Program postgraduálního kurzu Pokroky v neurovědách 2013 Semináře začínají vždy v 9:00 hod.

28. února 2013 – čtvrtekModerní pohledy na neuroanatomii a její metodikyprof. MUDr. P. Petrovický, DrSc. a prof. MUDr. M. Grim, DrSc.Anatomický ústav 1. lékařské fakulty UK, U Nemocnice 3, Praha 2, Velká posluchárna Anatomického ústavu - přízemítel.: 22496 5780

Koordinátor kursu: Prof. MUDr. J. Syka, DrSc.Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i., Vídeňská 1083, Praha 4 – Krč. tel.: 24106 2700Informace: I. Kolářová, tel. 24106 2218

1. Molekulárně biologické aspekty vývoje nervového systému

Miloš GrimMiloš GrimAnatomický ústav 1. LF UK v PrazeAnatomický ústav 1. LF UK v Praze

čtvrtek 28. února 2013čtvrtek 28. února 2013

Vývoj CNS a neurální lišty- úloha genů, struktura perif. nervů, Struktura autonomnmích nervů, Sensorické receptory

Molekulárně biologické aspekty vývoje nervového systému

Nervový systém vzniká ze tří neuroektodermových embryonálních základů: a) z mozkových váčků a neurální trubice se vyvíjí mozek a mícha, b) z neurální lišty vzniká periferní nervový systém. c) z neurogenních epidermových plakod vznikají smyslové buňky a neurony některých ganglií hlavových nervů

Vývoj nervového systému zahrnuje indukci, proliferaci, migraci, diferenciaci i apoptosu buněk podobně jako v jiných orgánových systémech a k tomu navíc specifický proces integrace neuronů do okruhů propojených synapsemi

NeurulaceViditelným projevem indukce neuroektodermu je vznik neurální ploténky. Buňky neurální ploténky intensivně proliferují a ploténka se vchlipuje a prohlubuje v neurální rýhu. Její okraje jsou vyzdviženy a tvoří neurální valy, které se k sobě postupně přibližují a uvolňují se ze spojení s ektodermem za vzniku neurální lišty, která je tvořena buňkami na přechodu valů do ektodermu. Spojením valů ve střední čáře se vytváří neurální trubice. .

Nervový systém se vyvíjí z ektodermu. Neurogenesu řídí induktivní signály. Nervovou ploténku indukuje SHH z mesodermu chordy a BMP z přilehlého ektodermu.Determinace nervové trubice probíhá ve třech osách (dorsoventrální, mediolaterální a rostrokaudální).V dorsoventrální ose se uplatňuje SHH signalisace ze spodinové ploténky a BMP signalisace ze stropové ploténky. Mediolaterální determinace motoneuronů v míše je pod vlivem exprese LIM kódu. Determinace nervové trubice v rostrokaudální ose: Rhombencephalon je organisován v segmentových jednotkách (rhombomerách), jejichž identitu určuje exprese Hox genů. V mesencephalu a telencephalu byla identifikována tři signalizační centra (MMB-, mesencephalic-metencephalic border, P2/P3, ANR- anterior neural ridge), která produkuji signální molekuly FGF-8, SHH a WNT-1, jejichž koncentrace podmiňuje expresi celé řady transkripčních faktorů, které determinují identitu struktur mesencephala a prosomer telencephala. Např. v expresní oblasti Gbx2 – vzniká cerebellum, v expresní doméně OTX2 vzniká optické tectum, exprese FOXG1 je charakteristická pro oblast telencephala. Regionální diferenciace kortexu závisí na aferentních vstupech a vnitřnímu programu příslušných buněk.

Neurogenní diferenciaci navozují diferenciační faktory, např neurogenin a neuroD. Mechanismus laterální inhibice rozhoduje o tom, zda půjde o neuron nebo gliovou buňku. Buď se zvýší hladina neurogeninu a bude se diferencovat neuron, nebo se jeho hladina sníží a bude se diferencovat glie. Glie: plasmatické asatrocyty (typ 1) se diferencuji jako prvé a secernují faktor, který stimuluje druhý typ prekurzorové buňky, ze které se diferencují fibrilární astrocyty (typ 2) a oligodendrocyty. Neurotrofní růstové faktory (NGF, BDNF, NT3, NT4) jsou syntetisovány v periferních tkáních a jejich tyrosin kinasové receptory (TrkA,. TrkB, TrkC, p75) jsou exprimovány na neuronech. Uplatňují se za vývoje při vytváření rovnováhy mezi počtem neuropnů a velikostí cílové struktury. V dospělosti udržují diferencovaný stav. Např. úroveň nocicepce je závislá na NGF/TrkA signalisaci. Proprioceptivní neurony vyžadují NT3/TrkC signalisaci.

