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PROGETTO “DNA chiavi in mano”
“Le Biotecnologie in classe e in laboratorio” – 11/03/2015 – Prof.ssa Paola Cazzani – I.T.E. “A. Bassi”- Lodi
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PROGETTO “DNA chiavi in mano”
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IFOM
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PROGETTO “DNA chiavi in mano”
Finalita’
Stimolare la conoscenza
scientifica in campo
biologico privilegiando
l’approccio laboratoriale
Stimolare l’interesse
per le Biotecnologie e
per i risvolti bioetici
Attuare azioni di
orientamento per gli
studenti delle classi
quarte e quinte.
Offrire un’opportunità
di aggiornamento teorico
e pratico agli studenti del
triennio
Avvicinare mondo della
ricerca e mondo della
scuola
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Laboratorio
Didattico IFOM
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VORTEX
per miscelare
TERMOCICLATORE
per amplificare sequenze
di DNA
CELLA ELETTROFORETICA
e GENERATORE DI CORRENTE
per la corsa elettroforetica
MICROPIPETTE
per prelevare
TRANSILLUMINATORE
per visualizzare il DNA su
gel di agarosio
MICROCENTRIFUGA
per separare componenti
I NOSTRI
STRUMENTI
FORNO MICROONDE
per riscaldare
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Al lavoro nel nostro laboratorio
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PROGETTO “DNA chiavi in mano”
Attività laboratoriale
Apertura del
laboratorio ad altre
scuole
Extracurricolare
Corsi di
potenziamento
Curricolare
Interna
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Protocolli sperimentali
• ESTRAZIONE DI gDNA DALLA MUCOSA BOCCALE
• DIGESTIONE ENZIMATICA DI DNA VIRALE
• VISUALIZZAZIONE DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE TRAMITE
CORSA ELETTROFORETICA
• AMPLIFICAZIONE DI UNA SEQUENZA DI DNA TRAMITE PCR
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La tecnica ci permetterà di evidenziare il DNA utilizzando
- la forza di un campo elettrico
- il “supporto” di un gel di agarosio
ELETTROFORESI
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GEL di AGAROSIO
L'agarosio è un polimero naturale di galattosio e 3,6 anidro-galattosio.
Viene sciolto in opportuno tampone (TBE o TAE) e fatto gelificare su un supporto
di vetro o di plastica.
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Versa l’agarosio nel TAE Scalda
Inserisci il pettine Versa l’agarosio nella slitta
Ecco cosa fare…...
Aggiungi il Sybr Safe
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La separazione del DNA
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DNA (carico -) Polo Negativo Polo Positivo
Pozzetto
(dove carichiamo il DNA)
Gel di agarosio
Tampone di corsa TAE
(Tris Acetato EDTA)
Il campo elettrico
TAE: il Tris consente il mantenimento di un valore costante
di pH della soluzione; l’acido Acetico fornisce l’appropriata forza
ionica al tampone; l’ EDTA chela i cationi bivalenti,
come il magnesio ( la maggior parte delle nucleasi richiede
cationi bivalenti per funzionare).
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ELETTROFORESI
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ELETTROFORESI
ELETTROFORESI
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BPB e XC
E' possibile visualizzare la corsa elettroforetica grazie a
coloranti inerti:
- Blu di bromofenolo
- Xilene cianolo
che si muovono nel campo elettrico come molecole a PM
noto, in relazione alla concentrazione del gel.
1%
BPB 300 bp
XC 4.000 bp
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Il Syber Safe
Il DNA viene visualizzato nel gel usando
un intercalante, il Sybr Safe, che emette
luce verde sotto illuminazione con luce blu
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Le bande di DNA
Una banda rappresenta un’area occupata da una popolazione di
molecole distinguibile da un’altra area.
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Carica i campioni
Inizia la corsa Osserva il gel
Ecco cosa fare…...
