamiento
con el agonista MECA aumenta sobre un 794% respecto al control.
Mediante análisis hechos por Western blot en el laboratorio, evaluamos el
contenido de podocina en glomérulos renales de ratas normales y diabéticas y el
efecto que tendrían los moduladores farmacológicos específicos de estos
receptores de adenosina. En ratas normales se observó que no se produce una
variación significativa con respecto al control en la expresión de podocina al utilizar
los moduladores farmacológicos para los receptores de adenosina en glomérulos
renales de ratas normales. Sin embargo, hubo una variación no significativa
85
evidente del 87% con respecto al control, que se produjo en el tratamiento con
NECA, agonista no selectivo de los receptores de adenosina. En el caso de ratas
diabéticas se observó que se produce una variación estadísticamente significativa
con respecto al control en la expresión de podocina al utilizar los moduladores
farmacológicos para los receptores de adenosina. En el caso del receptor A1
provocó una disminución significativa al utilizar el agonista selectivo de este
receptor. Este efecto parece ser revertido al utilizar en forma conjunta el agonista y
el antagonista del receptor A1. También, hubo una disminución de la expresión de
podocina al utilizar un agonista del receptor A2A pero no fue estadísticamente
significativa. El bloqueo del receptor A2B utilizando un antagonista de alta
selectividad (MRS1754) no recuperó la inhibición de la expresión de podocina
mediada por el agonista general NECA.
Además, mediante Western blot evaluamos el contenido de nefrina en
glomérulos renales de ratas normales y diabéticas y el efecto que tendrían los
moduladores farmacológicos específicos de estos receptores de adenosina. En
ratas normales se observó que se produce una disminución significativa con
respecto al control en la expresión de nefrina al utilizar los moduladores
farmacológicos para los receptores de adenosina en glomérulos renales de ratas
normales. Aparentemente, los receptores de adenosina A1 y A2A serían
responsables de disminuir la expresión de nefrina ya que se observó un claro
efecto al utilizar los agonistas de alta selectividad CPA y CGS21680,
respectivamente. Debido a que el agonista general NECA no provoca una
disminución en la expresión de nefrina, nos sugiere que habría también receptores
de adenosina que mantienen los niveles de esta proteína. Tal caso podría ser el
86
receptor A2B, ya que al bloquearlo con una antagonista de alta selectividad se
potencia el efecto de NECA sobre los receptores de adenosina que disminuyen la
expresión de nefrina. En el caso de ratas diabéticas se observó que no existe un
efecto significativo de los receptores de adenosina sobre la expresión de nefrina.
En conclusión, este trabajo estableció el efecto de la activación de los
receptores adenosina sobre la expresión y secreción de podocina y nefrina en
glomérulos renales. Donde el aumento de la biodisponibilidad de adenosina en los
glomérulos renales podría favorecer la actividad de los receptores de adenosina
A1, con lo cual se obtendría una disminución de la expresión de podocina y la
progresiva pérdida de la función de la barrera de filtración, ya que podocina al
disminuir su expresión no puede interactuar con nefrina lo que provoca una
pérdida de los procesos pedicelares, esto dado en estudios donde la disminución
de la expresión de podocina sigue a la reducción de nefrina en el desarrollo de
protenuria en ratas diabéticas (Guan et al. 2004).
Estos efectos estarían relacionados con alteraciones tempranas de la
nefropatía diabética. Lo que permitiría postular el uso de agonistas y/o
antagonistas de los receptores de adenosina como futuros tratamientos para
prevenir, retardar y/o revertir la nefropatía diabética.
87
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