Cell lineages in the developing central nervous system. (Based on Cameron R, Rakic P: Glial cell lineage in the cerebral cortex: a review and synthesis,

Glia 4:124-127, 1991.)

Downloaded from: StudentConsult (on 11 January 2013 02:02 PM)

Figure 11-11 The hindbrain of a live 3-day chick embryo (left), showing segmentation (rhombomeres). On the right is a whole mount of a similar area stained for neurofilament protein, showing darkly stained immature neurons running along the rhombomere borders. (From Lumsden A: Mech Dev 121:1081-1088, 2004.)

© 2005 Elsevier

Neuromery: projevem kraniokaudálního členění neurální trubice je vznik neuromer. V předním mozku je segmentace v prosomery pouze naznačena, kdežto v oblasti rhombencephala jsou neuromery patrné jako skutečné podjednotky, rhombomery

SHHSHH FGF- 8FGF- 8WNT-1WNT-1

ANRMMB

Organizační centra mozku a jejich signální molekuly

segmenty embryonálního mozkur1 – r8 = rhombomeryP1 – P6 = prosomery

P2/P3

Figure 11-9 Dorsal and ventral signaling in the early central nervous system. A, Signals from sonic hedgehog (Shh) (orange arrows) in the notochord induce the floor plate. B, In the dorsal part of the future neural tube, bone

morphogenetic protein-4 (BMP-4) and BMP-7 (green arrows) from the ectoderm adjacent to the neural tube induce slug in the future neural crest and maintain Pax-3 and Pax-7 expression dorsally. Ventrally, Shh, now

produced by the floor plate, induces motoneurons. C, Shh, produced by the floor plate, suppresses the expression of dorsal Pax genes (Pax-3 and Pax-7) in the ventral half of the neural tube.

Downloaded from: StudentConsult (on 11 January 2013 02:02 PM)© 2005 Elsevier

Indukce a epithelo-mesenchymová transformace Indukce a epithelo-mesenchymová transformace buněk neurální lišty buněk neurální lišty

B.M. Carlson (1999)

HH 10ISH mRNA SlugISH mRNA Slug

© 2005 Elsevier

Kraniokaudální členění neurální trubice

Figure 11-7 Experiments illustrating the influence of the notochord on development of the floor plate and exit sites of nerves from the spinal cord. A, Grafting an extra notochord near the neural tube induces a secondary floor plate. B, In the absence of a notochord, a very incomplete floor

plate forms, and nerve fibers exit from multiple sites around the spinal cord. C, Slitting the neural plate on one side of the floor plate removes the wall of the neural tube from the influence of the

notochord, allowing the disorganized exit of nerve fibers from that part of the spinal cord. (Modified from Hirano S, Fuse S, Sohal GS: Science 251:310-313, 1991.)

Downloaded from: StudentConsult (on 11 January 2013 02:02 PM)

Přechodová zóna mezi CNS a PNS (Obersteiner - Redlichova zóna)

Při výstupu nervových kořenů z CNS vybíhá neurothel arachnoidey do perineurální pochvy. Centrální myelin (z oligodendroglie) je nahrazován periferním myelinem ze Schwannových buněk, a to skokovou změnou vždy v místě Ranvierova zářezu.

Tento přechod se obvykle nachází o něco periferněji, než je makroskopická hranice CNS. Centrální segment je krátký u spinálních nervů. Při výstupu hlavových nervů může být několik mm dlouhý, např. u n. VIII až 26 mm, ale u n. VII jen 1 mm. Až sem také dosahuje gliová hraniční membrána tvořená výběžky astrocytů. Bazální lamina gliové hraniční membrány přechází plynule do bazální laminy jednotlivých periferních nervových vláken.

Z klinického hlediska je významné, že v úseku krytém centrální glií nerv neregeneruje, kdežto v periferním úseku krytém Schwannovými buňkami je regenerace možná.

Schéma somatotopické distribuce motoneuronů Schéma somatotopické distribuce motoneuronů inervujících skupiny svalů horní končetiny a trupu. inervujících skupiny svalů horní končetiny a trupu.

Transversální řez krční míchou.Transversální řez krční míchou.