Aggiungi il Loading Dye
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Protocolli sperimentali
• ESTRAZIONE DI gDNA DALLA MUCOSA BOCCALE
• DIGESTIONE ENZIMATICA DI DNA VIRALE
• VISUALIZZAZIONE DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE TRAMITE
CORSA ELETTROFORETICA
• AMPLIFICAZIONE DI UNA SEQUENZA DI DNA TRAMITE PCR
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Immergi lo spazzolino nella
provetta sterile
Raschia l’interno della guancia
sinistra con l’apposito spazzolino per 2
minuti
Lascia in incubazione a
100°C per 10 minuti
Aggiungi 20 m
L della
soluzione B
Raschia l’interno della guancia
destra con l’apposito spazzolino
per 2 minuti
Trasferisci 200 m L di
surnatannte in una
nuova provetta
contenente 300 m L di
isopropanolo freddo
ECCO IL
TUO DNA!!
Osserva, poi miscela
delicatamente per
inversione e osserva
nuovamente
Trasferisci in una
provetta sterile
200 m L della
soluzione A
Estrazione del DNA da cellule della mucosa boccale
Miscela con il
vortex e
centrifuga
Miscela con il
vortex
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Protocolli sperimentali
• ESTRAZIONE DI gDNA DALLA MUCOSA BOCCALE
• DIGESTIONE ENZIMATICA DI DNA VIRALE
• VISUALIZZAZIONE DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE TRAMITE
CORSA ELETTROFORETICA
• AMPLIFICAZIONE DI UNA SEQUENZA DI DNA TRAMITE PCR
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Digestione enzimatica ed
elettroforesi
Digestione enzimatica del DNA del Fago Lambda
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Corsa elettroforetica dei frammenti di
restrizione
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Protocolli sperimentali
• ESTRAZIONE DI gDNA DALLA MUCOSA BOCCALE
• DIGESTIONE ENZIMATICA DI DNA VIRALE
• VISUALIZZAZIONE DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE TRAMITE
CORSA ELETTROFORETICA
• AMPLIFICAZIONE DI UNA SEQUENZA DI DNA
TRAMITE PCR
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La PCR (Polymerase Chain Reaction)
• fu inventata nel 1983 da Mullis
• permette di amplificare una sequenza di DNA (un gene o parte
di esso) in vitro, cioe’ in una provetta, aggiungendo una serie di
reagenti e utilizzando un termociclatore
http http://www.youtube.com/watch?v=JRAA4C2OPwg
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Che cosa serve per fare una PCR?
DNA che funge da “stampo”
Nucleotidi precursori (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Buffer o Tampone di reazione (fornisce la giusta concentrazione
di Sali, tra cui il Magnesio Cloruro e il giusto pH)
Primers Forward e Reverse
DNA polimerasi, enzima che utilizza i nucleotidi precursori
per copiare un DNA “stampo” e generarne nuove copie
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• DNA : porzione del gene umano SRY
• Primers: 5’ GAATATTCCCGCTCTCCGGA 3’
5’ GCTGGTGCTCCATTCTTGAG 3’
• Taq polimerasi
La nostra reazione di PCR
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La “nostra” PCR
Denaturazione (94°C)
Appaiamento dei primer (57°C)
Polimerizzazione da parte della DNA
polimerasi (72°C)
Il termociclatore effettua 35 cicli di
Denaturazione-Appaiamento-Polimerizzazione
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Il gene SRY
National Center for biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
FONTE UTILIZZATA:
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Questo gene privo di introni codifica un fattore di trascrizione che è il “fattore di
determinazione testicolare” (TDF testis determining factor), che inizia la
determinazione sessuale maschile.
Mutazioni in questo gene danno origine a individui femminili XY con disgenesi
gonadica (sindrome di Swyer); traslocazioni di parte del cromosoma Y contenete
questo gene sul cromosoma X causa individui maschili XX
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Dopo la corsa elettroforetica….
Controllo positivo
Banda negativa
Banda positiva
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Colleghe e Colleghi,
che ne pensate?
Vi interessa il nostro progetto?
Contattatemi!