J.H.Martin: Neuroanatomy,1996

Lurai V, Laufer E: Neural Dev, 2007

Lim1+/+ Lmx1b +/+ Lim1 -/- Lmx1b -/-

Mediolaterální specifikace motoneuronů - LIM kód

Lurai V, Laufer E: Neural Dev, 2007

                       

Rastislav Druga, Miloš Grim, Petr DubovýAnatomie centrálního nervového systémuKoedice GALÉN - KAROLINUM; Praha 2011ISBN Karolinum 978-80-246-1895-1

Sadler Thomas W. Langmanova lékařská embryologie, překlad 10. vydání Grada 2011ISBN:978-80-247-2640-3

Antonin Střížek http://www.ad-astra.cz/data/pr_strizek.htm

W. HisW. His ( (18681868))

2. Neurální lišta – její vývoj, její deriváty2. Neurální lišta – její vývoj, její deriváty

SStrutrukkturturaa této části přednáškytéto části přednášky::

1)1) Proč Proč studstudovat ovat neuralneuralníní lištulištu (N (NLL) ) 2)2) Vznik a vývoj NL (indukce, epithelo- Vznik a vývoj NL (indukce, epithelo-

mesenchymová transformace, migrace, mesenchymová transformace, migrace, diferenciace buněk NLdiferenciace buněk NL

3)3) MethodMethody značení buněk NLy značení buněk NL4)4) Typy buněk, které se z NL diferencujíTypy buněk, které se z NL diferencují 5)5) Vývojové vady podmíněné defekty NLVývojové vady podmíněné defekty NL6)6) Buňky NL v epidermisBuňky NL v epidermis

Proč se věnovat studiu neurální lišty (NL)Proč se věnovat studiu neurální lišty (NL)•• vznik NL umožnil vývoj a rozšíření obratlovců oproti vznik NL umožnil vývoj a rozšíření obratlovců oproti strunatcům, u kterých není vytvořena,strunatcům, u kterých není vytvořena, •• NL je významný embryonální orgán, který přispívá NL je významný embryonální orgán, který přispívá téměř ke všem orgánům těla jako 4. zárodečný list,téměř ke všem orgánům těla jako 4. zárodečný list,•• NL jeNL je model pro studium embryonální indukce, model pro studium embryonální indukce, determinace a diferenciace buněk, jejich epithelo- determinace a diferenciace buněk, jejich epithelo- mesenchymové transformace a migrace,mesenchymové transformace a migrace,•• NL je model pro studium buněčné invasivity především NL je model pro studium buněčné invasivity především vzniku metastás z karcinomů,vzniku metastás z karcinomů,• • klinický význam NL - její defektní vývoj podmiňuje řadu klinický význam NL - její defektní vývoj podmiňuje řadu vrozených vad vrozených vad

Migrace buněk NL Migrace buněk NL in vivoin vivo a a in vitroin vitro

Molekulární mechanizmy diferenciaceMolekulární mechanizmy diferenciace buněk NLbuněk NLDiferenciaci Diferenciaci ovlivňují dvě kategorie molekul: ovlivňují dvě kategorie molekul: a) signální molekuly (cytokiny, růstové faktory, hormony)a) signální molekuly (cytokiny, růstové faktory, hormony)b) transkripční (diferenciační) faktoryb) transkripční (diferenciační) faktory

Molekulární mechanizmy migrace buněk NLMolekulární mechanizmy migrace buněk NLMigraci Migraci ovlivňují tři kategorie molekul:ovlivňují tři kategorie molekul:a)a) permisivní contact-guidancepermisivní contact-guidanceb)b) chemorepelentní molekulychemorepelentní molekulyc) parakrinní signální systémy migracec) parakrinní signální systémy migrace

Signální molekuly na trasách migrace buněk neurální Signální molekuly na trasách migrace buněk neurální lišty indukují expresi transkripčních faktorů a jim lišty indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů: nediferencované multipotentní buňky podřízených genů: nediferencované multipotentní buňky jsou postupně transformovány v sady bipotentních a jsou postupně transformovány v sady bipotentních a unipotentních buněk s lokálně specifickou identitou unipotentních buněk s lokálně specifickou identitou

Diferenciace buněk NL a jejich regionální identitaiferenciace buněk NL a jejich regionální identita

SSignální molekulyignální molekuly působí mezi buňkami působí mezi buňkami a indukují expresi a indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů. Vážou se na transkripčních faktorů a jim podřízených genů. Vážou se na specifické receptory specifické receptory v cytov cytoplazmatické membráněplazmatické membráně. R. Receptoreceptoryy mmajíají nitrobuněčnou složku nitrobuněčnou složku zajišťující zajišťující přenpřenosos signál signáluu do jádra, do jádra, které odpovídá změnou genové expresekteré odpovídá změnou genové exprese

Transkripční faktoryTranskripční faktory jsou proteiny, které jsou proteiny, které působí v jádře působí v jádře jako jako regulregulátory átory genové expresegenové exprese. . Jejich společnou vlastností je Jejich společnou vlastností je schopnost vazby na specifické sekvence DNAschopnost vazby na specifické sekvence DNA - - promotory a promotory a enhanceryenhancery

V embryuV embryu lokální signalizace určují, že určité typy buněk se lokální signalizace určují, že určité typy buněk se diferencují na určitém místě a v určitém časediferencují na určitém místě a v určitém čase

In vitroIn vitro lze lokální embryonální signalizaci nahradit složením lze lokální embryonální signalizaci nahradit složením media - přidáním růstových faktorů a signálních molekul lze cíleně media - přidáním růstových faktorů a signálních molekul lze cíleně navodit proliferaci a určitou diferenciaci buněknavodit proliferaci a určitou diferenciaci buněk

Epigenetic landscape was originally a metaphor for biological development. Its originator, Conrad Hal Waddington (1905-1975) , said that cell fates were established in development much like a marble rolls down to the point of lowest local elevation.

HNK-1tenascin

fibronektin

Molekulární mechanizmy migrace buněk NLMolekulární mechanizmy migrace buněk NL • Permisivní contact-guidance + chemorepelentní molekulyPermisivní contact-guidance + chemorepelentní molekuly

• Scatter factor /c-met receptor, Pax3 Scatter factor /c-met receptor, Pax3 •• Steel factor (stem cell factor) /c-kit receptorSteel factor (stem cell factor) /c-kit receptor•• Chemokin SDF-1 / CXCR4 receptorChemokin SDF-1 / CXCR4 receptor

• Parakrinní signální Parakrinní signální systémy migrace:systémy migrace:

Neurální lišta a periferní nervový systémNeurální lišta a periferní nervový systém HNK-1

Deriváty neurální lišty (na hlavě také ektomesenchym)Deriváty neurální lišty (na hlavě také ektomesenchym)

osteoblasty, fibroblasty,osteoblasty, fibroblasty,chondroblasty, hladké chondroblasty, hladké svalové buňky, tukové svalové buňky, tukové buňky, odontoblasty buňky, odontoblasty

Ectomesenchym:Ectomesenchym:

Migrace buněk hlavové neurální lištyMigrace buněk hlavové neurální lišty•• z prosencephala a mesencephala z prosencephala a mesencephala do okolí oka a čichové plakody, do okolí oka a čichové plakody, •• z rhombencephala do žaberních z rhombencephala do žaberních oblouků po obvodu farynguoblouků po obvodu faryngu R1, 3 a 5 - převážně apoptóza R1, 3 a 5 - převážně apoptóza R2 – 1. žaberní oblouk R2 – 1. žaberní oblouk R4 – 2. žaberní oblouk, R4 – 2. žaberní oblouk, R6 – 3. žab. oblouk R6 – 3. žab. oblouk R7 – 4. žab. obloukR7 – 4. žab. oblouk •• srdeční neurální lišta srdeční neurální lišta ze 4. – 8. rhombomery ze 4. – 8. rhombomery do výtokového traktu srdcedo výtokového traktu srdce •• identita buněk neurální lišty identita buněk neurální lišty v jednotlivých rhombomeráchv jednotlivých rhombomerách je podmíněna expresí je podmíněna expresí HoxHox genů genů N. LeDouarin (1999)ED4 kuře

Buňky z hlavové neurální lištyBuňky z hlavové neurální lišty •• část senzit. ganglií V., VII., IX., X. část senzit. ganglií V., VII., IX., X. •• parasymp. ganglia a jejich satelitní buňky parasymp. ganglia a jejich satelitní buňky •• Schwannovy buňky, glomus caroticum Schwannovy buňky, glomus caroticum •• parafolikulární C – buňky (kalcitonin), parafolikulární C – buňky (kalcitonin), •• melanocty, melanocty, •• ektomesenchymektomesenchym – skelet, chrupavky a vazivo v – skelet, chrupavky a vazivo v obličejové části hlavy, odontoblasty, hlavový obličejové části hlavy, odontoblasty, hlavový leptomeninx, část střední a zevní vrstvy oční koule, leptomeninx, část střední a zevní vrstvy oční koule, m. ciliaris, vazivové stroma thymu, štítné žlázy, m. ciliaris, vazivové stroma thymu, štítné žlázy, příštítných tělísek, slinných žláz a slzné žlázy, stěna příštítných tělísek, slinných žláz a slzné žlázy, stěna cév žaberních oblouků (bez endotelu), hladké cév žaberních oblouků (bez endotelu), hladké svalové buňky, tukové buňky svalové buňky, tukové buňky •• srdeční neurální lištasrdeční neurální lišta – výtokový trakt srdce, velké – výtokový trakt srdce, velké cévy z oblouku aorty cévy z oblouku aorty

Vývojové vady z defektů neurální lištyVývojové vady z defektů neurální lišty•• CHARGE syndromCHARGE syndrom ((CColoboma iridis, oloboma iridis, HHeart eart defects, defects, AAtresia choanae, tresia choanae, RRetardation of etardation of development, development, GGenital hypoplasia in males, enital hypoplasia in males, EEar anomalies)ar anomalies)•• DiGeorgeův syndromDiGeorgeův syndrom (hypofunkce příštítných (hypofunkce příštítných žláz a štítné žlázy, hypoplasie thymu, žláz a štítné žlázy, hypoplasie thymu, defekty septace aorty a truncus pulmonalis defekty septace aorty a truncus pulmonalis•• anomálie zubů anomálie zubů •• albinismusalbinismus •• Waardenburgův syndromWaardenburgův syndrom ((Pax3Pax3 mutace – mutace – defekty pigmentace, defekty konč. svalů, rozštěp defekty pigmentace, defekty konč. svalů, rozštěp patra, kardiovaskulární defekty, hypertelorismus) patra, kardiovaskulární defekty, hypertelorismus)•• Hirschsprungova choroba Hirschsprungova choroba •• Piebaldism Piebaldism

SpSp1H1H/+/+ SpSp1H1H/ Sp/ Sp1H1H

ED 13.5

Pax3Pax3 mutace u myši (splotch mutace) mutace u myši (splotch mutace)

PiebaldismPiebaldism (defekty pigmentace, sterilita, anemie) (defekty pigmentace, sterilita, anemie) mutace mutace KITKIT genu a podobná mutace genu a podobná mutace KitKit genu u myši genu u myši

buňky neurální lištyangiogenní buňky

myogenní buňky

Do základu končetiny migrují:

Buňky neurální lišty v končetině

Znázornění buněk neurální lišty v embryonálních Znázornění buněk neurální lišty v embryonálních chimérách bílé leghornky a japonské křepelkychimérách bílé leghornky a japonské křepelky

QCPN

ED 17

ED 3

Q/C ED 17

C/Q ED 17

Znázornění buněk neurální lišty u savcůZnázornění buněk neurální lišty u savců

•• pomocí pomocí reportérového genureportérového genu lacZ lacZ ((E. coliE. coli)) transgenní myš transgenní myš Wnt1/lacZWnt1/lacZ • • trvalá etrvalá exprese xprese reportérového genu reportérového genu lacZlacZ s využitím cs využitím cre-lox systémre-lox systémuu: : transgenní myš transgenní myš Wnt1-cre/Wnt1-cre/R26RR26R

průkaz exprese reporterprůkaz exprese reporterovéhoového gen genuu laclacZ Z indigogenní metodindigogenní metodaa ( (XXggalal) při pH 7.5 ) při pH 7.5 imunohistochemickyimunohistochemicky ( (BgalBgal) () (rabbit anti-rabbit anti-E. coliE. coli ββ-galaktosidase; Chemicon)-galaktosidase; Chemicon)

BgalXgal

Wnt1-lacZ ED 9.5

Průkaz buněk neurální lišty sledováním exprese Průkaz buněk neurální lišty sledováním exprese genu genu Wnt1Wnt1 pomocí reporterového genu pomocí reporterového genu lacZlacZ

Cre-lox systém: Cre-lox systém: trvalá etrvalá exprese xprese reportérového genu v reportérového genu v bubuňkách ňkách neurální lištyneurální lišty

Wnt1Wnt1 promotor promotor(specifický pro neurální lištu)(specifický pro neurální lištu)

Cre-rekombináza

myšmyš Wnt1-cre Wnt1-cre / + / +

Cre-rekombinázaCre-rekombináza rozpozná rozpozná loxP loxP a a vystřihne označenývystřihne označený STOPSTOP

ββ-gal-gal

ββ-galaktozidáza-galaktozidázaje exprimovánaje exprimovánakonstitutivněkonstitutivně

myšmyš R26R / +R26R / +

loxP loxP

STOP ββ-gal-galR26RR26Rpromotor (ubikvitérní)promotor (ubikvitérní)

Wnt1-creWnt1-cre / R26R myš / R26R myšloxP loxP

STOP β-galR26RR26Rpromotorpromotor

Exprese reportérového genu Exprese reportérového genu LacZLacZ v buňkách neurální v buňkách neurální lišty embrya lišty embrya Wnt1-cre/Wnt1-cre/R26RR26R myší mutanty myší mutanty

Xgal Xgal

Vlasové folikuly, ED 17.5

Xgal

ED 9.5ED 9.5

Xgal

ED13, B galED13, X gal

Jiang et al., Dev Biol 241:106, 2002Jiang et al., Dev Biol 241:106, 2002

Vývoj zubu u myši Vývoj zubu u myši ((Wnt1-creWnt1-cre/R26R) (Chai et al. /R26R) (Chai et al. Development 127:1671, 2000)Development 127:1671, 2000)Z NL pochází Z NL pochází mesenchym dentální papily:mesenchym dentální papily:odontoblasty, vazivo pulpy, odontoblasty, vazivo pulpy, cementoblasty, periodontiumcementoblasty, periodontium

Xgal

Bgal

Srdeční neurální lištaSrdeční neurální lištaoblast 4. – 8. rhombomeryoblast 4. – 8. rhombomery

z NL pochází výtokový trakt srdce a velké cévy z oblouku aortyz NL pochází výtokový trakt srdce a velké cévy z oblouku aorty

Wnt1-creWnt1-cre/R26R transgenní myš, /R26R transgenní myš, Xgal , Xgal , 7. – 9. týden 7. – 9. týden Jiang et al.: Development 127:1607, 2000Jiang et al.: Development 127:1607, 2000

Fate Maps of Neural Crest and Mesoderm in the Mammalian EyeP. J. Gage, W. Rhoades, S. K. Prucka and T. Hjalt, Invest Ophthalm & Vis Sci. 46:4200 – 8, 2005

Merkel cellsMerkel cells are derived from the neural crest are derived from the neural crest::

K8

Bgal

Bgal/K8

Xgal Xgal / / K8K8

they they express beta-galactosidase, express beta-galactosidase, the neural crest cell markerthe neural crest cell marker,,in compound transgenic Wnt1-cre/R26R micein compound transgenic Wnt1-cre/R26R mice and K8, the MCs markerand K8, the MCs marker

Szeder V, Grim M, Halata Z, Sieber-Blum M: Dev Biol 253: 258, 2003Szeder V, Grim M, Halata Z, Sieber-Blum M: Dev Biol 253: 258, 2003

3. Buňky neurální lišty v epidermis(melanocyty, Merkelovy buňky)

Merkelova buňka:Merkelova buňka:velká, světlá buňka, která spolu s nervovým velká, světlá buňka, která spolu s nervovým zakončením tvoří pomalu se adaptující zakončením tvoří pomalu se adaptující mechanoreceptor v kůži a ektodermové sliznici mechanoreceptor v kůži a ektodermové sliznici obratlovců obratlovců

Merkelovy buňky u člověka představují 3.6 - 5.7% Merkelovy buňky u člověka představují 3.6 - 5.7% buněk bazální vrstvy epidermis buněk bazální vrstvy epidermis (Fradette et al., 2003)(Fradette et al., 2003)

F. S. Merkel: „Tastzellen“ v kůži savců a ptáků (1875)F. S. Merkel: „Tastzellen“ v kůži savců a ptáků (1875)

Merkelova buňka je receptivní jednotkou mechanického Merkelova buňka je receptivní jednotkou mechanického podnětu, kontakt s axonem je místem synaptického přenosupodnětu, kontakt s axonem je místem synaptického přenosu

Halata Z, Grim M, Bauman K: Anat Rec 271A: 225, 2003

Hmatové (sinusové) chlupy - whiskers

sea-lion

The follicle of The follicle of sinus hairsinus hair ( (whiskerwhisker) contains the ) contains the largest known accumulation of Merkel cells largest known accumulation of Merkel cells

CK8/H

ED 10

ED 13

ED 13

Bgal +/ H

Pigmentové buňky v epidermis

E.M.J.Peters (2002)c-kit / hem

c-kit-positive melanoblasts

NCCs in hair follicles from the back skin Wnt1-cre/ R26R

c-kit XgalXgal / nucl. red

Xgal / CK8

4. Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových 4. Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových folikulech myšifolikulech myši

Bgal/H

Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových folikulech myšiuňky neurální lišty ve vlasových folikulech myši

Wnt1- cre/R26R Bgal/ HMath1 LacZ/+ Bgal + K8

The follicle of The follicle of sinus hairsinus hair ( (whiskerwhisker))blood sinus, innervation, bulgeblood sinus, innervation, bulge

Dissection of the bulge from adult whisker follicleDissection of the bulge from adult whisker follicle

Xgal + NCCs emigrated 4 days after explantationXgal + NCCs emigrated 4 days after explantation

Bulge explant-derived NCCs Bulge explant-derived NCCs express nestin and Sox10express nestin and Sox10

(day 5 in culture)(day 5 in culture)

Anti-nestin AbAnti-nestin Ab + + DAPI DAPI Anti-Sox10 AbAnti-Sox10 Ab + + DAPIDAPI

Bulge explant-derived NCCs are pluripotentBulge explant-derived NCCs are pluripotent

SCIP Ab; anti-S-100 Xgal

Smooth muscle cells Neurons Schwann cellsSmooth muscle cells Neurons Schwann cells (2 weeks in culture)(2 weeks in culture)

MelEM

Melanocyte progenitorsMelanocyte progenitors anti-SMAanti-SMA anti- anti-ßß-III tubulin-III tubulin DAPIDAPI

Xgal

Xgal

Targeted differentiation into Targeted differentiation into chondrocyteschondrocytes ((eNCCs cultured in presence of BMP-2 )eNCCs cultured in presence of BMP-2 )

Anti-collagen type II Ab (Anti-collagen type II Ab (redred), DAPI (), DAPI (blueblue), Xgal (), Xgal (blackblack)

Bulge-derived NCCs undergo self-renewalBulge-derived NCCs undergo self-renewal(determined by serial cloning)(determined by serial cloning)

6 h 18 h 72 h48 h

Primary clone

5-day-old secondary clone5-day-old secondary clone

cells from 2-weeks cells from 2-weeks secondary clonessecondary clones

ß-III tubulin

anti-SMA

Xgal

Xgal

NestinNestin GAD67GAD67 RIPRIP

Morphology of EPI-NCSC implants in the lesioned spinal cordMorphology of EPI-NCSC implants in the lesioned spinal cord

SSieber-Blum M, Schnell L, Grim M, Yao Fei Hu, ieber-Blum M, Schnell L, Grim M, Yao Fei Hu, Schneider R, Schwab MESchneider R, Schwab ME: Characterization of : Characterization of Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Grafts in Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Grafts in the Lesioned Spinal Cord. the Lesioned Spinal Cord. Molecular and Cellular Molecular and Cellular NeuroscienceNeuroscience (accepted February 2006) (accepted February 2006)

EPI-NCSC získané z vlasových folikulů byly EPI-NCSC získané z vlasových folikulů byly transplantovány do mechanicky poškozené míchy u transplantovány do mechanicky poškozené míchy u dospělé myši a jejich osud byl sledován 3. týden – 6. dospělé myši a jejich osud byl sledován 3. týden – 6. měsíc po transplantaci. Bylo zjištěno, že jsou měsíc po transplantaci. Bylo zjištěno, že jsou integrovány, přežívají, neproliferují, netvoří tumor a integrovány, přežívají, neproliferují, netvoří tumor a diferencují se v GABAergní neurony a oligodendrocyty diferencují se v GABAergní neurony a oligodendrocyty (exprimují (exprimují neuron-specificneuron-specifickýký beta III-tubulin, marker beta III-tubulin, marker GABAergGABAergních neuronůních neuronů glutamate decarboxylase-67, glutamate decarboxylase-67, marker oligodendrocytmarker oligodendrocytůů RIP RIP aa basic basickýký myelin myelinovýový protein. protein. Mohou se tedy uplatnit při náhradě lokálních Mohou se tedy uplatnit při náhradě lokálních neuronů a při remyelinizaci.neuronů a při remyelinizaci.

5. Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových 5. Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových folikulech folikulech u člověkau člověka

Růstová fáze, Růstová fáze, anagen (2-6 let)anagen (2-6 let), začíná regenerací dolního segmentu , začíná regenerací dolního segmentu folikulu. Tvoří se nová cibulka, dermální papila se zvětšuje, buňky folikulu. Tvoří se nová cibulka, dermální papila se zvětšuje, buňky v cibulce tvoří kořenové pochvy a v nich nový vlas. Involuce folikulu, v cibulce tvoří kořenové pochvy a v nich nový vlas. Involuce folikulu, katagen (1-2 týdny)katagen (1-2 týdny), je krátká fáze zástavy růstu vlasu. Nové fázi , je krátká fáze zástavy růstu vlasu. Nové fázi růstu předchází poměrně dlouhé klidové období, růstu předchází poměrně dlouhé klidové období, telogen (2-6 týdnů),telogen (2-6 týdnů), dokud není folikul aktivován k novému růstovému cyklu.dokud není folikul aktivován k novému růstovému cyklu.

Růstový cyklus vlasu.

Tissue source: skin biopsy from different body locations

Isolation of human epidermal neural crest stem cells (hEPI- NCSCs) from hair follicles

Epidermis with follicles after dispase treatment

Primary culture cells after emigration from isolated follicle

Sphere after readhesion

Coexpression of Sox10 and Nestin, Expression of Nanog

Sox10 + Nestin Nanog + DAPI

hEPI-NCSCs in tissue culture after emigration from back skin follicles

Differentiation of human epidermal neural crest stem cells fom hair follicles into neural crest progeny Folia Biol. (Praha) 56, 149-157, 2010

Smooth muscle actin

Beta III tubulin

S100

GFAP

Smooth muscle cells

NeuronsSchwann cells

Schwann cells

Folia Biologica (Praha) 56, 149-157 (2010)

PoděkováníPoděkováníspoluautorům publikací:spoluautorům publikací:

M. Sieber-Blum, E. Krejčí, V. Szeder, Z. Halata, Yao Fei HuM. Sieber-Blum, E. Krejčí, V. Szeder, Z. Halata, Yao Fei Hu

za poskytnutí transgenních myší:za poskytnutí transgenních myší: A. P. McMahon, P. SorianoA. P. McMahon, P. Soriano,, H. Sucov H. Sucov,, B. Fritzsch B. Fritzsch

za poskytnutí protilátky za poskytnutí protilátky α-α-MATH1 AbMATH1 Ab J.E. JohnsonJ.E. Johnson

za technickou pomoc:za technickou pomoc: AA. . KautskáKautská, , EE. . KluzákováKluzáková, M. Pleschnerová, J. Ward, M. Pleschnerová, J. Ward

za finanční podporu:za finanční podporu: MŠMT ČRMŠMT ČR - - VVýzkumný záměr ýzkumný záměr 1111 00003-31111 00003-3, , 000021620806 21620806

Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad LNLN--00A06500A065,, 1M1M 00 0021620803 21620803

((MGMG), ), R01 NS38500 R01 NS38500 (MSB(MSB), F05 NS11111 (), F05 NS11111 (VSVS))

Halata Z, Grim M, Christ B: Origin of spinal cord meninges, sheaths of peripheral nerves, and cutaneous receptors including Merkel cells. An experimental and ultrastructural study with avian chimeras. Anat Embryol 182: 529 – 537, 1990 Grim M, Halata Z, Franz T: Schwann cells are not required for guidance of motor nerves in the hindlimb in Splotch mutant mouse embryos. Anat Embryol 186: 311 – 318, 1992 Grim M, Christ B: Neural crest cell migration into the limb bud of avian embryos. In: Limb development and regeneration. JF Fallon, PF Goetinck, RO Kelley, DL Stocum (eds). J. Wiley- Liss, Inc. 1993, pp. 391 - 402 Grim M, Halata Z: Developmental origin of Merkel cells in birds. In: Merkel Cells, Merkel Cell Carcinoma and Neurobiology of the Skin. eds.: H Suzuki, T Ono, pp. 23 - 32 Excerpta Medica Internat. Congress Series 1187, Elsevier, 2000 Grim M, Halata Z: Developmental origin of avian Merkel cells Anat Embryol 202: 401 - 410, 2000 Grim M, Riedlbauchová L, Valášek P: Interaction of head mesoderm and cells of neural crest in the chick. In: Origin and Fate of Somites. Eds.:E.J.Sanders, J.W.Lash, C.P. Ordahl, IOS Press, 2001, NATO Sci. Ser. I. Vol. 329, pp. 48 - 55 Szeder V, Grim M, Halata Z, Sieber-Blum M: Neural Crest Origin of Mammalian Merkel Cells. Dev Biol 253: 258–263, 2003Halata Z, Grim M, Baumann KI: Merkelova buňka: morfologie, vývojový původ, funkce. Čas Lék čes 142: 4–10, 2003 Halata Z, Grim M, Baumann KI: Friedrich Sigmund Merkel and his “Merkel Cell”, morphology, development and physiology review and new results. Anat Rec 271A: 225-239, 2003 Grim M, Halata Z, Szeder V and M Sieber-Blum: Merkel Cells are Postmitotic Cells of Neural Crest Origin. In: The Merkel Cell, eds. Baumann KI, Halata Z, Moll I, Springer, 2003 pp. 89 – 96Sieber-Blum M and Grim M: The adult hair follicle – cradle for pluripotent neural crest stem cells. Embryo Today 72: 162 - 172, 2004Sieber-Blum M, Grim M, Hu YF, Szeder V: Pluripotent Neural Crest Stem Cells in the Adult Hair Follicle. Dev Dyn 231: 258 – 269, 2004Sieber-Blum M, Schnell L, Grim M, Yao Fei Hu, Schneider R, Schwab ME: Characterization of Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Grafts in the Lesioned Spinal Cord. Molecular and Cellular Neuroscience April 2006Krejčí E, Grim M: Isolation and Characterization of Neural Crest Stem Cells from Adult Human Hair Follicles Folia Biologica (Praha) 56, (4): 149 – 157, 2010

Děkuji Vám za pozornost !